PL193780B1 - Sposób wytwarzania receptora przeciw ludzkim antygenom, ludzkie przeciwciało i środek farmaceutyczny - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania receptora przeciw ludzkim antygenom, znamienny tym, ze prowadzi si e etapy (b) selekcjonowania kombinacji funkcjonalnie przegrupowanych la ncuchów VH i VL immu- noglobulin, w której to kombinacji co najmniej la ncuch VH pochodzi z niestymulowanych dojrza lych ludzkich limfocytów B, a la ncuch VL pochodzi z naturalnie wyst epuj acego repertuaru ludzkich komó- rek B, które to la ncuchy s a eksprymowane ze zrekombinowanego wektora, oraz (c) stosowania uk ladu prezentacji in vitro do wi azania si e z ludzkim antygenem, przy czym przed etapem selekcjonowania (b) przeprowadza si e etap (a) selekcjonowania la ncucha VH lub VL pod wzgl edem wi azania si e z antygenem wraz z la ncuchem V specyficznego przeciwcia la docelowego antygenu innego ni z ludzki. 15. Ludzkie przeciwcia lo specyficzne wzgl edem ludzkiego natywnego antygenu 17-1A. 19. Srodek farmaceutyczny, znamienny tym, ze zawiera przeciwcia lo zdefiniowane w zastrz. 15 i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny no snik. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są sposób wytwarzania receptora przeciw ludzkim antygenom, ludzkie przeciwciało i środek farmaceutyczny.

Układy odpornościowe ssaków, takie jak ludzki układ odpornościowy, prowadzą selekcję przeciwko immunokompetentym komórkom i cząsteczkom, które są specyficzne w stosunku do autoantygenów. Deregulacja układu odpornościowego pod tym względem może spowodować choroby autoimmunizacyjne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów. Na ogół nadzór układu odpornościowego w odniesieniu do autoreaktywnych przeciwciał lub komórek T jest więc wysoce korzystny. Jednak mogą być przypadki, w których byłoby korzystne mieć autoreaktywne przeciwciała, skierowane na antygeny eksprymowane w organizmie ssaka, w szczególności w organizmie ludzkim. Takimi antygenami są np. antygeny związane z nowotworami.

Przykładowo stwierdzono, że ludzki antygen 17-1A lub EpCAM, glikoproteina powierzchniowa eksprymowana przez komórki nabłonków prostych i pochodzących od nich złośliwych nowotworów, jest odpowiednim celem dla leczenia raka monoklonalnymi przeciwciałami, szczególnie u pacjentów z chorobą szczątkową w wyniku rozsiania komórek nowotworowych, które mogą później powodować lite przerzuty i w ten sposób pogarszać prognozę odnośnie pacjenta.

U pacjentów z minimalnym resztkowym rakiem okrężnicy, mysie monoklonalne przeciwciał o specyficzne dla ludzkiego antygenu 17-1A zmniejszyło 5-letnią śmiertelność o 30% w porównaniu z nieleczonymi pacjentami, gdy stosowane było ogólnoukładowo w pięciu dawkach w ciągu czterech miesięcy po usunięciu chirurgicznym pierwotnego nowotworu; każdy pacjent był leczony z użyciem łącznie 900 mg przeciwciała (Riethmϋller, Lancet 343 (1994), 1177-1183).

Jednak w czasie leczenia przeciwciałami u pacjentów rozwinęła się silna odpowiedź przeciwciał przeciwko mysiej immunoglobulinie. Te ludzkie anty-mysie przeciwciała (HAMA) poważnie ograniczają ciągłe stosowanie terapii przeciwciałami i coraz bardziej zmniejszają jej skuteczność. Co więcej, uprzednio wytworzone HAMA indukowane przez uprzednie leczenie przeciwciałami lub inny kontakt z mysią immunoglobuliną mogą silnie zakłócić późniejsze leczenie przeciwciałami.

Dla zapobieżenia tym problemom korzystne byłyby terapeutyczne przeciwciała o minimalnej immunogenności. Dla osiągnięcia tego celu można by np. rozważyć, aby terapeutyczne przeciwciała lub pochodne przeciwciał były całkowicie ludzkie pod względem ich sekwencji aminokwasów i aby immunogenny profil idiotypu ludzkiego przeciwciała był minimalizowany przez stosowanie ludzkich regionów zmiennych Ig, które prawdopodobnie byłyby tolerowane przez ludzki układ odpornościowy.

Jednak wytwarzanie ludzkich przeciwciał przeciwko ludzkim antygenom napotyka dwa główne problemy.

(1) Hybrydoma lub inne metody unieśmiertelniania przeciwciał okazały się być całkiem nieskuteczne w wytwarzaniu linii komórkowych produkujących ludzkie przeciwciała, w porównaniu z technologią mysich hybrydom (2) Autoreaktywne przeciwciała są stosunkowo skutecznie zubożone w naturalnie występujący repertuar przeciwciał ze względu na mechanizmy powodujące autotolerancję.

Ludzkie przeciwciała na ogół stały się znacznie bardziej dostępne od czasu dostępności transgenicznych myszy eksprymujących ludzkie przeciwciała (Brijggemann, Imnunol. Today 17 (1996), 391-397) i technologii biblioteki kombinatoryjnych przeciwciał i prezentacji fagowej, co umożliwia kombinację in vitro regionów zmiennych ciężkich i lekkich łańcuchów Ig (VH i VL) i selekcję in vitro ich specyficzności wiązania przeciwciała (Winter, Annu. Rev. Immunol. 12 (1994), 433-455). Z zastosowaniem metody prezentacji fagowej można łatwo wyizolować rzadkie przypadki, takie jak jedna specyficznie wiążąca jednostka spośród 10⁷ do 10⁹ różnych par VL/VH lub VH/VL; jest to szczególnie prawdziwe gdy repertuar regionów zmiennych został wzbogacony pod względem specyficznie wiążących jednostek w wyniku zastosowania limfocytów B z immunizowanych gospodarzy jako źródła do klonowania repertuaru.

Często jednak częstość specyficznie wiążących jednostek jest znacznie obniżona w naturalnie występujących repertuarach przeciwciał. Jest to szczególnie prawdziwe dla przypadków przeciwciał wiążących się do autoantygenów. Losowe kombinacje regionów VH i VL z autotolerancyjnego gospodarza dające w efekcie kombinatoryjną bibliotekę o konwencjonalnej wielkości (10⁷ do 10⁹ niezależnych klonów) najczęściej nie wystarczają do udanej selekcji in vitro autoreaktywnych przeciwciał metodą prezentacji fagowej.

PL 193 780 B1

Jedna strategia obejścia tego problemu to zastosowanie bardzo dużej biblioteki kombinatoryjnej przeciwciał, przy czym wielkość biblioteki kompensuje niską częstość występowania autoreaktywnych przeciwciał w naturalnie występujących repertuarach. Trudno jednak otrzymać kombinatoryjne biblioteki przeciwciał przekraczające wielkość 10⁹ niezależnych klonów, ze względu na obecne techniczne ograniczenia wydajności transformacji plazmidowego DNA do komórek E. coli.

Aby uniknąć zaburzeń reprezentacji przeciwciał powodowanych przez autotolerancję w naturalnie występujących repertuarach przeciwciał, w których niedoreprezentowane są autoreaktywne przeciwciała, oraz znacząco obniżyć szansę izolacji przeciwciał specyficznie rozpoznających autoantygeny, opracowano sposób z zastosowaniem półsyntetycznych lub syntetycznych repertuarów łańcuchów VH i/lub VL.

Przykładowo, niemal cały repertuar nieprzegrupowanych segmentów ludzkich genów V został sklonowany z genomowego DNA i zastosowany do rekombinacji in vitro funkcjonalnych genów regionów zmiennych, podobnej do rekombinacji V-J lub V-D-J in vivo (Hoogenboom, J. Mol. Biol. 227 (1992), 381-388; Nissim, EMBO J. 13 (1994) 692-696; Griffiths, EMBO J. 13 (1994), 3245-3260). Zazwyczaj zmienność styków V-D/D-J i różnorodność segmentu D przede wszystkim są odpowiedzialne za niesłychaną zmienność długości i sekwencji CDR3 łańcucha ciężkiego, jak i zmienność styku V-J mająca udział w zmienności CDR3 łańcucha lekkiego, są imitowane przez losowe sekwencje w wyniku zastosowania zdegenerowanych oligonukleotydów w całkowicie syntetycznych i półsyntetycznych podejściach (Hoogenboon (1994), powyżej; Nissim, powyżej; Griffiths, powyżej; Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4457-44610).

Jednak istnieje zagrożenie, że pary VL/VH lub VH/VL wybrane dla wiązania ludzkiego antygenu z takich półsyntetycznych lub w pełni syntetycznych repertuarów opartych na sekwencjach ludzkiego genu V będą tworzyły immunogenne epitopy, które mogą indukować niepożądaną odpowiedź immunologiczną u ludzi (Hoogenboom, TIBTECH 15 (1997), 62-70); w szczególności regiony CDR3 pochodzące z całkowicie uśrednionych repertuarów sekwencji są predestynowane do tworzenia potencjalnie immunogennych epitopów, jako że nigdy nie podlegały ludzkiemu nadzorowi immunologicznemu i rozpoznaniu jako obcy antygen, co następnie powodowało eliminację. Jest to tak samo prawdziwe w przypadku ludzkich przeciwciał z transgenicznych myszy eksprymują cych ludzkie przeciwciał a, jako że te cząsteczki immunoglobulin były wybrane jako tolerowane przez mysi, ale nie ludzki układ odpornościowy.

W publikacji WO 93/11236 opisano sposób wytwarzania anty-autoprzeciwcia ł i ich fragmentów mających miejsce wiązania specyficzne względem autoantygenu, w którym to sposobie stosuje się bibliotekę zestawów genetycznych zdolnych do replikacji oraz dokonuje selekcji produktów pod względem specyficzności wiązania z autoantygenem.

Istniała potrzeba opracowania sposobu umożliwiającego wytwarzanie receptorów przeciwko ludzkim antygenom, które to receptory mają niską immunogenność lub nie są immunogenne u ludzi i mogą być stosowane do adresowania antygenów w organizmie ludzkim.

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania receptora przeciw ludzkim antygenom, polegającego na tym, że prowadzi się etapy (b) selekcjonowania kombinacji funkcjonalnie przegrupowanych łańcuchów VH i VL immunoglobulin, w której to kombinacji co najmniej łańcuch VH pochodzi z niestymulowanych dojrzałych ludzkich limfocytów B, a łańcuch VL pochodzi z naturalnie występującego repertuaru ludzkich komórek B, które to łańcuchy są eksprymowane ze zrekombinowanego wektora, oraz (c) stosowania układu prezentacji in vitro do wiązania się z ludzkim antygenem, przy czym przed etapem selekcjonowania (b) przeprowadza się etap (a) selekcjonowania łańcucha VH lub VL pod względem wiązania się z antygenem wraz z łańcuchem V specyficznego przeciwciała docelowego antygenu innego niż ludzki.

Korzystnie receptor stanowi immunoglobulina lub fragment immunoglobuliny, taki jak fragment Fv.

Korzystnie co najmniej łańcuch immunoglobuliny VH i ewentualnie łańcuch VL pochodzą z ludzkiego repertuaru IgD.

Korzystnie jako układ prezentacji in vitro stosuje się układ prezentacji fagowej.

Korzystnie kombinacja przegrupowanych łańcuchów jest eksprymowana z jednej lub większej liczby różnych bibliotek.

Korzystnie ludzki antygen stanowi antygen nowotworu, taki jak ludzki antygen 17-1A.

Korzystnie łańcuch VH zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 7, nukleotydy 1 - 381, lub sekwencję przedstawioną na fig. 8, nukleotydy 1 - 339, i/lub łańcuch VL zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 6, nukleotydy 1 - 321, lub sekwencję przedstawioną na fig. 9, nukleotydy 1 - 321.

PL 193 780 B1

Korzystnie w etapie selekcji (b) (i) wiąże się ośrodek prezentacji eksprymujący receptor antygenu (a) na unieruchomionym docelowym antygenie lub jego fragmentach;

(b) na ewentualnie znakowanych komórkach eksprymujących docelowy antygen lub jego fragmenty; albo (c) z rozpuszczalnym, korzystnie znakowanym antygenem docelowym lub jego fragmentami;

(ii) wymywa się niespecyficznie wiążące się ośrodki prezentacji (a oraz b), a następnie eluuje specyficznie wiążące się ośrodki prezentacji, albo (iii) dodatnio wzbogaca się związane z docelowym antygenem ośrodki prezentacji (b oraz c) z roztworu docelowego antygenu lub z zawiesin komórek eksprymują cych antygen docelowy;

przy czym tak wyizolowane ośrodki prezentacji obejmujące receptory ich antygenów ewentualnie namnaża się przez replikację i poddaje dalszym rundom selekcji in vitro jak w (i)-(iii).

Korzystnie łańcuch specyficznego przeciwciała docelowego antygenu innego niż ludzki stanowi mysi łańcuch VH lub VL.

Korzystnie w etapie selekcji odpowiedniej kombinacji (a) testuje się jeden i ten sam łańcuch VH w kombinacji z różnymi łańcuchami VL pod względem wiązania się z ludzkim antygenem; albo (b) testuje się jeden i ten sam łańcuch VL w kombinacji z różnymi łańcuchami VH pod względem wiązania się z ludzkim antygenem.

Korzystnie po selekcji dodatkowo prowadzi się etapy otrzymywania ludzkich łańcuchów VH i VL lub odpowiednich kwasów nukleinowych oraz przyłączania tych łańcuchów do tych samych lub innych łańcuchów VH lub VL, do stałych regionów ciężkich łańcuchów (CH) albo lekkich łańcuchów (CL) immunoglobulin lub ich części, albo odpowiednio do nieimmunoglobulinowych łańcuchów i odpowiednich kwasów nukleinowych.

W szczególności stałe regiony łań cuchów pochodzą z ludzkich IgG1 lub IgG3.

Korzystnie po selekcji dodatkowo prowadzi się etapy otrzymywania ludzkich łańcuchów VH i VL oraz fizycznego przyłączania tych łańcuchów do niebiałkowych środków farmaceutycznych i/lub innych cząsteczek biologicznie czynnych.

Korzystnie łańcuchy VH lub VL są eksprymowane z sekwencji kwasów nukleinowych, które są wynikiem amplifikacji RT-PCR mRNA pochodzącego z niestymulowanych dojrzałych ludzkich limfocytów B.

Wynalazek dotyczy również ludzkiego przeciwciała specyficznego względem ludzkiego natywnego antygenu 17-1A.

Korzystnie przeciwciało według wynalazku zostało wytworzone sposobem opisanym powyżej.

Korzystne jest przeciwciało według wynalazku, które rozpoznaje epitop domeny zewnątrzkomórkowej antygenu 17-1A, korzystnie zawierający co najmniej jedną sekwencję aminokwasową peptydu nr 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 i 79.

Korzystne jest przeciwciało według wynalazku, w którym łańcuch VH zawiera co najmniej jeden CDR sekwencji przedstawionej na fig. 7, nukleotydy 1 - 381, lub sekwencji przedstawionej na fig. 8, nukleotydy 1 - 339, i/lub łańcuch VL zawiera co najmniej jeden CDR sekwencji przedstawionej na fig. 6, nukleotydy 1 - 321, lub sekwencji przedstawionej na fig. 9, nukleotydy 1 - 321.

Wynalazek dotyczy ponadto środka farmaceutycznego, którego cechą jest to, że zawiera przeciwciało zdefiniowane powyżej i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.

Sposób według wynalazku jest wysoce korzystny do dostarczania receptorów, które mogą być stosowane do adresowania antygenów u człowieka i które nie są immunogenne lub mają niską immunogenność. Takie receptory można dogodnie stosować do leczenia różnych chorób, takich jak nowotwory lub choroby autoimmunizacyjne, odrzucanie przeszczepów po transplantacji, choroby zakaźne, przez adresowanie receptorów komórkowych, a także chorób alergicznych, zapalnych, chorób gruczołów dokrewnych i chorób zwyrodnieniowych, przez adresowanie kluczowych cząsteczek biorących udział w procesie patologicznym.

Łańcuchy immunoglobulin VH/VL receptorów wytwarzanych sposobem według wynalazku można oczywiście dalej badać pod względem sekwencji kwasów nukleinowych i aminokwasów, z zastosowaniem metod dobrze znanych fachowcom, patrz np. Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)).

PL 193 780 B1

Po ustaleniu sekwencji kwasu nukleinowego lub sekwencji aminokwasów, receptory można też wytwarzać innymi sposobami, takimi jak syntetyczne lub półsyntetyczne sposoby dające receptory syntetyczne lub półsyntetyczne, albo w transgenicznych myszach eksprymujących ludzkie receptory immunoglobulinowe.

Po związaniu receptora z ludzkim antygenem, receptor można dalej oczyszczać. Na przykład niezwiązane receptory, które nie niosą specyficzności antygenu, można usunąć w etapach przemywania. Związany receptor można wyeluować z ludzkiego antygenu i dalej oczyszczać, przy czym można stosować dodatkowe rundy ekspresji, wiązania i selekcji żądanego receptora, aż żądany receptor i/lub odpowiedni zrekombinowany wektor zostaną wyizolowane w stanie czystym.

Sposób według wynalazku wykorzystuje więc preselekcję regionów zmiennych Ig przez ludzki układ opornościowy. Receptory pochodzą z repertuaru wybranego in vitro z ludzkich kombinatoryjnych bibliotek wyłącznie lub preferencyjnie składających się z naturalnie występującego repertuaru przeciwciał eksprymowanego przez zasadniczo niestymulowane dojrzałe ludzkie limfocyty B lub z zasadniczo anergicznych ludzkich komórek B.

Jednak zmienne domeny Ig mogą też pochodzić z różnych innych źródeł, które reprezentują preselekcjonowane populacje komórek B.

Naukowe podstawy dotyczące pochodzenia komórek B funkcjonujących jako źródło łańcuchów VH lub VL można wyjaśnić następująco.

Dojrzałe niestymulowane limfocyty B eksprymujące IgD i IgM jako błonowe receptory antygenów wnikają do pierwotnych pęcherzyków w czasie ruchów do wtórnych limfoidalnych narządów i między wtórnymi limfoidalnymi narządami, o ile nie napotkały multiwalentnych autoantygenów powodujących delecję klonalną, albo rozpuszczalnego monowalentnego autoantygenu powodującego ich anergię i krótki okres życia wskutek wykluczenia z pęcherzyków pierwotnych.

Kontakt niedojrzałych komórek B, które wyłącznie eksprymują IgM, z autoantygenem w szpiku kostnym, powoduje klonalną delecję lub anergię w zależności od wartościowości antygenu. Anergiczne komórki B, choć eksprymują powierzchniowy antygen IgD, są niezdolne do odpowiedzi na antygen poprzez ten receptor; bez dostępu do pierwotnych pęcherzyków i bez pomocy komórek T, komórki te wykazują krótki okres półtrwania, zaledwie kilka dni.

Natomiast dojrzałe niestymulowane limfocyty B, które nie napotkały autoantygenu, a więc mają dostęp do pęcherzyków pierwotnych, mają długi okres półtrwania wynoszący kilka tygodni. Mimo opisanych mechanizmów warunkujących autotolerancję, te populacje długożyjących dojrzałych niestymulowanych limfocytów B nadal zawierają potencjalnie auto-reaktywne komórki B, jednak istnieje małe prawdopodobieństwo by te komórki znalazły pomoc specyficznych komórek T ze względu na tolerancję komórek T i zostały powstrzymane od proliferacji i wydzielania przeciwciał. Okazało się, że brak reakcji komórek B na wiele autoantygenów, które są obecne na niskim poziomie, jest tego typu, że wpływa na pomocnicze komórki T ale nie komórki B. Zgodnie z wynalazkiem te długożyjące, niereagujące, potencjalnie autoreaktywne, dojrzałe niestymulowane limfocyty B, zidentyfikowano jako najbardziej obiecujący naturalnie występujący ludzki repertuar dla konstrukcji kombinatoryjnych bibliotek przeciwciał, szczególnie odpowiednich do wybierania ludzkich przeciwciał na ludzkie antygeny np. metodą prezentacji fagowej.

Oczekuje się, że ten wysoce wyselekcjonowany repertuar stosowany zgodnie z wynalazkiem, głównie pochodzący z komórek B o długim okresie półtrwania in vivo, a zatem eksponowanych na ludzki układ odpornościowy przez dłuższe okresy czasu, będzie znacznie zubożony w cząsteczki przeciwciał tworzące epitopy, zwłaszcza w obrębie wysoce zmiennych regionów CDR-3, które są immunogenne dla ludzkiego układu odpornościowego. Tak więc oczekuje się, że ludzkie przeciwciała wybrane z tego repertuaru przeciwciał będą miały niższy immunogenny profil u ludzi niż ludzkie przeciwciała wybrane z bibliotek półsyntetycznych lub w pełni syntetycznych ludzkich przeciwciał.

Dojrzałe niestymulowane komórki B, które są uaktywniane przez kontakt z obcym antygenem, przestają eksprymować IgD i rozpoczynają klonalną proliferację i różnicowanie do komórek osocza wydzielających rozpuszczalną immunoglobulinę; wczesne stadia odpowiedzi przeciwciał są zdominowane przez przeciwciała IgM, podczas gdy później predominującymi izotypami są IgG i IgA, a IgE stanowi małą ale ważną ze względów biologicznych część odpowiedzi przeciwciał.

W odróżnieniu od IgD-ujemnych dojrzałych stymulowanych przez antygen limfocytów B eksprymujących IgM, IgG, IgA lub IgE, IgD-dodatnie dojrzałe niestymulowane komórki B jeszcze nie przeszły klonalnej proliferacji, a więc kombinatoryjne biblioteki IgD nie nadreprezentują specyficzności przeciwciał, które obecnie biorą lub uprzednio brały udział w reakcjach odpornościowych na ogół ste6

PL 193 780 B1 rowanych przez obcy antygen, w ten sposób zmniejszając różnorodność repertuaru i marnując zakres biblioteki na kandydatów na przeciwciała, mających małe szansę wiązania autoantygenów. Jest to wyraźnie wbrew znanemu stanowi wiedzy zalecającemu stosowanie bibliotek kombinatoryjnych IgM do selekcji in vitro ludzkich przeciwciał przeciwko antygenom ludzkim z naturalnie występującego repertuaru ludzkich przeciwciał (Hoogenboom (1997), powyżej).

Fragment immunoglobuliny może stanowić znany fragment, taki jak Fab lub fragmenty F(ab)2, a zwł aszcza fragment Fv.

Wywnioskowano, że opisany receptor i korzystnie repertuar przeciwciał wybrany dla niskiej immunogenności, jest najlepiej reprezentowany w ludzkiej bibliotece IgD. IgD jest eksprymowana jako błonowy receptor antygenu wraz z powierzchniową IgM na dojrzałych niestymulowanych limfocytach B, które wnikają do pierwotnych pęcherzyków w czasie swego ruchu do wtórnych narządów limfatycznych i między wtórnymi narządami limfatycznymi, o ile nie napotkały multiwalentnych autoantygenów dających w efekcie klonalną delecję, albo rozpuszczalnego monowalentnego autoantygenu powodującego ich anergię i krótki okres życia w wyniku wykluczenia z pierwotnych pęcherzyków. Oprócz repertuaru przeciwciał dojrzałych niestymulowanych limfocytów B, ludzkie biblioteki IgD dalej tylko reprezentują te z krótkotrwałych komórek B, które stały się anergiczne w kontakcie z rozpuszczalnym monowalentnym autoantygenem, ale jest nieprawdopodobne by wnosiły specyficzne miejsca wiążące cząsteczki powierzchni komórek ludzkich przypominające multiwalentne autoantygeny, które powodują klonalną delecję zamiast anergii komórek B.

Układ prezentacji fagowej był w przeszłości dogodnie stosowany do selekcji różnych peptydów i białek, które wiążą się ze specyficznymi celami. Na podstawie tej wiedzy łańcuchy immunoglobulin VH i VL można dogodnie wklonować do wektorów, które także zawierają cząsteczki pożyteczne dla układów prezentacji fagowej. Takie odpowiednio cząsteczki i wektory są dobrze znane (Winter, powyżej; Barbas, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2 (1991), 119-124) i nie trzeba tu ich objaśniać bardziej szczegółowo.

Kombinacja przegrupowanych łańcuchów może być eksprymowana z jednej lub większej liczby różnych bibliotek, co jest szczególnie korzystne gdy znany jest łańcuch VH lub VL, który wiąże się do specyficznego celu, a wybiera się odpowiadający drugi łańcuch V, który rekonstytuuje lub polepsza wiązanie.

Gdy ludzki antygen stanowi antygen nowotworu, zwłaszcza antygen 17-1A, ten antygen jest korzystnie eksprymowany na powierzchni nowotworu. W tym przypadku łańcuchy VH i VL są korzystnie połączone z toksyną. Połączenia można dokonać na poziomie kwasu nukleinowego drogą inżynierii genetycznej, albo na poziomie białka drogą np. sprzęgania chemicznego.

Korzystnie łańcuch VH zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 7 (nukleotydy 1 - 381) lub na fig. 8 (nukleotydy 1 -339) i/lub łańcuch VL zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 6 (nukleotydy 1 - 321) lub fig. 9 (nukleotydy 1 - 321). Receptory z tymi specyficznymi regionami VH i VL, w których region VL może być połączony z obydwoma regionami VH, są pierwszymi ludzkimi przeciwciałami, które są specyficzne w stosunku do ludzkiego antygenu 17-1A.

Etap selekcji obejmuje wyżej opisane czynności (i), (ii) i (iii), przy czym w (ii) eluowanie specyficznie wiążącego ośrodka prezentacji można prowadzić w sposób niespecyficzny (np. buforem o niskim pH) lub specyficzny (np. docelowe specyficzne w stosunku do antygenu przeciwciało), a w (iii) dodatnie wzbogacanie ośrodka prezentacji można prowadzić np. z użyciem magnetycznych perełek wiążących się odpowiednio ze znakowanym docelowym antygenem lub ze znakowanymi komórkami eksprymującymi docelowy antygen.

Korzystnie przed etapem selekcji łańcuch VH albo łańcuch VL wybiera się do wiązania antygenu wraz z zastępczym łańcuchem V.

Tę dwuetapową procedurę można realizować z użyciem specyficznego przeciwciała matrycowego dla docelowego antygenu z innego gatunku, np. mysiego monoklonalnego przeciwciała przeciw docelowemu ludzkiemu antygenowi. Najpierw ludzki repertuar VL lub VH łączy się z pojedynczym zastępczym łańcuchem VH lub VL z mysiego przeciwciała eksponowanego np. na nitkowatych fagach, wybranego in vitro pod względem wiązania antygenu. Tak więc całkowita wielkość biblioteki jest dostępna wyłącznie dla repertuaru ludzkiego VL lub VH i mogą być wyizolowane kandydaci, ludzkie łańcuchy VL lub VH, zdolne do uczestniczenia w specyficznym wiązaniu ludzkiego docelowego antygenu. W drugim etapie zastępczy region zmienny matrycowego przeciwciała zastępuje się odpowiadającym repertuarem ludzkiego regionu zmiennego, a następnie przeprowadza się drugą rundę selekcji in vitro; ponownie, całkowita wielkość biblioteki jest wyłącznie dostępna dla pojedynczego reperPL 193 780 B1 tuaru regionu VH lub VL, co pozwala na przebadanie znacznie większej liczby potencjalnych regionów VH i VL pod względem wiązania antygenu w warunkach ograniczonej wielkości biblioteki na drodze procedury dwuetapowej, niż na drodze procedury jednoetapowej.

Do klonowania sekwencji DNA kodujących regiony zmienne ludzkich przeciwciał, które wiążą się specyficznie z ludzkim antygenem 17-1A, zastosowano z powodzeniem tę dwuetapową procedurę selekcji do przeszukiwania kombinatoryjnych bibliotek ludzkiego IgD metodą prezentacji fagowej. Najpierw segment Fd ciężkiego łańcucha (VH+CH1) mysiego monoklonalnego przeciwciała M79 (Gottlinger, Int. J. Cancer 38 (1986); 47-53), które specyficznie wiąże się do ludzkiego antygenu 17-1A, połączono odpowiednio z ludzkim repertuarem lekkiego łańcucha κ i λ.

Powstałe biblioteki eksponowano na nitkowatych fagach i wybrano in vitro na drodze kilku rund selekcji na immobilizowanym zrekombinowanym ludzkim antygenie 17-1A. Rozpuszczalne fragmenty Fab, eksprymowane z kilku klonów po każdej rundzie selekcji, przeszukiwano metodą ELISA pod względem wiązania antygenu. Stwierdzono, że każda z silnie wiążących jednostek wzbogaconych w czasie procesu selekcji zawiera taki sam ludzki lekki łańcuch κ, co potwierdzono metodą analizy sekwencji. Ten ludzki lekki łańcuch, poniżej zwany K8, następnie połączono z ludzką biblioteką ciężkiego łańcucha IgD, która była znowu eksponowana na nitkowatym fagu i selekcjonowana in vitro na drodze kilku rund selekcji na unieruchomionym antygenie ludzkim 17-1A. Kilka fragmentów Fab, eksprymowanych z kilku klonów po każdej rundzie selekcji, ponownie badano metodą ELISA pod względem wiązania antygenu.

Analiza sekwencji jednostek wiążących wzbogaconych w czasie procedury selekcji ujawniła dwa różne regiony ciężkiego łańcucha, nazwane D4.5 i D7.2, z których każdy łączy się z łańcuchem lekkim K8, i tworzy różne ludzkie miejsca wiążące antygen ze specyficznością w stosunku do ludzkiego antygenu 17-1A. Ludzkie repertuary lekkiego i ciężkiego łańcucha sklonowano z kilku preparatów całkowitego RNA wyizolowanego z próbek ludzkiej krwi i szpiku kostnego kilku dawców, z zastosowaniem RT-PCR specyficznej w stosunku do lekkiego łańcucha κ lub λ, jak i specyficznego w stosunku do ciężkiego łańcucha IgD.

Jako że jest niemożliwa selektywna amplifikacja repertuaru łańcucha lekkiego, który jest połączony in vivo z ciężkimi łańcuchami IgD, o ile IgD-dodatnie komórki B nie zostaną oczyszczone do preparatyki RNA, stosowane biblioteki łańcucha lekkiego nie są ograniczone do repertuaru przeciwciał dojrzałych niestymulowanych lub anergicznych limfocytów B. Jednak ze względu na przewagę łańcucha ciężkiego w rozpoznawaniu antygenu, nie podważa to w sposób zasadniczy zalet repertuaru IgD w selekcji ludzkich przeciwciał na auto-antygeny. Ponadto, co najważniejsze, ze względu na ekspozycję na ludzki układ odpornościowy, selekcja takich lekkich łańcuchów nadal gwarantuje niski profil immunogenny u ludzi.

Selekcji odpowiedniej kombinacji dokonuje się drogą a) testowania łańcucha VH w kombinacji z różnymi łańcuchami VL, względnie b) testowania łańcucha VL w kombinacji z różnymi łańcuchami VH, pod względem wiązania z ludzkim antygenem; gdy wiadomo, że VL albo VH specyficznie oddziałuje z ludzkimi cząsteczkami docelowymi. Wówczas odpowiedni drugi łańcuch można korzystnie wybrać na podstawie polepszonego wiązania do cząsteczki docelowej.

Po selekcji można prowadzić etapy otrzymywania ludzkich łańcuchów VH i VL lub odpowiednich kwasów nukleinowych oraz przyłączania tych łańcuchów do tych samych lub innych łańcuchów VH lub VL, do stałych regionów ciężkich łańcuchów (CH) lub lekkich łańcuchów (CL) immunoglobulin lub ich części, albo do innych biologicznie czynnych cząsteczek, takich jak peptydy, białka, kwasy nukleinowe, małe cząsteczki związków organicznych, hormony, neurotransmitery, peptydomimetyki, PNA (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs i Oliff, Cell 79 (1994), 193-198). Inną funkcjonalną cząsteczkę można związać albo fizycznie, np. drogą chemiczną, z łańcuchami VH i VL, albo połączyć drogą dobrze znanych metod rekombinacji DNA.

Takie postępowanie jest szczególnie odpowiednie przy opracowywaniu specyficznych leków, które mogą być stosowane do adresowania pożądanych antygenów w organizmie ludzkim. Na przykład gdy adresowane są antygeny nowotworów, łańcuchy VH i VL mogą być, na poziomie kwasów nukleinowych lub aminokwasów, przyłączone do ugrupowania toksyny z wytworzeniem immunotoksyny, do zewnętrznej części receptora komórkowego lub rozpuszczalnej cytokiny lub odpowiednio do ich części z wytworzeniem konstruktów wzmagających przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną, albo też do fragmentu Fv przeciwciała z wytworzeniem bispecyficznej pochodnej przeciwciała.

PL 193 780 B1

Ludzkie łańcuchy o stałych regionach IgG1 lub IgG3 korzystnie stosuje się gdy komórki eksprymujące docelowy antygen powinny być niszczone w organizmie ludzkim. Dobrze wiadomo, że te podklasy IgG skutecznie pośredniczą w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) i przyczyniają się do zniszczenia komórek rozpoznawanych i wiązanych przez te podklasy przeciwciał.

Łańcuchy VH i/lub VL mogą być połączone z niebiałkowymi farmaceutykami, korzystnie o niskiej masie cząsteczkowej, takimi jak radioizotopy lub substancje stosowane w chemioterapii, co umożliwia bardziej specyficzne adresowanie tych farmaceutyków in vivo.

Łańcuchy VH lub VL mogą być eksprymowane z sekwencji kwasów nukleinowych, które są wynikiem amplifikacji RT-PCR mRNA pochodzącego z zasadniczo niestymulowanych dojrzałych ludzkich limfocytów B lub z zasadniczo anergicznych ludzkich komórek B.

Korzystnie amplifikację łańcuchów VH lub VL prowadzi się drogą RT-PCR, po zidentyfikowaniu i wyizolowaniu odpowiedniego ich ź ródła. Korzystnie w amplifikacji i łańcuchów VH lub VL drogą RT-PCR stosuje się mRNA z zawierających jądra komórek z ludzkiego szpiku kostnego lub, korzystniej, z ludzkiej krwi, gdyż te dwa przedziały tkankowe są najłatwiej dostępnymi źródłami komórek B u ludzi.

Ponadto korzystnie wydziela się anergiczne komórki B lub, korzystniej, dojrzałe niestymulowane limfocyty B z zawierających jądra komórek tych przedziałów tkankowych, z użyciem np. perełek magnetycznych albo sortowania komórek metodą cytometrii przepływowej, przed preparatyką RNA. Ta procedura gwarantuje, że oba łańcuchy VH i VL amplifikowane droga RT-PCR pochodzą od preferowanej populacji komórek B.

Alternatywnie, gdy mRNA całej frakcji komórek zawierających jądra z tych przedziałów tkankowych stosuje się do amplifikacji łańcuchów VH lub VL drogą RT-PCR, to korzystnie amplifikuje się region VH jako połowę segmentu Fd (VH-CH1) łańcucha ciężkiego ludzkiego IgD, z użyciem IgD-specyficznego 3' startera PCR, np. wymienionego w tabeli 1, który wyłącznie zapewnia jedynie produkty PCR z ludzkiego ciężkiego łańcucha IgD, eksprymowanego tylko w dojrzałych niestymulowanych ludzkich limfocytach B i anergicznych ludzkich komórkach B.

Sposobem według wynalazku wytwarza się korzystnie receptor przeciw ludzkiemu antygenowi, który ma niską immunogenność u ludzi lub nie jest immunogenny, i zawiera kombinację funkcjonalnie przegrupowanych łańcuchów VH i VL, korzystnie z zasadniczo niestymulowanych dojrzałych limfocytów B lub z zasadniczo anergicznych ludzkich komórek B.

Zalety przeciwciała według wynalazku zostały wymienione powyżej. Należy podkreślić, że odpowiednie przeciwciała skierowane przeciwko ludzkim antygenom i pochodzące z ludzkich źródeł, które to przeciwciała mają niską immunogenność lub nie są immunogenne u ludzi, nie zostały dotychczas wyizolowane. Zatem przeciwciała według wynalazku są punktem wyjścia dla całego nowego opracowania przeciwciał, które mogą być przydatne w różnych działach medycyny lub farmacji.

Receptor może stanowić przeciwciało lub jego fragment.

Korzystnie receptor jest specyficzny dla ludzkiego antygenu nowotworu, a najkorzystniej ludzkiego antygenu 17-1A.

W szczególności receptor zawiera korzystne łańcuchy VH i/lub VL opisane powyżej.

Korzystnie część łańcucha VH stanowi domena CDR3.

W sposobie według wynalazku można stosować zestaw zawierający kombinację funkcjonalnie przegrupowanych łańcuchów immunoglobulinowych VH i VL, w której to kombinacji co najmniej jeden z ł a ń cuchów VH i VL pochodzi z zasadniczo niestymulowanych dojrzał ych ludzkich limfocytów B lub z zasadniczo anergicznych ludzkich komórek B, przy czym te ł a ń cuchy mogą być eksprymowane ze zrekombinowanych wektorów układu prezentacji in vitro. Zastosowanie tego zestawu umożliwia wytworzenie receptorów o pożądanej specyficzności.

Korzystnie w tym zestawie układ prezentacji in vitro stanowi układ prezentacji fagowej.

Zgodnie ze sposobem wynalazku, po raz pierwszy opracowano przeciwciało ludzkie specyficzne dla ludzkiego antygenu 17-1A. Jak uprzednio wykazano, to opracowanie nie było zadaniem szablonowym, gdyż ludzkie przeciwciała przeciwko ludzkim antygenom związanym z nowotworami, ulegają zazwyczaj mechanizmom warunkującym autotolerancję układu odpornościowego, co powoduje eliminację limfocytów B eksprymujących autoreaktywne przeciwciała in vivo.

Wśród znanych związanych z nowotworami antygenów 17-1A jest znacznie bardziej powszechnie eksprymowany w szerokim zakresie normalnych tkanek nabłonkowych niż inne antygeny nowotworów, oprócz jego ekspresji na nowotworach nabłonkowych. Tak więc antygen 17-1A jest obecnie

PL 193 780 B1 uważany za reprezentujący raczej antygen ogólnonabłonkowy niż za antygen nowotworowy, za który go uważano w czasie, gdy został po raz pierwszy opisany.

Dla porównana, inne tak zwane antygeny nowotworów, spotykane na nowotworach nabłonkowych, takie jak erb-B2 (Her 2/neu), Muc-1 (PEM) lub antygen Thompsona-Friedreicha, zazwyczaj wykazują znacznie bardziej ograniczony wzór ekspresji na normalnych tkankach nabłonkowych. Tak więc oczekuje się, że siła selekcyjna autotolerancji przeciwko limfocytom B eksprymującym przeciwciała reagujące z 17-1A, nawet z niskim powinowactwem, będzie wyjątkowo wysoka, ponieważ wydaje się nieomal niemożliwe, aby takie komórki B uniknęły spotkań z antygenem 17-1A przez dłuższe okresy czasu, wskutek powszechności występowania tego antygenu. Tak więc nieoczekiwanie stwierdzono, zgodnie z tym wynalazkiem, że przeciwciała specyficzne w stosunku do 17-1A albo co najmniej odpowiednie łańcuchy ciężkie można wyizolować z repertuaru przeciwciał ludzkich komórek B, takich jak np. dojrzałe niestymulowane limfocyty B.

Wiadomo, że te komórki B mają długi okres półtrwania in vivo i już udało im się uniknąć usunięcia przed swym dojrzeniem, mimo obecności antygenu 17-1A w samym miejscu dojrzewania; anergia komórek B nie występuje w przypadku antygenu 17-1A, gdyż ten typ tolerancji komórek B jest tylko indukowany przez rozpuszczalny autoantygen. Tylko długożyjące komórki B, którym udało się przeżyć mimo ich potencjalnej reaktywności z 17-1A, reprezentują repertuar regionu zmiennego ludzkiej immunoglobuliny, który ma szansę być dobrze tolerowany przez ludzki układ odpornościowy, gdy jest stosowany dla konstrukcji ludzkich przeciwciał i pochodnych przeciwciał, przeznaczonych do wielokrotnego podawania ogólnoukładowego ludziom, ponieważ już został przeszukany pod względem sekwencji immunogennych i następnie wyeliminowany przez nadzór układu odpornościowego.

Tak więc wynalazek dotyczy także ludzkich przeciwciał specyficznych dla antygenu 17-1A i odpowiednich dla powtarzalnego stosowania in vivo, niezależnie od sposobu, jakim zostały otrzymane, gdyż oczekuje się, że sekwencje ludzkich przeciwciał o wysokiej zgodności in vivo będą znajdować się również w repertuarze komórek B zdrowych ludzi, np. dzięki sposobowi według wynalazku. Zatem po raz pierwszy obecnie opracowano ludzkie przeciwciało, które można z powodzeniem stosować w monitorowaniu i/lub niszczeniu komórek nowotworowych niosących antygen 17-1A.

Tak więc przeciwciało według wynalazku jest korzystnie nieimmunogenne lub ma niską immunogenność u ludzi. Przeciwciało to można otrzymać w sposób opisany powyżej. W szczególności przeciwciało zawiera korzystne łańcuchy VH i/lub VL opisane powyżej.

Wywnioskowano, że receptor, a korzystnie repertuar przeciwciał wybranych ze względu na niską immunogenność, jest najlepiej reprezentowany w ludzkiej bibliotece IgD-przeciwciało. IgD jest eksprymowany jako błonowy receptor antygenu wraz z powierzchniowym IgM na dojrzałych niestymulowanych limfocytach B, które wnikają do pierwotnych pęcherzyków w czasie swoich ruchów do wtórnych narządów limfatycznych i między wtórnymi narządami limfatycznymi, o ile nie spotkają multiwalentnego autoangenu powodującego klonalną delecję, albo rozpuszczalnego monowalentnego autoantygen powodującego, że stają się anergiczne i żyją krótko ze względu na wykluczenie z pierwotnych pęcherzyków.

Poza dojrzałymi niestymulowanymi limfocytami B, ludzkie biblioteki IgD tylko reprezentują repertuar przeciwciał krótkożyjących komórek B, które stały się anergiczne w wyniku kontaktu z rozpuszczalnym monowalentnym autoantygenem, ale jest mało prawdopodobne, by wniosły specyficzne jednostki wiążące do powierzchni komórki ludzkiej przypominające multiwalentne autoantygeny, które indukują klonalną delecję zamiast anergii komórek B.

Receptory lub ich części można stosować do wytwarzania środków farmaceutycznych, ewentualnie zawierających także farmaceutycznie dopuszczalny nośnik lub zaróbkę. Przykłady odpowiednich farmaceutycznych nośników są dobrze znane i obejmują roztwory soli buforowane fosforanami, wodę, emulsje, takie jak emulsje olej/woda, różne typy środków zwilżających, roztwory sterylne itp. Środki zawierające takie nośniki można formułować dobrze znanymi sposobami. Takie środki farmaceutyczne można podawać pacjentowi w odpowiedniej dawce. Odpowiedni środek można podawać różnymi sposobami, np. dożylnie, śródotrzewnowo, podskórnie, domięśniowo, miejscowo lub śródskórnie.

Takie środki farmaceutyczne można stosować do leczenia, profilaktyki i/lub opóźnienia wzrostu nowotworu u pacjenta, korzystnie w przypadku gdy nowotwór jest pochodzenia nabłonkowego.

Poniżej opisano figury rysunku dla dokładniejszego przedstawienia wynalazku.

PL 193 780 B1

Figura 1. Miejsce klonowania pComb3H z ważnymi miejscami restrykcyjnymi. Zastosowano następujące skróty: P, promotor; VL, domena zmienna łańcucha lekkiego; CL, domena stała łańcucha lekkiego; VH, domena zmienna łańcucha ciężkiego; CH1, domena stała łańcucha ciężkiego 1; L1/2 prokariotyczne sekwencje liderowe. Domena określana jako gen III w pComb3H koduje niezakaźną część produktu genu III nitkowatych fagów, takich jak np. VCSM13.

Figura 2. Schemat plazmidu pComb3H i w pełni eksprymowanego faga M13. Na pComb3H przedstawiono organizację lidera (L) ompA, łańcucha lekkiego, lidera (L) pelB, ciężkiego łańcucha i genu III. W peł ni eksprymowany fag M13 eksponuje na swojej powierzchni fenotyp pewnego fragmentu Fab przeciwciała złożonego z łańcucha lekkiego i segmentu Fd (VH+CH1) łańcucha ciężkiego połączonego z niezakaźną częścią produktu genu III i zawiera odpowiedni genotyp jako jednoniciowy DNA kodujący ciężki i lekki łańcuch eksponowanego fragmentu Fab. Zakaźne białko genu III jest dostarczane przez faga pomocniczego VCSM13.

Figura 3. ELISA rozpuszczalnych fragmentów Fab. Preparaty peryplazmy rozpuszczalnych fragmentów Fab, z których każdy zawiera segment Fd chimeryzowanego M79 i pojedynczy łańcuch ludzki κ na klon. Płytki ELISA inkubowano przez noc z rozpuszczalnym antygenem 17-1A. Wykrywanie związanych fragmentów Fab-przeciwciało przeprowadzono z użyciem skoniugowanego z peroksydazą przeciwciała poliklonalnego anty-ludzka immunoglobulina. Płytki ELISA ostatecznie wywołano przez dodanie roztworu ABTS-substrat (ABTS = kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenztiazolino-6-sulfonowy), a obrót substratu mierzono przy długości fali 405 nm (oś y). Klony przedstawiono na osi x, przy czym pierwsza liczba wskazuje rundę selekcji, a druga jest numerem klonu. Klony 1.5-9 mają kombinację chimerycznego segmentu M79 Fd z jednym losowym łańcuchem κ i stanowią negatywne kontrole.

Figura 4. ELISA rozpuszczalnych fragmentów Fab. Preparaty peryplazmy rozpuszczalnych fragmentów Fab, z których każdy zawiera łańcuch lekki k8 i pojedynczy segment Fd ludzkiej Ig δ. Płytki ELISA inkubowano przez noc z rozpuszczalnym antygenem 17-1A. Wykrywanie związanych fragmentów Fab-przeciwciało przeprowadzono z użyciem biotynylowanego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzki łańcuch lekki κ, a następnie streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą. Płytki ELISA ostatecznie wywołano przez dodanie roztworu ABTS-substrat (ABTS = kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenztiazolino-6-sulfonowy)), a obrót substratu mierzono przy długości fali 405 nm (oś y). Klony przedstawiono na osi x, przy czym pierwsza liczba wskazuje rundę selekcji, a druga jest numerem klonu. Klony 1.2-6 mają kombinację łańcucha lekkiego k8 z jednym losowym fragmentem Fd łańcucha ciężkiego Ig δ i stanowią negatywne kontrole.

Figura 5. ELISA rozpuszczalnych fragmentów Fab. Preparaty peryplazy rozpuszczalnych fragmentów Fab, z których każdy zawiera segment D4.5 Fd i pojedynczy łańcuch ludzki κ na klon. Płytki ELISA inkubowano przez noc z rozpuszczalnym antygenem 17-1A. Wykrywanie związanych fragmentów Fab-przeciwciało przeprowadzono z użyciem biotynylowanego poliklonalnego przeciwciała antyludzki łańcuch lekki κ, a następnie streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą. Płytki ELISA ostatecznie wywołano przez dodanie roztworu ABTS-substrat (ABTS = kwas 2,2'-azyno-bis(3-etylobenztiazolino-6-sulfonowy)), a obrót substratu mierzono przy długości fali 405 nm (oś y). Klony przedstawiono na osi x, przy czym pierwsza liczba wskazuje rundę selekcji, a druga jest numerem klonu; S jest skrótem dla klonów przed pierwszą rundą selekcji. Klony S.1-3 mają kombinację łańcucha lekkiego k8 z jednym losowym segmentem Fd łańcucha ciężkiego Ig δ i stanowią negatywne kontrole.

Figura 6. Sekwencja DNA i regionu białka ludzkiego zmiennego łańcucha lekkiego κ 8. Liczby wskazują pozycje nukleotydów (nt), aminokwasy przedstawiono w kodzie jednoliterowym. CDR1 obejmuje nt 70 do nt 102, CDR2 nt 148 do 168, CDR3 nt 265 do nt 294.

Figura 7. Sekwencja DNA regionu zmiennego D4.5 ludzkiego łańcucha ciężkiego. Liczby wskazują pozycje nukleotydów (nt), aminokwasy przedstawiono w kodzie jednoliterowym. CDR1 obejmuje nt 91 do nt 105, CDR2 nt 148 do nt 198, CDR3 nt 292 do nt 351. Granica między regionem zmiennym łańcucha ciężkiego i domeną CH1 regionu stałego δ Ig znajduje się między nt 382 i nt 383, a sekwencje obszaru stałego 8 zaczynają się w nt 384.

Figura 8. Sekwencja DNA ludzkiego regionu zmiennego D7.2 łańcucha ciężkiego. Liczby wskazują pozycje nukleotydów (nt), aminokwasy są przedstawione w kodzie jednoliterowym. CDR1 obejmuje nt 91 do nt 105, CDR2 nt 148 do 198, CDR3 nt 292 do nt 309. Granica między regionem zmiennym łańcucha ciężkiego i domeną CH1 regionu stałego δ Ig znajduje się między nt 340 i nt 341, a sekwencje obszaru stałego δ zaczynają się w nt 343.

PL 193 780 B1

Figura 9. Sekwencja DNA i białka regionu zmiennego ludzkiego łańcucha lekkiego κ 5.1. Liczby wskazują pozycje nukleotydów (nt), aminokwasy przedstawiono w kodzie jednoliterowym. CDR1 obejmuje nt 70 do nt 102, CDR2 nt 148 do nt 168, CDR3 nt 265 do nt 294.

Figura 10. Analiza metodą cytometrii przepływowej fragmentów Fab przeciwciał i kontrolnego przeciwciała M79 na 17-1A dodatnich komórkach Kato do testowania zdolności wiążącej preparatu peryplazmy zawierającego fragment k8-D4.5-Fab. Komórki Kato inkubowano z: I) niedotyczącym preparatem peryplazmy, II) 10 μg/ml chimerycznego (biwalentnego) M79, III) preparatem peryplazmy k8-D4.5 i LV) rozcieńczeniem 1:10 preparatu peryplazmy K8-D4.5. Względną liczbę komórek podano na osi y, a względne natężenie fluorescencji na osi x.

Figura 11. Analiza metodą cytometrii przepływowej fragmentów Fab przeciwciał i kompletnych przeciwciał na 17-1A dodatnich komórkach Kato, i odpowiednio komórkach CHO transfekowanych i nietransfekowanych 17-1A, do testowania zdolności wiążącej preparatów peryplazmy (pp) zawierających fragment k8-D4.5, k5.1-D.4.5 lub niezwiązany fragment k-D.4.5-Fab. Komórki Kato inkubowano z: I) niedotyczącym pp (linia przerywana) lub k5.1-D4.5-pp (linia ciągła), albo II) 20 μg/ml przeciwciała M79 (linia ciągła) lub odpowiednim kontrolnym izotypem mysim IgG2A (linia przerywana). Komórki CHO transfekowane 17-1A inkubowano z III) niedotyczącym pp (linia przerywana) lub k5.1-D4.5-pp (linia ciągła), IV) niedotyczącym pp (linia przerywana) lub k8-D4.5-pp (linia ciągła), lub V) z 20 μg/ml przeciwciała M79 (linia ciągła) lub odpowiednim kontrolnym izotypem mysim IgG2A (linia przerywana). W III), IV) i V) inkubację i detekcję odpowiednich pp (odpowiednio k5.1-D4.5Fab-pp i k8-D4.5-Fab-pp) i mysiego przeciwciała M79 przeprowadzono także na nietransfekowanych komórkach CHO (linie kropkowane). Względną liczbę komórek podano na osi y, a względne natężenie fluorescencji na osi x.

Figura 12. Miejsce klonowania pEF-ADA z ważnymi miejscami restrykcyjnymi. Stosowano następujące skróty: P, promotor; VL, domena zmienna łańcucha lekkiego; CL, stały lekki łańcuch; Leuc, eukariotyczna sekwencja liderowa.

Figura 13. Miejsce klonowania pEF-DHFR z ważnymi miejscami restrykcyjnymi. Stosowano następujące skróty: P, promotor; VH, domena zmienna łańcucha ciężkiego; CH1/2/3 stała domena łańcucha ciężkiego 1/2/3; Leuc, eukariotyczna sekwencja liderowa.

Figura 14. SDS-PAGE preparatów ludzkiego przeciwciała H79. Około 10 μg każdego przeciwciała poddano elektroforezie na 12,5% denaturującym żelu poliakryloamidowym w warunkach redukujących i nieredukujących i wybarwiono błękitem Coomassie.

Ścieżka 1: marker (m.cz. [kDa] pojedynczych prążków zaznaczone z lewej strony żelu)

Ścieżka 2: ludzkie IgG1 H79 (w warunkach nieredukujących)

Ścieżka 3: ludzkie IgG1 H79 w warunkach redukujących

Ścieżka 4: mysie IgG1 H79 (w warunkach nieredukujących)

Ścieżka 5: mysie IgG1 H79 w warunkach redukujących

Figura 15. SDS-PAGE preparatów ludzkich przeciwciał H79 i HD70. 10 μg H79 i 3,5 μg HD70 poddano elektroforezie na 12,5% denaturującym żelu poliakryloamidowym w warunkach nieredukujących (żel 1) i redukujących (żel 2) i wybarwiono błękitem Coomassie.

Żel 1: Ścieżka 1: marker (m.cz. [kDa] pojedynczych prążków zaznaczone z lewej strony żelu)

Ścieżka 2: ludzkie IgG1 H79 (w warunkach nieredukujących)

Ścieżka 3: ludzkie IgG1 HD70 (w warunkach nieredukujących)

Żel 2: Ścieżka 4: marker (m.cz. [kDa] pojedynczych prążków zaznaczone z lewej strony żelu)

Ścieżka 5: ludzkie IgG1 H79 w warunkach redukujących

Ścieżka 6: ludzkie IgG1 HD70 w warunkach redukujących

Figura 16. Analiza metodą cytometrii przepływowej 17-1A dodatnich komórek Kato dla sprawdzenia aktywności wiążącej oczyszczonego ludzkiego IgG1 H79, jak i oczyszczonego mysiego IgG1 H79. Komórki Kato inkubowano z kontrolnymi izotypami IgG (10 ng/ml odpowiednio ludzkiego IgG1 i mysiego IgG1), pozytywnymi kontrolami (odpowiednio M79 i chimeryzowane M74, każde w stężeniu 10 μg/ml; (oba specyficzne w stosunku do 17-1A) i z ludzkim IgG1 H79 lub mysim IgG1 H79 (10 μg/ml i 1 μg/ml każdy). Względną liczbę komórek podano na osi y, a względne natężenie fluorescencji na osi x.

Figura 17. Analiza metodą cytometrii przepływowej przeciwciał (stężenie 20 μg/ml każdy) na komórkach Kato 17-1A dodatnich, komórkach CHO transfekowanych i nietransfekowanych 17-1A dla sprawdzenia aktywności wiązania oczyszczonych przeciwciał ludzkich IgG1 H79, mysich IgG1 H79, HD70, D7.2, M79, Panorexu i kontrolnych izotypów (ludzka IgG1, mysia IgG1 i 2a). I) ludzkie IgG1 H79 (linia ciągła) i kontrolny ludzki izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach Kato, II) mysie IgG1 H79 (linia ciągła) i kontrolny mysi izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach Kato, III) HD70 (linia ciągła)

PL 193 780 B1 i kontrolny ludzki izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach Kato, IV) D7.2 (linia cią g ł a) i kontrolny ludzki izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach Kato, V) M79 (linia ciągła) i kontrolny mysi izotyp IgG2a (linia przerywana) na komórkach Kato, VI) Panorex (linia ciągła) i kontrolny mysi izotyp IgG2a (linia przerywana) na komórkach Kato; VII) ludzkie IgG1 H79 (linia ciągła) i kontrolny ludzki izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach CHO transfekowanych 17-1A, VIII) mysie IgG1 H79 (linia ciągła) i kontrolny mysi izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach CHO transfekowanych 17-1A, IX) HD70 (linia ciągła) i kontrolny ludzki izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach CHO transfekowanych 17-1A, X) D7.2 (linia ciągła) i kontrolny ludzki izotyp IgG1 (linia przerywana) na komórkach CHO transfekowanych 17-1A, XI) M79 (linia ciągła) i kontrolny mysi izotyp IgG2a (linia przerywana) na komórkach CHO transfekowanych 17-1A, XII) Panorex (linia ciągła) i kontrolny mysi izotyp IgG2a (linia przerywana) na komórkach CHO transfekowanych 17-1A. Figury VII-XII przedstawiają także wyniki inkubacji i detekcji odpowiednich przeciwciał na nietransfekowanych komórkach CHO (linia kropkowana).

Figura 18. Próba cytotoksyczności komórkowej opartej na przeciwciele ⁵¹cr. Dla uwolnienia ⁵¹Cr nie stymulowane jednojądrzaste komórki ludzkiej krwi obwodowej (PBMC, 5 x 10⁵ komórek) jako komórki efektorowe inkubowano ze znakowanymi komórkami docelowymi (komórki Kato znakowane przez 2 godziny 51-Cr) i przeciwciałami w różnych stężeniach przez 4 lub 20 godziny w 37°C. Odpowiednie niewiążące izotypy (h-IgG = ludzka IgG1; mIgG2a = mysia IgG2a) stosowano jako negatywne kontrole (H79 = H79huIgG1). Lizę właściwą obliczano jako (cpm, eksperymentalne uwolnienie) - (cpm, uwolnienie samorzutne) / (cpm, maksymalne uwolnienie) - (cpm, uwolnienie samorzutne), gdzie cpm oznacza liczbę impulsów na minutę.

Figura 19. Zdjęcie mikroskopowe komórek zdrowej ludzkiej tkanki okrężnicy, barwionej M79, (pozytywna) kontrola. 5 nm krioskrawki normalnej tkanki błony śluzowej inkubowano z mysim przeciwciałem M79 (IgG2a) jako pozytywną kontrolą (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała antymysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 20. Zdjęcie mikroskopowe zdrowych komórek ludzkiej tkanki okrężnicy barwionej mysim IgG1 H79. 5 nm krioskrawki normalnej tkanki błony śluzowej inkubowano z mysią wersją IgG przeciwciała H79 (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał IgG1 przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała antymysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 21. Zdjęcie mikroskopowe tkanki raka okrężnicy barwionego M79 (pozytywna kontrola). 5 nm krioskrawki tkanki raka okrężnicy inkubowano z mysim przeciwciałem M79 (IgG2a) jako pozytywną kontrolą (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała anty-mysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 22. Zdjęcie mikroskopowe tkanki raka okrężnicy, barwionego mysim IgG1 H79. 5 nm krioskrawki tkanki raka okrężnicy inkubowano z mysią wersją przeciwciała IgG H79 (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał IgG1 przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała antymysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 23. Zdjęcie mikroskopowe zdrowej ludzkiej tkanki okrężnicy, barwionej kontrolnym mysim izotypem IgG2a. 5 nm krioskrawki normalnej tkanki błony śluzowej inkubowano z niedotyczącym mysim przeciwciałem IgG2a jako negatywną kontrolą (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała anty-mysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 24. Zdjęcie mikroskopowe tkanki ludzkiego raka okrężnicy, barwionej kontrolym izotypem IgGl. 5 nm krioskrawki normalnej tkanki błony śluzowej inkubowano z niedotyczącym mysim przeciwciałem IgG1 jako negatywną kontrolą (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała anty-mysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciw-barwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

PL 193 780 B1

Figura 25. Zdjęcie mikroskopowe tkanki ludzkiego raka okrężnicy, barwionego kontrolnym mysim izotypem IgG2a. 5 nm krioskrawki normalnej tkanki błony śluzowej inkubowano z niedotyczącym mysim przeciwciałem IgG2a jako negatywną kontrolą (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała anty-mysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 26. Zdjęcie mikroskopowe tkanki ludzkiego raka okrężnicy, barwionej kontrolnym mysim izotypem IgGl. 5 nm krioskrawki normalnej tkanki błony śluzowej inkubowano z niedotyczącym mysim przeciwciałem IgG1 jako negatywną kontrolą (10 μg/ml). Detekcję związanych mysich przeciwciał przeprowadzono z użyciem poliklonalnego przeciwciała anty-mysiego Ig sprzęgniętego z peroksydazą i wybarwiono karbazolem (brązowy). Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu (niebieski).

Figura 27. Analiza epitopu mysiego przeciwciała M79 i ludzkich przeciwciał H79 i HD70, z których każde jest specyficzne dla ludzkiego antygenu 17-1A. Przeciwciała inkubowano z rozmieszczonym w sposób uporządkowany zestawem peptydów zawierającym 119 polipeptydów po 13 aminokwasów, przesuniętych co dwa aminokwasy i pokrywających całą zewnątrzkomórkową sekwencję antygenu ludzkiego 17-1A. Peptydy łączono kowalencyjnie przez ich C-końce do Pep Spots Membrane (Jerini Biotools, Berlin) jako indywidualne plamy. Związane mysie przeciwciało M79 wykrywano bezpośrednio na Pep Spots Membrane przez przeciwciało anty-mysia immunoglobulina połączone z peroksydazą chrzanową, a następnie przez chemoluminescencję.

Sygnały, które są wynikiem reaktywności samego drugorzędowego przeciwciała z pojedynczymi plamami peptydów, wykazano w odpowiednim kontrolnym barwieniu Pep Spots Membrane. Po odjęciu głównego wybarwienia tła w plamie peptydu 87, plam peptydów 38 i 95 stwierdzono, że reprezentują specyficzne wiązanie mysiego przeciwciała M79. Ze względu na wyższy stopień reaktywności krzyżowej drugorzędowego ludzkiego przeciwciała immunoglobulinowego sprzęgniętego z HRP z kilkoma plamami peptydów, związane ludzkie odpowiednie przeciwciała HD79 i HD70 przeniesiono z Pep Spots Membrane do błony do blotowania, metodą elektrotransferu, a następnie wykryto z zastosowaniem tego drugorzędowego przeciwciała ludzkiego i chemoluminescencji. Specyficzne wiązanie ludzkiego przeciwciała można było wykryć przede wszystkim dla plam peptydów 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 i 79; jednak w przypadku ludzkiego przeciwciała HD70 nie wykryto wiązania.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady.

P r z y k ł a d 1. Konstrukcja kombinatoryjnych bibliotek przeciwciał i prezentacja fagowa

Bibliotekę ludzkiego lekkiego łańcucha immunoglobuliny (Ig) i fragmentów łańcucha ciężkiego Fd-DNA skonstruowano metodą RT-PCR z użyciem zestawów starterów specyficznych w stosunku do κ, λ, i Fd δ na całkowitym RNA wydzielonym z limfocytów krwi obwodowej (PBL) i próbek szpiku kostnego odpowiednio czterech i dziesięciu ludzkich dawców, według Chomczynski, Analytical Biochemistry 162 (1987) 156-159. cDNA zsyntetyzowano standardowymi metodami (Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, wydanie drugie).

Wybrano następujące zestawy starterów tworzące miejsca restrykcyjne 5'-XhoI i 3'-Spel dla fragmentów łańcucha ciężkiego i 5'-Sad i 3'-Xbal dla łańcuchów lekkich.

Do amplifikacji PCR fragmentów δ Fd cDNA każdy z pięciu różnych 5'starterów specyficznych dla rodziny VH połączono z jednym starterem 3'CH1 δ; do amplifikacji PCR fragmentów lekkiego łańcucha κ (K) każdy z pięciu różnych 5'starterów specyficznych dla rodziny VK połączono z jednym starterem 3'CK; a do amplifikacji PCR fragmentów lekkiego łańcucha λ, osiem różnych 5'starterów specyficznych dla rodziny VL połączono z jednym starterem 3'CL.

Zestawy starterów do amplifikacji fragmentów DNA Fab (5' do 3') przedstawiono w tabeli 1 poniżej.

Do amplifikacji zastosowano następujący program PCR.

Denaturacja w 94°C przez 15 s, hybrydyzacja startera w 52°C przez 50 s i wydłużanie startera w 72°C przez 90 s przez 40 cykli, a następnie 10 minut ostatecznego przedłużania w 72°C.

PL 193 780 B1

T a b e l a 1. Zestawy starterów fragment Fd łańcucha ciężkiego starter 5'

VH1,3,6,7: AGGTGCAGCTGCTCGAGTCTGG

VH2: CAG(AG)TCACCTTGCTCGAGTCTGG

VH4: CAGGTGCAGCTGCTCGAGTCGGG

VH4B: CAGGTGCAGCTACTCGAGTGGGG

VH6: CAGGTACAGCTGCTCGAGTCAGG starter 3'

CD1: TGCCTTACTAGTCTCTGGCCAGCGGAAGAT fragment łańcucha κ:

starter 5'

VK1: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCCAGATGACĆCAGTCTCC

VK3: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTG(AT)TGAC(AG)CAGTCTCC

VK2/4: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGATGAC(CT)CAGTCTCC

VK5: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCACACTCACGCAGTCTCC

VK6: GAGCCGCACGAGCCCGAGCTCGTGCTGACTCAGTGTCC starter 3'

CK1D:

GCGCCGTCTAGAATTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGA

CGGGCGAACTCAG fragment łańcucha λ:

starter 5'

VL1: AATTTTGAGCTCACTCAGCCCCAC

VL2: TCTGCCGAGCTCCAGCCTGCCTCCGTG

VL3: TCTGTGGAGCTCCAGCCGCCCTCAGTG

VL4: TCTGAAGAGCTCCAGGACCCTGTTGTGTCTGTG

VL5: CAGTCTGAGCTCACGCAGCCGCCC

VL6: CAGACTGAGCTCACTCAGGAGCCC

VL7: CAGGTTGAGCTCACTCAACCGCCC

VL8: CAGGCTGAGCTCACTCAGCCGTCTTCC starter 3'

CL2: CGCCGTCTAGAATTATGAACATTCTGTAGG

PL 193 780 B1

450 ng fragmentów lekkiego łańcucha κ (trawionych SacI i Xbal) zligowano z 1400 ng fagmidu pComb3H (trawionego SacI i Xbal; duży fragment DNA) pochodzącego z pComb3 (Barbas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7978-7982), w którym pozycja ciężkiego łańcucha była już zajęta przez fragment Fd chimeryzowanego mysiego przeciwciała M79 (zawierającego ludzki IgG1 CH1) skierowanego przeciwko zewnątrzkomórkowej części białka 17-1A (patrz miejsce klonowania pCombSH na fig. 1).

Otrzymaną kombinatoryjną biblioteką przeciwciał następnie transformowano z użyciem 300 μΐ elektrokompetentnych Escherichia coli XL1 Blue metodą elektroporacji (2,5 kV, kuweta ze szczeliną 0,2 cm, 25 FD, 200 Ω, Gene-Pulser Biorad) i otrzymano bibliotekę o wielkości 4 x 10⁷ niezależnych klonów. Po jednej godzinie ekspresji fenotypowej, dodatnie transformanty wyselekcjonowano pod względem oporności na karbenicylinę, kodowanej przez wektor pComb. Po tej selekcji klony zakażano zakaźną dawką 1 x 10¹² cząsteczek fagowych faga pomocniczego VCSM13, w wyniku czego otrzymano i wydzielono nitkowate fagi M13, z których każdy zawierał jednoniciowy DNA pComb3H kodujący pojedynczy lekki łańcuch ludzki i segment Fd chimerycznego M79 i eksponował odpowiedni fragment Fab na powierzchni faga jako fuzję translacyjną z niezakaźną częścią białka okrywy faga III (prezentacja fagowa), patrz fig. 2.

Bibliotekę fagowa niosącą sklonowany repertuar Fab zebrano z supernatantu hodowli przez strącanie PEG8000/NaCl i wirowanie, rozpuszczono w TBS/1%BSA i inkubowano ze zrekombinowanym s17-1A unieruchomionym na 96-studzienkowych płytkach ELISA. s17-1A przygotowano w opisany sposób (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92 (1995) 7021-7025). Fagi Fab, które nie wiązały się specyficznie z docelowym antygenem, wyeliminowano przez prowadzenie do 10 etapów przemywania TBS/0,5% Tween. Składniki wiążące wyeluowano z użyciem glicyny-HCl o pH 2,2 i po zobojętnieniu eluatu 2 M Tris pH 12 zastosowano do zakażenia nowej niezakażonej hodowli E. coli XL1 Blue. Komórki, które były z powodzeniem transdukowane kopią fagmidu pComb, kodujące fragment Fab wiążący antygen, ponownie wyselekcjonowano pod względem oporności na karbenicylinę, a następnie zakażono fagiem pomocniczym VCSM13, aby rozpocząć drugą rundę prezentacji przeciwciał i selekcji in vitro.

Po pięciu rundach wytwarzania i selekcji fagów Fab wiążących antygen otrzymano DNA plazmidów zawierający wybrany repertuar Fab.

W celu wytwarzania rozpuszczalnych białek Fab fragment DNA genu III wycięto z plazmidów, niszcząc translacyjną fuzję segmentu Fd ciężkiego łańcucha z białkiem genu III. Po religacji otrzymaną pulą plazmidowego DNA transformowano z użyciem 100 μl komórek E. coli XL1 Blue ukompetentnionych wskutek szoku cieplnego i wysiano na agarze LB-karbenicylina (Carb). Pojedyncze kolonie hodowano w 10 ml LB-karbenicylina/20 mM MgCl2 i zainicjowano ekspresję Fab po sześciu godzinach przez dodanie izopropylo-e-D-tiogalaktozydu (IPTG) do uzyskania końcowego stężenia 1 mM. Taką selekcję in vitro, jak i ekspresję rozpuszczalnych fragmentów Fab, przeprowadzono według Burtona, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 10134-10137. Komórki zebrano po 20 godzinach; preparowanie peryplazmy przeprowadzono na drodze czterech rund zamrażania (etanol/suchy lód) i rozmrażania (37°C) i zbadano metodą ELISA obecność fragmentów Fab wiążących się do S17-1A. 23 z 27 klonów wykazywało aktywność wiązania. Po sekwencjonowaniu okazało się, że dwa klony z najsilniejszymi sygnałami (patrz fig. 3) mają identyczne łańcuchy κ i oznaczono je jako k8; patrz fig. 6.

Ten ludzki lekki łańcuch κ k8 zastosowano następnie jako partnera do wiązania puli ludzkiego ciężkiego łańcucha Ig δ; 2250 ng fragmentów Fd ludzkiego łańcucha ciężkiego δ (trawionego Xhol i Spel) zligowano z 7000 ng wektora fagmidowego pComb3H (trawionego XhoI i Spel; duży fragment DNA) zawierającego fragment DNA k8 w pozycji lekkiego łańcucha.

Wybór ludzkiego repertuaru łańcucha δ jako źródła regionów zmiennych łańcucha ciężkiego, które specyficznie wiążą się do antygenu 17-1A gdy są połączone z łańcuchem lekkim k8, okazał się najbardziej odpowiedni. Łańcuchy δ są wytwarzane tylko w dojrzałych niestymulowanych komórkach B i w anergicznych komórkach B specyficznych dla autoantygenow, które jeszcze nie uległy proliferacji lub jej nie przejdą; tak więc różnorodność repertuaru ich ciężkiego łańcucha jest wyższa, a liczba każdej pojedynczej specyficzności w nich jest niższa w porównaniu z repertuarami łańcucha ciężkiego innych izotypów immunoglobulin.

Transformacja biblioteki pComb-k8-fragmentów Fd δ do łącznie 1500 μl E. coli XL1 Blue drogą pięciu jednakowych elektroporacji (2,5 kV, kuweta ze szczeliną 0,2 cm, 25 FD, 200 Ω) dała końcową liczbę 1,1 x 10⁹ niezależnych klonów.

PL 193 780 B1

Selekcję in vitro tej kombinatoryjnej biblioteki przeciwciał przeprowadzono w sposób opisany powyżej dla repertuaru ludzkiego łańcucha lekkiego. Po czterech rundach selekcji z ośmiu klonów otrzymano rozpuszczalne fragmenty Fab.

Preparaty peryplazmy testowano metodą ELISA. Jeden z klonów wykazał silne wiązanie antygenu (patrz fig. 4). Klon ten określono jako D4.5, a DNA fragmentu Fd δ zsekwencjonowano z użyciem odwrotnego startera specyficznego w stosunku do δ CH1 (patrz fig. 7).

Inny fragment Fab wiążący s17-1A wyizolowany po dalszych rundach selekcji pojawił się po raz pierwszy w rundzie siódmej ze znacząco słabszym sygnałem ELISA w porównaniu z D4.5 (patrz fig. 4). Ten klon określono jako D1.2, a jego sekwencję DNA określono stosując również starter specyficzny do 5 (patrz fig. 8).

Aby zidentyfikować kolejnych partnerów, lekkie łańcuchy, które łączą się z segmentem Fd łańcucha ciężkiego δ D4.5 przeprowadzono doświadczenie z przetasowaniem:

450 ng ludzkich fragmentów łańcucha lekkiego κ i 450 ng fragmentów ludzkiego łańcucha lekkiego λ, (oba trawione SacI i XbaI) każdy zligowano z 1400 ng fagmidu pComb3H (strawionego SacI i XbaI; duży fragment DNA), w którym pozycja łańcucha ciężkiego była już zajęta przez fragment D4.5 Fd. Powstałe biblioteki kombinatoryjne przeciwciał (κ i λ) następnie oddzielnie wtransformowano do 300 μΐ elektrokompetentnych Escherichia coli XL1 Blue metodą elektroporacji (2,5 kV, kuweta ze szczeliną 0,2 cm, 25 FD, 200 Ω, Gene Pulser Biorad) i otrzymano końcową bibliotekę o wielkości 0,5 x 10⁷ niezależnych klonów dla biblioteki κ i 1,4 x 10⁷ niezależnych klonów dla biblioteki λ.

Po jednej godzinie ekspresji fenotypowej, dodatnie transformanty wyselekcjonowano pod względem oporności na karbenicylinę kodowaną przez wektor pComb. Po tej selekcji klony zakażano zakaźną dawką 1 x 10¹² cząsteczek fagowych faga pomocniczego VCSM13, w wyniku czego otrzymano i wydzielono M13, z których każdy zawierał jednoniciowy DNA pComb3H kodujący pojedynczy lekki łańcuch ludzki i segment D4.5 Fd łańcucha ciężkiego i eksponował odpowiedni fragment Fab na powierzchni faga jako fuzję translacyjną z niezakaźną częścią białka okrywy faga III.

Obie biblioteki fagowe niosące sklonowane repertuary Fab (κ i λ,) zebrano z supernatantu hodowli przez strącanie PEG8000/NaCl i wirowanie, rozpuszczono w TBS/1%BSA i inkubowano ze zrekombinowanym s17-1A unieruchomionym na 96-studzienkowych płytkach ELISA. Fagi Fab, które nie wiązały się specyficznie z docelowym antygenem, wyeliminowano przez prowadzenie do 10 etapów przemywania TBS/0,5% Tween. Składniki wiążące obu bibliotek (κ i λ) eluowano z użyciem glicyny-HCl pH 2,2 i po zobojętnieniu eluatu 2 M Tris pH 12 zastosowano do zakażenia nowej niezakażonej hodowli E. coli XL1 Blue, jednej dla biblioteki κ i jednej dla biblioteki λ. Komórki, które były z powodzeniem transdukowane kopią fagmidu pComb, kodujące fragment Fab wiążący antygen, ponownie wyselekcjonowano pod względem odporności na karbenicylinę, a następnie zakażono fagiem pomocniczym VCSM13, aby rozpocząć drugą rundę prezentacji przeciwciał i selekcji in vitro.

Po pięciu rundach wytwarzania i selekcji fagów Fab wiążących antygen, przeprowadzono preparatykę plazmidowego DNA zawierającego wybrany repertuar Fab odpowiednio dla każdej rundy selekcji.

W celu wytwarzania rozpuszczalnych białek Fab fragment DNA genu III wycięto z plazmidów, niszcząc translacyjną fuzję segmentu Fd ciężkiego łańcucha z białkiem genu III. Po religacji, otrzymaną pulą plazmidowego DNA transformowano do 100 μl komórek E. coli XL1 Blue ukompetentnionych wskutek szoku cieplnego i wysiano na agarze LB-karbenicylina (Carb). Pojedyncze kolonie hodowano w 10 ml LB-karbenicylina/20 mM MgCl2 i zainicjowano ekspresję Fab po sześciu godzinach przez dodanie izopropylo-e-D-tiogalaktozydu (IPTG) do uzyskania końcowego stężenia 1 mM. Komórki zebrano po 20 godzinach; preparowanie peryplazmy przeprowadzono drogą zamrażania i rozmrażania i metodą ELISA zbadano obecność fragmentów Fab wiążących się do s17-1A.

Łącznie 45 klonów biblioteki κ i 45 klonów biblioteki λ, pochodzących przede wszystkim z piątej rundy selekcji ale w niewielkim stopniu także z innych rund, przebadano pod względem wiązania antygenu 17-1A. Tylko jeden klon określony jako k5.1 (biblioteka κ), który pojawił się w rundzie piątej wykazywał aktywność wiązania (patrz fig. 5). Ustalono sekwencję DNA regionu Kappa-V k5.1 (patrz fig. 9).

PL 193 780 B1

P r z y k ł a d II. Ekspresja w bakteriach E. coli XL1 Blue

Jak to zaznaczono uprzednio w przykładzie I, E. coli XL1 Blue transformowana pComb3H zawierającym jeden lekki łańcuch i segment Fd jednego łańcucha ciężkiego wytwarza rozpuszczalny Fab w wystarczającej ilości po wycięciu fragmentu genu III i indukcji IPTG. Segment Fd łańcucha ciężkiego Fd i lekki łańcuch są eksportowane do peryplazmy, gdzie łączą się i tworzą funkcjonalne fragmenty Fab.

W celu otrzymania lepszych preparatów peryplazmy, komórki hodowano w pożywce SB uzupełnionej 20 mM MgCl2 i rozpuszczano w PBS po zebraniu. W wyniku rund zamrażania w -70°C i rozmrażania w 37°C zniszczono zewnętrzną błonę bakterii metodą szoku cieplnego, a rozpuszczalne białka peryplazmatyczne wraz z fragmentami Fab uwolniono do supernatantu. Po usunięciu nienaruszonych komórek i osadu komórkowego drogą wirowania, zebrano supernatanty zawierające fragmenty Fab przeciwciał i zastosowano do dalszej analizy.

Najpierw przebadano preparaty peryplazmy k8-D4.5-Fab i k5.1-D4.5-Fab pod względem wiązania do unieruchomionego antygenu s17-1A, przy czym oba wykazały silne sygnały ELISA (patrz przykład I).

Detekcję fragmentów k8-D4.5 i k5.1-D4.5-Fab związanych z immobilizowanym antygenem s17-1A przeprowadzono z użyciem biotynylowanego poliklonalnego przeciwciała anty-ludzki łańcuch κ (1 Lig/ml PBS). Sygnał wykryto przez dodanie awidyny (1 μg/ml PBS) skoniugowanej z peroksydazą chrzanową. Sygnał wywołano przez dodanie roztworu substratu zawierającego kwas 2,2'azyno-bis(3-etylobenztiazolino-6-sulfonowy) i nadboran sodu i wykryto przy długości fali 405 nm.

Ponownie przeprowadzono test wiązania dwu 17-1A dodatnich ludzkich fragmentów Fab (k8-D4.5-Fab i k5.1-D4.5-Fab) na komórkach Kato (linia komórkowa raka żołądka eksprymująca 17-1A), komórkach CHO transfekowanych 17-1A (CHO/17-1A) i nie-transfekowanych komórkach CHO z preparatami peryplazmy. Transfekowane linie komórkowe CHO wygenerowano przez subklonowanie fragmentu DNA kodującego całkowitą sekwencję aminokwasów antygenu 17-1A, znanego także jako GA733-2 (Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 3542-3546) do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pEF-DHFR (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), zgodnie ze standardowymi procedurami (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie 2, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY (1989)).

Otrzymany plazmid linearyzowano Ndel i transfekowano do komórek CHO pozbawionych DHFR w celu stabilnej ekspresji. Ekspresję transmembranowego 17-1A zwiększano przez zachodzącą etapami amplifikację genów indukowaną przez następne dodanie inhibitora DHFR metotreksatu (MTX) we wzrastającym stężeniu, do końcowego stężenia 500 nM, ze zwiększaniem stężenia o 20 nM i 100 nM (Kaufmann, Meths. Enzymol. 185 (1990) 537-566).

200000 komórek (komórki Kato, CHO/17-1A lub CHO) inkubowano z jednym z preparatów peryplazmy zawierających dotyczący lub niedotyczący Fab, a następnie z biotynylowanym poliklonalnym przeciwciałem antyludzki łańcuch lekki κ (20 μg/ml PBS) i streptawidyną koniugowaną z FITC. Oznakowane komórki następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej. Preparaty peryplazmy zawierające k8-D4.5-Fab i k5.1-D4.5-Fab odpowiednio wykazywały wyraźne sygnały w porównaniu z niedotyczącymi preparatami peryplazmy (kontrola negatywna), przy braku zabarwienia nietransfekowanych komórek CHO, co wykazało specyficzność dla antygenu 17-1A. Przeciwciało M79 anty-17-1A (Gottlinger, Int. J. Cancer 38 (1986), 47-53) zastosowano jako pozytywną kontrolę dla komórek 17-1A-dodatnich, a mysie przeciwciało IgG2A jako kontrolny izotyp (patrz fig. 10 i 11).

P r z y k ł a d III. Ekspresja eukariotyczna w komórkach CHO

Bakterie zazwyczaj nie są zdolne do wytwarzania całkowitych funkcjonalnych immunoglobulin, choć eksprymują funkcjonalne fragmenty Fab.

W celu wytwarzania całkowitych funkcjonalnych przeciwciał trzeba stosować komórki ssaków, toteż łańcuch lekki k8 i zmienną domenę ciężkiego łańcucha D4,5 subklonowano do ssaczych wektorów ekspresji.

a) łańcuchy lekkie (k8 i k5.1): Aby wygenerować odpowiednie końcowe miejsca restrykcyjne, fragmenty DNA k8 i k5.1 amplifikowano metodą PCR i otrzymano fragmenty κ z miejscem Bsu36I na 5' końcu oraz miejscami SalI i NotI na 3' końcu.

Fragmenty te (k8 i k5.1) subklonowano w plazmidzie BSPOLL z użyciem Bsu36I i NotI i w ten sposób dodano ssaczą sekwencję liderową, po czym sekwencjonowano dla zapobiegania mutacjom powodowanym przez PCR.

PL 193 780 B1

Z użyciem EcoRI i SalI, k8 i k5.1 wycięto z BSPOLL i subklonowano do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pEF-ADA (patrz fig. 12) pochodzącego z wektora ekspresyjnego pEF-DHFR (Mack, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7021-7025), w wyniku zastąpienia cDNA kodującego mysią reduktazę dihydrofolianu (DHFR) sekwencją kodującą mysią deaminazę (ADA).

W przypadku każdego rodzaju łańcucha lekkiego (k8 i k5.1) transfekowano 10⁷ komórek CHO odpowiednio 100 μg linearyzowanego DNA plazmidowego, a następnie hodowano w warunkach selekcjonujących pod względem aktywności deaminazy adenozyny (ADA) kodowanej przez ten wektor ekspresyjny.

Żywe komórki ADA-dodatnie hodowano w celu dalszej transfekcji ciężkimi łańcuchami niosącymi domenę zmienną D4.5 lub D7.2.

b) ciężka domena zmienna 4.5: Z fragmentu δ Fd D4.5 zamplifikowano obszar zmienny generując miejsca restrykcyjne Bsu36I na obu końcach.

Powstały fragment V-D4.5 następnie subklonowano z zastosowaniem tych miejsc restrykcyjnych do eukariotycznego wektora ekspresyjnego pEF-DHFR już zawierającego eukariotyczną sekwencję liderową, a także fragment DNA kodujący stały region ludzkiego łańcucha ciężkiego IgG1 (patrz fig. 13). W wyniku tego region zmienny łańcucha ciężkiego D4.5 został wstawiony pomiędzy liderem i regionem stałym łańcucha ciężkiego.

Region zmienny zsekwencjonowano i całkowity klon określono jako H79V-D4.5 huIgG1.

Dla późniejszego barwienia tkanek, region stały ludzkiego ciężkiego łańcucha IgG1 zastąpiono regionem stałym mysiego łańcucha ciężkiego IgG1 z zastosowaniem XbaI do subklonowania. Ten plazmid określono jako H79V-D4.5 MlgG1.

Każdą z obu wersji, ludzką i mysią IgG1 łańcucha ciężkiego D4.5, transfekowano odpowiednio do 10⁷ komórek CHO, już eksprymujących lekki łańcuch k8. Ludzką wersję IgG1 także transfekowano do komórek CHO eksprymujących lekki łańcuch k5.1. Stosowano odpowiednio 100 μg linearyzowanego DNA plazmidowego do transfekcji ciężkiego łańcucha.

Region zmienny fragmentu D7.2 Fd łańcucha ciężkiego także subklonowano w pEF-DHFR i otrzymano plazmid eksprymujący ludzki łańcuch ciężki IgG1, jak opisano dla VD4.5. Ten plazmid ekspresyjny transfekowano następnie do komórek CHO już eksprymujących łańcuch lekki k8, jak opisano powyżej dla H79V-D4.5 huIgG1.

Transfekowane komórki poddawano selekcji pod względem aktywności ADA i DHFR jak opisano (Kaufman, Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566).

Powstałe linie komórkowe nazwano H79-huIgG1 (VD4.5huIgG1-k8), H79-MIgG1 (VD4.5MIg1-k8), D7.2 (VD7.2huIgG1-k8) i HD70 (VD4.5HuIgG1-k5.1).

Supernatanty trzydniowych hodowli z czterech różnych konfluentnych 30 ml hodowli komórek, z których każda wytwarzała jedno z czterech przeciwciał anty-17-A (H79-huIgG1, H79-MIgG1, D7.2 i HD70) testowano metodą ELISA pod względem wiązania immobilizowanego s17-1A. Z wyjątkiem D7.2 wykazującego słaby sygnał w ELISA, trzy pozostałe przeciwciała wykazały silne sygnały, co wskazuje na powinowactwo wiązania w zakresie mysiego przeciwciała M79.

Oczyszczanie przeciwciał w dużej skali przeprowadzono w butelkach do rolerów z użyciem 500 ml pożywki.

Przeciwciała H79-huIgGl, D7.2 i HD70 oczyszczono w kolumnie powinowactwa z białkiem A. Przeciwciało H79-MIgG1 oczyszczono metodą chromatografii powinowactwa na anty-mysim IgG.

Czystość i masę cząsteczkową zrekombinowanych przeciwciał określono metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących i nieredukujących (fig. 14 i 15).

Oczyszczanie białek i SDS-PAGE przeprowadzono według standardowych procedur.

P r z y k ł a d IV. Funkcjonalna analiza przeciwciał H79 i HD70

IVI. Test na immobilizowanym antygenie

Supernatanty trzydniowych hodowli odpowiednio z konfluentnych 30 ml hodowli komórek transfekowanych ludzką i mysią IgG1, jak i odpowiednich preparatów oczyszczonych przeciwciał testowano metodą ELISA pod względem wiązania immobilizowanego s17-1A i porównywano z mysim przeciwciałem M79 anty-17-1A.

Detekcję przeprowadzono w sposób opisany w II.

Stwierdzono, że przeciwciała H79 (wersje hulgG1 i MlgG1) i HD70 mają bardzo podobne powinowactwa wiązania w zakresie mysiego M79.

PL 193 780 B1

IV.2. Określanie powinowactwa

Pomiar powierzchniowego rezonansu plazmonowego przeprowadzono z użyciem urządzenia BLACORE 2000 (Biacore AB, Freiburg, Freiburg, Niemcy). Immobilizację zrekombinowanego rozpuszczalnego antygenu 17-1A w każdej celce przepływowej i analizę interakcji przeprowadzono automatyczną metodą w BLACORE 2000. Antygen połączono kowalencyjnie z obwodem scalonym sensora CMS poprzez pierwszorzędowe grupy aminowe.

Po aktywacji karboksylowanej matrycy dekstranowej obwodu scalonego sensora CM5 za pomocą pojedynczego wstrzyknięcia 80 μΐ 0,1 M N-hydroksysukcynoimidu /0,4 M N-etylo-N'-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (NHS/EDC9) przez wszystkie cztery celki przepływowe, przepływowe celki 1,2, 3 i 4 kolejno włączano do szlaku przepływu w czasie wstrzykiwania antygenu s17-1A (60 μg/ml w 10 mM octanie sodu, pH 4,7). Różne okresy czasu kontaktu 17-1A ze zaktywowaną powierzchnią prowadzą do około 2500 jednostek odpowiedzi (RU9 w celce przepływowej 1, 14000 RU w celce przepływowej 2, 780 w celce przepływowej 3 i 290 RU w celce przepływowej 4). Nadmiar aktywowanych estrów zablokowano przez wstrzyknięcie 85 μl 1 M etanoloaminy pH 5 na wszystkie celki przepływowe.

Doświadczenia z wiązaniem przeprowadzono w 25°C w buforze pH 7,4 zawierającym 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA i 0,005% związku powierzchniowo czynnego P20. Kinetykę wiązania przeciwciał do immobilizowanego zrekombinowanego 17-1A określono przez wstrzyknięcie przeciwciał w stężeniu od 0,5 do 2 uM. Układ scalony sensora regenerowano między kolejnymi przebiegami z użyciem 100 mM glicyny, 500 mM NaCl, 0,005% Tween pH 3. Stałe szybkości asocjacji i dysocjacji, Kon i Koff określono z zastosowaniem oprogramowanie do oceny BIA od Biacore AB, w opisany sposób (Karlsson, (1991) J. Immunol. Meth. 145:229-240).

Wykonano dwa zestawy określeń powinowactwa (1. zestaw: M79, H79, D7.2, Panorex; 2. zestaw: Panorex, HD70); mysi Panorex także włączono w zestawie 2 jako wzorzec wewnętrzny.

Okazało się, że wartość KD D7.2 jest poniżej minimalnej wykrywanej wartości 10^-4 M, a więc nie jest podana w tabeli 2.

T a b e l a 2

Stałe KD, Kon i Koff ludzkich i odpowiednich mysich przeciwciał 17-1A

Przeciwciało	Kon(M-1s1)	Koff (s 1)	Kd(M)
zestaw 1:
mysie M79	6,0 x 104	4,5 x 10 2	7,5 x 10 '
ludzkie H79	2,1 x 104	7,2 x 10-3	3,4 x 10 '
mysie Panorex	1,1 x 105	2,2 x 10 2	2,0 x 10 '
zestaw 2:
ludzkie HD70	0,9 x 105	3,5 x 10 2	3,9 x 10 '
mysie Panorex	1,0 x 105	2,7 x 10'2	2,0 x 10'7

IV. 3. Cytometria przepływowa na komórkach eukariotycznych eksprymujących 17-1A

Oczyszczone preparaty przeciwciał H79 (wersja ludzka i mysia IgG1), HD70 (ludzka IgG1) i D7.2 (ludzka IgG1) testowano metodą analizy FACS na komórkach Kato eksprymujących 17-1A, komórkach CHO transfekowanych 17-1A i nietransfekowanych komórkach CHO. 2 x 10⁵ komórek inkubowano odpowiednio z oczyszczonym H79-HuIgG1, H79-MIgG1, HD70, D7.2, M79, Panorex, M74ch (=ludzka CHIgG1-ludzka wersja Ck mysiego przeciwciała M74 anty 17-1A (Gottlinger, Int. J. Cancer 38 (1986), 47-53)), mysim IgG2a, mysim IgG1 lub ludzkim IgG1 (po 20 μg/ml przeciwciała). Wykrywanie przeciwciał związanych z komórkami przeprowadzono z użyciem oznakowanych FITC ludzkich przeciwciał anty mysich IgG lub anty ludzkich IgG (po 20 μg/ml). Inkubację prowadzono przez 45-60 minut na lodzie.

H79 ludzkie IgGl, H79 mysie IgG1 i HD70 wykazały wyraźne wiązanie do 17-1A dodatnich komórek, podobnie jak M79 i Panorex. D7.2 wykazał słabe ale wyraźne wiązanie do komórek 17-1A dodatnich. Żadne z przeciwciał nie wykazywało wiązania do nietransfekowanych komórek CHO,

PL 193 780 B1 a kontrole IgG były negatywne na komórkach Kato, komórkach CHO-17-1A i nietransfekowanych komórkach CHO (patrz fig. 16 i 17).

IV. 4. Cytotoksycznośc komórek zależna od przeciwciał (uwalnianie ⁵¹Cr)

W celu uwalniania ⁵¹Cr, ludzkie jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) jako komórki efektorowe wydzielono ze świeżej górnej jaśniejszej warstwy skrzepu krwi zawierającej osocze i krwinki białe od zdrowych dawców. PBMC rozdzielono drogą wirowania w gradiencie gęstości Ficollu, a następnie wirowania przy 100 x g. Niestymulowane PBMC (5 x 10⁵ komórek) dodawano w objętości 100 μl w pożywce RPMI 1640 z 10% FCS do każdej studzienki o płaskim dnie płytki do mikromianowania i inkubowano przez noc w 37°C. Docelowe komórki znakowano przez 2 godziny za pomocą ⁵¹Cr. Znakowane komórki docelowe (100 μθ i przeciwciała w różnych stężeniach (50 μθ dodano do PBMC i inkubowano przez 18 godzin w 37°C. Odpowiednie niewiążące izotypy stosowano jako negatywną kontrolę. Lizę właściwą obliczano jako (cpm, eksperymentalne uwolnienie) - (cpm, samorzutne uwolnienie)/(cpm, maksymalne uwolnienie) - (cpm, samorzutne uwolnienie).

Stwierdzono, że ludzkie przeciwciała anty 17-1A H79 i HD70 warunkują wysoką cytotoksyczność dla 17-1A dodatniej linii komórek raka żołądka KATO w tym teście uwalniania ⁵¹Cr. Okazało się, że mysie przeciwciała anty 17-1A M79 i Panorex pośredniczą w zabijaniu komórek na znacznie niższym poziomie (fig. 18).

IV.5. Badanie na tkance ludzkiej nm krioskrawki odpowiednio raka okrężnicy i normalnej tkanki okrężnicy inkubowano z mysią wersją IgG przeciwciała H79 (10 μg/ml). W tym doświadczeniu zastosowano mysią wersję IgG H79, aby uniknąć niespecyficznego barwienia ze względu na obecność immunoglobuliny w tkance ludzkiej. Wykrywanie wiązanego H79MIgG1 przeprowadzono z użyciem sprzęgniętego z peroksydazą skoniugowanego poliklonalnego przeciwciała anty-mysiego Ig i barwiono karbazolem. Przeciwbarwienie przeprowadzono z użyciem hemalaunu.

Wyniki oceniono metodą mikroskopii optycznej.

H79MlgG1 oraz mysie monoklonalne przeciwciało M79 (pozytywna kontrola) wykazały silne barwienie na normalnej błonie śluzowej okrężnicy (M79, fig. 19; H79-MIgG1, fig. 20) i słabsze barwienie komórek raka okrężnicy (M79, fig. 21; H79-MIgG1, fig. 22). Natomiast izotypy kontrolne nie wykazały żadnego barwienia na błonie śluzowej jelita i tkankach raka okrężnicy (dla M79; fig. 23 i 25 oraz dla H79-MlgG1, fig. 24 i fig. 26).

P r z y k ł a d V. Analiza epitopów H79 i HD70

Dla porównania epitopów 17-1A rozpoznawanych przez ludzkie przeciwciała H79 i HD70 i przez mysie matrycowe przeciwciało M79, 13-merowe peptydy pochodzące z sekwencji aminokwasowej z zewnątrzkomórkowej części antygenu 17-1A zsyntetyzowano jako pojedyncze plamy na Pep Spots Membrane. Peptydy te pokrywają całą zewnątrzkomórkową sekwencję antygenu 17-1A (określoną przez Szala, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3542-3546), gdyż zawierają zachodzące na siebie sekwencje 11 aminokwasów z każdym z sąsiadujących peptydów, z pierwszym aminokwasem peptydu 1 identycznym z N-końcowym aminokwasem antygenu 17-1A oraz ostatnim aminokwasem peptydu 119 identycznym z C-końcowym aminokwasem zewnątrzkomórkowej części antygenu 17-1A (tab. 3).

PL 193 780 B1

T a b e l a 3. Zsyntetyzowane peptydy (liczby odpowiadaj ą liczbom plam peptydów)

I. TATFAAAQEECVC

3. AAAQEECVCENYK

5. EECVCENYKLAVN 7. CENYKLAVNCFVN

9. KLAVNCFVNNNRQ

II. NCFVNNNRQCQCT

13. NNNRQCQCTSVGA

15. QCQCTSVGAQNTV

17. TSVGAQNTVICSK

19. AQNTVICSKLAAK

21. VICSKLAAKCLVM

23. KLAAKCLVMKAEM 25. KCLVMKAEMNGSK

27. MKAEMNGSKLGRR

29. MNGSKLGRRAKPE

31. KLGRRAKPEGALO

33. RAKPEGALONNDG 3$. EGALONNDGLYDP

37. ONNDGLYDPDCDE

39. GLYDPDCDESGLF

41. PDCDESGLFKAKO

43. ESGLFKAKCłCNGT

45. FKAKQCNGTSTCW 47. QCNGTSTCWCVNT

49. TSTCWCVNTAGVR

51. WCVNTAGVRRTDK

53. TAGVRRTDKDTEI

55. RRTDKDTEITCSE

57. KDTEITCSERVRT

59. ITCSERVRTYWII

61. ERVRTYWIIIELK

63. TYWIIIELKHKAR

65. IIELKHKAREKPY

67. KHKAREKPYDSKS

69. REKPYDSKSLRTA

71. YDSKSLRTALQKE

73. SLRTALOKEITTR

75. ALQKEITTRYQLD

77. EITTRYQLDPKFI

79. RYOLDPKFłTSIL

81. DPKFITSILYENN

2. TFAAAQEECVCEN

4. AQEECVCENYKLA

6. CVCENYKLAVNCF 0. NYKLAVNCFVNNN

10. AVNCFVNNNRQCQ

12. FVNNNRQCQCTSV

14. NRQCQCTSVGAQN

16. QCTSVGAQNTVIC

18. VGAQNTVICSKLA

20. NTVICSKLAAKCL

22. CSKLAAKCLVMKA

24. AAKCLVMKAEMNG 26. LVMKAEMNGSKLG

28. AEMNGSKLGRRAK

30. GSKLGRRAKPEGA

32. GRRAKPEGALONN

34. KPEGALONNDGLY 36. ALONNDGLYDPDC

38. NDGLYDPDCOESG

40. YDPDCDESGLFKA

42. CDESGLFKAKOCN

44. GLFKAKOCNGTST

46. AKQCNGTSTCWCV 40. NGTSTCWCVNTAG

50. TCWCVNTAGVRRT

52. VNTAGVRRTDKDT

54. GVRRTDKDTEITC

56. TDKDTEITCSERV

58. TEITCSERVRTYW

60. CSERVRTYWIIIE

62. VRTYWIIIELKHK

64. WIIIELKHKAREK

66. ELKHKAREKPYDS

68. KAREKPYDSKSLR

70. KPYDSKSLRTALO

72. SKSLRTALOKEIT

74. RTALQKEITTRYQ

76. OKEITTRYOLDPK

78. TTRYOLDPKFITS

80. OLDPKFITSILYE

82. KFITSILYENNYI

PL 193 780 B1

83. ITSILYENNVITI

84. SILYENNVITIDL

85. LYENNVITIDLVQ 87. NVITIDLVQNSSQ 89. IDLVQNSSQKTQN 91. QNSSQKTQNDVDI 93. QKTQNDVDIADVA 95. NDVDIADVAYYFE 97. IADVAYYFEKDVK 99. AYYFEKDVKGESL 101. EKDVKGESLFHSK 103. KGESLFHSKKMDL 105. LFHSKKMDLTYNG 107. KKMDLTVNGEQLD 109. LTVNGEQLDLDPG

111. GEQLDLDPGQTLI 113. DLDPGQTLIYYVD 115. GQTLIYYVDEKAP 117. IYYVDEKAPEFSM 119. DEKAPEFSMQGLK

86. ENNVITIDLVQNS 88. ITIDLVQNSSQKT 90. LVQNSSQKTQNDV 92. SSQKTQNDVDIAD 94. TQNDVDIADVAYY 96. VDIADVAYYFEKD 98. DVAYYFEKDVKGE 100. YFEKDVKGESLFH 102. DVKGESLFHSKKM 104. ESLFHSKKMDLTV 106. HSKKMDLTVNGEQ 108. MDLTVNGEQLDLD 110. VNGEQLDLDPGQT 112. QLDLDPGQTLIYY 114. DPGQTLIYYVDEK 116. TLIYYVDEKAPEF 118. YVDEKAPEFSMQG

Pep Spots Membrane ze zsyntetyzowanymi peptydami wytrząsano dziesięć minut w metanolu i nastę pnie przemywano trzy razy przez 10 minut w buforze TBS-pH8. Membranę nastę pnie blokowano przez jedną godzinę w roztworze blokującym opartym na kazeinie, zawierającym 0,05 g/ml sacharozy, a następnie wytrząsano jeden raz w TBS pH8/0,5% Tween 20 (TBS-T). Każde z przeciwciał anty-17-1A inkubowano w temperaturze pokojowej wraz z membraną przez trzy godziny w roztworze blokującym (1 μg przeciwciała/ml). Po trzech przemywaniach w TBS-T, prowadzonych za każdym razem po dziesięć minut, drugorzędowe przeciwciało skoniugowane z peroksydazą chrzanową (HRP) (antymysia/antyludzka; 1 μg/ml roztworu blokującego) inkubowano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej wraz z membraną. Następnie membranę przemywano trzy razy po 10 minut w TBS-T. Detekcję związanych przeciwciał przeprowadzono bezpośrednio na Pep Spots Membrane w przypadku M79 zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do chemoluminescencji (Boehringer). Wywołane błony przedstawiono na fig. 27. Membranę regenerowano po trzech przemywaniach TBS-T (10 min) w roztworze zawierającym 50 mM Tris-HCl pH 6,7, 100 mM 2-merkaptoetanol i 2% (wag./obj.) SDS przez 30 min w 50°C, po czym ponownie używano do mapowania epitopu następnego przeciwciała.

Ze względu na wyższy stopień niespecyficznego wiązania drugorzędowego przeciwciała antyludzkiej immunoglobuliny do plam polipeptydów na membranie, przeprowadzono frakcjonowany elektrotransfer na drugą błonę blotującą, a następnie detekcję z użyciem drugorzędowego przeciwciała przeciwludzkiego w przypadku HD70 i H79 według Rϋdiger, EMBO 16 (1997) 1501-1507. Inkubacja z drugorzędowym przeciwciałem i wykrywanie przeciwciał na błotach przeprowadzono jak opisano powyżej. Wywołane błony przedstawiono na fig. 27.

Jak przedstawiono na tej figurze (fig. 27), wyniki mapowania epitopów wskazują, że epitop rozpoznawany przez mysie matrycowe przeciwciało M79 głównie reprezentowany przez plamy peptydów 38 i 95, znacząco różni się od rozpoznawanego przez ludzkie przeciwciało H79, głównie reprezentowanego przez plamy peptydów 8, 11, 13, 14, 59-60, 77 i 79. Ludzkie przeciwciało HD70 nie wykazuje żadnego wykrywalnego wiązania, toteż można spodziewać się, że jego epitop też różni się od epitopu mysiego przeciwciała M79 i że także epitopy ludzkich przeciwciał H79 i HD70 nie są identyczne.

Brak wykrywalnych sygnałów wiązania w przypadku ludzkiego przeciwciała HD70 można wytłumaczyć przez jego możliwe rozpoznanie konformacyjnego, ciągłego lub nieciągłego epitopu częściowo lub całkiem złożonego z węglowodanów; w każdym z tych przypadków trudno jest oczekiwać imitacji takich epitopów przez krótkie peptydy.

PL 193 780 B1

Wykaz sekwencji (1) Informacja ogólna:

(i) Zgłaszający:

(A) Nazwa: Micromet Gesellschaft fur

Biomedizinische Forschung mbH (B) Ulica: Am Klopferspitz 19 CC) Miasto: Planegg-Martinsried (E) Kraj: Niemcy (F) Kod pocztowy(ZIP): 82152 (ii) Tytuł wynalazku:

Nowy sposób wytwarzania receptorów przeciw ludzkim antygenom i ich zastosowania (iii) Liczba sekwencji: 148 (iv) Sposób odczytu komputerowego:

(A) Typ nośnika: dyskietka; 3,5 cala (B) Komputer: kompatybilny z IBM PC (C) System operacyjny: PC-DOS/MS-DOS (D) Oprogramowanie: Patentln Release #1.0, wersja #1.30 (EPO) (v) Dane zgłoszenia:

(A) Numer zgłoszenia: WO PCT/EP98/02180 (vi) Dane o wcześniejszym zgłoszeniu:

(A) Numer zgłoszenia: EP 97 10 6109.8 (B) Data zgłoszenia: 14 kwietnia 1997 (2) Informacja o SEQ ID NO: 1:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 193 780 B1 (A) Długość: 22 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 1: AGGTGCAGCT GCTCGAGTCT GG (2) Informacja o SEQ ID NO: 2:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 2:

CAGAGTCACC TTGCTCGAGT CTGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 3:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 23 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 3:

CAGGTGCAGC TGCTCGAGTC GGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 4:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 23 pary zasad

PL 193 780 B1 (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 4:

CAGGTGCAGC TACTCGAGTG GGG ₂₃ (2) Informacja o SEQ ID NO: 5:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 23 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 5:

CAGGTACAGC TGCTCGAGTC AGG 23 (2) Informacja o SEQ ID NO: 6:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 6:

TGCCTTACTA GTCTCTGGCC AGCGGAAGAT 30 (2) Informacja o SEQ ID NO: 7:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

PL 193 780 B1 (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 7:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC 30 (2) Informacja o SEQ ID NO: 8:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 40 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 8:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATTGAC AGCAGTCTCC 40 (2) Informacja o SEQ ID NO: 9:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 39 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 9:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACC TCAGTCTCC 39 (2) Informacja o SEQ ID NO: 10:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

PL 193 780 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 10:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC (2) Informacja o SEQ ID NO: 11:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 38 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 11:

GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC (2) Informacja o SEQ ID NO: 12:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 58 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 12:

GCGCCGTCTA GAATTAACAC TCTCCCCTGT TGAAGCTCTT TGTGACGGGC GAACTCAG (2) Informacja o SEQ ID NO: 13:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

PL 193 780 B1 (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 13: AATTTTGAGC TCACTCAGCC CCAC (2) Informacja o SEQ ID NO: 14:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy

CC) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 14:

TCTGCCGAGC TCCAGCCTGC CTCCGTG (2) Informacja o SEQ ID NO: 15:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa .

(ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 15:

TCTGTGGAGC TCCAGCCGCC CTCAGTG (2) Informacja o SEQ ID NO: 16:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 33 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy

PL 193 780 B1 (A) Opis: /opis - „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 16:

TCTGAAGAGC TCCAGGACCC TGTTGTGTCT GTG 33 (2) Informacja o SEQ ID NO: 17:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa .

(ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 17:

CAGTCTGAGC TCACGCAGCC GCCC ²⁴ (2) Informacja o SEQ ID NO: 18:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 18:

CAGACTGAGC TCACTCAGGA GCCC 24 (2) Informacja o SEQ ID NO: 19:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 24 pary zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter

PL 193 780 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 19: CAGGTTGAGC TCACTCAACC GCCC (2) Informacja o SEQ ID NO: 20:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 27 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 20:

CAGGCTGAGC TCACTCAGCC GTCTTCC (2) Informacja o SEQ ID NO: 21:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 30 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: inny kwas nukleinowy (A) Opis: /opis = „starter· (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 21:

CGCCGTCTAG AATTATGAAC ATTCTGTAGG (2) Informacja o SEQ ID NO: 22:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 22:

Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys ¹ 5 10

PL 193 780 B1 (2) Informacja o SEQ ID NO: 23:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rod2aj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 23:

Thr Phe Ala Ala Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn 1 S 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 24:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 24:

Ala Ala Ala Gin. Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 25:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 25:

Ala Gin Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 26:

PL 193 780 B1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 26:

Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 27:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 27:
Cys Val	Cys Glu Asn Tyr Lys	Leu Ala Val Asn Cys Phe
1	5	10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 28: ' (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 28:

Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 29:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 193 780 B1 (A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 29:

Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 30:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 30:

Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 31:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 31:

Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 32:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów

PL 193 780 B1 (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 32:

Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr ¹ S 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 33:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 33:

Phe Val Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 34:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 34:

Asn Asn Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 35:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas

PL 193 780 B1 (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 35:

Asn Arg Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 36:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 36:

Gin Cys Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 37:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 37:

Gin Cys Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys 1 5 10 .

(2) Informacja o SEQ ID NO: 38:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość': 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

PL 193 780 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 38:

Thr Ser Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys ¹⁵ 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 39:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 39:

Val Gly Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 40:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów .

(B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 40:

Ala Gin Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys 1 5

Leu Ala Ala Lys 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 41:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

PL 193 780 B1 (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 41:

Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 42:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 42:

Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 43:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 43:

Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala 1 5 -10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 44:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd

PL 193 780 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 44:

Lys Leii Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 45:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: P^tyd
(xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 45:

Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly 1 5 10 · (2) Informacja o SEQ ID NO: 46:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 46:
Lys cys 1	Leu Val Met Lys Ala 5	Glu Met Asn Gly Ser Lys 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 47:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 47:

PL 193 780 B1

Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 48:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 48:

Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 49:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 49:

Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 50:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 50:

Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu ¹ 5 10

PL 193 780 B1 (2) Informacja o SEQ ID NO: 51:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 51:

Gly Ser Lys Len Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 52:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 52:

Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 53:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 53:

Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 54:

PL 193 780 B1

(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A) Długość: 13	i aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 54:

hcg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 55:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 55:

Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 56:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: peptyd
(xi)	Opis	sekwencji: SEQ ID NO: 56:

Glu Gly Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro 1 5 · 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 57:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 193 780 B1

	(A) Długość:	13 aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia	: liniowa
(ii)	Typ cząsteczki	: peptyd
(xi)	Opis sekwencji	: SEQ ID NO: 57:

Ala Leu Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys ¹ 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 58:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 58:

Gin Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 59:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 59:

Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 60:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów

PL 193 780 B1 (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 60:

Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 61:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 61:

Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 62:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 62:

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 63:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas

PL 193 780 B1 (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 63:

Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 64:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 64:

Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 65:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia;	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 65:

Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 66:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

PL 193 780 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID KO: 66:

Phe Lys Ala Lys Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 67:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 67:
Ala Lys	Gin Cys Asn Gly Thr	Ser Thr Cys Trp Cys Val
1	5	10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 68:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencji:	SEQ ID NO: 68:

Gin Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 69:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

PL 193 780 B1 (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 69:

Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val Ash Thr Ala Gly 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 70:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 70:
Thr Ser	Thr Cys Trp Cys Val	Asn Thr Ala Gly Val Arg
1	5	10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 71:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa _ '
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 71:

Thr Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 72:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów . (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd

PL 193 780 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 72:

Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys ¹ 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 73:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyne
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 73:

Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr 15 ₁₀ (2) Informacja o SEQ ID NO: 74:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 74:

Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile ^{1 5} 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 75:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość:	13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia	: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki	: peptyd
<xi)	Opis	sekwencj i	: SEQ ID NO: 75:

PL 193 780 B1

Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile The Cys 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 76:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 76:

Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 77:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 77:

Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 78:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 78:
Lys Asp 1	Thr Glu Ile Thr Cys 5	Ser Glu Arg Val Arg Thr 10

PL 193 780 B1 (2) Informacja o SEQ ID NO: 79:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencji:	SEQ ID NO: 79:

Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp 1 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 80:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 80:

Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 81:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 81:

Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu 1 .5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 82:

PL 193 780 B1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 82:

Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 83:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości:	pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: peptyd
(xi)	Opis	sekwencji: SEQ ID	NO: 83:
Val Arg	Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu	Leu Lys His Lys
1		5	10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 84: ' (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd ’ (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 84:

Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 85:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 193 780 B1

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 85:

Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 86:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	CC)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	CD)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 86:

Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 87:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C> Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 87:

Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 88:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów

PL 193 780 B1 (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 88:

Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser 1 -5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 89:

(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 89:

Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 90:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 90:

Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 91:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas

PL 193 780 B1 (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 91:

Lys Ero Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 92:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
<xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 92:

Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu 1 ' 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 93:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas

CC) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 93:

Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 94:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

PL 193 780 B1 (D) Topologia liniowa (ii) Typ cząsteczki (xi) Opis sekwencji peptyd

SEQ ID NO: 94:

(2) Informacja o SEQ ID NO: 95:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 95:

Arg Thr Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 96:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 96:

Ala Leu Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 97:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

PL 193 780 B1 (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 97:

Gin Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Ero Lys 1 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 98:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 98:

Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 99:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa -
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 99:

Thr Thr Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 100:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd

PL 193 780 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 100:

Arg Tyr Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu ¹ 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 101:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 101:

Gin Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tvr Glu 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 102:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 102:

Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn ¹ .5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 103:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 103:

PL 193 780 B1

Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 104:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: peptyd
(xi)	Opis	sekwencji: SEQ ID NO: 104:
Ile Thr 1	Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile 5 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 105

(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 105:
Ser Ile 1	Leu Tyr Glu Asn Asn 5	Val Ile Thr Ile Asp Leu 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 106

(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 106:
Leu Tyr	Glu Asn Asn Vał Ile	Thr Ile Asp Leu Val Gin
1	5	10

PL 193 780 B1 (2} Informacja o SEQ ID NO: 107:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 107:

Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 108:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: peptyd
(xi)	Opis	sekwencji: SEQ ID NO: 108:
Asn Val 1	Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin 5 10 .

(2) Informacja o SEQ ID NO: 109:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 109:

Ile Thr Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 110:

PL 193 780 B1 (i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 110:

Ile Asp Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 111:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B> Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 111:

Leu Val Gin Asn Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 112:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: peptyd
(xi)	Opis	sekwencji: SEQ ID NO: 112:
Gin Asn 1	Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile 5 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 113:

(i) Charakterystyka sekwencji:

PL 193 780 B1 (A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 113:

Ser Ser Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 114:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 114:

Gin Lys Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 115:

(i) Charakterystyka sekwencji: '

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 115:

Thr Gin Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 116:

(i) Charakterystyka sekwencji;

(A) Długość: 13 aminokwasów

PL 193 780 B1 (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 116:

Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 117:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 117:

Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Ehe Glu Lys Asp 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 118:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencji:	SEQ ID NO: 118:

Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 119:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas

PL 193 780 B1 (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 119:

Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 120:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości:	pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi>	Opis sekwencji:	SEQ ID	NO: 120:

Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu 15 10 (2) Informacja o SEQ TD NO: 121:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 121:
Tyr Phe	Glu Lys Asp Val Lys	Gly Glu Ser Leu Phe His
1		5	10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 122:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

PL 193 780 B1 (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 122:

Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lvs ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 123:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencji:	SEQ ID NO: 123:
Asp Val 1 '	Lys Gly Glu Ser Leu 5	Phe His Ser Lys Lys Met 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 124:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 124:

Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu 1 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 125:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa

PL 193 780 B1 (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 125:

Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val ¹⁵ 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 126:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 126:
Leu Phe 1	His Ser Lys Lys Met 5	Asp Leu Thr Val Asn Gly 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 127:

(i) Charakterystyka sekwencji

	(A)	Długość: 13 aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia: liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki: peptyd
(Xi)	Opis	sekwencji: SEQ ID NO: 127:
His Ser 1	Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin 5 10

(2) Informacja o SEQ ID NO: 128:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd

PL 193 780 B1 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 128:

Lys Lys Met Asp Leu Thr Val As-n Gly Glu Gin Leu Asp 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 129:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 129:

Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp ¹ 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 130:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 130:

Leu Thr Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 131:

(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 131:

PL 193 780 B1

Val Asn Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 132:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
(ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 132:

Gly Glu Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile ¹ 5 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 133:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	CC)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 133:

Gin Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 134:

(i)	Charakterystyka	sekwencj i:
	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 134:

PL 193 780 B1

Asp Leu Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 135:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 135:

Asp Pro Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 136:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów

(B) Typ: aminokwas

(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza

(D) Topologia: liniowa

ii) Typ cząsteczki: peptyd

xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 136:

Gly Gin Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro 15 io (2) Informacja o SEQ ID NO: 137:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A)	Długość: 13	aminokwasów
	(B)	Typ: aminokwas
	(C)	Rodzaj niciowości: pojedyncza
	<D)	Topologia:	liniowa
ii)	Typ	cząsteczki:	peptyd
xi)	Opis	sekwencj i:	SEQ ID NO: 137:

PL 193 780 B1

Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 138:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 138:

Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met ¹ 5 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 139:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 13 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (C) Rodzaj niciowości: pojedyncza (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: peptyd (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 139:

Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly 15 10 (2) Informacja o SEQ ID NO: 140:

(i) Charakterystyka sekwencji:

	(A) Długość: 13	aminokwasów
	(B) Typ: aminokwas
	(C) Rodzaj niciowości: pojedyncza
	(D) Topologia:	liniowa
(ii)	Typ cząsteczki:	peptyd
(xi)	Opis sekwencji:	SEQ ID NO: 140:

Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gin Gly Leu Lys 1 5 10

PL 193 780 B1 (2) Informacja o SEQ ID NO: 141:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 321 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: podwójna (D) Topologia: liniowa (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..321 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 141: ,

GAG CTC CAG ATG ACC CAG Glu Leu Gin Met Thr Gin	TCT Ser	CCA Pro
1	5
GAC	AGA GTC ACC ATC ACT	TGT	CGG
Asp	Arg Val Thr Ile Thr 20	Cys	Arg
TTA	AAT TGG TAT CAG CAG	AAA	CCA
Leu	Asn Trp Tyr Gin Gin 35	Lys	Pro 40
TAC	TGG GCA TCT ACC CGG	GAA	TCC
Tyr	Trp Ala Ser Thr Arg ' 50	Glu 55	Ser
AGC	GGG TCT GGG ACA GAT	TTC	ACT
Ser 65	Gly Ser Gly Thr Asp 70	Phe	Thr
GAA	GAT TCT GCA ACT TAC	TAC	TGT
Glu	Asp Ser Ala Thr Tyr 85	Tyr	Cys
ACT	TTT GGC CAG GGG ACC	AAG	CTG
Thr	Phe Gly Gin Gly Thr 100	Lys	Leu
(2)	Informacja o SEQ	ID	NO:

TCC TCC	CTG TCT Leu Ser	GCT TCT	GTG Val 15	GGA Gly
Ser	Ser 10	Ala	Ser
ACA	AGT	CAG	AGC	ATT	AGC	AGC	TAT
Thr	Ser	Gin	Ser	Ile	Ser	Ser	Tyr
25					30
GGA	CAG	CCT	CCT	AAG	CTG	CTC	ATT
Gly	Gin	Pro	Pro	Lys	Leu	Leu	Ile
				45
GGG	GTC	CCT	GAC	CGA	TTC	AGT	GGC
Gly	Val	Pro	Asp 60	Arg	Phe	Ser	Gly
CTC	ACC	ATC	AGC	AGT	CTA	CAA	CCT
Leu	Thr	Ile	Ser	Ser	Leu	Gin	Pro
		75					80
CAG	CAG-	AGT	TAC	GAC	ATC	CCG	TAC
Gin	Gln	Ser	Tyr	Asp	Ile	Pro	Tyr
	90					95
GAG	ATC	AAA
Glu	Ile	Lys

144

192

240

233

321

105

142:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 107 aminokwasów (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 142:

PL 193 780 B1

Glu Leu Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1

5

10

15

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ero

Lys

Leu

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Trp

Ala

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser

Gly

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Ser

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Gin

Gin

Ser

Tyr

Asp

Ile

Pro

Tyr

85

90

95

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Leu

Glu

Ile

Lys

100

105

(2) Informacja o SEQ ID NO: 143:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 414 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: podwójna (D) Topologia: liniowa (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..414 .

(xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 143:

GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG GGA GGC GTG GTC CAG CCT GGG AGG

Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg

110 115 120

TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGC TAT

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

125 130 135

GGC ATG CAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG

Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

140 145 150 155

GCA GTT ATA TCA TAT GAT GGA AGT AAT AAA TAC TAT GCA GAC TCC GTG

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

160 165 170

AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr . 175 180 185

144

192

240

PL 193 780 B1

CTG Leu

CAA ATG

AAC AGC

CTG AGA

GCT GAG

GAC Asp

ACG GCT GTG TAT

TAC Tyr

TGT Cys

Gin

Met 190

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala 195

Glu

Thr Ala

Val 200

Tyr

GCG

AAA

GAT

ATG

GGG

TGG

GGC

AGT

GGC

TGG

AGA CCC

TAC

TAC

TAC

TAC

Ala

Lys

Asp

Met

Gly

Trp

Gly

Ser

Gly

Trp

Arg Pro

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

205

210

215

GGT

ATG

GAC

GTC

TGG

GGC

CAA

GGG

ACC

ACG

GTC ACC

GTC

TCC

TCA

GCA

Gly

Met

Asp

Val

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Thr

Val Thr

Val

Ser

Ser

Ala

220

225

230

235

CCC

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

240

245

(2)

Informacj a

o SEQ

ID NO:

144

(i)

Charakterystyka

sekwencj i

2S8

336

384

414 (A) Długość: 138 aminokwasów

(

B) Typ:

aminokwas

(

D) Topologia: liniowa

(ii)

Typ cząsteczki: białko

<xi)

Opis sekwencji: SEQ

ID

NO:

: 144:

Glu

Val

Gin

Leu Leu

Glu Ser Gly

Gly

Gly

Val

Val

Gin

Pro

Gly Arg

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu Ser

Cys Ala Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Tyr

20

25

30

Gly

Met

His

Trp Val

Arg Gin Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Val

35

40

45

Ala

Val

Ile

Ser Tyr

Asp Gly Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

50

55

60

Lys

Gly

Arg

Phe Thr

Ile Ser Arg

Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

65

70

75

80

Leu

Gin

Met

Asn Ser

Leu Arg Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

b

85

90

95

Ala

Lys

Asp

Met Gly

Trp Gly Ser

Gly

Trp

Arg

Pro

Tyr

Tyr

Tyr

Tyr

100

105

110

Gly

Met

Asp

Val Trp

Gly Gin Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

Ala

115

120

125

Pro

Thr

Lys

Ala Pro

Asp Val Phe

Pro

Leu

130 135 (2) Informacja o SEQ ID NO: 145:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 372 pary zasad

PL 193 780 B1 (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: podwójna (D) Topologia: liniowa (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..372 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 145:

GAG GTG CAG CTG CTC

GAG TCT GGG GGA GTC GTG GTA CAG CCT GGG GGG

48

Glu

Val 140

Gin

Leu Leu

Glu

Ser 145

Gly

Gly

Val

Val Val 150

Gin

Pro

Gly Gly

TCC

CTG

AGA

CTC

TCC

TGT

GCA

GCC

TCT

GGA

TTC

ACC

TTT

GAT

GAT

TAT

96

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp

Asp

Tyr

155

160

165

170

GCC

ATG

CAC

TGG

GTC

CGC

CAG

GCT

CCA

GGC

AAG

GGG

CTG

GAG

TGG

GTG

144

Ala

Met

His

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

.Gly

Leu

Glu

Trp

Val

175

180

185

GCA

GTT

ATA

TCA

TAT

GAT

GGA

AGT

AAT

AAA

TAC

TAT

GCA

GAC

TCC

GTG

192

Ala

Val

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Asp

Ser

Val

190

195

200

AAG

GGC

CGA

TTC

ACC

ATC

TCC

AGA

GAC

AAT

TCC

AAG

AAC

ACG

CTG

TAT

240

Lys

Gly Arg

Phe

Thr

Ile

Ser

Arg Asp

Asn

Ser

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr

205

210

215

CTG

CAA

ATG

AAC

AGC

CTG

AGA

GCT

GAG

GAC

ACG

GCT

GTG

TAT

TAC

TGT

283

Leu

Gin

Met

Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

220

225

230

GCG

AAA

AAG

GAA

GGC

TAC

TGG

GGC

CAG

GGA

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

336

Ala

Lys

Lys

Glu

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Leu

Val

Thr

Val

Ser

235

240

245

250

TCA

GCA

CCC

ACC

AAG

GCT

CCG

GAT

GTG

TTC

CCT

CTA

372

Ser

Ala

Pro

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp

Val

Phe

Pro

Leu

255

260

2) Informacja

o SEQ

ID NO:

146

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 124 aminokwasy (B) Typ: aminokwas (D) Topologia: liniowa (ii) Typ cząsteczki: białko (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 146:

PL 193 780 B1

Glu 1

Val

Gin

Leu

Leu 5

Glu

Ser

Gly

Gly

Val 10

Val

Val

Gin

Pro

Gly 15

Gly

Ser

Leu

Arg

Leu 20

Ser

Cys

Ala

Ala

Ser 25

Gly

Phe

Thr

Phe

Asp 30

Asp

Tyr

Ala

Met

His 35

Trp

Val

Arg

Gin

Ala 40

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu 45

Glu

Trp

Val

Ala

Val 50

Ile

Ser

Tyr

Asp

Gly 55

Ser

Asn

Lys

Tyr

Tyr 60

Ala

Asp

Ser

Val

Lys 65

Gly

Arg

Phe

Thr

Ile 70

Ser

Arg

Asp

Asn

Ser 75

Lys

Asn

Thr

Leu

Tyr 80

Leu

Gin

Met

Asn

Ser SS

Leu

Arg

Ala

Glu

Asp 90

Thr

Ala

Val

Tyr

Tyr 95

Cys

Ala

Lys

Lys

Glu 100

Gly

Tyr

Trp

Gly

Gin 105

Gly

Thr

Leu

Val

Thr 110

Val

Ser

Ser

Ala

Pro 115

Thr

Lys

Ala

Pro

Asp 120

Val

Phe

Pro

Leu

(2) Informacja o SEQ ID NO: 147:

(i) Charakterystyka sekwencji:

(A) Długość: 321 par zasad (B) Typ: kwas nukleinowy (C) Rodzaj niciowości: podwójna (D) Topologia: liniowa (ix) Cechy:

(A) Nazwa/klucz: CDS (B) Położenie: 1..321 (xi) Opis sekwencji: SEQ ID NO: 147:

GAG

CTC

CAG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

TCC

TCC

CTG

TCT

GCA

TCT

GTA

GGA

Glu

Leu

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Val

Gly

125

130

135

140

GAC

AGA

GTC

ACC

ATC

ACT

TGC

CGG

GCA

AGT

CAG

AGC

ATT

AGC

AGC

TAT

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Ala

Ser

Gin

Ser

Ile

Ser

Ser

Tyr

145

150

155

TTA

AAT

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCA

GGA

CAG

CCT

CCT

AAG

CTG

CTC

ATT

Leu

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

160

165

144

170

TAC

TGG

GCA

TCT

ACC

CGG

GAA

TCC

GGG

GTC

CCT

GAC

CGA

TTC

AGC

GGC

192

Tyr

Trp

Ala 175

Ser

Thr

Arg

Glu

Ser 180

Gly

Val

Pro

Asp

Arg 185

Phe

Ser

Gly

AGT

GAA

TCT

GGG

ACA

AAT

TAC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

CCT

240

Ser

Glu 190

Ser

Gly

Thr

Asn

Tyr 195

Thr

Leu

Thr

Ile

Ser 200

Ser

Leu

Gin

Pro

PL 193 780 B1

GAA GAT

TTT Phe

GCT ACT

TAC Tyr 210

TTT Phe

TGT Cys

CAA Gin

CAG Gin

TCT Ser 215

GAC Asp

AGT Ser

TTG Leu

CCG Pro

ATC Ile 220

28B

Glu 205

Asp

Ala

Thr

ACC

TTC

GGC

CAA

GGG

ACA

CGA

CTG

GAC

ATT

CAA

321

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Arg

Leu

Asp

Ile

Gin

225

230

(2) Informacja o RRQ II) NC): 14fl:

(i) Charakterystyka sekwencji

		(Λ)	Długość: 107 ani	inol	kwas	IÓW
		(B)	Typ: aminokwas
		(D)	Topologia: lilii·	owa
C	Li)	Typ	cząsteczki: biał	ko
(xi)	Opis	sekwencji.: SEQ	ID NO:	14 0
Glu	Leu	Gin Het Thr Gin Ser Pro	Ser	Ser	Leu	Ser	Ala	Ser	Val	Gly
1			5		10					15
Asp	Arg	Val '1	,’hr Ile Thr Cys Arg	Ala	Ser	Gin	Ser	Ile	Ser	Ser	Tyr
		20	25					30
Leu	Asn	Trp Tyr Gin Gin Lys Pro	Gly	Gin	Pro	Pro	Lys	Leu	Leu	Ile
		35	40					45
Tyr	Trp	Ala :	Ser The Arg Glu Ser	Gly	Val	Pro	Asp	Arg	Phe	Ser	Gly
50		55				60
Ser	Glu	Ser	Gly Thr Asn Tyr Thr	Leu	Thr	Ile	Ser	Ser	Leu	Gin	Pro
65			70			75					80
Glu	Asp	Phe	Ala Thr Tyr Phe Cys	Gin	Gin	Ser	Asp	Ser	Leu	Pro	Ile
		85		90					.95
Thr	Phe	Gly	Gin Gly Thr Arg Leu	Asp	Ile	Gin
		100	105

Zastrzeżenia patentowe

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania receptora przeciw ludzkim antygenom, znamienny tym, że prowadzi się etapy (b) selekcjonowania kombinacji funkcjonalnie przegrupowanych łańcuchów VH i VL immunoglobulin, w której to kombinacji co najmniej łańcuch VH pochodzi z niestymulowanych dojrzałych ludzkich limfocytów B, a łańcuch VL pochodzi z naturalnie występującego repertuaru ludzkich komórek B, które to łańcuchy są eksprymowane ze zrekombinowanego wektora, oraz (c) stosowania układu prezentacji in vitro do wiązania się z ludzkim antygenem, przy czym przed etapem selekcjonowania (b) przeprowadza się etap (a) selekcjonowania łańcucha VH lub VL pod względem wiązania się z antygenem wraz z ł a ń cuchem V specyficznego przeciwciał a docelowego antygenu innego niż ludzki.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że receptor stanowi immunoglobulina lub fragment immunoglobuliny, taki jak fragment Fv.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że co najmniej łańcuch immunoglobuliny VH i ewentualnie ł a ń cuch VL pochodzą z ludzkiego repertuaru IgD.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako układ prezentacji in vitro stosuje się układ prezentacji fagowej.
5. 5. Sposób według zastrz, 1, znamienny tym, że kombinacja przegrupowanych łańcuchów jest eksprymowana z jednej lub większej liczby różnych bibliotek.

   PL 193 780 B1
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ludzki antygen stanowi antygen nowotworu, taki jak ludzki antygen 17-1A.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że łańcuch VH zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 7, nukleotydy 1 - 381, lub sekwencję przedstawioną na fig. 8, nukleotydy 1 - 339, i/lub łańcuch VL zawiera sekwencję przedstawioną na fig. 6, nukleotydy 1 - 321, lub sekwencję przedstawioną na fig. 9, nukleotydy 1 - 321.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie selekcji (b) (i) wiąże się ośrodek prezentacji eksprymujący receptor antygenu (a) na unieruchomionym docelowym antygenie lub jego fragmentach;

   (b) na ewentualnie znakowanych komórkach eksprymujących docelowy antygen lub jego fragmenty; albo (c) z rozpuszczalnym, korzystnie znakowanym antygenem docelowym lub jego fragmentami;

   (ii) wymywa się niespecyficznie wiążące się ośrodki prezentacji (a oraz b), a następnie eluuje specyficznie wiążące się ośrodki prezentacji, albo (iii) dodatnio wzbogaca się związane z docelowym antygenem ośrodki prezentacji (b oraz c) z roztworu docelowego antygenu lub z zawiesin komórek eksprymujących antygen docelowy;

   przy czym tak wyizolowane ośrodki prezentacji obejmujące receptory ich antygenów ewentualnie namnaża się przez replikację i poddaje dalszym rundom selekcji in vitro jak w (i)-(iii).
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że łańcuch specyficznego przeciwciała docelowego antygenu innego niż ludzki stanowi mysi łańcuch VH lub VL.
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie selekcji odpowiedniej kombinacji (a) testuje się jeden i ten sam łańcuch VH w kombinacji z różnymi łańcuchami VL pod względem wiązania się z ludzkim antygenem; albo (b) testuje się jeden i ten sam łańcuch VL w kombinacji z różnymi łańcuchami VH pod względem wiązania się z ludzkim antygenem.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po selekcji dodatkowo prowadzi się etapy otrzymywania ludzkich łańcuchów VH i VL lub odpowiednich kwasów nukleinowych oraz przyłączania tych łańcuchów do tych samych lub innych łańcuchów VH lub VL, do stałych regionów ciężkich łańcuchów (CH) albo lekkich łańcuchów (CL) immunoglobulin lub ich części, albo odpowiednio do nieimmunoglobulinowych łańcuchów i odpowiednich kwasów nukleinowych.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stałe regiony łańcuchów pochodzą z ludzkich IgG1 lub IgG3.
13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po selekcji dodatkowo prowadzi się etapy otrzymywania ludzkich łańcuchów VH i VL oraz fizycznego przyłączania tych łańcuchów do niebiałkowych środków farmaceutycznych i/lub innych cząsteczek biologicznie czynnych.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że łańcuchy VH lub VL są eksprymowane z sekwencji kwasów nukleinowych, które są wynikiem amplifikacji RT-PCR mRNA pochodzącego z niestymulowanych dojrzałych ludzkich limfocytów B.
15. 15. Ludzkie przeciwciało specyficzne względem ludzkiego natywnego antygenu 17-1A.
16. 16. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że zostało wytworzone sposobem zdefiniowanym w zastrz. 1.
17. 17. Przeciwciało według zastrz. 15 albo 16, znamienne tym, że rozpoznaje epitop domeny zewnątrzkomórkowej antygenu 17-1A, korzystnie zawierający co najmniej jedną sekwencję aminokwasową peptydu nr 8, 11, 13, 14, 59, 60, 77 i 79.
18. 18. Przeciwciało według zastrz. 15, znamienne tym, że łańcuch VH zawiera co najmniej jeden CDR sekwencji przedstawionej na fig. 7, nukleotydy 1 - 381, lub sekwencji przedstawionej na fig. 8, nukleotydy 1 - 339, i/lub łańcuch VL zawiera co najmniej jeden CDR sekwencji przedstawionej na fig. 6, nukleotydy 1 - 321, lub sekwencji przedstawionej na fig. 9, nukleotydy 1 - 321.
19. 19. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera przeciwciało zdefiniowane w zastrz. 15 i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.