ES2258277T3 - Procedimiento de concentracion de soluciones de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA PREPARACION DE ANTICUERPOS CONCENTRADOS, A FORMULACIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENE DICHA PREPARACION, SU USO EN TERAPIA HUMANA Y A LOS PROCESOS PARA SU PREPARACION.

Description

Procedimiento de concentración de soluciones de anticuerpos.

La presente invención se refiere a una preparación concentrada de anticuerpo, a las formulaciones farmacéuticas que contienen dicha preparación, a su uso en terapia humana y a los procedimientos para su preparación.

La mayoría de inmunoglobulinas comercialmente disponibles producidas a alta concentración se derivan del suero humano y se producen por la industria de productos sanguíneos. La primera preparación humana purificada de inmunoglobulina G (IgG) usada clínicamente fue la inmunogobulina del suero, que se preparó en la década de 1940 (Cohn, EJ., y col "Preparation and properties of serum and plasma proteins". J. Am. Chem. Soc. Pg 68, 459-475 (1946) y Oncley, J. L. y col., "The separation of antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and \beta-lipoproteins into sub-fractions of human plasma" J. Am. Chem. Soc. 71, 541-550 (1949)).

La siguiente generación de IgG purificadas se desarrolló en los años 60, y se centró en preparaciones adecuadas para la administración intravenosa (Barandun, S. y col., "Intravenous administration of human \gamma-globulin". Vox. Sang. 7, 157-174 (1962)). La primera de estas preparaciones intravenosas de IgG (Gamimune®, Cutter Biological), se formuló en forma de una solución de IgG al 5% (50 mg/ml) en glicina 0,2 M, maltosa al 10%, pH 6,8. Esta solución era estable durante al menos 2,5 años a 5ºC. Los criterios clave para la aceptación de los productos de IgG intravenosa (IVIF) eran que la IgG tenía que experimentar poca fragmentación y que no estuvieran presente agregados de alto peso molecular.

Hoy en día, están disponibles los productos terapéuticos de la inmunoglobulina humana bien para administración intramuscular (IMIG) o intravenosa (IVIG). La IMIG se usa principalmente para la profilaxis de la hepatitis A y algunas veces para el tratamiento de los pacientes agammaglobulinaémicos. La IVIG se usa en el tratamiento de las inmunodeficiencias primarias y de la púrpura trombocitopénica idiopática, así como para las inmunodeficiencias secundarias, infecciones diversas, enfermedades hematológicas y otras autoinmunes. En general, los productos IMIG se comercializan en forma de soluciones al 16% (160 mg/ml) y los productos IVIG en forma de soluciones al 5% (p/v) (50 mg/ml).

La experiencia de los fabricantes con IVIG la ha demostrado que estas preparaciones son inestables en soluciones relativamente diluidas (< 10% (p/v)) y la inestabilidad se manifiesta por la formación de partículas insolubles mediante un procedimiento conocido como "supresión" cuando el material se almacena a temperatura ambiente (Fernández, P. M. y Lundand, J. L. "Preparation of a stable intravenous gamma-globulin: process design and scale up". Vox. Sang. 39, 101-112 (1980)). La \gamma.globulina comercialmente disponible al 16,5% se estabiliza de manera usual en una solución salina tamponada con glicina. El uso de maltosa a un 5-10% como estabilizador ha demostrado ser efectivo en la protección de la IVIG al 5% de la formación de particulados (Fernández y col más arriba).

De manera adicional a la supresión, las soluciones concentradas (16,5%) de IVIG tienen tendencia a agregarse durante el almacenamiento a largo plazo. Se puede quedar dentro de los agregados hasta un 10-30% (p/p) de la solución de IVIG (Gronski, P. y col., "On the nature of IgG dimers. I. Dimers in human polyclonal IgG preparations: kinetic studies". Behring Inst. Mitt. 82, 127-143 (1988)).

La mayoría de estos agregados son dímeros producidos por complejos de anticuerpos idiotípicos y antiidiotípicos. Ya que los anticuerpos preparados a partir de sobrenadantes de cultivos de tejido no contienen anticuerpos antiidiotipo, este tipo de dímeros está ausente. Sin embargo, se puede producir la formación del dímero en estas preparaciones por complejación entre moléculas de anticuerpo monomérico parcialmente desnaturalizadas. El estrés mecánico tal como el que se encuentra durante el flujo tangencial de ultrafiltración usado para concentrar las preparaciones de anticuerpos puede conducir también a un incremento en la agregación (Wang, Y. -C. J. y Hanson, M. A. "Parenteral formulations of proteins and peptides: stability and stabilisers". J. Parenteral Sci Technol. 42, Suppl. S3-S26 (1988)).

Las preparaciones concentradas (> 100 mg/ml) de inmunoglobulina están por tanto disponibles, pero hasta la fecha, estas son preparaciones de anticuerpos policlonales derivadas de la industria de procesamiento de la sangre, y se estabilizan mediante la adición de diversos excipientes tales como glicina y maltosa.

Es por tanto sorprendente que las preparaciones de anticuerpos monoclonales se hayan obtenido a una concentración > 100 mg/ml en ausencia de excipientes y sin un aumento concomitante en los agregados.

El Abstract Derwent del Documento JP01268646A (AN89-359879) informa que la solicitud describe una preparación para inyección de un anticuerpo monoclonal IgG_{3} que tiene una concentración de 0,1 \mug a 100 mg/ml. La materia sujeto descrita en dichas publicaciones está fuera del alcance de la presente invención.

En el Documento WO 94/15640 se describe un procedimiento para recubrir la superficie de tejidos y biomateriales con un repertorio completo de inmunoglobulinas (Ig) que contempla la concentración de la Ig de hasta 200 mg/ml aunque no se ejemplifica dentro de esta descripción acerca de como se consigue esto.

En Velez. Biotech. Bioengin. Vol 33, pp 938-940 (1989) se describe el uso de una filtración mediante flujo tangencial en propagación por perfusión del hibridoma de células para la producción de mAb.

En el Documento EP 0661060-A, se describe una preparación de Ig altamente concentrada que tiene una concentración de Ig comprendida entre 13,5 y 17,5 p/v. No hay descripción de anticuerpos monoclonales.

En el Documento CH684164, se describe una solución de Ig para uso intravenoso que tiene una concentración de 120 a 180 mg/ml, No hay descripción de anticuerpos monoclonales.

En el Documento EP 0064210 se describe una composición farmacéutica oral que contiene inmunoglobulina. La concentración de Ig reseñada es de 5 a 20 g/ 100 ml aunque no hay descripción de anticuerpos monoclonales en esta aplicación.

En el documento DE4211169C1 describe un procedimiento y dispositivo para la producción in vitro de anticuerpos monoclonales altamente concentrados. El dispositivo está constituido por una cámara de diálisis de tambor rotatorio. En el interior de los tubos de diálisis se cultivan las células capaces de secretar un anticuerpo monoclonal. La concentración máxima de anticuerpo monoclonal alcanzada parecería ser aproximadamente 10 mg/ml.

En la solicitud copendiente WO 97/04801, se describe una formulación de proteína liofilizada isotónica estable. Una de dichas proteínas puede ser un anticuerpo monoclonal purificado a partir del medio de cultivo usando procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina. La concentración máxima de anticuerpo ejemplificada es de 102 mg/ml.

La presente descripción proporciona por tanto una preparación de anticuerpo monoclonal para la administración a un ser humano caracterizada porque el anticuerpo en dicha preparación está a una concentración de 100 mg/ml o mayor, de manera preferible mayor de 100 mg/ml. Por encima de la concentración de 350 mg/ml la preparación puede ser muy viscosa y las tasas de recuperación se vuelven inaceptablemente bajas. La concentración ideal está entre 100 y 300 mg/ml.

Las preparaciones de acuerdo con la descripción están sustancialmente libres de agregados. Los niveles aceptables de contaminantes agregados serían menores de un 5%, de manera ideal menores de un 2%. Se pueden alcanzar niveles tan bajos como un 0,2%, aunque es más usual aproximadamente un 1%. La preparación está de manera preferible libre también de excipientes usados tradicionalmente para estabilizar las formulaciones policlonales, por ejemplo glicina y/o maltosa.

La presente descripción proporciona por tanto una preparación de anticuerpo monoclonal para la administración a un ser humano caracterizada porque el anticuerpo en dicha preparación está a una concentración de 100 mg/ml o mayor, de manera preferible mayor de 100 mg/ml y la preparación está sustancialmente libre de agregados.

Los anticuerpos recombinantes por su auténtica naturaleza se producen en un entorno de cultivo celular sintético y no natural. Los sistemas de expresión que se usan para generar cantidades suficientes de la proteína para comercialización se basan de manera rutinaria en células huésped de mieloma u ovario de hámster chino (CHO).

Con el fin de cultivar dichas células, se ha concebido un medio sintético complejo que está desprovisto de proteína animal contaminante dando como resultado unos modelos de glicosilación de la proteína que no se esperaría que aparecieran en la naturaleza. Es por tanto de lo más sorprendente que un complejo de glicoproteína producido bajo dichas condiciones sintéticas pueda prepararse a concentraciones varias veces mayores que las que podrían producirse en el suero humano normal con todas su capacidades tamponantes.

La presente descripción proporciona por tanto una preparación de anticuerpo monoclonal para administración a un ser humano caracterizada porque el anticuerpo en dicha preparación es un anticuerpo recombinante y está a una concentración de 100 mg/ml o mayor, de manera preferible mayor de 100 mg/ml. La preparación está de manera preferible sustancialmente libre de agregados.

Durante la producción de anticuerpos purificados para uso tanto terapéutico como diagnóstico, es importante que el anticuerpo sea suficientemente estable en el almacenamiento, y diversas entidades químicas pueden tener un efecto adverso, sobre la estabilidad del anticuerpo. Por ejemplo, se sabe ahora que cantidades traza de cobre (Cu++) tienen un efecto desestabilizante sobre las moléculas de inmunoglobulina durante el almacenamiento (WO 93/08837), y que este efecto puede eliminarse formulando la molécula de inmunoglobulina con un adecuado quelante de iones de cobre, por ejemplo EDTA o ión citrato.

La presente invención es aplicable a una preparación de inmunoglobulinas de todas las clases, es decir, IgM, IgG, IgA, IgE e IgD, y esto se extiende también a la preparación de fragmentos Fab y anticuerpos biespecíficos. La invención se aplica de manera preferible a una preparación de inmunoglobulinas de la clase IgG, que incluye las subclases IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} e IgG_{4}. La invención se aplica de manera más preferible a una preparación de inmunoglobulinas de las clases IgG_{4} e IgG_{1}, de manera más preferible IgG_{1}.

La invención encuentra particular aplicación en la preparación de anticuerpos recombinantes, de manera más particular anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados (CDR-injertado). Los ejemplos particulares de estos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados frente a los antígenos CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD23, CD25, CD33, CD54 y CDw52. Los ejemplos adicionales incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados frente a diversos marcadores de células tumorales, por ejemplo 40 kd (J. Cell Biol. 125 (2) 437-446 (1994)) o los antígenos de los agentes infecciosos tales como hepatitis B o citomegalovirus humano. Los ejemplos particularmente preferidos incluyen anticuerpos quiméricos o humanizados frente a los antígenos CDw52, CD4, y CD23.

Las inmunglobulinas pretendidas para uso terapéutico se administrarán de manera general al paciente en forma de formulación farmacéutica. Dichas formulaciones incluyen de manera preferible, de manera adicional a la inmunoglobulina, un vehículo o diluyente fisiológicamente aceptable, posiblemente en premezcla con uno o más diferentes agentes tales como otras inmunoglobulinas o fármacos, tales como un antibiótico. Los vehículos adecuados incluyen, pero no se limitan a, solución salina fisiológica, solución salina tamponada con fosfato, glucosa y solución salina tamponada, solución salina tamponada con citrato, ácido cítrico/tampón de citrato de sodio, tampón de maleato, por ejemplo ácido málico/tampón de hidróxido de sodio, tampón de succinato, por ejemplo ácido succínico/tampón de hidróxido de sodio, tampón de acetato, por ejemplo acetato de sodio/tampón de ácido acético o tampón de fosfato, por ejemplo dihidrógeno ortofosfato de potasio/tampón de hidrógeno ortofosfato disódico. De manera opcional la formulación contiene polisorbato para la estabilización del anticuerpo. De manera alternativa la inmunoglobulina puede estar liofilizada (criodesecación) y reconstituida para su uso cuando se necesite mediante la adición de agua y/o una solución tamponada acuosa tal como se ha descrito anteriormente.

El pH preferido de las formulaciones farmacéuticas dependerá de la ruta particular de administración. Sin embargo, con el fin de maximizar la solubilidad del anticuerpo en la solución concentrada, el pH de la solución deberá ser diferente del pH del punto isoeléctrico del anticuerpo.

De esta manera, de acuerdo con un aspecto adicional, la descripción proporciona una preparación de anticuerpo monoclonal para la administración a un ser humano caracterizada porque el anticuerpo en dicha preparación está a una concentración de 100 mg/ml o mayor y el pH de la preparación es diferente del pH del punto isoeléctrico del anticuerpo.

Las rutas de administración son de manera rutinaria la parenteral, incluyendo intravenosa, intramuscular, e inyección intraperitoneal o dosificación. Sin embargo, la preparación es especialmente útil en la generación de formulaciones subcutáneas que deben ser bajas en volumen, por ejemplo 1 ml en volumen por dosis. Para asegurar que se puede conseguir la dosificación terapéutica n dicha formulación, será necesaria, de forma invariable, una preparación concentrada. Las concentraciones preferidas para las preparaciones subcutáneas están por ejemplo en el intervalo de 100 mg/ml a 200 mg/ml, por ejemplo 150 mg/ml a 200 mg/ml. Una preparación subcutánea tiene la ventaja que se puede autoadministrar evitando de esta manera la necesidad de hospitalización para administración intravenosa.

De manera preferible, las formulaciones subcutáneas de acuerdo con la invención son isotónicas y se tamponarán a un pH particular. El intervalo de pH preferido para una formulación subcutánea oscilará en general entre pH 4 y pH 9. El pH referido y por tanto el tampón dependerá del punto isoeléctrico del anticuerpo implicado, tal como se ha descrito anteriormente. De esta manera, en el caso de preparaciones subcutáneas que contienen anticuerpos anti-CD4, el pH estará de manera preferible en el intervalo de pH 4 a pH 5,5, por ejemplo pH 5,0 a pH 5,5, por ejemplo pH 5,5, y en el caso de anticuerpo anti-CD23 e el intervalo de pH 4 a pH 6,5. De esta manera, los tampones preferidos para uso en formulaciones subcutáneas que contienen anticuerpos anti-CD4 son maleato, succinato, acetato o, de manera más preferible tampones fosfato. Los tampones se usan de manera preferible a una concentración de 50 mM a 100
mM.

Las formulaciones subcutáneas pueden contener también de manera opcional cloruro de sodio para ajustar la tonicidad de la solución

De esta manera, de acuerdo con un aspecto adicional de la descripción, se proporciona una preparación de anticuerpo monoclonal para administración subcutánea a un ser humano caracterizada porque el anticuerpo en dicha preparación está a una concentración de 100 mg/ml o mayor y el pH de la preparación es diferente del pH del punto isoeléctrico del anticuerpo.

En un aspecto adicional de la descripción, la preparación monoclonal se prevé para uso en terapia humana, Se pueden tratar diversos transtornos humanos tales como cáncer o enfermedades infecciosas, por ejemplo aquellas mencionadas anteriormente y disfunciones inmunes tales como trastornos mediados por células T entre los que se incluyen vasculitis grave, artritis reumatoide, lupis sistémicos, también transtornos autoinmunes tales como esclerosis múltiple, injerto frente enfermedad del huésped, psoriasis, comienzo de diabetes juvenil, enfermedad de Sjogrens, enfermedad del tiroides, miastenia grave, rechazo al transplante, enfermedad inflamatoria del intestino y asma.

La descripción proporciona por tanto el uso de una preparación concentrada de anticuerpo monoclonal tal como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cualquiera de los transtornos anteriormente mencionados. Se proporciona también un procedimiento de tratamiento de un ser humano que tiene dicho transtorno que comprende administrar a dicho individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de una preparación de acuerdo con la invención.

Las dosificaciones de dichas preparaciones de anticuerpo variarán con las dolencias que se están tratando y el paciente del tratamiento, pero estarán en el intervalo de 50 a aproximadamente 2000 mg, para un paciente adulto se administrarán diaria o semanalmente de manera preferible 100-1000 mg durante un período entre 1 y 30 días y se repetirá cuanto sea necesario. Las dosis se pueden administrar como dosis únicas o múltiples.

Se puede concentrar una preparación de anticuerpo mediante diversos medios tales como ultrafiltración en agitación o en flujo cruzado (tangencial), la ruta preferida es mediante filtración en flujo tangencial. Las bajas velocidades de recuperación y la formación del precipitado pueden ser un problema cuando se concentra un anticuerpo. La presente invención resuelve este problema particular mediante un procedimiento de concentración que implica reducir los esfuerzos de cizalladura de la ultrafiltración de flujo cruzado a velocidades de circulación altas (500 ml/min). Reducir la recirculación por ejemplo a 250 ml/min conduce a una concentración satisfactoria de anticuerpo a > de 150 mg/ml y a la recuperación alta de material.

La invención proporciona por tanto un procedimiento para la preparación de una preparación concentrada de anticuerpo tal como se describe en el presente documento. La recuperación del anticuerpo en la preparación concentrada es de manera preferible mayor del 70% pero de manera rutinaria es mayor del 90%.

Las preparaciones concentradas de anticuerpo preparadas de acuerdo con el procedimiento anterior pueden contener ingredientes adicionales tales como tampones, sales, polisorbato y/o EDTA. Estos agentes adicionales pueden no requerirse en la formulación farmacéutica final en cuyo caso se pueden eliminar o intercambiar usando diafiltración de acuerdo con los procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Por ejemplo, las preparaciones concentradas de anticuerpo que contienen tampón citrato y EDTA se pueden convertir en preparaciones concentradas de anticuerpo que contienen tampón fosfato o maleato usando este procedimiento.

La descripción proporciona también una preparación concentrada de anticuerpo nueva obtenible mediante dichos procedimientos.

Los siguientes ejemplos no son limitantes de la descripción.

Ejemplo 1 Concentración de Campath 1H

El armazón de ultrafiltración Minitan (Minitan XX42 ASY MT Ultrafiltration System, Millipore)) se ensambló con 2 placas de filtro de polisulfona 30K NMWCO (Minitan PTTK 30K NMWCO, Millipore), y la tubuladura y placas se desinfectaron durante 30 min con NaOH 0,1 M de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (Minitan Ultrafiltration System: Assembly, Operation, Maintenance Instructions, Millipore Corporation, P15076). Se eliminó el desinfectante por lavado con 1-2 litros de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2.

El Campath 1H (un anticuerpo humanizado frente al antígeno CDw52: Reichmann y col., Nature, 332, 323-327 (1988)) (2200 ml a 16,4 mg/ml en citrato de sodio 50 mM, pH 6,0), se hizo circular a través del lado del retentato de las membranas con un caudal de 600 ml/min, con una presión de respaldo de 2-2,5 bar (2-2,5 x 10^{5} N/m^{2}). Se mantuvo la presión de respaldo a este valor durante el resto del experimento, y se midió el caudal del permeato a diversos intervalos de tiempo. Se eliminaron las muestras de anticuerpo del recipiente del retentato en diversos momentos de tiempo y se ensayaron para la concentración de anticuerpo, turbidez, % de agregado y viscosidad.

Debido a que la velocidad de filtración fue tan lenta en este experimento, fue necesario llevar a cabo la concentración durante 3 días. Se lavó el sistema con PBS, y se almacenó el concentrado durante la noche a 4ºC. Tras el día 2 se añadió Thiomersal al 0,01% (p/v) al concentrado antes del almacenamiento durante la noche para evitar la contaminación microbiana. Al final de la concentración, se lavó el sistema con 500 ml de PBS, a continuación se lavó con 500 ml más de PBS, se recirculó alrededor del lado del retentato de las membranas durante 30 min. Se determinó la concentración de anticuerpo en estos lavados midiendo la absorbancia a 280 nm.

El tiempo total que tarda el concentrado Campath-1H desde 16,4 mg/ml a 257 mg/ml usando sólo 2 placas en el Minitan fue de 17,25 horas. La Tabla 1 (a) muestra el cambio en la concentración de Campath-1H durante este tiempo.

TABLA 1(a)

Tiempo (h)	0	5	6,5	9,5	11,5	12,5	14,5	16	17	17,25
Conc
Mg/ml	16	34	41	79	106	136	190	230	301	257

La concentración aumentó de manera exponencial hasta un pico de 300 mg/ml tras 17 horas. La concentración final fue ligeramente inferior que este valor punta; la discrepancia probablemente se debió a la dificultad de obtener una muestra representativa de un líquido muy viscoso. La tabla 1 (b) muestra que la concentración de Campath-1H se acompañó de una disminución recíproca en el caudal del permeato.

TABLA 1(b)

Conc
(mg/ml)	16	34	41	79	106	136	189	301	257
Caudal
(ml/min)	4	3	2,5	1,5	1,25	0,9	0,5
Viscosidad
(cPs)	1	1	1	1	1	1	0,96	4,85	8,1

Esta Tabla muestra que hubo un incremento importante en la viscosidad del concentrado restante por encima de una concentración de 189 mg/ml.

La Tabla 1(c) muestra que la recuperación fue alta hasta una concentración de 190 mg/ml, pero comienza a declinar marcadamente por encima de esta concentración a medida que la viscosidad aumenta llevando a la adherencia de los materiales al material de vidrio y a la tubuladura y perdiéndose durante el lavado antes del almacenamiento durante la noche. La recuperación final de 257.

TABLA 1(c)

Conc	16	41	106	190	257
mg/ml
Rec (%)	100	97	97	85	63

mg/ml de material (excluyendo el material eliminado durante el muestreo y la pérdida en lavados) fue del 63,4%, Se recuperó un 14,6 adicional en el primer lavado con PBS del sistema y un 0,5% en el segundo lavado con PBS recirculado. En total, por tanto, se recuperó un 78,5% del material inicial al final del experimento (excluyendo el material eliminado durante el muestreo y la pérdida en lavados), dejando una pérdida de un 21,5% debido principalmente a la adherencia del material viscoso al material de vidrio y los plásticos.

Se calculó la turbidez de la solución Campath-1H durante la concentración. Se utilizó la absorbancia de las alícuotas de 1,0 ml diluidas adecuadas de las muestras de anticuerpo a 650 nm como una medida de la turbidez. La tabla 1(d) muestra que no hubo incremento

TABLA 1(d)

Conc	16	41	79	106	136	190	301	257
(mg/ml)
Rec (%)	0,96	1,16	1,1	0,91	1	1,01	1,11	1,01
Agregado	0,002	0,015	0,023	0,032	0,042	0,032	0,035
(%)

Se diluyeron las muestras para la determinación del agregado hasta una concentración de proteína de 1 mg/ml utilizando PBS y alícuotas de 50 \mul o 100 \mul sobre una columna de HPLC de exclusión por tamaño TSK-GEL G3000SW_{XL}. Se desarrolló la columna con NaN_{3} al 0,05% y Na_{2}SO_{4} 0,1 M en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,7 con un caudal de 1,0 ml/min. Se determinó la cantidad de agregado integrando las puntas de absorbancia a 280 nm y se encontró que quedaba alrededor de un 1% en su interior.

Ejemplo 2 Concentración de anticuerpo Anti-CD4 - Procedimiento A

El armazón de ultrafiltración Minitan se ensambló y desinfectó tal como en el Ejemplo 1 excepto en que se usaron 8 placas de filtro de polisulfona 30 K NMWCO en lugar de 2, y el armazón completo se colocó en una carcasa estéril. Se circuló el anticuerpo Anti-CD4 (2142 ml a 13,9 mg/ml en citrato de sodio 50 mM, pH 6,0) a través del lado del retentato de las membranas a un caudal de 190 ml/min a una presión de respaldo de 2-2,5 bar (2-2,5 x 10^{5} N/m^{2}). Se mantuvo la presión de respaldo en este valor durante el resto del experimento, y se midió el caudal del permeato en diversos intervalos de tiempo. Se eliminaron las muestras de anticuerpo del recipiente del retentato en diversos momentos de tiempo y se ensayó para la concentración de anticuerpo, enlace CD4, turbidez, % de agregado y viscosidad.

Al final del experimento se bombeó el retentato del armazón del Minitan y se lavó el lado del retentato de las membranas con 500 ml de citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 y se recogieron fracciones de 50 ml del lavado. Finalmente se lavo el sistema recirculando 500 ml de citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 alrededor del lado del retentato de la membrana durante 30 min. se determinó la concentración de anticuerpo de las fracciones lavadas midiendo su absorbancia a 280 nm.

Se muestran los resultados en las Tablas 2(a)-(d). El incremento en el número de placas usadas para la concentración lleva a una disminución en el tiempo tomado para alcanzar una concentración de 250 \mug/ml - 250 mg/ml en 6 h en comparación con las 17,25 h para la concentración de Campath-1H (véase tabla 2 (a)). La Tabla 1 (a) muestra también que la viscosidad del anticuerpo Anti-CD4 no aumentó de manera medible hasta que se alcanzó una concentración de 113 mg/ml. Por encima de esta concentración, la viscosidad aumentó de manera importante.

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TABLA 2(a)

Tiempo (h)	0	2	3,5	5	6
Conc	13,9	47,2	83	112,8	252
Mg/ml
Viscosidad	1	1	1	1	9,7
cPs

A concentraciones por encima de 83 mg/ml hubo una opalescencia notable en el material concentrado, y esto hizo que se formara un precipitado a medida que la concentración aumentaba por encima de este valor. Esto llevó a la disminución en los caudales del permeato que se muestra en la Tabla 2 (b) y también al aumento de la turbidez que se muestra en la Tabla 2 (c). El nivel del agregado permaneció muy bajo en todas las concentraciones siendo el rendimiento menor de un 0,2% (véase Tabla 2 (c)). La Tabla 2 (b) muestra que las recuperaciones fueros altas hasta que aumentó la viscosidad y se produjo el precipitado que disminuyo de manera importante hasta la recuperación final en el retentato tras eliminación del armazón del 50%.

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TABLA 2 (b)

Conc	13,9	47,2	83	112,8	252
mg/ml
Rec (%)	100,0	100,0	100,0	113,0	51,4
Caudal	13,5	3,2	2,0	2,5
(ml/min)

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TABLA 2(c)

Conc	13,90	47,2	83	112,8	252
Mg/ml
Turb	0,011	0,012	0,030	0,185
A650 nm
Agg (%)	0,140	0,150	0,150	0,160	0,170

Esta mala recuperación fue debida a la alta viscosidad del anticuerpo Anti-CD4 concentrado haciendo este adherente a la tubuladura y membranas del sistema de ultrafiltración. Todos los anticuerpos Anti-CD4 perdidos por esta vía se recuperarían posteriormente lavando el sistema con tampón. La tabla 2 (d) muestra la recuperación del anticuerpo Anti-CD4 en sucesivas fracciones de lavado de 50 ml durante el lavado del armazón Minitan al final del experimento. La primera fracción contiene 11,7 g de anticuerpo Anti-CD4 en una concentración de 235 mg/ml, con lo que estos podrían combinarse con los 12,6 g de concentrado inicialmente recuperados del armazón a 252 mg/ml sin diluir de manera significativa la concentración global. Las fracciones del lavado restantes contenían un total de 5,1 g de anticuerpo Anti-CD4, pero esto fue en una concentración de menos de 57 mg/ml con lo que estas no podrían combinarse con el material concentrado. La recuperación global en el concentrado y la primera fracción de lavado fue del 90%. Se notó que tras el almacenamiento del anticuerpo anti-CD4 concentrado final durante la noche a 4ºC se produjo cierta redisolución del precipitado.

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TABLA 2(d)

ml	50	100	150	200	250	300	350	400	450	500
mg	11727	2828	866	379	245	202	175	151	132	125

Se montó por tanto un experimento para determinar la concentración a la cual el anticuerpo Anti-CD4 precipitado se resolubiliza de manera completa. Se diluyó de forma progresiva una alícuota de anticuerpo Anti-CD4 de 10 ml a 250 mg/ml mediante la adición de citrato de odio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0. Se usó la absorbancia de alícuotas de 1,0 ml diluidas adecuadas de muestras de anticuerpo a 650 nm como una medida de la turbidez. En la Tabla 3 se muestran los resultados

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TABLA 3

Conc	237,7	149,5	110,4	88,6	76,3	60,3
mg/ml
Turb	1,17	0,096	0,082	0,074	0,03	0,027
(A650 nm)

Se volvió a disolver el precipitado, pero la turbidez y la opalescencia no desaparecieron de manera completa hasta que se alcanzó una concentración de anticuerpo Anti-CD4 de aproximadamente 80 mg/ml. Fue por encima de esta concentración que fue observada primero la opalescencia durante la concentración, de esta manera el precipitado parece ser reversible y la concentración dependiente.

Ejemplo 3 Concentración del Anticuerpo Anti-CD4 - Procedimiento B Tampón de ajuste del Anticuerpo Anti-CD4

El anticuerpo Anti-CD4 (1460 ml; 24 g) se preparó en citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0. Este tampón se fabricó a partir de citrato de sodio \approx 100 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 añadiendo ácido cítrico sólido a la preparación de anticuerpo y ajustando el pH a 6,0 con NaOH. La preparación resultante se filtró de forma estéril a través de un filtro de a 0,22 \mum y se almacenó en forma de 2 alícuotas de \approx 12 g.

Concentración del Anticuerpo Anti-CD4 en el Filtron Ultrasette

El Filtron Mini-Ultrasette y la bomba Watson-Marlow se situaron en una habitación fría. El Mini-Ultrasette (ultrafiltro Filtron de flujo cruzado con corte a 30 K) se lavó con agua y a continuación se desinfectó durante 30 min con NaOH 0,1 M de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes (instrucciones operativas del Mini Ultrasette Tangential Flow Device & Mini Ultrasette Care y Manual de uso., Filtron Technology Corporation). El desinfectante se eliminó por lavado con agua estéril seguido por 1-2 litros de PBS estéril, pH 7,2, hasta que el pH del efluente fue de 7,2. El anti-CD4 se hizo circular a través del lado del retentado de las membranas con una caudal de 250 ml/min.

Tras concentrar el anticuerpo Anti-CD4 hasta \approx150 mg/ml el retentado se bombeo fuera del Mini-Ultrasette y el lado del retentado de las membranas se lavó con 3 X 20 ml de citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 y se recogió cada fracción de 20 ml de lavado. Se determinó la concentración de anticuerpo en las fracciones de lavado midiendo su absorbancia a 280 nm como se describe en el Ejemplo 1.

Los resultados sugieren que una reducción en el caudal del retentado puede proporcionar un procedimiento para concentrar anti-CD4 hasta \approx150 mg/ml mediante ultrafiltración en flujo cruzado y evitando cualquier precipitación. Esto se ensayó usando el Filtron Mini-Ultrasette y un caudal de circulación de retentato de 250 ml/min.

Un tampón isotónico adecuado para este trabajo es citrato de sodio 100 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0. De esta forma, los restantes 1460 ml de anti-CD4 en el citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 se reformularon añadiendo 16,8 g de ácido cítrico, y el pH de la solución final se ajustó con NaOH. Este material se filtró estéril y se dividió en 2 alícuotas iguales, que a continuación se concentraron de forma separada en el dispositivo de ultrafiltración Filtron usando una relación de recirculación de 250 ml/min. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

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TABLA 4 Concentración de Anti-CD4 hasta más de 100 mg/ml en una celda de ultrafiltración de flujo cruzado con una relación de recirculación de 250 ml/min

Parámetro	Antes de la	Concentración	Concentración
	concentración	1	2
Máxima concentración alcanzada	-	169	156
(mg/ml)
Concentración del producto final	14,4	106,4	100,5
(mg/ml)
Recuperación tras la concentración	-	90	95
(%)
Tiempo que tarda la concentración	-	11	9
(h)
Agregación (%) *	4,14	3,95	3,97
Turbidez (A650 nm)	0,003	0,018	0,037
Osmolaridad >(mOs/kg)	281	288	306
Enlace con CD4	20	98,8	68,3
* Análisis de agregados mediante HPLC de exclusión por tamaños

Las muestras para la determinación de agregados se diluyeron hasta una concentración de proteína de 1 mg/ml usando PBS y 50 \mul o 100 \mul de la alícuota se inyectaron en una columna de HPLC de exclusión por tamaños TSK-GEL G3000SWXL. La columna se reveló con NaN_{3} al 0,05% y Na_{2}SO_{4} 0,1 M en tampón fosfato 0,1 M pH 6,7 a un caudal de 1,0 ml/min. La cantidad de agregado se determinó integrando los picos de absorbancia a 280 nm.

Ambas concentraciones alcanzaron una concentración máxima de >150 mg/ml en el aparato de ultrafiltración sin efectos adversos sobre la solubilidad del anticuerpo. Las concentraciones tardaron 9-11 h. Las concentraciones finales de \approx100 mg/ml fueron el resultado de una dilución con los residuos necesarios para maximizar la recuperación del aparato de la ultrafiltración. La recuperación global fue del 90-95%, y no se produjo precipitado visible, ni se observó aumento en los niveles de agregados. El ligero aumento de la turbidez tras la concentración, según se mide mediante la absorbancia a 650 nm causó una ligera opacidad en el concentrado final, pero esta se elimino de la formulación con Polisorbato 80 y filtración estéril, y no se consideró significativa.

La actividad de enlace de CD4 para la concentración 1 fue de casi 100 mg/ml según lo esperado, pero se obtuvo un valor mucho más pequeño par la concentración 2. La osmolalidad final del material mezclado entre las concentraciones 1 y 2 fue aproximadamente de 297 mOs/kg, y la mezcla resultó una solución transparente y brillante que podía pasar fácilmente a través de un filtro estéril de 0,2 \mum.

Concentración de Anticuerpo Anti-CD4 en la celda agitada

Una alícuota de 330 ml del anticuerpo Anti-CD4 (como anteriormente) se concentró a 5ºC en una celda de ultrafiltración agitada Amicon (equipada con una membrana Amicon YM30) hasta una concentración final de 170 mg/ml aplicando una presión de 1,5 bar (1,5 x 10^{5} N/m^{2}) usando gas nitrógeno. El anticuerpo Anti-CD4 en la celda de ultrafiltración se muestreó a intervalos, y se determinó la concentración midiendo la absorbancia a 280 nm y la turbidez midiendo la absorbancia a 650 nm. Al final del experimento el material concentrado se retiró de la celda de ultrafiltración y se filtró de forma estéril a través de un filtro de 0,22 \mum.

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Para superar las grandes fuerzas de cizalladura generadas en el equipo de ultrafiltración de flujo cruzado Filtron, se llevó a cabo la concentración en una celda de ultrafiltración agitada, usando como tampón citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0. La Tabla 5 muestra los resultados de este experimento.

TABLA 5 Concentración por Ultrafiltración de Anti-CD4 en una celda agitada Amicon

Tiempo (h)	Volumen de	Concentración	Caudal de
	retentato (ml)	aproximada del	ultrafiltración
		retentato (mg/ml)	(ml/h)
0	330	16,7	-
6	150	37	30
9	100	55	17
11	75	73	12
14	46	120	10
38	40	134	0,25
54	27	171*	0,81
* Concentración real determinada midiendo la absorbancia a 280 nm.

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En total, la concentración tardo aproximadamente 2,5 días, y el caudal disminuyó rápidamente, a medida que aumentaba la viscosidad del anticuerpo concentrado. Se consiguió con éxito una concentración final de 171 mg/ml sin evidencia de precipitación. Este material se retiró de la celda de ultrafiltración y la membrana se lavó con suficiente cantidad de citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 para dar una concentración final de 100 mg/m cuando se mezcló con el concentrado.

Este material atravesó fácilmente un filtro estéril de 0,2 \mum. La concentración medida real de este material combinado fue de 94,3 mg/ml en un volumen de 46 ml. Esto se corresponde con una recuperación en la etapa de ultrafiltración de 79%.

Este experimento, por tanto, proporciona evidencia que citrato de sodio 50 mM, EDTA 0,05 mM, pH 6,0 es un tampón adecuado para la concentración de anti-CD4 hasta al menos 171 mg/ml, y que son probablemente las elevadas fuerzas de cizalladura las que causaron la precipitación en los experimentos originales de ultrafiltración en flujo cruzado en el Minitan y Filtron Mini-Ultrasette descritos más arriba.

Ejemplo 4 Formulaciones subcutáneas de los anticuerpos Anti-CD4 y Anti-CD23

a)	Anticuerpo Anti-CD4 o Anti-CD23	0,15 g
	Dihidrógeno ortofosfato de potasio (anhidro) KH_{2}PO_{4}	0,0656 g
	Hidrógeno ortofosfato de disodio Na_{2}HPO_{4} \cdot 12H_{2}O	0,0673 g
	NaCl	0,6263 g
	Polisorbato 80 (% en peso de la formulación total)	0,01
	Agua	hasta 100 g

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b)	Anticuerpo Anti-CD4 o Anti-CD23	0,15 g
	Acetato de Na	3,674 g
	Ácido acético glacial, solución al 10%	0,315 g
	NaCl	0,630 g
	Polisorbato 80 (% en peso de la formulación total)	0,01
	Agua	hasta 100 g

c)	Anticuerpo Anti-CD4 o Anti-CD23	0,15 g
	Ácido maleico	0,227 g
	NaOH 0,5 M	6,09 g
	NaCl	0,777 g
	Polisorbato 80 (% en peso de la formulación total)	0,01
	Agua	hasta 100 g

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d)	Anticuerpo Anti-CD4 o Anti-CD23	0,15 g
	Ácido succínico	0,203 g
	NaOH 0,5 M	6,54 g
	NaCl	0,779 g
	Polisorbato 80 (% en peso de la formulación total)	0,01
	Agua	hasta 100 g

NB cada una de las formulaciones a), b), c), o d) pueden contener de forma opcional EDTA 0,05 mM.

Claims (4)

1. Un procedimiento para concentrar una preparación de anticuerpo, dicho procedimiento comprende las etapas de;

(a)

Someter una preparación de anticuerpo a ultrafiltración en flujo cruzado con una relación de recirculación de 250 ml/min, en el que dicha preparación de anticuerpo se filtra a través de una membrana de 30 K.

(b)

Recuperar una preparación final de anticuerpo de la etapa (a).

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la preparación de anticuerpo final es > 150 mg/ml.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el anticuerpo es IgG.

4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD4.