PL166131B1

PL166131B1 - Sposób skriningowania potencjalnych srodków przeciwgrzybiczychPierwszenstwo: PL PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number: PL166131B1
Application number: PL90302121A
Authority: PL
Inventors: Maria Fattori; Stefaan R M Horemans; Marc Lefebvre; Keith A Powell; Annabel Renwick
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1990-10-17
Publication date: 1995-04-28
Also published as: CZ284515B6; ZA908268B; FI921722A0; FI102615B1; SK503590A3; DE69029739D1; HUT60423A; GB8923407D0; MY107283A; DK0496791T3; FI102615B; NO921519L; WO1991005475A1; AU6614190A; US5260302A; CZ503590A3; GR3022295T3; JPH05501407A; EP0496791A1; AU652132B2

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób skriningowania potencjalnych środków przeciwgrzybiczych.

W celu poszukiwania drobnoustrojów o interesujących właściwościach, powszechnie stosuje się w mikrobiologii skriningowania wielkiej ilości, zwykle wielu tysięcy izolatów z gleby pod względem aktywności, interesującej z punktu widzenia zamierzonego celu. Jednym z takich celów jest izolowanie biologicznych czynników kontrolujących, określonych dalej skrótem BCAs, które są aktywne w stosunku do wybranych patogenów roślin. Tego rodzaju BCAs mogą stanowić alternatywne środki do zwalczania patogenów lub dodatki do środków chemicznych.

166 131

W normalnej praktyce pobiera się próbki gleby z tych obszarów pól, gdzie wydaje się, że występowania danego patogenu jest przytłumione; może to bowiem wskazywać, że drobnoustroje występujące w samej glebie mogą hamować patogenność. Następnie, w laboratorium, izoluje się drobnoustroje z poszczególnych próbek, przez spłukiwanie ich z korzeni i hodowanie na agarze w jednej lub dwóch temperaturach typowych dla optymalnych temperatur wzrostu drobnoustrojów, zazwyczaj w temperaturze 25-30°C. Następnie izolaty poddaje się skriningowaniu, najpierw przeciw różnym patogenom na agarze, na szeregu płytkach Petriego, stosując metodę podwójnej hodowli. Jest to skriningowanie wstępne. Następnie bada się dokładniej obiecujące izolaty ze wstępnego skriningowania stosując szereg wtórnych badań skaningowych z zastosowaniem gleby.

Jak wykazuje doświadczenie, tradycyjne skriningowanie wstępne nie jest ani właściwe ani wystarczająco selektywne w stosunku do izolatów, które ostatecznie przechodzą przez następne testy skriningowe i doświadczenia polowe. Przez tradycyjne wstępne skriningowanie przechodzi duża ilość izolatów (zwykle około 20%), które wydają się obiecujące; jednak większość z nich zostaje odrzucona w następnych testach. Ponadto, wiemy obecnie, że skriningowanie wstępne, poza tym, że przepuszcza izolaty które następnie, jak się okazuje nie mają użytecznej aktywności, odrzuca pewne izolaty, które jak obecnie wiadomo, są zdolne do przejścia przez następne testy skriningowe. W efekcie, tradycyjne testy przepuszczają izolaty, które mają niską aktywność, a nie przepuszczają izolatów, które są dobrymi inhibitorami patogeniczności.

Istnieje więc oczywiście potrzeba opracowania nowego sposobu skriningowania izolatów z gleby, tak aby wyodrębnić dużą ilość potencjalnie dobrych izolatów i odrzucić jak najwięcej możliwie substancji o małej aktywności.

Przedmiotem wynalazku jest sposób skriningowania potencjalnych środków przeciwgrzybiczych. Polega on na tym, że bada się efekty hamujące potencjalnych środków przeciwgrzybiczych za pomocą dwóch testów, to jest za pomocą pierwszego testu na hamowanie rozwoju patogenu w wyjałowionej glebie, zakażonej grzybicą Pythium spp oraz za pomocą drugiego testu, znów na hamowanie rozwoju zakażenia w rosnącej roślinie, należącej do gatunku podatnego na zakażenia, wynikające z kompleksu zakażenia powodującego gnicie skutkiem nadmiernej wilgoci, w obecności powyższego kompleksu, identyfikuje się środki wykazujące potencjalny efekt hamujący w obu testach w porównaniu do prób kontrolnych i poddaje się je dalszemu badaniu.

Wynalazek ma szczególne, ale nie wyłączne, zastosowanie w skriningowaniu drobnoustrojów w próbek gleby w celu selekcji potencjalnych BCAs, ale nie ma żadnego powodu aby tego samego sposobu według wynalazku nie stosować, bez żadnej adaptacji, do środków chemicznych.

Jak wskazano powyżej, tradycyjny sposób izolowania drobnoustrojów nie jest sam w sobie selektywny. Tak więc niniejszy wynalazek umożliwia również wstępnie skriningujący sposób izolowania drobnoustrojów z próbek gleby. Sposób ten polega na umieszczeniu w pojemniku, dającym się szczelnie zamknąć, warstwy wilgotnego, wyjałowionego piasku, umieszczeniu na niej próbki wilgotnej gleby i wysianiu na próbce gleby nasienia rośliny podatnej na dane zakażenie, szczelnym zamknięciu pojemnika, umieszczeniu pojemnika w warunkach środowiskowych prowadzących do rozwoju zakażenia, umożliwieniu wykiełkowania nasienia i przejście jego korzeni z warstwy gleby do warstwy piasku, przecięciu rurki wzdłuż przez obie warstwy, wyjęciu korzeni z warstwy piasku i wyizolowaniu drobnoustroju z wyjętych korzeni.

Środki, tak chemiczne jak i mikrobiologiczne, które przejdą dwa testy według wynalazku, można następnie poddawać dalszemu skriningowaniu na hamowanie zakażeń grzybiczych, stosując jeden lub więcej niż jeden dodatkowy test wybrany z następującej grupy:

a) zakażenie buraka cukrowego przez Aphanomyces cochlioides w temperaturze 12-15°C;

b) zakażenie grochu przez Pythium ultimum w temperaturze 12-15°C;

c) zakażenie grochu przez Pythium ultimum w temperaturze 24-27°C;

d) zakażenie grochu przez Rhizoctonia solani w temperaturze 24-27°C;

e) zakażenie pszenicy przez Fusarium culmorum w temperaturze 18-21°C;

f) zakażenie soi przez Phytophthora megasperma w temperaturze 20-24°C;

g) zakażenie plasterka ziemniaka przez Fusarium moniliforme w temperaturze 20-24°C;

h) zakażenie plasterka ziemniaka przez Fusarium Sambusinum w temperaturze 20-24°C oraz

i) zakażenie buraka cukrowego przez Phoma spp w temperaturze 15-19°C.

166 131

Tak więc, biorąc pod uwagę wszystkie elementy wynalazku, można izolować potencjalne BCAs sposobem, który jest przeznaczony tylko do wyodrębniania organizmów korzeniowoaktywnych, przepuszczonych przez dwa wstępne testy skriningujące, które identyfikują organizmy o wysokiej potencjalnej aktywności i następnie skriningowanych w szeregu rygorystycznych testów, które identyfikują środki, które okazują się później bardzo silne przy testowaniu ich w szeregu różnych warunkach polowych.

Stanowi to znaczny postęp w stosunku do tradycyjnych sposobów, które jak już wspomniano, mają tendencję do odrzucania organizmów, które przechodzą przez testy według wynalazku i do przepuszczania bardzo wielkiej liczby organizmów, które w testach według wynalazku okazują się albo w dużym stopniu nieaktywne albo mniej aktywne niż próby kontrolne.

Środek przeciwgrzybiczy skriningowany sposobem według wynalazku wykazuje takie samo lub lepsze hamowanie zakażeń grzybiczych niż porównywalny środek chemiczny, na co wskazują wyżej wymienione testy skriningowe według wynalazku.

Sposobem według wynalazku wyizolowano i oceniono cztery drobnoustroje, które uznano za szczególnie aktywne względem różnych zakażeń grzybiczych, na ogół związanych z nadmiarem wilgoci.

Środki przeciwgrzybicze, skriningowane sposobem według wynalazku zawierają droboustroje gatunku Pseudomonas fluorescens, których hodowle zdeponowano 1 września 1989 r. zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, w Aberdeen, Zjednoczone Królewstwo, pod numerami przyjęcia 40186, 40187, 40188 i 40190.

Rolnicze środki przeciwgrzybicze zawierają jako substancję czynną jeden lub więcej z wymienionych drobnoustrojów w połączeniu z kompozycją nośnikową dopuszczalną w praktyce rolniczej.

Jako przykłady typów środków rolniczych można wymienić środki do zaprawiania nasion, ciekłe środki do zraszania korzeni lub gleby oraz środki granulowane i proszkowe. Podstawowe materiały do ich wytwarzania są dobrze znane.

Jako przykład skuteczności skriningowej sposobu według wynalazku zastosowano tradycyjny sposób in vitro do skriningowania około 7000 izolatów i stwierdzono, że procent „przechodzenia wynosił około 20%, podczas gdy sposób według wynalazku przepuszczał tylko około 4-5% izolatów. Ważne jest, że zestaw drobnoustrojów, które przeszły przez każdy z minimum dwóch testów według wynalazku obejmował bardzo podobne drobnoustroje, zaś tradycyjny skrining agarowy przepuścił zestaw zupełnie niepodobnych drobnoustrojów. Niektóre drobnoustroje, które mogłyby być odrzucowe gdyby stosowano tradacyjne metody skriningowe, wykazały wysoką aktywność w następnych testach skaningowych i w doświadczeniach polowych. Jest to główna zaleta wynalazku: wstępny skrining obniża całkowitą liczbę drobnoustrojów, które wymagają dalszego skaningu oraz duża część z tych, które nadają się do dalszego skriningowania, wykazuje następnie poszukiwaną aktywność w doświadczeniach polowych. Uważa się, że przyczyny tego są następujące. Parametry testowania, np. temperatura i skład środowiska odżywczego w sposobie tradycyjnym optymalizuje się w celu pobudzenia wzrostu drobnoustroju na agarze: takie warunki hodowli są bardzo dalekie od surowych warunków panujących w rzeczywistości w środowisku, w którym zamierza się stosować te drobnoustroje. W rezultacie wiele drobnoustrojów, które przeżywa ten wstępny test, jest na ogół słabych; mogą one przeżyć tylko w zamkniętym środowisku hodowli na agarze, a następnie giną w bardziej rygorystycznym teście wtórnym i w dalszych testach skaningowych, nastawionych na stwarzanie warunków bardziej podobnych do polowych warunków środowiskowych. Z drugiej strony, w partii izolatów zawsze są, co potwierdzają doświadczenia, szczepy drobnoustrojów, które wolą warunki polowe, to jest np. niskie temperatury lub mniej środków odżywczych albo środki odżywcze o innym składzie. Takie drobnoustroje nie hodują się dobrze w testach agarowych i normalnie zostałyby odrzucone. Doświadczenia wykazują, że dwa testy skriningowe, stanowiące istotę wynalazku, zapewniają warunki podczas testu bardziej zbliżone do warunków polowych i w związku z tym dają bardziej realistyczne wskazania co do zdolności drobnoustroju dobrego rozwoju w środowisku, w którym ma on być stosowany.

Szczep NCIB 40 187 wyizolowano z korzeni pszenicy, pobranych z roślin, hodowanych na polu na farmie zwanej Badbury 2, Draycott Farm, Chiseldon, Swindon, Wiltshire, Zjednoczone Królewstwo.

166 131 5

Szczepy NCIB 40186 i 40188 wyizolowano z gleby pobranej z pola znanego pod nazwą Stockoy Field w Jodoigne w Belgii.

Szczep NCIN 40 190 wyizolowano z korzeni sadzonek pszenicy z pola Lower Garston, Rushall Farm, Newbury, Zjednoczone Królewstwo.

Poniżej opisano sposób izolowania, charakteryzowania i skriningowania izolatów bakteryjnych pod względem aktywności przeciw szeregowi grzybów zakażających rośliny uprawne. Bardzo wiele droboustrojów wyizolowano, zidentyfikowano i poddano skriningowi w sposób opisany poniżej, a spośród nich wyizolowano cztery szczepy ze względu na ich wyjątkową skuteczność.

Poniżej opisano izolowanie mikroorganizmów.

Probówki otrzymywano z rurkowaniem dializowanym na głębokości 35 cm przy szerokości

5,5 cm z poszerzaniem wykonanym w odległości 5 do 7 cm od jednego końca. Miałki piasek przemywano, suszono i wsypywano do probówki na głębokość 12 cm i nawilżano 20 ml wody destylowanej. Probówki z piaskiem dla podtrzymania umieszczano wewnątrz szklanych probówek (średnica 7 cm, głębokość 30 cm). Następnie probówki na dnie zatykano kauczukowym korkiem pokrytym folią aluminiową i u góry korkiem z waty bawełnianej, po czym pakowano w folię aluminiową. Całość utrzymywano dwukrotnie w autoklawie w temperaturze 121°C w czasie 60 minut.

Próbkę gleby zbierano z powierzchni sita i i utrzymywano przy wilgotności 40% w temperaturze 4°C aż do użycia, to jest w ciągu dwóch dni zbierania. Następnie próbkę gleby przesiewano przez sita 4 mm i dodawano do probówek na głębokość 3 cm od powierzchni piasku. Nasiona (grochu, pszenicy, buraków cukrowych, słonecznika, kukurydzy lub soi) sadzono i pokrywano glebę na całkowitą głębokość 6 cm. Probówki umieszczano prosto w drucianym koszu, który następnie zamykano w plastikowym pojemniku z otworami dla umożliwienia wymiany powietrza i minimalnych strat odparowywania. Następnie kosze umieszczano w komorze wzrostowej i inkubowano w czasie czterech tygodni w temperaturach 10-24°C, przy wilgotności względnej 70%, w cyklu 16 godzin dnia/8 godzin nocy.

Po upływie czterech tygodni inkubowania, plastikowe rurkowanie do dializowania otwierano wysterylizowanym skalpelem. Korzenie każdej rośliny oczyszczano z gleby i piasku i roślinę umieszczano na białej plastikowej tacy. Koronę i końcowe regiony roślin odcinano i myto oddzielnie w sterylnej wodzie.

Obcięte fragmenty umieszczano w sterylnych kolbach Erlenmeyera, zawierających 20 ml dejonizowanej wody i warstwę szklanych kulek. Następnie kolby wytrząsano w orbitalnym inkubatorze przy 120 obrotach/min w ciągu 30 minut. Stosując czysty roztwór korzeni i popłuczyny z korzeni i koron z kolb, przygotowano roztwory w rozcieńczeniu 1:9 w sterylnym 1:9 w sterylnym roztworze Ringera do rozcieńczenia 10”³. Następnie pod wielokrotnością 100μΐ z każdego roztworu powlekano powierzchnię trzech mediów agarowych o następującym składzie:

Agar soi tryptonowej

Brzeczka soi tryptonowej 3,0 g

Agar bakteriologiczny 17,5 g

Woda dejonizowana 1000 ml (Środowisko utrzymywano w autoklawie w 121°C w ciągu 15 minut).

Agar z ekstraktu z korzeni

Świeże korzenie pszenicy 10 g

Agar nr 3 17,5 g

Woda dejonizowana 1000 ml (Świeże korzenie zważono i zmieszano z niewielką ilością dejonizowanej wody w mieszarce do żywności. Gęstą zawiesinę umieszczono wewnątrz torby o czterech warstwach muślinu o małym mesh. Torbę zawieszono w pozostałej ilości dejonizowanej wody w 2-litrowej zlewce i inkubowano w 20°C w ciągu 4 dni. Następnie muślinową torbę usunięto i do wyciągu z korzeni dodano agar. Środowisko utrzymywano w autoklawie w 121°C w ciągu 15 minut).

166 131

Agar z wyciągu z gleby

Próbka gleby 10 g

Agar nr 3 17,5 g

Dejonizowana woda 1000 ml (Glebę zważono i umieszczono w dejonizowanej wodzie w 2-litrowej zlewce. Zawiesinę gleby przykryto i inkubowano w 20°C w ciągu 4 dni, po czym odwodniono przez poczwórną warstwę muślinu o małym mesh. Następnie dodano agar i środowisko utrzymywano w autoklawie w 121°C w ciągu 15 minut).

Dla każego rozcieńczenia sporządzano trzy powtórzenia. Płytki agarowe inkubowano w 12°C w ciągu do pięciu dni, po których ilość kolonii na każdej płytce została obliczona i zarejestrowana. Tam gdzie to możliwe z każdej rośliny, wybranego miejsca i połączenia agaru wybrano płytkę zawierającą pięćdziesiąt lub mniejszą ilość kolonii. Gdy to nie było możliwe, na płytce narysowano siatkę z pięćdziesięciu przecięć i pobrano kolonie, które znajdowały się na lub w pobliżu każdego przecięcia. W ten sposób selekcja kolonii była całkowicie wyrywkowa.

Poszczególne kolonie wypikowano z płytek, stosując sterylną pętlę i poddano przeszczepianiu na płytkach Petriego o średnicy 5 cm, zawierających 1/10 agar z soji tryptonowej (1/10 TSA). Następnie płytki inkubowano w 12°C w ciągu 5 dni i sprawdzano izolaty pod względem czystości. Gdy hodowla była mieszana, izolat wcierano na pochyłość 1/10 TSA w celu uzyskania pojedynczej kolonii. Wybierano jedną kolonię i przeszczepiono na 1/10 TSA. Kolekcję hodowli przechowywano w 4°C.

Określenie cech charakterystycznych mikroorganizmu.

Charakterystyki morfologiczne mikroorganizmu są następujące:

Morfologia komórki: pałeczki gram-ujemne.

Morfologia kolonii: NCIB 40 186: odbielone, okrągłe, regularne, pełne, mało wypukłe, gładkie, błyszczące, półprzezroczyste, średnica 1,5-2mm; NCIB 40 187: odbielone, okrągłe, regularne, pełne, podniesione, gładkie, błyszczące, półprzezroczyste, średnica 1 mm; NCIB 40 188: odbielone, okrągłe, regularne, pełne, mało wypukłe, gładkie, błyszczące, półprzezroczyste, średnica 1,5-2 mm; NCIB 40 190: odbielone, okrągłe, regularne, pełne, płaskie, gładkie, błyszczące, półprzezroczyste, średnica 1 mm.

Temperatura wzrostu. Wszystkie szczepy 37°C + ve; 41°C-ve; 45°C-ve.

Fluoroscencja - wszystkie szczepy + ve.

Kataliza - wszystkie szczepy + ve.

Oksydaza - wszystkie szczepy + ve.

Fermentujące w glukozie OF - wszystkie szczepy -ve.

Szybki test (API)

Redukcja azotanów

Wytwarzania indolu

Kwas z glukozy

Dehydrolaza argininy

Ureaza

Hydroliza aeskuliny

Hydroliza żelatyny β-Galaktozydaza

Asymilacja glukozy

Asymilacja arabinozy

Asymilacja mannozy

Asymilacja mannitolu

Asymilacja M-acetyloglukozaminy Asymilacja maltozy Asymilacja glukonianu

MCIB
40186	40187	40 188	40190
-	-	-	-
-	-	-	-
_-	_-	-	-
+	+	+	+
-	-	-	-
-	_-	_-	-
+	+	+	+
-	-	-	-
+	+	+	+
+	+	+	+
+	+	+	+
+	+	+	+
+	+	-	+
-	-	-	+
+	+	+	+

166 131

Asymilacja kapronianu	+	+	+	+
Asymilacja adypinianu	-	-	-	+
Asymilacja jabłczanu	+	+	+	+
Asymilacja cytrynianu	+	+	+	+
Asymilacja fenylooctanu	-	-	-	+
Cytochromooksydaza	+	+	+	+
Skrining wstępny
Skrin płytki Petriego z glebą.

Płytki Petriego (5 cm) napełniano 10 ml agaru dekstrozy ziemniaczanej (PDA). Skosy agarowe siedmiodniowej kultury Pythium ulcimum rosnące w temperaturze 20°C umieszczono centralnie na PDA. Płytki inkubowano 5 dni w temperaturze 20°C, przy czym P. ultimum wytwarzał kolonie na płytkach.

Piasek gliniasty Minster Mendip utrzymywano w autoklawie w temperaturze 120°C w czasie 60 min. Następnie dodawano kiełki pszenicy (1% wag/wag.) i dokładnie mieszano. W celu pokrycia Pythium w każdej płytce umieszczano około 8 g gleby.

Badane bakterie rosły na płytkach 1/10 TSB lub 1/0 TSA w czasie 48 h w temperaturze 12°C. Na każdą płytkę stosowano 2 ml kultury, przy czym płytki stosowano w dwóch powtórzeniach.

Obróbka: samo 1/10 TSB; metalaksyl (100 ppm). Badany organizm 1/10 TSB dodano do gleby na PDA nie inokulowanej Pythium.

Płytki inkubowano w czasie 4 dni w 10°C. Aktywność obliczano w skali od zera do 3, na podstawie całkowitego zahamowania wzrostu grzybów w glebie.

Skrin ziemniaczany Fusarium.

Sterylny krążek filtracyjny (9 cm średnicy) nawilżano dokładnie wodą i umieszczano na podstawce sterylnej płytki Petriego. Do każdej obróbki stosowano dwie płytki.

W celu wytworzenia konidiów kultury Fusarium (Fusarium sambusinum, Fusarium culmorum i Fusarium moniliforme) wzrastały na agarze dekstrozy ziemniaczanej w czasie 14 dni w temperaturze 20°C w świetle. Następnie konidia zawieszano w sterylnej solance i doprowadzano do transmitancji 20% na spektrofotometrze przy 420 nm.

Jedną połowę posiewu bakterii rosnącą na pożywce agarowej (Oxoid) w czasie 24 h w 20°C zawieszano w 2,5 ml sterylnej solanki. W próbie kontrolnej stosowano kaptan (N-trójchlorometyloczterohydroftaloimid) w ilości 2,0 g/l, a także samą solankę.

Zawiesinę Fusarium (50 μΐ) umieszczono w sterylnej mikrocentrofugowej probówce, przy czym stosowano jedną probówkę dla każdej próbki.

Jeden plasterek ziemniaka o grubości poniżej 10 mm, którego cztery ścianki obkrojono korkoborem o średnicy 10 mm umieszczono w każdej płytce Petriego. Powierzchnię plasterka ziemniaka sterylizowano etanolem i suszono sterylnym papierem filtracyjnym. Plasterki używano w czasie 30 minut od ścinania (lub 60 minut jeżeli były utrzymywane w temperaturze 4°C).

Próbkę 50 ml zawiesiny sporów Fusarium (10^e konidia/ml) umieszczono na trzech z czterech

A ścianek plasterka ziemniaka. Próbkę zawiesiny bakteryjnej (50pl, około 10 komórek w 1 ml) mieszano z zawiesiną Fusarium na jednej z trzech ścianek, na drugiej stosowano benomyl w ilości 100 ppm, a trzecią ściankę użyto jako nieinokulowaną kontrolę. Płytki Petriego zamykano wieczkami i inkubowano 3 dni w temperaturze 20°C. Poziom zakażenia tkanek oceniano skalą ocen od 0 do 3. Skriningowanie wobec Phoma betae.

Kawałki buraka cukrowego o wymiarach 2,5 X 2,5 X 1,5 mm wydzielono z wewnętrznej części korzenia i nawilżono około 13 ml sterylnej wody w plastikowym pojemniku.

Na powierzchnię naniesiono próbkę kultury Phoma beta z/lub bez próbki mikroorganizmu przeciwgrzybowego i kawałki te inkubowano w czasie 3 tygodni. Pod koniec okresu inkubowania próbki buraka kładziono na korzeń.

Skrin burak cukrowy/gleba.

Glebę pochodzenia naturalnego, która wiadomo było, że powoduje (zgorzel) gnicie skutkiem nadmiaru wilgoci, doprowadzono do wilgotności 45%. Oczyszczone nasiona buraka cukrowego

166 131 oraz nasiona pokryte badaną bakterią sadzono do gleby. Następnie próbki inkubowano w czasie 10 dni z 12-godzinnym cyklem naświetlania na dzień w temperaturze 15⁰C. Działanie przeciwgrzybowe bakterii oceniano na podstawie liczby wschodów, które pojawiały się w porównaniu z chemiczną kontrolną metodą Tachigaren/TWTD.

Skrining drugi.

Do badania efektywności dwóch skinów wyselekcjonowanych mikroogranizmów użyto: Pythium iltimum i Rhizoctonia solani.

Kultury P. ultimum i R. solani hodowano na płytkach PDA w czasie 7 dni w temperaturze 20°C.

Mieszaninę 200 g srebrzystego piasku, 5 g mąki kukurydzianej, 4 g kiełków pszenicy Beemax i 40 ml wody przetrzymywano w autoklawie w temperaturze 120°C w czasie 20 minut, po czym umieszczano w kolbie i inokulowano 1/4 płytki z Pythium. W przypadku Thizoctonia stosowano te same substraty lecz bez użycia mąki kukurydzianej. Kolbę inkubowano w temperaturze 20°C w czasie 7 dni. Serie rozcieńczeń. Zawartość każdej kolby z Phytium ultimum mieszano z miałkim piaskiem do uzyskania końcowego ciężaru wagowego 300 g. Jedna kolba z Phytium w 8 litrach gliniastego piasku Mendip Minster=2 Normalności (2N).

Całość rozcieńczano czystym gliniastym piaskiem Mendip do uzyskania dalszych żądanych rozcieńczeń. Izolaty były zwyczajnie skriningowane przeciw Pythium przy N/8 i N/32 w temperaturze 12-15°C. 3/4 kolby inokulum Rhizoctonia solani w 6 litrach gliniastego piasku Mendip Minster = Normalne rozcieńczenie.

Do skriningowania użyto stężenia o N/4 i N/16.

Próbę prowadzono w 7,62 cm doniczkach. Doniczki napełniano do 3/4 zakażoną ziemią. Do każdej doniczki sadzono po 5 ziaren grochu i pokrywano czystą glebą. W celu namoczenia do każdej doniczki dodawano 35 ml wody lub zawiesiny bakteryjnej. W każdej obróbce stosowano doniczki w pięciu powtórzeniach. W skrinach BTC bakterie wzrastały w czasie 48 h w 20°C w 1/10 TSB. Do doniczek dodawano całość zawiesiny (35 ml). Kontrolę stanowiły zwykle 1/10 TSB i chemiczne. Do namoczenia dodawano Pencycuron w stężeniach 10, 100 i 200 ppm w przypadku skrinów Rhizoctonia i metalaksyl w stężeniu 100 ppm w przypadku skrinów Pythium.

Rośliny wzrastały w teście dla R. solani w czasie 7-10 dni w temperaturze 20-25°C, a dla Pythium w temperaturze 12-15°C w czasie 14 dni. Wschodzenie siewek kontrolowano co tydzień. Rośliny codziennie nawadniano. Szczególną uwagę poświęcono zapewnieniu tego, by gleba utrzymywała wilgotność podczas testów, która w obydwu chorobach inicjowała gnicie skutkiem nadmiaru wilgoci (zgorzel).

Badania skriningowe wobec Phytophthora megasperma.

Próbkę o średnicy 5 mm pobraną z hodowli płytkowej P. megasperma hodowano na płycie o średnicy 9 cm na podłożu V-8 w ciągu 13 dni w 25°C. Podłoże V-8 ma następujący skład:

Sok V-8 Campbell CaCO3

Woda destylowana Agar Difco

180 ml

2,7 g

720 ml 13,5 g (składniki poza agarem, zmieszano i ogrzewano przez 30 minut, przesączono, pH doprowadzono do 7,2, dodano agar i poddano podłoże sterylizacji w 120°C w ciągu 20 minut).

Nawilżone nasiona prosa (50 g + 20 ml wody destylowanej) sterylizowano dwukrotnie w 110°C przez 45 minut. 1/4 hodowli płytkowej P. megasperma umieszczono na powierzchni prosa i inkubowano w ciemności w ciągu 28 dni w 25°C.

22,5 g prosa aokażonego P. megasjrerma dokładnie wimiesrano w mieszainiku z 1477,5 g jałowej ziemi i 112,5 g wody. Ziemia stanowiła minskuninę 1:1:1 obj./obj. piasku („silver sand“), ziemi z pola o pH 7 i torfu, którą sterylizowano w 100°C w ciągu 1 godziny.

Do słoi Leonarda odważono 500 g mieszanki zakażonego prosa i ziemi, następnie przykryto je plastikowymi pokrywkami, aż dolny zbiornik wody słoi Leonarda wypełnił się 100 ml wody destylowanej. W mieszance proso/ziemia zrobiono 4 dołki, do każdego wysiano soję i przysypano otaczającą mieszanką.

166 131

Kultury badanego organizmu przygotowano prowadząc hodowlę na płytkach z podłożem agarowym w 28°C przez 24 godziny i w 250 ml kolbach NB (150 ml/NB) przez 24 godziny w 28°C. 75 ml próbkę hodowli wirowano przy 8000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut w 20°C. Odrzucano supernatant, dodano jeszcze 75 ml próbki, ponownie odwirowano i znów odrzucono supernatant. Placek pozostały w probówkach wirówki kilkakrotnie przemyto 5 ml roztworu solanki (9,2 g/l). W końcu placek zdyspergowano tworząc zawiesinę w 150 ml solanki.

Do każdego ze słoi Leonarda wstrzyknięto 30 ml zawiesiny solankowej za pomocą 60 ml strzykawki.

Dla porównania ze środkami chemicznymi do kontrolnych słoi Leonarda wstrzyknięto 30 ml próbki roztworu 285,5 g 35% metalaksylu (nazwa handlowa APRON) w 500 ml wody destylowanej.

Przeprowadzono także próby kontrolne stosując próbki niezakażonej mieszaniny prosa i ziemi.

Następnie wywołano wzrost nasion w komorze wzrostowej w 20±2°C przy oświetleniu 1517000 lux. Ocenę oparto na stopniu rozwoju w procentach w porównaniu z próbą kontrolną, w której stosowano środki chemiczne.

Badania skriningowe pod względem aktywności wobec Fusarium culmorum.

Hodowlę Fusarium culmorum w PDA prowadzono przez 10 dni w 20°C aż do wytorzenia się konidiów. Konidia zebrano i doprowadzono do stężeń w zakresie od 10⁴ do 108 konidiów na ml. Do 100 g nasion pszenicy w butelce dodano 5 ml z tej kolonii, po czym wirowano przez noc w 10°C.

Próbkę zakażonych nasion przed wysianiem moczono w mieszaninie badanych bakterii i piasku przez 60 minut, aby uzyskać otoczkę około 10® komórek na ziarno. Drugą próbkę potraktowano 100 ppm benomylu jako kontrolnego środka chemicznego.

100 nasion wysiano do kompostu opartego na torfie na głębokość 2 cm, na tacy do sadzonek. Na początku próby kompost nawodniono, utrzymując w 20°C przez 2 tygodnie i ponownie nawodniono 5 dnia po wysianiu. Po tym początkowym nawodnieniu w celu wywołania kiełkowania nasion, kompost pozostawiono do wyschnięcia, aby wywołać rozwój zakażenia.

Sadzonki oceniano pod względem rozwoju i stopnia rozwoju zakażenia. Objawy zakażenia określano według skali od zera (brak objawów) do 4 (poważne zakażenie).

Wyniki.

Za pomocą opisanych powyżej testów poddano skriningowi około 7000 izolatów bakterii glebowych. Poniżej w tabeli 1 zestawiono wyniki tych testów. W kolumnach podano cyfry według skali od zera (brak działania przeciwgrzybowego) do 3 (brak widocznych objawów zakażenia). W tabeli zamieszczono także przykład porównawczy z typowym, nieskutecznym szczepem bakteryjnym, oznaczonym jako 53/87.

Tabela 1

Skrining wstępny NCIB	40186	40187	40188	40190	53/87
Fusarium culmorum	1	2	0	2	1
Fusarium moniliforme	1	1	0	1	1
Fusarium sambusinum	0	1	0	0	1
Pythium ultimum	2	3	2	2	0
Aphanomyces	3	1	0	2	0
Phoma betae	2	0	3	1	0
Burak cukrowy/ziemia	3	2	2	3	0
Skrining wtórny NCIB	40186	40187	40188	40190	53/87
Rhizoctonia solani	0	3	3	0	0
Pythium ultimum 15°C	3	3	3	0	0
Pythium ultimum 24°C	3	2	2	2	0
Fusarium culmorum	2	2	2	2	0
P. megasperma Próby polowe w 1989 r.	2	1	1	1	0

Do prób polowych jako biologiczne środki do zwalczania „gnicia na skutek nadmiernej wilgoci grochu i buraków cukrowych wybrano najbardziej obiecujące szczepy we wstępnych i wtórnych badaniach skriningowych.

166 131

Na figurze 1 przedstawiono wyniki otrzymane dla szczepu NCIB 40186 przy zwalczaniu „gnicia grochu w próbie przeprowadzonej w W.Brytanii. Uzyskano stopień zwalczania wynoszący 80% zwalczenia za pomocą obróbki chemicznej metalaksylenu APRON. W próbie tej szczep NCIB 40187 był w znacznej części nieskuteczny.

Na figurze 2 i 3 przedstawiono wyniki prób polowych na buraku cukrowym z użyciem szczepów NCIB 40186 i 40190, przeprowadzone w Belgii. Wybrano sześć miejsc na polu. W trzech miejscach (1, 3 i 6) wysiano buraki cukrowe w marcu, a w pozostałych trzech w maju. Na fig. 2 przedstawiono wyniki pierwszej oceny, którą przeprowadzono w 3 tygodniu po wysianiu, a na fig. 3 wyniki uzyskane po 6-8 tygodniach po wysianiu.

Reasumując, z uzyskanych wyników widać, że „gnicie na skutek nadmiaru wilgoci grochu wywołane przez Pythium ultimum zmniejsza się przy zastosowaniu szczepu NCIB 40186 na poziomie porównywalnym z uzyskanym w wyniku działania chemicznego metalaksylenu. Wyniki uzyskane dla buraka cukrowego wskazują na lepszy rozwój sadzonej we wszystkich sześciu miejscach przy użyciu szczepów NCIB 40186 i 40190 w porównaniu z próbami kontrolnymi nietraktowanymi. W trzech miejscach rozwój sadzonek w obecności szczepów był porównywalny do uzyskanego z użyciem metalaksylu.

Próby polowe w 1990 r.

W 1990 r. przeprowadzono próby polowe z mikroorganizmami NCIB 40186 i 40190 na zdolność hamowania przez nie Pythium spp. Próby przeprowadzono w USA, Belgii i Francji, a wyniki przedstawiono poniżej. W próbach w Europie stosowano mikroorganizmy na namoczonych nasionach, które następnie suszono w piasku, a w próbach w USA jako formulacje żywica/-torf. Prowadzono też próby w innych częściah swata, gdzie „gnicie na skutek nadmiaru wilgoci ma charakter endemiczny, np. w uprawach warzyw w Malazji. Chociaż nie jesteśmy w stanie przedstawić wyników prób przeprowadzonych na świecie, ponieważ nie są jeszcze zakończone, a nie mogą być przyśpieszone ze względu na sezonowe ograniczenia, to uzyskane początkowe wyniki są korzystne i przynajmniej te konkretne mikroorganizmy wykazują duży potencjał jako handlowe biologiczne środki kontroli. Dalsze badania innych wymienionych mikroorganizmów są prowadzone w laboratorium i w komorze wzrostu zgodnie z normalną praktyką badań na skuteczność i bezpieczeństwo dla człowieka i środowiska. Wyniki przekazywane na bieżąco potwierdzają właściwości znalezione wcześniej, o których w niniejszym opisie wspomniano.

Szczepy NCIB 40186 i 40190 badano na aktywność wobec „gnicia buraka cukrowego w próbach na dziewięciu poletkach w Belgii i we Francji. Podczas wysiewania wczesną wiosną było ciepło i sucho, co spodowowało pewne problemy w rozwoju „gnicia na skutek nadmiaru wilgoci buraka cukrowego.

Na każdym z badanych poletek wysiano 200 nasion. Do tej pory uzyskano wyniki z 9 prób.

Tabela 2

Próby w Belgii i Francji w 1990 r. Badana uprawa: burak cukrowy. Zwalczanie chemiczne: tachigaren/TMTD.

Nr próby	Liczba nasion, które wykiełkowały z 200
Próba kontrolna nietraktowana	Działanie chemiczne	NCIB 40186	NCIB 40190
1	93	125	130“	114
2	118	141“	124	127
3	118	157*	146*	138“
4	107	139“	131*	12₂“
5	120	150^x	128	130
6	84	116“	111“	114“
7	135	153“	143	138
8	119	148*	141	135
9	134	155*	144	144

“ = LSD przy 5% prawdopodobieństwie.

166 131

U

Próby we Francji, 1990 r.

Badana uprawa: groch.

Zwalczanie chemiczne: jak przedstawiono poniżej.

Liczba roślin dotyczy średniej liczby roślin, które wykiełkowały na pasku o długości 5 m po 22 dniach po obróbce.

W kolumnie 2 w tabelach podano liczbę roślin, które wykiełkowały z 200 nasion po 22 dniach po wysianiu. Litery po liczbach mają znaczenie statystyczne. Nie ma żadnej znacznej różnicy przy 5% poziomie prawodopodobieństwa pomiędzy pozycjami ze wspólnymi literami.

Tabela 3

Działania kontrolne.

Testy przeprowadzono w glebie z pola, bez dodatku patogentów.

Działanie	Liczba wykielkowanych roślin
Nasiona nietraktowane	172,58 AC
NCIB 40186-107 komórek na ziarno	184,75 A
APRON - 30 g subst. czyn./100kg nasion	171,50 AC
RIDOMIL 2E metalaksyl moczenie bruzdowe	181,00 A
Czyste nasiona 100 komórek/ziarno	176,00 AC
Działania testowe. Dadano patogen (Pythium) w ilości 200 g/m rzędu.
	Liczba
Działanie	wykiełkowanych roślin
Nasiona nietraktowane	111.25I
NCIB 40186-107 komórek na ziarno	144,75 DG
APRON - 30g subst. czyn./1(0)kg nasion	157,25 BCDF
RIDOMIL 2E metalaksyl moczenie bruzdowe	164,25 AD
Czyste nasiona 100 komórek/ziarno	119,88 NI

Tabela 4

Próby w Kalifornii (USA), 1990.

Badana uprawa: groch.

Badany patogen: Pythium 30 g/m rzędu.

Działanie	% wykiełkowanych
Nie dodano patogenu, nie traktowano	93,13 AB
Patogen + NCIB 40186-107 komórek/ziarno	75,31 BCD
Patogen + czyste nasiona-100 komórek/ziarno	51,56 EF
Patogen + APROM-30g subst. czyn./100 kg	92,81 AB
Próby w Mississipi (USA), 1990.
Badana uprawa: kukurydza.
Badany patogen: Fusarium (i) 10g/m rzędu, (ii) 30 g/m rzędu.
Kiełkowanie określano w % po 15 dniach po wysianiu.
Działanie	% wykiełkowanych
Nie dodano patogenu, nie traktowano	65,833 C
Nie dodano patogenu,
NCIB 40186-107 komórek/ziarno	67,917 C
Nie dodano patogenu,
KAPTAN jako zaprawa nasienna	69,853 BC
Patogen (i), bez obróbki	51,250 D
Patogen (i) + NCIB 40186-107 komórek/ziarno	80,000 AB
Patogen (ii), bez obróbki	69,375 BC
Patogen (ii) + NCIB ^0186-107 komórek/ziarno	82,708 A
Patogen (ii) + KAPTAN jako zaprawa nasienna	63,958 C

FIG.1

Próby z pythium ilość siewek w rzędzie

BapronH «»86 a «»87 □ kontrola

FIG.2 Próby połowę

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób skriningowania potencjalnych środków przeciwgrzybiczych, w którym bada się efekty hamujące potencjalnych środków przeciwgrzybiczych za pomocą dwóch testów, znamienny (tym, że w pierwszym teście wytwarza się grzybnię patogenu Pythium spp w warstwie środowiska hodowlanego, w warstwie hodowlanej umieszcza się warstwę wyjałowionej gleby, dodaje się do warstwy gleby podwielokrotność potencjalnego środka przeciwgrzybiczego, inkubuje się badaną jednostkę i określa efekt hamujący środka przeciwgrzybiczego na wzrost patogenu, w drugim teście szczepi się próbkę gleby kompleksem grzybowym powodującym gnicie skutkiem nadmiernej wilgoci, do gleby zakażonej grzybem wysiewa się nasiona rośliny podatnej na zakażenie grzybowe, na glebę stosuje się podwielokrotność potencjalnego środka przeciwgrzybiczego, pozwalając nasionom na wykiełkowanie i wyrośnięcie z nich rośliny, po czym określa się efekt hamujący środka przeciwgrzybiczego na roślinach w porównaniu z niezakażonymi roślinami kontrolnymi.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako roślinę podatną na zakażenie, wynikające z kompleksu powodującego gnicie skutkiem nadmiernej wilgoci, stosuje się burak cukrowy.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako potencjalny środek przeciwgrzybiczy stosuje się drobnoustrój.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako drobnoustrój stosuje się drobnoustrój zasiedlający korzenie.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się wymieniony drobnoustrój zasiedlający korzenie, wyizolowany z próbki gleby sposobem obejmującym umieszczenie w pojemniku, dającym się uszczelnić, warstwy wilgotnego, wyjałowionego piasku, umieszczenie na niej wilgotnej próbki gleby i wysianie w próbce gleby nasienia rośliny, podatnej na dane zakażenie, szczelne zamknięcie pojemnika, umieszczenie pojemnika w warunkach środowiskowych prowadzących do rozwoju zakażenia, umożliwienie wykiełkowania nasienia i przejścia jego korzeni z warstwy gleby do warstwy piasku, przecięcie rurki wzdłuż przez obie warstwy, wyjęcie korzeni tylko z warstwy piasku i wyizolowanie drobnoustrojów z wyjętych korzeni.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że środek wykazujący hamowanie zakażenia w obu wymienionych testach poddaje się dalszemu skriningowaniu pod względem hamowania zakażenia grzybiczego w jednym lub więcej niż jednym dodatkowym teście wybranym z grupy obejmującej:

(a) zakażenie buraka cukrowego przez Aphanomyces cochlioides w temperaturze 12-15°C; (b) zakażenie grochu przez Pythium ultimum w temperaturze 12-15°C; (c) zakażenie grochu przez Pythium ultimum w temperaturze 24-27°C; (d) zakażenie grochu przez Rhizoctonia solani w temperaturze 24-27 °C; (e) zakażenie pszenicy przez Fusarium culmorum w temperaturze 18-21°C; (f) zakażenie soi przez Phytophthora magasperma w temperaturze 20-24°C; (g) zakażenie plasterka ziemniaka przez Fusarium moniliforme w temperaturze 20-24°C; (h) zakażenie plasterka ziemnika przez Fusarium sambusinum w temperaturze 20-24 °C; oraz (i) zakażenie buraka cukrowego przez Phoma spp w temperaturze 15-19°C.