CZ382498A3

CZ382498A3 - Prostředek s obsahem monoklonální protilátky

Info

Publication number: CZ382498A3
Application number: CZ983824A
Authority: CZ
Inventors: Julian Marcus Relton
Original assignee: Glaxo Group Limited
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 1999-05-12
Also published as: PE69098A1; AU2958997A; GB9610992D0; KR20000015935A; EP0907378A1; EA001860B1; NZ332625A; CO4850562A1; IS4892A; YU53098A; JPH11512753A; AU731950B2; CN1219882A; CA2254983A1; ES2258277T3; EA199800946A1; ATE318146T1; US6252055B1; AR007249A1; BR9709267A

Description

Prostředek s obsahem monoklonální protilátky

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká koncentrovaného protilátkového přípravku, farmaceutických přípravků obsahujících takový přípravek, jeho použití v terapii u lidí a způsobů pro jeho přípravu.

Dosavadní stav techniky

Většina z komerčně dostupných imunoglobulinů produkovaných ve vysokých koncentracích je získávána z lidského séra a je produkována průmyslem na zpracování krve. První přípravek přečištěného lidského imunoglobulinu G (IgG) použitý klinicky byl imunitní sérový globulin, který byl připraven v roce 1940 (Cohn,

E.J. et al., Preparation and properties of sérum and plasma proteins, J. Am. Chem. Soc. 68: 459 - 475 (1946) a Oncley, J.L. et al., The Separation of antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and β-lipoproteins into sub-fractions of human plasma, J. Am. Chem. Soc. 71: 541 - 550 (1949)).

Další generace přečištěných IgG byla vyvinuta v roce 1960, se zaměřením na přípravky vhodné pro intravenosní podání (Barandun, S. et al., Intravenous administration of human r-globulin, Vox. Sang. 7: 157 - 174 (1962)). První z nich - IgG intravenosní přípravek (Gamimune^R, Cutter Biological), byl připraven jako 5% (50 mg/ml) roztok IgG v 0,2 M glycinu, 10% maltose, pH 6,8.

Roztok byl stabilní po dobu minimálně 2,5 let při 5 °C. Základní kriteria pro přijatelnost intravenosních IgG (IVIG) produktů byly ty, aby IgG podléhal malé fragmentaci a aby nebyly přítomny • 4 44 44 4« 44 44 · 4 « ·9·4 «···

44 44 4 4444

44 · · · 4 4 4 444 444

4444444 4 4

44 44 4444 44 44 agregáty ο vysoké molekulové hmotnosti.

V současnosti jsou dostupné lidské terapeutické imunoglobulinové produkty jak pro intramuskulární (IMIG), tak pro intravenosní (IVIG) podání. IMIG jsou používány hlavně pro profylaxi hepatitidy A a někdy pro léčbu pacientů s agamaglobulinemií. IVIG jsou používány při léčbě primárních imunodeficiencí a pro léčbu idiopatické trombocytopenické purpury, stejně jako pro léčbu sekundárních imunodeficitů, různých infekcí, hematologických nebo jiných autoimunitních onemocnění. Obecně jsou IMIG produkty prodávány jako 16% (hmot./obj.) (160 mg/ml) roztoky a IVIG produkty jako 5% (hmot./obj.) roztoky (50 mg/ml).

Zkušenosti výrobců s IVIG ukázaly, že tyto přípravky jsou nestabilní v roztocích s relativně nízkou koncentrací (< 10% (hmot./obj.)) a že nestabilita se projevuje tvorbou nerozpustných částic při procesu známém jako ztrácení při skladování materiálu při pokojové teplotě (Fernandes, P.M. and Lundband,

J.L. Preparation of stable intravenous gamma-globulin: process design and scale up, Vox. Sang. 39: 101 - 112 (1980)). Komerčně dostupný 16,5% τ-globulin je obvykle stabilizován v pufrovaném glycinovém-salinickém roztoku. Použití maltosy v koncentraci 5 10% jako stabilizátoru bylo ukázáno jako účinné v ochraně 5% IVIG před tvorbou částic (Fernandes et al., výše).

Kromě ztrácení mají koncentrované (16,5%) roztoky IVIG tendenci k agregaci v průběhu dlouhodobého skladování. Až 10 30% (hmot./hmot.) roztoku IVIG může být tvořeno agregáty (Gronski, P. et al., On the nátuře of IgG dimers. I. Dimers in human polyclonal IgG preparations: kinetics studies Behring β · fcfc ·· fcfc 99

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · » · ··· ··· ···»·«· · 9

99 99 9999 99 99

Inst. Mitt 82: 127 - 143 (1988).

Většina z těchto agregátů jsou dimery produkované tvorbou komplexů mezi idiotypovými a anti-idiotypovými protilátkami. Protože monoklonální protilátky připravené ze supernatantů tkáňových kultur neobsahují anti-idiotypové protilátky, není tento druh dimerů přítomen. Nicméně, tvorba dimerů v těchto přípravcích může být způsobena tvorbou komplexů mezi částečně denaturovanými molekulami monomemí protilátky. Mechanický stres, jako je například stres při ultrafiltraci s tangenciálním tokem použité pro koncentrování protilátkových přípravků, může také vést ke zvýšení agregace (Wang, Y.-C.J. a Hanson, M.A.

Parenteral formulations of proteins and peptides: stability and stabilisers J. Parenteral Sci. Technol. 42: Suppl. S3 - S26 (1988) ) .

Koncentrované (> 100 mg/ml) přípravky imunoglobulinů jsou proto dostupné, ale dosud se jedná o přípravky polyklonálních protilátek získaných při zpracování krve, které jsou stabilizovány přidáním různých přísad jako je glycin a maltosa.

Je proto překvapivé, že byly získány přípravky monoklonálních protilátek v koncentracích > 100 mg/ml za absence přísad a bez současného zvýšení tvorby agregátů.

Derwent Abstract JP01268646A (An89-359879) popisuje injekční přípravek IgG₃ monoklonální protilátky mající koncentraci 0,1 gg až 100 mg/ml. Předmět popsaný v této přihlášce je mimo rozsah předkládaného vynálezu.

·· »· ·« ·· ·9 ··

9 9 · * · · · 9 9 9 · • 9 9* 9 9 · 9 9 9 9 • 99 · · 9 9 · » 999 999

9 9 9 9 9 9 · 9 • 9 ·· 99 ···· *9 99

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález proto poskytuje přípravek monoklonální protilátky pro podání lidem, kde protilátka v uvedeném přípravku je v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší, výhodně vyšší než 100 mg/ml. Přípravky s koncentrací vyšší než 350 mg/ml mohou být velmi viskózní a zpětné zisky se stávají nepřijatelně nízkými. Ideální koncentrace je mezi 100 a 300 mg/ml.

Přípravky podle předkládaného vynálezu jsou v podstatě prosté agregátů. Přijatelná hladina kontaminace agregáty by měla být menší než 5%, ideálně menší než 2%. Dosažitelné jsou hladiny až 0,2%, ačkoliv častěji se jedná o hladiny přibližně 1%. Přípravek je také výhodně bez přísad tradičně používaných pro stabilisaci polyklonálních přípravků, například bez glycinu a/nebo maltosy.

Předkládaný vynález proto poskytuje přípravek monoklonální protilátky pro podání u lidí, kde protilátka v uvedeném přípravku je v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší, výhodně vyšší než 100 mg/ml a přípravek je v podstatě bez agregátů.

Rekombinantní protilátky ve své přirozené podobě jsou produkovány v syntetickém a nepřirozeném prostředí buněčných kultur. Expresní systémy, které jsou použity pro generování dostatečných množství proteinu pro komerční použití jsou rutině založeny na myelomových hostitelských buňkách nebo na hostitelských ovariálních buňkách čínského křečka (CHO).

Pro kultivaci takových buněk byla vyvinuta komplexní syntetická media prostá kontaminujících zvířecích proteinů, což vede k charakteru glykosylace, který by přirozeně nebyl přítomen.

flfl flfl • · · 9 • · fl· • ♦ · · * · fl fl fl fl flfl »« «· ·· ·« • ••fl flflflfl • · · flflflfl • · · fl flflfl flflfl • · · fl » • fl flflflfl fl· flfl

Je proto ještě více překvapivé, že komplexní glykoprotein produkovaný za takových syntetických podmínek může být připraven v koncentracích několikrát vyšších, než se vyskytuje v normálním lidském séru se všemi jeho pufrovacími schopnostmi.

Předkládaný vynález proto poskytuje přípravek monoklonální protilátky pro podání u lidí, kde protilátka v uvedeném přípravku je rekombinantní protilátka a je v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší, výhodně vyšší než 100 mg/ml. Přípravek je výhodně v podstatě bez agregátů.

Během produkce přečištěných protilátek, ač pro terapeutické, nebo pro diagnostické použití, je významné, aby byla protilátka dostatečně stabilní při skladování a různé chemické entity mohou mít nežádoucí vliv na stabilitu protilátky. Například, o stopovém množství mědi (Cu++) je známo, že má destabilizující vliv na imunoglobulinové molekuly při skladování {WO 93/08837), a tento účinek může být eliminován formulací imunoglobulinové molekuly s vhodným chelačním činidlem pro ionty mědi, například s EDTA nebo citratovými ionty.

Předkládaný vynález je použitelný pro přípravu imunoglobulinů všech tříd, t.j. IgM, IgG, IgA, IgE a IgD, a také je použitelný pro přípravu Fab fragmentů a bispecifických protilátek. Vynález je výhodně použit pro přípravu imunoglobulinů třídy IgG, která obsahuje podtypy IgG_iř IgG_a, IgG₃ a IgG₄. ještě výhodněji je vynález použit pro přípravu imunoglobulinů třídy IgG₄ a IgG_iřnejlépe IgG^.

Vynález je zejména použitelný pro přípravu rekombinantních protilátek, přesněji chimérických protilátek nebo humanizovaných ·· ·* • · · • · ·· • · ·

·· ·· • · · · · • · · · ·· ····* (s přenosem CDR) protilátek. Jednotlivé příklady zahrnují chimérické nebo humanizované protilátky proti CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CDlla, CDllb, CD18, CD19, CD23, CD25, CD33, CD54 a CDw52 antigenu. Další příklady zahrnují chimérické nebo humanizované protilátky proti různým nádorovým buněčným markérům, například 40 kD (J. Cell. Biol. 125 (2) 437 - 446 (1994)) nebo antigenům infekčních agens jako je virus hepatitidy B nebo cytomegalovirus. Zejména výhodné příklady zahrnují chimérické nebo humanizované protilátky pro antigenům CDw52, CD4 a CD23.

Imunoglobuliny pro terapeutické použití budou obyčejně podány pacientovi ve formě farmaceutického přípravku. Takové přípravky výhodně obsahují, kromě imunoglobulinu, fyziologicky přijatelný nosič nebo ředidlo, popřípadě ve směsi s jedním nebo více jinými činidly jako jsou jiné imunoglobuliny nebo léky, jako například antibiotika. Vhodné nosiče zahrnují, ale nejsou omezeny na, fyziologický roztok, fosfátem pufrovaný salinický roztok, glukosu a pufrovaný salinický roztok, citrátem pufrovaný salinický roztok, pufr kyselina citronová/citrat sodný, maleinanový pufr, například pufr kyselina jablečná/hydroxid sodný, sukcinatový pufr, například kyselina jantarová/hydroxid sodný, acetatový pufr, například pufr octan sodný/kyselina octová nebo fosfátový pufr, například pufr dihydroortofosforečnan draselný/hydroortofosforečnan sodný. Volitelně obsahuje přípravek Polysorbat pro stabilisaci protilátky. Alternativně může být imunoglobulin lyofilizován (sušen sublimací za mrazu) a rekonstituován pro použití přidáním vody a/nebo vodného pufrovacího roztoku jak je popsáno výše.

Výhodné pH farmaceutických přípravků podle předkládaného vynálezu bude záviset na určitém způsobu podání. Nicméně, pro maximalizaci rozpustnosti protilátky v koncentrovaném roztoku by pH roztoku mělo být odlišné od pH izoelektrického bodu protilátky.

Tak, podle dalšího aspektu, vynález poskytuje přípravek monokionální protilátky pro podáni u lidí, kde protilátka v uvedeném přípravku je v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší a pH přípravku je odlišné od pH izoelektrického bodu protilátky.

Způsoby podání jsou běžné parenterální způsoby, včetně intravenosní, intramuskulární a intraperitoneální injekce nebo podání. Nicméně, přípravek je zejména užitečný při výrobě subkutáních přípravků, které musí mít malý objem, například 1 ml na dávku. Pro zajištění podání terapeutické dávky v takových přípravcích bude nezbytně nutný koncentrovaný přípravek. Výhodné koncentrace pro subkutánní přípravky jsou například V a- ozíhs 2 x oči 100 mg/ml do 200 mg/ml, například 150 mg/ml až 200 mg/ml. Subkutánní přípravky mají tu výhodu, že mohou být podány pacientem samotným, což eliminuje potřebu hospitalizace pro intravenosní podání.

Výhodně jsou subkutánní přípravky podle předkládaného vynálezu izotonické a pufrované na určité pH. Výhodný rozsah pH pro subkutánní přípravky bude obecně v rozmezí od pH 4 do pH 9. Výhodné pH, a proto i pufr, budou záviset na izoelektrickém bodu určité protilátky, jak bylo uvedeno výše. Tak, v případě subkutánních přípravků obsahujících anti-CD4 protilátky, bude pH výhodně v rozmezí pH 4 až pH 5,5, například pH 5,0 až pH 5,5, například pH 5,5, a v případě anti-CD23 protilátky v rozmezí pH 4 až pH 6,5. Proto jsou výhodnými pufry pro použití v subkutánních přípravcích maleinanový, sukcinatový, acetatový nebo, lépe, • · flfl ·· flfl ···· fosfátový pufr. Pufry jsou výhodně použity v koncentraci 50 mM až 100 mM.

Subkutánní přípravky podle předkládaného vynálezu mohou také volitelně obsahovat chlorid sodný pro úpravu tonicity roztoku.

Tak, podle dalšího aspektu, vynález poskytuje přípravek monoklonální protilátky pro subkutánní podání u lidí, kde protilátka v uvedeném přípravku je v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší a pH přípravku je odlišné od pH izoelektrického bodu protilátky.

V dalším aspektu vynálezu je monoklonální přípravek míněn pro použití v terapii u lidí. Mohou být léčeny různé nemoci u lidí, jako jsou nádorové a infekční nemoci, jak byly například uvedeny výše, a imunitní dysfunkce jako jsou onemocnění zprostředkovaná T-buňkami včetně těžké vaskulitidy, revmatoidní artritidy, systémového lupus erythematodes, a také autoimunitní onemocnění jako je roztroušená sklerosa, reakce štěpu proti hostiteli, psoriasa, juvenilní diabetes, Sjogrenův syndrom, onemocnění štítné žlázy, myastenia gravis, rejekce transplantátu, zánětlivá onemocnění střev a asthma.

Vynález proto poskytuje přípravek koncentrované monoklonální protilátky jak je zde popsán pro výrobu léku pro léčbu výše uvedených onemocnění. Také je poskytnut způsob pro léčbu lidí, kteří mají jakékoliv z takových onemocnění, ve kterém je uvedeným jedincům podáno terapeuticky účinné množství přípravku podle předkládaného vynálezu.

Dávka takového protilátkového přípravku se bude velmi lišit • ·· · ···· ···· ···· · · · ···« • ·· · · ♦ · · · ··· ··· »·«··«· · · ·· ·· ·· ···· ·· ·· podle léčeného stavu a podle příjemce léčby, ale bude v rozmezí od 50 do přibližně 2000 mg pro dospělé pacienty, výhodně 100 1000 mg podaných denně nebo týdně po dobu mezi 1-30 dny a v případě potřeby může být opakována. Dávky mohou být podány jako jedna dávka nebo jako více dávek.

Protilátkový přípravek může být koncentrován různými způsoby, jako je ultrafiltrace s příčným tokem (tangenciálním) nebo míchaná ultrafiltrace, kdy výhodným způsobem je ultrafiltrace s tangenciálním tokem. Nízké zpětné zisky a tvorba sraženin může být problémem při koncentrování protilátky. Předkládaný vynález řeší tento určitý problém způsobem koncentrování, který obsahuje redukci střihového stresu ultrafiltrace s příčným tokem při vysokých rychlostech cirkulace (500 ml/min). Redukce recirkuiace například na 250 ml/min vede k úspěšnému koncentrování protilátky na > 150 mg/ml a k vysokému zpětnému zisku materiálu.

Vynález proto poskytuje způsob pro přípravu koncentrovaného přípravku protilátky jak je zde popsán. Zpětný zisk protilátky v koncentrovaném přípravku je výhodně vyšší než 70%, ale běžné je vyšší než 90%.

Koncentrované protilátkové přípravky připravené podle výše uvedených způsobů mohou dále obsahovat další složky, jako jsou pufry, soli, Polysorbat a/nebo EDTA. Tato další činidla nemusí být nutná v konečném farmaceutickém přípravku, ve kterém mohou být odstraněny nebo vyměněny za použití diafiltrace podle běžných metod známých v oboru. Například, koncentrované protilátkové přípravky obsahující citratový pufr a EDTA mohou být za použití této metody přeměněny na koncentrované protilátkové přípravky obsahující fosfátový a maleinanový pufr.

I • •00 0 0 0 0 · Μ · • · · · · 0 · 0 0 0 0 • 00 0 0 0 0 0 0 000 000 • 000000 0 0 • 0 00 00 0000 00 00

Vynález také poskytuje nové koncentrované protilátkové přípravky, které je možné získat takovými metodami.

Následující příklady neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Koncentrování Campath 1H

Minitan ultrafiltrační příslušenství (Minitan XX42 ASY MT Ultrafiltration System, Millipore) bylo použito spolu s 2 polysulfon 30 K NMWCO filtračními plotnami (Minitan PTTK 30K NMWCO, Millipore) a trubičky a plotny byly desinfikovány po dobu 30 minut 0,1 M NaOH podle návodu výrobce (Minitan Ultrafiltration System: Assembly, Operation, Maintenance Instructions, Millipore Corporation, P15076). Desinficiens bylo odstraněno výplachem 1-2 litry fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS), pH 7,2.

Campath-1H (humanizovaná protilátka proti CDw52 antigenů: Reichmann et al., Nátuře 332: 323 - 327 (1988)) (2200 ml při 16,4 mg/ml v 50 mM citrátu sodného, pH 6,0) se nechala cirkulovat přes retenční stranu membrán při průtoku 600 ml/min při zpětném tlaku 2 - 2,5 baru. Zpětný tlak byl udržován na této hodnotě v průběhu zbytku pokusu a vymývací průtok byl měřen v různých časových intervalech. Vzorky protilátky byly odstraněny z retenční nádoby v různých časových obdobích a byly testovány na koncentraci protilátky, zákal, % agregátů a viskozitu.

Protože byla rychlost filtrace v tomto pokusu pomalá, bylo nezbytné provádět koncentraci v průběhu 3 dní. Systém byl • · · · · » · · φ • ΦΦΦΦΦΦ · · « φ «φ ΦΦ ···· ΦΦ ΦΦ propláchnut PBS a koncentrát byl uskladněn přes noc při 4 °C. Po dnu 2 bylo do koncentrátu přidáno 0,01 % (hmot./obj.) thiomersalu před skladováním přes noc pro prevenci mikrobiální kontaminace.

Na konci koncentrace byl systém propláchnut 500 ml PBS, potom se nechalo dalších 500 ml PBS recirkulovat okolo retenční strany membrán po dobu 30 minut. Koncentrace protilátky v těchto výplachách byla určena měřením absorbance při 280 nm.

Celková doba nutná pro koncentrování Campath-1H z 16,4 mg/ml ne 257 mg/ml za použití pouze 2 ploten v Minitan byla 17,25 hodin. Tabulka 1 (a) ukazuje změnu v koncentraci Campath-1H během této doby.

Tabulka la

Čas (h)	0	5	6,5	9,5	11,5	12,5	14,5	16	17	17,25
Koncentrace (mg/ml)	16	34	41	79	106	136	190	230	301	257

Koncentrace se zvyšovala exponenciálním způsobem do maxima 300 mg/ml po 17 hodinách. Konečná koncentrace byla o něco nižší než je tato vrcholová hodnota; nesoulad je pravděpodobně způsoben obtížemi při získání representativního vzorku z velmi viskózní kapaliny. Tabulka l(b) ukazuje, že koncentrování Campath-1H bylo provázeno recipročním snížením průtoku výplachu.

• · · · · · 9 · · ·«·*·« ····»·· · · • · «· « · ···· · · · ·

Tabulka lb

Koncentrace (mg/ml)	16	34	41	79	106	136	189 301	257
Průtok (ml/min)	4	3	2,5	1,5	1,25	0,9	0,5
Viskozita (cPs)	1	1	1	1	1	1	0,96 4,85	8,1

Tato tabulka také ukazuje dramatické zvýšení viskozity ve zbývajícím koncentrátu při koncentraci vyšší než 189 mg/ml.

Tabulka l(c) ukazuje, že zpětný zisk byl vysoký do koncentrace 190 mg/ml, ale při vyšší koncentraci se začal rychle snižovat se zvyšující se viskozitou, která vedla k přilnutí materiálu na skleněnou výbavu a trubice a díky ztrátám v průběhu promývání přes uskladněním přes noc. Konečný zpětný zisk materiálu o koncentraci 257 mg/ml (s vyloučením materiálu odebraného v průběhu odebírání vzorků a ztrát při promytí) byl 63,4%. dalších 14,6% bylo získáno v prvním výplachu systému PBS a 0,5% ve druhém, recirkulovaném PBS výplachu. Celkem bylo proto získáno 78,5% počátečního materiálu na konci pokusu (s vyloučením materiálu odebraného v průběhu odebírání vzorků a ztrát při promytí), se ztrátou 21,5% způsobenou hlavně přilnutím viskosního materiálu k skleněné výbavě a plastu.

• ·· · · ·· · • · ·· · * · • · · ··· « · • · · · · · · • · ·» · · ····

Tabulka l(c)

Koncentrace	(mg/ml)	16	41	106	190	257
Zpětný zisk	(%)	100	97	97	85	63

Byl vypočítán zákal roztoku Campath-1H během koncentrování. Absorbance vhodně ředěných 1,0 ml aliquot vzorků protilátky při 650 nm byla použita pro měření zákalu. Tabulka l(d) ukazuje, že nebylo přítomno žádné zvýšení.

Tabulka 1(d)

Koncentrace (mg/ml)	16	41	79	106	136	190	301	257
Zpětný zisk (%)	0,96	1,16	1,1	0,91	1	1,01	1,11	1,01
Agregáty (%)	0,002	0,015	0,023	0,032	0,042	0,032	0,035

Vzorky pro určení agregátů byly ředěny na koncentraci proteinu 1 mg/ml za použití PBS a 50 μΐ nebo 100 μΐ aliquot injikovaných do TSK-GEL G3000SW_xrj HPLC kolony s vylučováním podle velikosti. Kolona byla vyvíjena za použití 0,05% NaN₃ a 0,1 M Na₂SO₄ v 1 M fosfátovém pufru, pH 6,7, při průtoku 1,0 ml/min. Množství agregátů bylo určeno integrováním píků absorbance při 280 nm a bylo zjištěno, že je v celém průběhu okolo 1%.

to··· · · · · · · · • · · « · · · · · ····*· toto····· · · «· toto ·· to to to to ·> ··

Příklad 2 - Koncentrování anti-CD4 protilátky - metoda A

Minitan ultrafiltrační příslušenství bylo sestaveno a desinfikováno stejně jako v příkladu 1 s tou výjimkou, že byly použity 8 polysulfon 30K NMWCO ploten místo 2 a celé příslušenství bylo umístěno ve sterilním boxu. Anti-CD4 protilátka (2142 ml při 13,9 mg/ml v 50 mM citrátu sodného, pH 6, 0) se nechala cirkulovat přes retenční stranu membrán při průtoku 190 ml/min při zpětném tlaku 2 - 2,5 baru. Zpětný tlak byl udržován na této hodnotě v průběhu zbytku pokusu a vymývací průtok byl měřen v různých časových intervalech. Vzorky protilátky byly odebrány z retenční nádoby v různých časových intervalech a byly testovány na koncentraci, CD4 vazbu, zákal, % agregátů a viskozitu.

Na konci pokusu byla retenční kapalina vypumpována z Minitan příslušenství a retenční strana membrán byla promyta 500 ml 50 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 a byly odebrány 50 ml frakce výplachu. Nakonec byl systém vypláchnut recirkulací 500 ml 50 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 okolo retenční strany membrán po dobu 30 minut. Koncentrace protilátky v těchto vypláchnutých frakcích byla určena měřením jejich absorbance při 280 nm.

Výsledky jsou ukázány v tabulkách 2(a)-(d). Zvýšení počtu ploten použitých ke koncentrování vedlo ke zkrácení doby nutné pro dosažení koncentrace 250 μ$/πι1 - 250 mg/ml na 6 hodin ve srovnání s 17,25 hodinami pro koncentrování Campath-1H (viz tabulka 2(a)). Tabulka 2(a) také ukazuje, že viskozita anti-CD4 protilátky se měřitelně nezvýšila, dokud nebyla dosažena koncentrace 113 mg/ml. Nad touto koncentrací se viskozita ♦ · ·

• « · 444 449 • · 4 4 44 zvyšovala rychle.

Tabulka 2(a)

Čas (h)	0	2	3,5	5	6
Koncentrace mg/ml	13,9	47,2	83	112,8	252
Viskozita cPs	1	1	1	1	9,7

Při koncentracích nad 83 mg/ml byla pozorována významná opalescence v koncentrovaném materiálu a ta byla způsobena tvrobou sraženiny při zvyšování koncentrace nad tuto hodnotu. Toto vedlo ke snížení rychlosti průtoku výplachu, jak je ukázáno v tabulce 2(b) a také ke zvýšení zákalu jak je ukázáno v tabulce 2(c). Hladina agregátů zůstávala velmi nízká při všech koncentracích a ve všech případech byla nižší než 0,2% (viz tabulka 2(c)). Tabulka 2(b) ukazuje, že zpětné zisky byly vysoké až do zvýšení viskozity a tvorby sraženin, kdy dramaticky poklesly na konečný zpětný zisk 50 % v retenční kapalině po odstranění z přístroje.

• · • · ι • ·· • fc fcfc > · · ·

I · · · ··· ··· • ♦ • fc ··

Tabulka 2(b)

Koncentrace (mg/ml)	13,9	47,2	83	112,8	252
Zpětný zisk (%)	100,0	100,0	100,0	113,0	51,4
Průtok	13,5	3,2	2,0	2,5
(ml/min)

Tabulka 2(c)
Koncentrace (mg/ml)	13,9	47,2	83	112,8	252
Zákal A 650 nm	0,011	0,012	0,030	0,185
Aggregáty	0,140	0,150	0,150	0,160	0,170

(%)

Tento slabý zpětný zisk byl způsoben vysokou viskozitou koncentrované anti-CD4 protilátky, která způsobovala její přilnutí na trubice a membrány ultrafiltračního systému. Všechny anti-CD4 protilátky ztracené tímto způsobem mohly být následně získány při promytí systému pufrem. Tabulka 2(d) ukazuje zpětný zisk anti-CD4 protilátky v opakovaných 50 ml promývacích frakcích v průběhu promývání Minitan příslušenství na konci pokusu. První frakce obsahuje 11,7 g anti-CD4 protilátky v koncentraci 235 • «· * • · · ♦ · • · · fl « · · · mg/ml, takže může být sloučena s 12,6 g koncentrátu prve získaného z přístroje v koncentraci 252 mg/ml bez významného ředění celkové koncentrace. Zbývající promývací frakce obsahovaly celkem 5,1 g anti-CD4 protilátky, ale ta byla přítomna v koncentracích menších než 57 mg/ml, takže nemohla být sloučena s koncentrovaným materiálem. Celkový zpětný zisk v koncentrátu a první promývací frakci byl 90%. Bylo zjištěno, že při uskladnění konečné koncentrované anti-CD4 protilátky přes noc při 4 °C došlo k určitému rozpuštění sraženiny.

Tabulka 2(d)

ml	50	100	150	200	250	300	350	400	450	500
mg	11727	2828	866	379	245	202	175	151	132	125

Byl proto proveden pokus pro určení koncentrace, při které byla vysrážená anti-CD4 protilátka zcela resolubilizována. 10 ml aliquota anti-CD4 protilátky při 250 mg/ml byla progresivně ředěna přidáním 50 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6,0. Absorbance vhodně ředěných 1,0 ml aliquot vzorků protilátky při 650 nm byla použita jako měření zákalu. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Koncentrace (mg/ml) 237,7 149,5 110,4 88,6 76,3 60,3

Zákal (A650 nm)

1,17

0,096 0,082 0,074 0,03 0,027 ···· BBBB ····

Β « Β· Β Β · BBBB • · · BBB Β Β Β ··· ♦ ·«

ΒΒΒΒΒΒΒ · ♦

ΒΒ ΒΒ Β Β ΒΒΒΒ Β · ΒΒ

Sraženina se rozpustila, ale zákal a opalescence nezmizela zcela, dokud nebylo dosaženo koncentrace anti-CD4 protilátky okolo 80 mg/ml. Nad toutu koncentrací byla v průběhu koncentrování nejprve pozorována opalescence, takže se zdá, že sraženina je reversibilní a závislá na koncentraci.

Příklad 3 - Koncentrování anti-CD4 protilátky - metoda B

Úprava anti-CD4 protilátky pufrem

Anti-CD4 protilátka (1460 ml; 24 g) byla připravena v 50 mM citrátu sodném, 0,05 mM EDTA, pH 6,0. Tento pufr byl vyroben z více než 100 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 přidáním pevné kyseliny citrónové do protilátkového přípravku a úpravou pH na 6,0 za pomoci NaOH. Vzniklý přípravek byl sterilně filtrován přes 0,22 μπι filtr a byl uskladněn jako 2 aliquoty po asi 12 g.

Koncentrace anti-CD4 protilátky ve Filtron Ultrasette

Filtron Mini-Ultrasette a Watson-Marlow pumpa byly umístěny v chladné místnosti. Mini-Ultrasette (limit 30 K ultrafiltr Filtron s příčným tokem) byl promyt vodou a potom desinfikován po dobu 30 minut 0,1 M NaOH podle návodu výrobce (Mini Ultrasette Tangential Flow Device Operating Instructions & Mini Ultrasette Care an Use Manual, Filtron Technology Corporation). Desinficiens bylo odstraněno promytím sterilní vodou a potom 1-2 litry sterilního PBS, pH 7,2, dokud nebylo pH výtoku 7,2. Anti-CD4 se nechala cirkulovat přes retenční strany membrán při průtoku 250 ml/min po celou dobu.

Po koncentrování anti-CD4 protilátky na asi 150 mg/ml byla • ·

«4 ·» • 4 4 4

4 44 retenční kapalina vypumpována z Mini-Ultrasette a retenční strana membrán byla promyta 3 x 20 ml 50 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 a každá 20 ml frakce výplachu byla odebrána. Koncentrace protilátky v těchto vypláchnutých frakcích byla určena měřením jejich absorbance při 280 nm jak je popsáno v příkladu 1.

Výsledky ukazuji, že redukce průtoku retenční kapaliny může poskytnout způsob pro koncentrování anti-CD4 na asi 150 mg/ml pomocí ultrafiltrace s příčným tokem a bez jakéhokoliv srážení. Toto bylo testováno za použití Filtron Mini-Ultrasette a rychlosti cirkulace retenční kapaliny 250 ml/min.

Vhodným izotonickým pufrem pro tuto práci byl 100 mM citrát sodný, 0,05 mM EDTA, pH 6,0. Proto bylo zbývajících 1460 ml anti-CD4 v 50 mM citrátu sodném, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 znovu formulováno přidáním 16,8 g kyseliny citrónové a pH konečného roztoku bylo upraveno za použití NaOH. Tento materiál byl sterilně filtrován a rozdělen do dvou stejných aliquot, které byly potom samostatně koncentrovány na Filtron ultrafiltračním přístroji za použití recirkulační rychlosti 250 ml/min. Výsledky jsou ukázány v tabulce 4.

Tabulka 4: Koncentrování anti-CD4 na více než 100 mg/ml v ultrafíltrační s příčným tokem kyvetě při recirkulační rychlosti 250 ml/min.

Parametr	Před koncentrováním	Koncentrace 1	Koncentrace 2
Maximální dosažená koncentrace (mg/ml)	-	169	156
Koncentrace konečného produktu (mg/ml)	14,4	106,4	100,5
Zpětný zisk po koncentraci (%)	-	90	95
Doba nutná pro koncentraci (h)	-	11	9
Agregáty (%)*	4,14	3,95	3,97
Zákal (A650 nm)	0,003	0,018	0,037
Osmolalita (mOs/kg)	281	288	306
Vazba CD4 (mg/ml)	20	98,8	68,3

* Analýza agregátů HPLC s vylučováním podle velikosti

Vzorky pro určení agregátů byly ředěny na koncentraci proteinu ·· ·* ·· 0* ··

0·· 0 00 0 0 00 0 00 00 ·· 0 0000 0 00 000 0 0 0 000000 0000000 · 0

00 00 0000 00 00 mg/ml za použiti PBS a 50 μΐ nebo 100 μΐ aliquot injikovaných do TSK-GEL G3000SW_xl HPLC kolony s vylučováním podle velikosti. Kolona byla vyvíjena za použití 0,05% NaN₃ a 0,1 M Na₂SO₄ v 1 M fosfátovém pufru, pH 6,7, při průtoku 1,0 ml/min. Množství agregátů bylo určeno integrováním píků absorbance při 280 nm.

Obě koncentrování dosahovaly maximální koncentrace > 150 mg/ml v ultrafiltračním přístroji bez negativního ovlivnění rozpustnosti protilátky. Koncentrování trvalo 9-11 hodin. Konečné koncentrace asi 100 mg/ml byly výsledkem ředění s výplachy, které bylo nutné pro maximalizaci zpětného zisku z ultrafiltračního přístroje. Celkové zpětné zisky byly 90-95% a nebyla pozorována žádná viditelná sraženina ani zvýšení hladiny agregátů. Po koncentrování se mírně zvýšil zákal, jak je měřen absorbancí při 650 nm, který způsobil mírnou opalescenci konečného koncentrátu, ale tento byl odstraněn formulováním s Polysorbatem 80 a sterilní filtrací a nebyl považován za významný.

CD4 vazebná aktivita pro koncentrování 1 byla téměř 100 mg/ml, jak bylo předpokládáno, ale mnohem nižší hodnoty byly získány pro koncentrování 2. Konečná osmolalita sloučeného materiálu z koncentrací 1 a 2 byla přibližně 297 mOs/kg a sloučený materiál byl čirý, světlý roztok, který snadno procházel přes sterilní 0,2 μτη filtr.

Koncentrování Anti-CD4 protilátky v míchací kývete

330 ml aliquoty anti-CD4 protilátky (jak je uvedena výše) byly koncentrovány při 5 °C v Amicon míchací ultrafiltrační kývete (opatřené YM30 membránou Amicon) na konečnou koncentraci 170

999 • ·· • 9 9 9

9

9 9

9

9999

9 9

999

9

99 mg/ml za použití tlaku 1,5 baru při použití plynného dusíku. Anti-CD4 protilátka v ultrafiltrační kyvetě byla vzorkována v intervalech a koncentrace byla určena měřením absorbance při 280 nm a zákal byl určen měřením absorbance při 650 nm. Na konci pokusu byl koncentrovaný materiál odstraněn z ultrafiltrační kyvety a byl sterilně filtrován přes 0,22 μτη. filtr.

Pro překonání vysokých střihových sil generovaných na Filtron ultrafiltračním přístroji s příčným tokem bylo koncentrování v míchací ultrafiltrační kyvetě za použití 50 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 jako pufru. Tabulka 5 ukazuje výsledky z tohoto pokusu.

Tabulka 5: Koncentrace ultrafiltrací anti-CD4 v Amicon míchací kyvetě

Čas (h)	Objem retenční kapaliny (ml)	Přibližná koncentrace Rychlost
retenční kapaliny (mg/ml)	ultrafiltračního toku (ml/h)
0	330	16,7	-
6	150	37	30
9	100	55	17
11	75	73	12
14	46	120	10
38	40	134	0,25
54	27	171*	0,81

Aktuální koncentrace určená měřením absorbance při 280 nm.

4 4 #444

44444 444

4 4 4 4

4444 44 44 » 4 4 ι

4 4

Celkem trvala koncentrace okolo 2,5 dne a rychlost toku se rychle snižovala se stoupající viskozitou koncentrované protilátky. Konečná koncentrace 171 mg/ml byla úspěšně dosažena bez známek srážení. Tento materiál byl odstraněn z ultrafiltrační kyvety a membrána byla promyta dostatečným množstvím 50 mM citrátu sodného, 0,05 mM EDTA, pH 6 za zisku konečné koncentrace 100 mg/ml po sloučení s koncentrátem.

Tento materiál snadno procházel přes 0,2 μτα. sterilní filtr. Aktuální měřená koncentrace tohoto sloučeného materiálu byla 94,3 mg/ml v objemu 46 ml. Toto odpovídá zpětnému zisku po kroku ultrafiltrace 79%.

Tento pokus proto poskytuje důkaz, že 50 mM citrát sodný, 0,05 mM EDTA, pH 6,0 je vhodným pufrem pro koncentraci anti-CD4 alespoň 171 mg/ml a že to byly pravděpodobně vysoké střihové síly, které způsobily srážení v původních ultrafiltračních pokusech s příčným tokem při použití jak Minitan, tak Filtron Mini-Ultrasette, jak byly uvedeny výše.

Příklad 4 - Subkutánní přípravky pro anti-CD4 a anti-CD23 protilátky

a) Anti-CD4 nebo anti-CD23 protilátka Dihydroortofosforečnan draselný (anhydrický)

Hydroortofosforečnan sodný

0,15 g 0,0656 g

0,0673 g

Na HPO . 12H O

4 2

NaCl 0,6263 g

Polysorbate 80 (% celkové hmotnosti přípravku) 0,01 Voda do 100 g * 4

999

9 4 4 9 9 9 9 9 9 • 9 4 994 9 4 4 444

4 4 4 9 4 4 · · •· 44 94 9444 4 9 44

b) Anti-CD4 nebo anti-CD23 protilátka 0,15 g

Octan sodný 3,674 g

Ledová kyselina octová, 10% roztok 0,315 g

NaCl 0,630 g

Polysorbate 80 (% celkové hmotnosti přípravku) 0,01

Voda do 100 g

c) Anti-CD4 nebo anti-CD23 protilátka 0,15 g

Kyselina maleinová 0,0227 g

0,5 M NaOH 6,09 g

NaCl 0,777 g

Polysorbate 80 (% celkové hmotnosti přípravku) 0,01 Voda do 100 g

d) Anti-CD4 nebo anti-CD23 protilátka 0,15 g

Kyselina jantarová 0,203 g

0,5 M NaOH 6,54 g

NaCl 0,779 g

Polysorbate 80 (% celkové hmotnosti přípravku) 0,01 Voda do 100 g

NB. Každý z přípravků a), b), c) nebo d) může volitelně obsahovat 0,05 mM EDTA.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Prostředek s obsahem monoklonáiní protilátky pro podání u lidí, vyznačující se tím, že koncentrace protilátky v prostředku je 100 mg/ml nebo vyšší.
2. Prostředek s obsahem monoklonáiní protilátky pro podání u lidí, vyznačující se tím, že koncentrace protilátky v prostředku je 100 mg/ml nebo vyšší a prostředek je v podstatě prostý agregátů.
3. Prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t i m, žr protilátks je v něm přítomna v koncentraci vyšší než 100 mg/ml.
4. Prostředek podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, žejev něm protilátka přítomna v koncentraci 100 až 350 mg/ml.
5. Prostředek podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že jako protilátku obsahuje protilátku typu IgG.
6. Prostředek podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že jako protilátku obsahuje rekombinantní protilátku.
7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že jako protilátku obsahuje pozměněnou protilátku.
8. Prostředek podle nároku 7, vyznačující se tím, že jako protilátku obsahuje chimérní protilátku nebo protilátku s přeneseným CDR.

*· ·· ·· ·· ·· ••99 · · · « ·«·· • 9 ·· ·· · ···· «······ · φ ««φ ·«· • •••••· · φ
9· ·· Φ* ···· «« ··

9. Prostředek podle některého z nároků 1 až 8, vyzná'Sující se t í m, že se váže na T-buňky nebo na nádorové antigeny.
10. Prostředek podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se jeho pH liší od pH isoelektrického bodu protilátky.
11. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje monoklonální protilátku v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší a farmaceuticky přijatelnou přísadu.
12. Farmaceutický přípravek podle nároku 11, v y z n a čující se tím, že je upraven pro podkožní podání.
13. Prostředek s obsahem monoklonální protilátky podle některého z nároků 1 až 10 pro použití v therapii u lidí.
14. Použití prostředku s obsahem monoklonální protilátky, v němž je protilátka obsažena v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší pro výrobu léku pro léčbu onemocnění, zprostředkovaných T-buňkami.
15. Způsob výroby prostředku s obsahem monklonální protilátky, v němž koncentrace této protilátky je 100 mg/ml nebo vyšší, vyznačující se tím, že se využívá ultrafiltrace s tangenciálním tokem.
16. Prostředek s obsahem monoklonální protilátky, obsahující tuto protilátku v koncentraci 100 mg/ml nebo vyšší, získatelný ultrafiltrací s tangenciálním tokem.