CZ503590A3

CZ503590A3 - Způsob vyhledávání potenciálních fungicidních prostředků

Info

Publication number: CZ503590A3
Application number: CS905035A
Authority: CZ
Inventors: Maria Fattori; Stefaan Renaat Maria Horemans; Marc Lefébvre; Annabel Renwick; Keith Adrian Powell
Original assignee: Zeneca Limited
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1990-10-17
Publication date: 1998-10-14
Also published as: AU6614190A; AU652132B2; NO921519D0; DE69029739T2; ZA908268B; NZ235711A; SK503590A3; WO1991005475A1; US5260302A; SK279149B6; FI921722A0; HUT60423A; YU195990A; PL166864B1; ATE147580T1; EP0496791A1; ES2095879T3; BG96249A; RU2108038C1; FI102615B

Description

Způsob vyhledávání potenciálních fúngiTTÍdrTTTh prostředků

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu vyhledávání potenciálních fungicidních prostředků provedením dvou testů.

Dosavadní stav techniky

V mikrobiologické praxi je obvyklé vyhledávat mikroorganismy mající zajímavé vlastnosti zkoumáním velkého počtu, obvykle mnoha tisíc, organismů z půdy na jejich účinek významný pro zamýšlená použití. Jedním takovým použitím je isolace biologicky účinných prostředků, které jsou účinné proti vybraným druhům rostlinných pathogenů. Tyto biologicky účinné prostředky lze používat jako alternativní nebo daolňující orostředky k chemickým prostředkům pro hubení pathogenů.

V běžné praxi se odebírají vzorky půdy z míst, kde se požadovaný pathagen zdá být potlačen, což může znamenat, že sám tento mikroorganismus může v půdě inhibovat pathogenicitu.

Z jednotlivých vzorků se potom v laboratoři isolují tyto mikroorganismy vymýváním z kořenů a nechají se růst na agaru při jedné nebo dvou teplotách optimálních pro mikrobiologický růst, obvykle od 25 do 33 °C. Tyto organismy se potom testují nejprve proti různým pathogenům na agaru v sérii Petrího misek za použití metody dvojí kultury. Toto je primární zkoušení. Nadějné organismy z tohoto primárního zkoušení se potom podrobí důkladnějšímu zkoumání v sérii sekundárního zkoušení za použití půdy.

Podle zkušeností autorů tohoto vynálezu organismy, které nakonec projdou dalšími testy a polními pokusy, nevykazují při prvním zkoušení ani příslušnou ani dostatečnou selektivitu. Obvyklé primární zkoušení propustí velký počet organismů (obvykle okolo 20 které se zdají být nadějnými, ale většina z nich je potom v následujících testech zavržena.

Kroně tohoto js nyní autorům tohoto vynálezu známo, že při primárním zkoušení projdou kromě organismů, které se následně ukáží jako nepoužitelné, také určité organismy, které jsou zcela schopné projít dalšími následnými testy. Výsledkem toho je, že tradiční testy propouštějí organis/my, které jsou slabými inhibitory pathogenicity a nepropouštějí organismy, které jsou dobrými inhibitory pathogenicity.

Je tedy třeba najít nový způsob vyhledávání organismů z půdy, aby byl nalezen velký počet potenciálně dobrých organismů a aby byly vyloučeny pokud možno nejvíce látky se špatným účinkem.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je tedy způsob vyhledávání potenciálních fungicidnich prostředků, který spočívá podle vynálezu v tom, že se testuje inhibiční účinek potenciálního fungicidního prostředku ve dvou testech, přičemž první test je na inhibici vývinu pathogenu ve sterilisované půdě infikované myceliem Pythium spo. a druhý test je dále na inhibici vývinu choroby v rostoucí rostlině náchylné k onemocnění vyvolanému přítomností komplexu způsobujícího vadnuti klíčících rostlin, načež se prostředky mající potenciální inhibiční účinek v obou testech ve srovnání s kontrolou identifikují a podrobí se dalšímu zkoumání.

Předložený vynález je použitelný zvláště, i když ne výlučně, pro testování mikroorganismů ze vzorků půdy na jejich možný biologický účinek, ale není žádný zvláštní důvod k tomu, aby tentýž postup podle vynálezu nemohl být použit pro chemické prostředky, aniž by byl jakkoliv uoravován.

Jak již bylo uvedeno výše, tradiční způsob isolace mikroorganismů není sám o sobě selektivní: předložený vynález proto také poskytuje způsob předběžného testování mikroorganismů isolovaných ze vzorků půdy, který spočívá v tom, že se do uzavíratelné nádoby umístí vrstva vlhkého sterilního písku a na ni se umístí vlhký vzorek půdy a do vzorku půdy se zaseje semena rostliny náchylné k určitému onemocnění, nádoba se uzavře a umístí se do takového prostředí, které způsobuje vývin choroby, semeno se nechá vyklíčit a kořeny se nechají prorůst z vrstvy půdy do vrstvy písku, vyřízne se tunel podélně oběma vrstvami, vyberou se kořeny pouze z vrstvy písku a z těchto kořenů se isolují mikroorganismy.

Prostředky chemické nebo mikrobiologická , která prošly dvěma výše popsanými testy podle vynálezu, mohou být potom dále zkoumány na inhibiční účinek proti plísnové infekci v jednom nebo ve více než jednom testu, které zahrnují:

a) infekci cukrové řepy organismem Aphanomyces cochlioides při teplotě od 12 do 15 °C,

b) infekci hrachu organismem Pythium ultimum při teolotě od 12 do 15 °C,

c) infekci hrachu organismem Pythium ultimum při teplotě od 24 do 27 °C,

d) infekci hrachu organismem Rhizoctonia solani pří teplotě od 24 do 27 °C,

e) infekci pšenice organismem Fusarium culmorum při teplotě od 13 do 21 °C,

f) infekci sojového bobu organismem Phytoohthora megasperma při teplotě od 20 do 24 °C,

g) infekci řezu bramboru organismem Fusarium maniliforme při teplotě od 20 do 24 °C,

h) infekci řezu bramboru organismem Fusarium sambusinum při teplotě od 20 do 24 °C a

i) infekci cukrové řepy organismem Phoma soo. při teplotě od 15 do 19 °C.

Takto lze při využití všech složek vynálezu isolovat potenciální biologicky účinné prostředky způsobem, který je určen jen pro získávaní aktivních organismů z kořenů, jejich zkoušením ve dvou počátečních testech, kterými se identifikují organismy s vysokou potenciální aktivitou a ty se potom po4 drobí sériím přísných testů, kterými se identifikují prostředky, u kterých se pak při testování za nejrůznějších polních podmínek dokáže jejich vysoká účinnost. Toto představuje oproti známým způsobům, jak jsou výše uvedeny, značný pokrok, neboť známými způsoby by byly odmítnuty organismy, které prošly testy podle vynálezu a naopak jimi prošla řada organismů, které se testy padle vynálezu ukázaly jako většinou neúčinné nebo méně účinné než kontrola.

Způsobem podle vynálezu byly isolovány čtyři mikroorganismy, které se ukázaly být obzvláště účinné proti různým plísňovým onemocněním, obvykle doprovázeným vadnutím.

Pro případ zkoušení účinnosti podle vynálezu byla použita tradiční metoda in vitro, kterou bylo testováno asi 7 000 organismů, a bylo zjištěno, že touto metodou prošlo asi 20 % organismů, zatímco způsobem podle vynálezu prošlo pouze i až 5 ΐ organismů. Důležité je, že soubor organismů, které prošly každým z minimálně dvou testů podle vynálezu, je velmi stejnoměrný, zatímco tradičním agarovým testem prošel zcela různorodý soubor organismů. Některé z organismů, které by třeba byly odmítnuty tradiční vyhledávací metodou, vykázaly v následujících vyhledávacích testech a v palních pokusech vysokou účinnost. Toto je základní výhoda předloženého vynálezu: počátečním vyhledáváním se sníží celkový počet organismů, které vyžadují další testování a velká část těch, které byly vybrány pro další testování, vykázala potom požadovaný účinek při polních testech. Předpokládá se, že důvod tohoto je následující. Parametry testování, například teplota a nutriční složení, jsou u tradiční metody optimalisovány, aby se podoořil růst mikroorganismu v agaru. Tato potrava je velmi rozdílná od skutečné potravy v drsném životním prostředí za podmínek, ve kterých se má mikroorganismus připravovat.

Proto mnohé z mikroorganismů, které přežijí tyto počáteční testy, jsou obvykle slabé a jsou schopné pouze přežití v uzavřeném prostředí agarové kultury a následně selžou, protože přísnější druhé a další testy jsou mnohem více přibližné sku5 až 10 tečnému polnímu prostředí. Na druhé straně v souboru organismů existují, a zkušenosti autorů tohoto vynálezu to potvrzují, kmeny mikroorganismů, které dávají přednost polním oodmínkám, například nízkým teplotám nebo potravě méně bohaté nebo různého složení. Tyto mikroorganismy nerostou dobře v aga rovem testu a normálně by byly odmítnuty. Bylo tak zjištěno, že dvojí testování, které je podstatou tohoto vynálezu, zaručuje testovací podmínky bližší polním podmínkám a poskytuje tak realističtější náznak schopnosti mikroorganismu prospívat v prostředí, ve kterém by měl být používán.

Nyní následuje popis isolace, charakteristiky a testování bakteriálních organismů na účinek proti některým plísním, které infikují sklizňová plodiny. Byl isolován velmi velký počet mikroorganismů, identifikován a testován výše uvedeným způsobem.

Isolace mikroorganismů

Připraví se trubice z dialysační trubice dlouhá 35 cm a široká 5,5 cm s uzávěrem 5 až 7 cm od jednoho konce. Jemný písek se promyje, vysuší a nasype se do trubice do hloubky 12 cm a zvlhčí se 20 ml destilované vody. Trubice s oískem se pro podepření uloží dovnitř skleněných zkumavek (7 cm v průměru a 30 cm dlouhých). Trubice se potom uzavřou u dna gumovou zátkou pokrytou hliníkovou folií a navrchu zátkou z vaty a potom se zabalí do hliníkové folie. Celá sestava se autoklávujs dvakrát při 121 °C po dobu 60 minut.

Vzorek půdy se odebere z určené strany půdy a dva dny po odebrání se udržuje při 4 °C na 40 % vlhkosti. Vzorek pfkdy se presije sítem 4 mm a přidá se do trubice na povrch písku do hloubky 3 cm. Zasadí se semeno / hrách, pšenice, cukrová řepa, slunečnice, kukuřice nebo sója / a přikryje se půdou na celkovou hloubku 6 cm. Trftbice se potom postaví kolmo do drátěného koše, který se pak umístí do plastikového kontejneru s otvory, které umožňují výměnu vzduchu, přičemž tento kontejner minimalisuje ztráty z odpařování. Koše se potom umístí do růstové skříně a inkubují se čtyři týdny při teplotách 10 °C až 24 °C a 70 % vlhkosti s cyklem 16 hodin den / 8 hodin noc.

Po čtyřtýdenní inkubaci ae plastické dialysační trubice rozříznou předem sterilisovaným skalpelem. Z půdy a· písku se vytrhají kořeny každé rostliny a rostlina se umístí na bílou plastickou misku. Vrcholové části rostliny se rozřežou a promyjí odděleně ve sterilní vodě.

Rozřezané části se umístí do sterilních c

Erlenmeyerových baněk obsahujících 20 ml dwionisované vody a vrstvu skleněných kuliček. Banky se potom třepou v orbitálním inkubátoru při 120 otáčkách za mi- 12 nutu po Sobu 30 minut· Za použiti neředěného roztoku z kořenů a promývacich roztoků z kořenů a vrcholků rostlin z baněk se připraví zředění 1 : 9 ve sterilním Ringerově roztoku na zředění 10*\ Alikvotní část 100 /ul z každého roztoku se potom rozprostře na povrchy tri agarových medií, majících následující složení :

1/10 trypton sojový agar trypton sojový bujón 3,0 g bakteriologický agar 17,5 g deionisovaná voda 1000 ml / prostředí se autoklávuje 15 minut při 121 °C / agar s kořenovým extraktem Čerstvé pšeničné kořínky 10 g agar S. 3 17,5 g deionisovaná voda 1000 ml / Čerstvé kořínky se naváží a smísí s malým množstvím deionisované vody v mixéru· Hustá suspense se potom umístí do váčku ze čtyř vrstev hustého mušelínu a ten se potom suspenduje ve zbývající deionisované vodě ve dvoulitrové kádince a inkubuje se 4 dny při 20 °C. Mušelínový váček se potom odstraní a ke kořenovému extraktu se přidá agar· Prostředí se

- 13 potom autoklávuje 15 minut při 121 °G /,

Agar s extraktem z půdy vzorek půdy 10 g agar č. 3 17,5 g deionisovaná voda 1000 ml / Půda se naváží a umístí se do deionisované vody ve dvoulitrové kádince. Suspense půdy se přikryje a inkubuje se 4 dny při 20 °C_r načež se odsaje přes čtyřnásobnou vrstvu hustého mušelínu. Potom se přidá agar a prostředí se autoklávuje 15 minut při 121 °C /.

Pro každé ředění jsou tři opakování. Agarové misky se inkubují při 12 °C až do 5 dnů, načež se spočte počet kolonií na každé misce a zapíše se. Kde to je možné, vybere se miska, která obsahuje padesát nebo méně kolonií. Kde to není možné, udělá se na misce mřížka z padesáti průsečíků a vyberou se kolonie, které jsou na každém průsečíku nebo nejblíže k němu. Takto je selekce kolonií zcela náhodná.

Jednotlivé kolonie se stáhnou z misky použitím sterilního očka a kultivují se na Petriho miskách o průměru 5 cm obsahujících 1/10 trypton sojový agar / 1JÓ.0 TSA /. Misky se potom inkubují 5 dnů při 12 °C, Organismy se potom zkontrolují na čistotu. Kde byla smíšená kultura, organismus se naočkuje na

- 14 šikmý 1/10 trypton sojový agar, aby se získaly jednotlivé kolonie. Jedna kolonie se vybere a pěstuje se ve vedlejší kultuře na 1/10 trypton sojovém agaru. Sbírka kultur se skladuje při 4 °C.

Charakteristika mikroorganismů

Morfologie

Morfologické charakteristiky mikroorganismů jsou následující :

Morfologie buněk : gram-negativní tyčinkové bakterie Morfologie kolonie :

NCIB 40 136 : špinavě bílé, kulové, pravidelné, neporušené, mírně konvexní, hladké, lesklé, poloprůhledné, průměr 1,5 aš 2 mm.

NCIB 40 137 x špinavě bílé, kulové, pravidelné, neporušené, vypouklé, hladké, lesklé, poloprůhledné, průměr 1 mm.

NCIB 40 188 : špinavě bílé, kulové, pravidelné, neporušená, mírně konvexní, hladké, lesklé, poloprůhledné, průměr 1,5 a2 2 mm.

NCIB 40 190 : Špinavě bílé, kulové, pravidelné, neporušené, ploché, hladké, lesklé, poloprůhledné , průměr .1 mm.

- 15 Teplota růstu :

všechny kmeny 37 °C	+ve
	41 °C	-ve
	45 °C	-ve
Fluorescence	všechny kmeny	+ve
Katalasa	všechny kmeny	+ve
Oxidasa	všechny kmeny	+ve
Fermentace
v glukose OF	všechny kmeny	-ve

Rychlý test / API /

NCI3 40186 40187 40188 40190

redukce nitrátů	-	—	-	-
produkce indolu	-	-	-	-
kyselina z glukosy	-	·*	-	-
arginin dehydrolasa	+	+	+	+
ureasa	-	-	-	-
hydrolysa eskulinu	-	-	-	-
hydrolysa želatiny			+	+
β-galaktosidasa	-	-	-	-
asimilace glukosy	+	+	+	+
asimilace arabinosy	+	+		+
asimilace manosy		+	+	+
asimilace mannitu	+	+	+	+

- 16 asimilace N-acetylglukosaminu asimilace maltosy asimilace glukonátu asimilace kaprinátu asimilace adipátu asimilace malátu asimilace citrátu asimilace fenylacetátu cytochromoxidasa +

+ +

+

Primární zkoušení

Půdní test na Petriho miskách

Petriho misky /5 cm / se naplní 10 ml aga ru s bramborovou dextrosou / PM /, Na tento agar se do středu umístí agarová zátka / 5 mm / ze 7 dní staré kultury Pythium ultimum rostoucí při 20 °C. Misky se inkubují 5 dnů při 20 °C, během nichž se na misce vytvoří kolonie P. ultimum.

Minster Mendip · půda se autoklávu je 60 mi nut při 120 °C. Do této půdy 3e dají pšeničné klíčky / l % hmotV/hmoť. / a dobře se promíchá. Přibližně 6 g půdy se unístí do každé Petriho misky a překryje se jí vzrostlé Pythium.

- 17 Testované bakterie rostou na 1/10 TSB nebo na 1/10 TSA deskách 48 hodin při 12 °C,

Na každou Petriho misku se aplikují 2 ml kultury : připraví se duplikátní desky.

Zkoušení : 1/10 TSB samotný metalaxyl / 100 ppm / testovaný organismus

1/10 TSB přidaný k půdě na agaru s bramborovou dextrosou nenaočkovaná organismem Pythium

Desky se inkubují 4 dny při 10 °C.

Účinek vyjádřený ve stupnici od 0 do 3 se stanoví na základě úplné inhibice růstu plísně v půdě.

Test na plíseň bramborovou

Sterilní kotouč z filtračního papíru / průměr 9 cm / se důkladně zvlhčí vodou a umístí se na dno sterilní Petriho misky. Pro každý pokus se připraví dvě misky.

Kultury Pusarium / Pusarium sambusinum, Pusarium culmorum a Pusarium moniliforme / se nechají růst na agaru s bramborovou dextrosou 14 dnů při 20 °C na světle, čímž se vyprodukují konidie. Konidie se potom suspendují ve sterilním solném roztoku / 0,85 % /

- 18 a upraví se na 20 # transmitanci na spektrofotometru při 420 nm.

Polovina očka bakterie rostoucí na výživném agaru / Oxoid / 24 hodin při 20 °C se suspenduje v 2,5 ml sterilního solného roztoku. Jako kontrola se připraví captan v koncentraci 2,0 g/1. Jako kontrola se také použije samotný solný roztok.

Suspense kultury Fusarium / 50 yul / se umístí do sterilní zkumavk^píkroceníriíugy, jedna zkumavka pro každý pokus.

Ito každé Petriho misky se umístí jeden plátek bramboru tenčí než 10 mm, do kterého se korkovrtem o průměru 10 mm vyříznou 4 otvory. Povrch bramborového plátku se sterilisuje ethanolem a vysuší se sterilním filtračním papírem. Plátky se užívají v prů běhu 30 minut od řezání / nebo 60 minut, jestliže jsou uchovávány při 4 °C /.

Do tří ze čtyř otvorů v bramborovém plátku se umísti 50 /ul vzorek suspense spor Fuearium / 10® konidií na 1 ml /. V jednom ze třech otvorů se smísí vzorek bakteriální suspense / 50 _//Ul, přibližně 10® buněk na 1 ml / se suspensí Fusarium, do další ho se přidá benon^l v množství 100 ppm a třetí otvor slouží jako nenaočkovaná kontrola.

- 19 Petriho misky se uzavřou víčky a inkubují se 3 dny při 20 °C.

Stupeň onemocnění tkáně se vyhodnotí stupnicí od O do 3.

Testování na Phoma betae

Z vnitřku bulvy cukrové řepy se vyříznou koosíty o velikosti 2,5 x 2,5 x 1,5 nm a zvlhčí se asi 13 ml sterilní vody v plastikové nádobě.

Povrch kousků cukrové řepy se zahrne vzorkem kultury Phama betae se vzorkem předpokládaného fungicidnfho mikroorganismu nebo bez něho a kousky řepy se inkubují 3 týdny.

Ke konci inkubační periody se vzorky řepy vyhodnotí na přítomnost hniloby.

Půdní testování s cukrovou řepou

Přírodní půda, která je známá tím, Že způsobuje * vadnutí cukrové řepy, se zvlhčí na vlhkost 45 %. Do půdy se zašijí semena neošetřené cukrové řepy a semena potažená testovanými bakteriemi. Vzorky se potom inkubují 10 dnů při 15 °C za 12hodinového denního osvětlování. Fungicidní účinnost bakterií se vyhodnotí na basi počtu vzešlých semenáčků ve srovnání

- 20 s chemickým ošetřením tschigarenem /TMTtyí.

Druhé testování

Pro testování účinnosti vybraných mikroorga nismů sa použijí dva organismy : Pythium ultimum a Rhizoctonia solani.

Kultury P. ultimum a R. solani se pěstuji na agarp7ých deskách s bramborovou dextrosou po dobu 7 dnů při 20 °G.

Směs 200 g stříbřitého písku, 5 g kukuřičné mouky, 4 g pšeničných klíčků Beemax a 40 ml vody se autoklávuje 20 minut při 120 °C, potom se umístí do banky a inokuluje se čtvrtinou desky Pythium. Pro Rhizoctonia se použije tentýž substrát, ale bez kukuřičné mouky.

Baňky se inkubují 7 dnů při 20 °C.

ZřeSovací serie

Obsahy každé baňky s lýthium ultimum se smí sí s jemným pístem na konečnou hmotnost 300 g.

Jedna baňka Pythium v 8 litrech hlinitopísčité půdy * Mendip Minater = 2 normální / 2 N /.

Tuto půdu lze ředit čistou hlinitopísčitou půdou * Mendip · na další požadovaná zředění. Organismy se obvykle testují na lithium při zředění N/8 a HT/32 při 12 až 15 °C.

- 21 3/4 banky inokula Rhizoctonia solani v 6 litrech hlinitopísčité půdy Mendip Minster = nor máÍcí* Pro testování se používají koncentrace N/4 a ΪΙ/16.

Pokus se provádí v květináčích o průměru 7,62 cm, přičemž květináče se naplní ze tří čtvrtin infikovanou půdou· Do každého květináče se zaseje 5 hrachů a překryjí se čistou půdou. Přidá se 35 ml vody nebo bakteriální suspense jako zálivka pro každý květináč. Pro každé ošetření se připraví pět dvojic květináčů. Při testech biologicky účinných prostředků rostou bakterie 48 hodin při 20 °C v 1/10 TSB. Ke květináčům se přidá celá suspense / 35 ml /. Jako kontroly slouží obvykle 1/10 TSB a chemický pro středek. U testů na Rhizoctonia se jako zálivka přidá Pencycuron v koncentracích 10 , 100 nebo 200 ppm a na Pythium se jako zálivka použije metalaxyl v kon centraci 100 ppm.

Rostliry se nechají růst u testu na R. solani 7 až 14 dnů při 20 až 25 °G a na Pythium 14 dnů při 12 až 15 °C. Vzcházení rostlinek se monitoruje týdně. Rostliny se denně zalévají vodou. Zvláštní péče byla věnována tomu, aby byla půda během testů udržována vlhká, protože obě choroby mají sklon způsobovat uvadání rostlin.

- 22 Testování na Phytophthora megasperma

Kotouček z kultury P. megasperma o průměru 5 mm se umístí na misku o průměru 9 cm na medium V-8 na dobu 13 dnů při 25 °C. Medium 7-8 má následující složení :

V-8 Campbellova šláva	180 ml
GaGO^	2,7 S
destilovaná voda	720 ml
Difeo agar	13,5 g

/ Složky kromě agaru se smísí a prohřívají se 30 minut parou, přefiltrují se, pH se upraví na 7,2, přidá se agar a medium se sterilisuje 20 minut při 120 °C /,

Vlhké proso / 50 g + 20 ml destilované vody / se sterilisuje dvakrát 45 minut při 110 °C. Čtvrtina desky P· megasperma se položí dnem vzhůru na povrch prosa a inkubuje se ve tmě 28 dnů při 25 °C.

Proso infikované P. megasperma / o hmotnosti 22,5 g / se pečlivě v mixéru promísí se sterilisovanou půdou / 1 477,5 g / a vodou / 112,5 g /· Jako půda se použije směs 1:1:1 Obj,/obj. stříbřitého písku, polní půdy o pH 7 a rašeliny, která byla sterilisována 1 hodinu při ICO °0,

Do Leonardových nádob se naváží 500 g infikovaného prosa a půdní směsi a nádoby se potom přikryjí plastickými uzávěry až do zpracovávání· Dno vodní ná- 23 držky Leonardových nádob ae naplní 100 ml destilované vody.

Na povrchu prosa a směsi půdy se utvoří čtyři jamky pro rostliny a do každé se zasadí sojový bob / c.v, Azzurra / a překryje se oklfoní směsí.

Kultury testovaného organismu se připraví na deskách s živným agarem kultivovaných 24 hodin při 28 °C a v 250 ml NB baňkách / 150 ml NB / kultivovaných 24 hodin při 28 °C. Vzorek 75 ml kultury se centrifuguje 5 minut při 8 000 otáčkách za minutu při 20 °C. Supernatant se vyhodí, přidá se další 75 ml vzorek, centrifuguje se a supernatant se opět vyhodí. Usazenina zbylá ve zkumavce v centrifuze se opakovaně promývá 5 ml dávkami solného roztoku /9,2 g/1 /. Nakonec se usazenina disperguje do suspense ve 150 ml solného roztoku.

Do každé Leonardovy nádoby se 60 ml stříkačkou injikuje 30 ml solné suspense.

Pro srovnání s chemickými prostředky se do Leonardových nádob jako kontrola injíkují 30 ml vzorky roztoku 285,5 g metalaxylu 35 % / obchodní značka APRON / v 500 ml destilované vody.

Také se nasadí neinfikované kontroly za použití vzorků neinfikované směsi prosa a půdy.

- 24 Semena se potom nechají růst ve skleníku pri 20 + 2 °C za osvětlování 15 000 až 17 000 lux. Vyhodnocování se vyjadřuje v procentech vzcházení ve srovnání s chemickým ošetřením.

Test na Fusarium culmorum

Kultura Fusarium culmorum se pěstuje na agaru s bramborovou dextrosou 10 dnů při 20 °C, až se vytvoří konidíe, Konidie se seberou a spočítají o

na rozmezí koncentrací od 10* do 10 konidif na 1 ml. Ke ICO g pšeničných semen v nádobě se přidá 5 ml konidií a ná3oba se potom nechá přes noc rotovat při 10 °C,

Vzorek infikovaných semen se před setím umístí do směsi testovaných bakterií a stříbřitého písku na 60 minut, čímž dojde k povlečení asi 10^ bteěk na semeno. Druhý vzorek se ošetří benomylem / 100 pum / jako chemickou kontrolou.

Jedno sto semen se zasadí do rašelinového kompostu v sázecí misce do hloubky 2 cm. Kompost se zalije vodou na začátku pokusu, nechá se 2 týdny při 20 °C a zalije se opět pátý den po zasetí. Po tomto počátečním zalití kompostu za účelem vzklíčení semen se kompost nechá uschnout, aby se podpořil vývin choroby.

- 25 Sleduje 3e vzcházení semenáčků a vývin choroby. Příznaky choroby se hodnotí ve stupnici od nuly / žádné příznaky / do 4 / vážné onemocnění /.

Výsledky

Asi 7 CCC bakteriálních půdních, organismů se podrobí testování popsanému výše. Tabulka 1 níže sumarizuje výsledky těchto testů. Číslice ve sloupcích jsou ve stupnici od nuly / Žádný fungicidní účinek / do 3 / žádné zjistitelné příznaky choroby /.

V tabulce je také zahrnut srovnávací příklad typického neúčinného bakteriálního kmene označeného 53/87.

Tabulka 1

primární testy NCIB	40186 40187 40188 40190 53/87
Fusarium culmorum	1	2	0	2	1
Fusarium moniliíorme	1	1	0	1	1
Fusarium sambusinum	0	1	0	0	1
Pýthium ultimum	2	3	2	2	0
Aphanomyces	3	1	0	2	0
Phoma betae	2	0	3	1	0
cukrová řeca/půda	3	2	2	3	0

sekundární te3ty NCI3	40186	40187 40188 40190 53/87
Hhizoctonia solani	0	3	3	0	0
lythium ultimum 15°C		3	3	0	0
Pythium ultimum 24°C	3	2	2	2	0
Pusarium culaorum	2	2	2	2	0
P. megasperma	2	1	1	1	0

Výsledky polních pokusů 1989

Kmeny, které byly nejslibnější v primárních a sekundárních testech byly vybrány pro polní pokusy jako biologické prostředky proti chorobě padání klíčících rostlin * / vadnutí / u hrachu a cukrové řepy.

Obr. 1 znázorňuje výsledky získané s kmenem NCIB 40 186 proti vadnutí hrachu, Tyto pokusy byly prováděny ve Velké Británii. Tímto kmenem bylo dosaženo ochrany okolo 80 % z ochrany dosažené chemickým ošetřením metalaxylem / obchodní značka APRON /,

Kmen NCI3 40 137 byl v tomto pokusu z velké části neúčinný.

Obr, 2 a 3 znázorňují výsledky polních pokusů na cukrové řepě za použití kmenů NCI3 40 136 a

190. Tyto pokusy byly prováděny v Belgii. Btylo

- 27 vybráno 6 míst na polí. Tři místa /1 , 3 a 6/ byla oseta cukrovou řepou v březnu a zbylá tři místa byla oseta v květnu. Obr. 2 uvádí výsledky při prvním výhod nocováni, které bylo prouděno 3 týdny po vysetí a abr. 3 uvádí výsledky po 6 až 3 týdnech po vysetí.

Sumárně tyto výsledky ukazují, Že vadnutí hrachu způsobené Pythium ultimum se aplikací kmene NCIB 40 136 sníží na hladinu srovnatelnou s hladinou dosaženou chemickým ošetřením metalaxylem. Výsledky u cukrové řepy ukazují na zlepšené vzcházení semenáčků při aplikaci kmenů NCIB 40 135 a 40 190 ve srovná44 ní s neožtřenou kontrolou na všech 6 místech. Vzcházení semenáčků na třech místech v přítomnosti uvedených kmenů je srovnatelné se vzcházením dosaženým při použití metalaxylu.

Výsledky polních pokusů 1990

Během polních pokusů v roce 1990 byly mikroorganismy NCIB 40 186 a 40 190 zkoušeny na jejich možnou inhibici Pythium spp. . Pokusy byly prováděny ve Spojených státech amerických, v Belgii a ve Francii a výsledky jsou uvedeny níže. Pro účely pokusů byly πύΐ£ΓοοΓδ3ηί3πξ7 aplikovány jako postřiky semen s následujícím vysušením v písku při pokusech

- 28 v Evropě a jako gumovíto-rašelinové přípravky ve Spojených státech amerických. Dljaší pokusy probíhají v ostatních částech světa, kde choroby vadnutí jsou endemické, například u zeleninových plodin v Hala jsii. I když ještě nemůžeme dodat výsledky pokusů z celého světa, prostě proto, že pokusy nejsou ještě kompletní a nelze je samozřejmě 2 důvodů sezónních omezení zemědělských postupů urychlit, lze přesto již nyní říci, že tyto zvláštní mikro/organismy vykazují přinejmenším velkou schopnost být komerčními biologickými prostředky k ochraně rostlin.

Další testování ostatních výše uvedených mikroorganismů pokračuje v laboratoři a ve skleníku v souladu s normální praxí pro zjišťování účinnosti a bezpečnosti jak pro lidi, tak pro životní prostředí. Výsledky, která jsou v současné době k disposici potvrzují to, co bylo nalezeno dříve a co je již výše popsáno.

Kmeny NCIB 40 186 a 40 190 byly testovány proti vadnutí cukrové řepy při pokusech na 9 políčkách v Belgii a ve Francii. Během setí v časném jaru tylo počasí velmi teplé a sttché, což způsobilo určité problény s vývinem choroby vadnutí cukrové řepy.

V každém testovaném políčku bylo vyseto celkově 200

- 29 semen. Výsledky z těchto 9 pokusů jsou následující.

Belgické a francouzské pokusy 1990 testovaná plodina : cukrová řepa chemická kontrola : tachigaren/TLÍTO

pokus č«	počet semen	, vzešlých ze 200 s	semen zasetých
neosetřená kontrola	chemické ošetření	NC13 40136	NC 13 40190
1	93	125	130*	114
£	113	141*	124	127
3	113	157*	146*	138*
4	107	139*	131*	122*
5	120	150³¹	123	130
6	84	116*	111*	114*
7	135	153*	143	13S
8	119	148*	141	135
9	134	155*	144	144

x = L3D při 5 % pravděpodobnosti

Francouzské pokusy 1990 testovaná plodina : hrách • 30 chemická kontrola : jak je uvedeno níže

Počet rostlin znamená střední počet rostlin, které vzešly na pruhu 5 m dlouhém 22 dnů po ošetření.

Sloupec 2 v tabulkách uvádí počet rostlin, které vzešly z 200 semen sa 22 dnů po vysetí. Písmena za Čísly znamenají statistickou významnost. Obecně při 5 % hladině pravděpodobnosti není žádný signifikantní rozdíl mezi hodnotami označenými stejnými písmeny.

Kontrolní ošetření

Testy byly prováděny v normální polní půdě bez jakýchkoliv přidaných pathogenů.

ošetření	počet vzešlých
neoáetřené semeno	172,58 AC
NCIB 40186 - 107 buněk na semeno	184,75 A
APRON - 30 g ÚČ.lítky/100 kg semen	171,50 AC
EEDOIÍIL 23 metalaxyl - zálivka do řádku	151,00 A
blank semeno 100 buněk/semeno	176,00 AC

- 31 Testy

Pathogen / Pýthium / se přidá v množství 200 g na metr řádku ošetření počet vzešlých neoŠetřené semeno

NCI3 40186 - 107 buněk na semeno

APRON - 30 g úč.látky /ICO kg semen

RHXMEL 25 metalaxyl - 2álivka do řádku blank semeno 100 buněk/semeno

111.25 I 144,75 DC157.25 SCDF

164.25 AD

119,88 ΞΙ

Kalifornské / USA / pokusy 1990 testovaná plodina : hrách testovaný pathogen : lithium v dávce 30 g na metr řádku ošetření % vzešlých žádný přidaný pathogen, žádné ošetření pathogen + NCI3 40186 - 107 buněk/semeno pathogen + blank semeno - ICO buněk/semeno pathogen + APBON 30g úč. látky /ICC kg

93,13 A3

75,31 ECD

51,56 5F

92,81 A3

- 32 Misaissippeký pokus / USA / 1990 testovaná plodina : kukuřice testovaný pathogen : Fusarium i/ 10 z na metr řádku ii/ 30 g na metr řádku

Vzcházení se počítá v % po 15 dnech co vysetí

ošetření	% vzešlých
žádný přidaný pathogen, žádné ošetření	65,833 0
žádný přidaný pathogen,
NCIB 40 136 107 bunek/semeno	67,917 C
žádný přidaný pathogen,
CAPTAN jako ošetření semene	69,583 EC
pathogen i/, žádné ošetření	51,250 D
pathogen i/ +
NCIB 40186 107 bunšk/semeno	50,000 A3
pathogen ii/, Žádné ošetření	69,375 HC
pathogen ii/ +
NCIB 40186 107 bunšk/semano	82,708 A
pathogen ii/ +
CAPTAN jako ošetření semene	63,958 C

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1, Způsob vyhledávání potenciálního fungicidního prostředku, vyznačující se tím, že zahrnuje stanovení inhibičního účinku tohoto prostředku na houbové napadení ve dvou testech, přičemž v prvním testu se připraví mycelium pathogena, kterým je Pythium spp, ve vrstvě kultivačního média, na kultivační vrstvu se umístí vrstva sterilní půdy, do vrstvy půdy se přidá vzorek potenciálního fungicidního prostředku, testovací jednotka se inkubuje a stanoví se inhibiční vliv fungicidního prostředku na růst pathogena, a ve druhém testu se inokuluje vzorek půdy pathogenní houbou, do této houbou infikované půdy se vyseje semeno rostliny citlivé na napadení touto houbou, na půdu se aplikuje vzorek potenciálního fungicidního prostředku, semeno se nechá vyklíčit a nechá se z něj vyrůst rostlina, a stanoví se inhibiční vliv fungicidního prostředku srovnáním zdravotního stavu rostliny s neinfikovanou kontrolou.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í tn , že rostlinou náchylnou k infekci komplexem způsobujícím vadnutí klíčících rostlin je cukrová řepa.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že potenciálním fungicidním prostředkem je mikroorganismus.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že mikroorganismem je mikroorganismus žijící na kořenech .
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se mikroorganismus žijící na kořenech isoluje ze vzorku půdy tak, že se do uzavíratelné nádoby umístí vrstva vlhkého sterilního písku a na ni se umístí vlhký vzorek půdy a do vzorku půdy se zaseje semeno rostliny náchylné k určitému onemocnění, nádoba se uzavře a umístí se do takového prostředí, které způsobuje vývin choroby, semeno se nechá vyklíčit a kořeny se nechají prorůst z vrstvy půdy do vrstvy písku, vyřízne se tunel podélně oběma vrstvami, vyberou se kořeny pouze z vrstvy písku a z těchto kořenů se isolují mikroorganismy.
6. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se prostředek, který vykazuje inhibici choroby v obou uvedených testech podrobí dalšímu testování na inhibici plísňové infekce v jednom ne bo ve více než jednom testu, které zahrnují :

a) infekci cukrové řepy organismem Aphanomyces cochlioides při teplotě od 12 do 15 ^UC,

b) infekci hrachu organismem Pythium ultimum při teplotě od 12 do 15 °C,

c) infekci hrachu organismem Pythium ultimum při teplotě od 24 do 27 °C,

d) infekcí hrachu organismem Shizoctania solani při teplotě cd 24 dc 27 °C,

e) infekcí pšenice organismem Fusarium culmorum při teplotě od 13 do 21 °C,

f) infekci sojového bobu organismem Phytophthora megasparma při teplotě od 20 do 24 °C,

g) infekci řezu bramboru organismem Fusarium moniliforme při teplotě od 20 do 24 °C,

n) infekci řezu bramboru organismem Fusarium sambusinum při teplotě od 20 do 24 °C a

i) infekci cukrové řepy organismem Phoma spp. při teplotě od 15 do 19 °C.