CZ52498A3 - Použití sloučenin aminoadamantanu jako imunoregulátorů - Google Patents

Description

Použití sloučenin aminoadamantanu jako imunoregulátorů

Oblast techniky

Vynález se týká použití sloučenin aminoadamantanu jako imunoreguiátorů, zejména pro regulaci a modulaci již aktivovaných neutrofi 1ních leukocytů.

D o s a v a d ni stav t e c h η i k y

Neutrofilní leukocyty, podtřída leukocytů, jsou obsaženy v imunitních obranných a jiných reakcích v systému krevních cév v hraničních tkáních (Roitt, I.M.: Příručka imunologie, Steinkopf-Verlag Darmstadt, druhé vydání, 1984).

Neutrofily mohou být aktivovány látkami zevního původu (exogenními látkami), jako jsou např. složky buněčné stěny (obchodně získatelný produkt je Zymosan). Ve spojení s tímto jsou reaktivní kyslíkaté druhy tvořeny v tzv. dýchacích (respiračních) prasklinách.

Obr. 1 popisuje zjednodušené schéma stimulace neutrofi 1ního leukocytu: po navázání příslušného ligandu (např. Zymosanu A) na specifické čidlo na neutrofilní membráně je aktivován guanosintrifosfát (GTP), který dále aktivuje fosfatidyl-inositol-4,bbifosfát (PIPž) specifickou fosfolipázu C (PLC). PLC katalyzuje hydrolýzu PIP2 na nosítol-1,4,5-trifosfát (IP3) a diacy1glycero1 (DG). IP3 stimuluje uvolňování iontů Ca^{2 +} z nitrobuněčných (intracelulárních ) zásob. Ionty Ca²⁺ spolu s DG aktivují enzymatický protein kinázu C (PC), jenž fosforyluje Četné bílkoviny a tímto způsobem aktivuje ni j . komplex oxidázy NADPH. Oxidáza NADPH katalyzuje dále reakci:

O2 + NADPH ----> 2 02' + NADP⁺ + H⁺ z níž vyplývá reaktivní druh kyslíkatého kationtu O2 .

Ačkoliv aktivované neutrofilní leukocyty (neutrofily) jsou důležité pro fungování imunitní obrany, mohou mít za následek subjektivní příznaky chorob jako jsou např. akutní nebo chronické záněty nebo jiné alergické reakce vyvolané nadměrnými reakcemi způsobenými zejména reaktivními kyslíkatými částicemi.

Na druhé straně může být

• * • φφφφ φ · ·· v « ΦΦ ΦΦΦΦ φ * · φ φφφ • Φ «φφ φφ ·· neutrofilní aktivita příliš nízká či nedostatečná pro úspěšnou imunitní obranu s obecnou imunitní nedostatečností jako např. u AIDS. Existuje tudíž potřeba, zejména z lékařského hlediska, možnosti ovlivňování regulační a/nebo zklidňující činnosti neutrofi 1nich leukocytů in vivo (v živém organizmu) a in vitro (ve zkumavce). V této souvislosti by měla být neutrofilní aktivita buď zvětšována nebo zmenšována v závislosti na dané indikaci, tj. měla by být regulovatelná podle libosti.

Proto je cílem tohoto vynálezu zpřístupnit prostředek nebo činidlo k regulaci a/nebo zklidňování činnosti neutrofilu.

Podstata vyná1ezu

Bylo nyní neočekávaně zjištěno, že mají regulační a/nebo zklidňující leukocytů. Tento vynález se týká jisté sloučeniny aminoadamantanu účinek na činnost neutrofiIních tohoto zjištění. Pro toto je rozhodující, že neutrofilní leukocyty již byly aktivovány jinými stimulujícími prostředky. Aminoadamantany samy o sobě neprokazují žádný aktivující účinek na neutrofily.

Výše uvedený cíl je podle toho řešen použitím sloučenin aminoadamantanu o vzorci (I)

(I) kde Ri , R2, R3 a R4 jsou zvoleny na sobě navzájem nezávisle z následujících prvků či skupin: -NRsRe, -NR5ReR7⁺, vodík, aryly nebo heteroaryly až se sedmičlennými kruhy, C1-C20-alky 1y, C1-Cjo ajkenyiy a C1-C2o-alkjnyly, kde alkylové, alkenylové a alkinylové zbytky (funkční skupiny) mohou být rozvětveny, nerozvětveny nebo cyklizovány a volitelně substituovány halogeny, aryly nebo heteroaryly až se • « · · · * ·* • φ « φ · · ·· ΦΦ » φ . φ · · · ··· ·· ·· φ·· · ·* ··· ··· ·♦ ··· ·· ·· sedmičlennými cykly pod podmínkou, že alespoň jeden ze zbytků či funkčních skupin Ri , R2, R3 a R4 bude zastoupen -NR5R6 nebo -NR5R6R7;

a

R5, Re a R7 jsou nezávisle na sobě zvoleny ze zbytků či funkčních skupin: vodík, aryl nebo heteroaryl s až sedmičlennými cykly, C1-C20alkyl , C1-C2o-alkenyl, C1-C2o-a 1kiny1, kde alkyl-, alkenyl- Či alki ny1 skupí ny mohou být rozvětvené, nerozvětvené, cyklické a volitelně substituované halogeny, aryly nebo heteroaryly s až 7 členy cyklu, nebo R5 nebo Re, jež spolu s atomem dusíku tvoři heterocyk1 ickou skupinu až se sedmi členy cyklu;

pro regulaci činnosti již aktivovaných neutrofilú.

Sloučeniny ani i noadamantanu tohoto typu jsou známy. Tak

1-aminoadamantany jsou popsány v patentech DE 22 19 256, DE 28 56 393, DE 22 32 735, US 3 450 761 nebo US 4 122 193. Výroba sloučenin o vzorci (I) se děje obecně známými způsoby, jako je např. alkylace halogenovaných adamantanů. Následná další halogenace a alkylace vytvářejí jednotlivé di - a /nebo trisubstituované adamantany. Na EP 392 059, jehož podstata je sem výslovně zahrnuta příslušným odkazem, se podívejte ohledně výroby aia i noadaman tanů .

Sloučeniny aminoadamantanu byly již používány pro farmaceutické účely. Tak patent EP 392 059 odkrývá použití sloučenin 1-aminoadamantanu pro léčení A1zheimerovy choroby nebo poškození mozkových buněk jako důsledek mozkové ischémie (místní nedokrevnosti mozkové tkáně). Patent US 3 450 761 popisuje aminoadamantany s proti virovou aktivitou.

Zda je aktivita neurofilů (neurofi lnich leukocytů) zvětšena nebo částečně nebo zcela potlačena, závisí na koncentraci použité sloučeniny aminoadamantanu. Tak koncentrace od 10~^e do 10⁵ M má účinek zvětšující příslušnou aktivitu. Koncentrace zhruba 5.1Ο“⁶ M se ukázala zvlášť účinná pro zvětšování neurofilní aktivity - což je koncentrace, jež může být snadno dosažena in vivo v krevní plazmě. Naopak potlačení aktivity je důsledkem zvětšení koncentrace aminoadamantanu. Koncentrace vhodná pro tento účel je 10⁴ až 10’³ M.

Vynález zahrnuje sloučeniny adamantanů substituované jednou nebo několika aminoskupinámi, přičemž jsou upřednostňovány

I • · • « « · . ·'· ······· • * ·» · ··· • · · ··* ·· ··· ·· ·· sloučeniny o vzorci (I) jsou ty, kde je např. l-amino3ety1-5,7-dimety1nichž Ri představuje aminoskupinu a jako např. l-amino-3-cyklohexylřnonoaminoadamantany. Tudíž vhodné Ri představuje aminoskupinu, jako adamantan; a rovněž sloučeniny, v

Ra a Rí představují vodíkový atom, adamantan nebo 1-am i no-.3- ety ladamantan .

Příklady provedení vynálezu

Upřednostňované sloučeniny adamantanu jsou l-amino-3,5-di metyladamantan, 1-ami no-3,5-dietyladamantan a N-substituované sloučeniny 1-N-metylam ino-3,5-di metyladamantan a sloučenina 1-N-etylam ino-3,5-di metyladamantan. Zvlášť výhodný je 1-amino-3,5-di metyladamantan, k němuž je odkazováno jako k memantinu (INN, Akatinol Memantine^R). Gorte1meyer, R. et al. popisují léčbu Demensova syndromu v knize Spektrum neurorehabi1 i táce, W: Zuckschwerdt Publishers, Mnichov, 1993, str. 50 a dále.

Jak bylo vysvětleno výše, sloučeniny adamantanu podle tohoto vynálezu mají pouze regulační účinek na neutrofily, jež jsou předem aktivovány nebo byly stimulovány zvláštními aktivátory.

Přírodní látky, jako jsou Zymosan, N-formy1-Met-Leu-Phe (N-FLMP) nebo A 23187 (Ca protilátka), jsou známy jako aktivátory. Tyto látky mohou být používány, jestliže se zamýšlí specificky a intenzivněji aktivovat neutrofily in vitro, ale rovněž in vivo. Takto je možné zjistit neutrofily ve vzorku, např. ve vzorku tělesné tekutiny, zejména ve vzorku krve, i když je přítomno jen málo neutrofilú nebo když je jejich činnost velmi slabá. V této souvislosti muže být aktivátor přítomen ve spojení se sloučeninou aminoadamantanu: stupeň aktivace neutrofilú stimulovaných daným aktivátorem je zesílen současným přidáním sloučeniny aminoadamantanu.

Další oblastí použití je zlepšování imunitní obrany u osob s různými formami imunitních nedostatečností, zejména u pacientů s AIDS. V tomto případě může být podáván farmaceutický lék, jenž obsahuje sloučeninu adamantanu podle tohoto vynálezu, alternativně ve spojení s aktivátorem neutrofilú. Kromě toho je možné použití u CGD (agranulomatózy), Wegenerovy granulomatózy a/nebo glykogenóz.

Jako samozřejmá věc mohou být neutrofily aktivovány rovněž jako důsledek přirozené imunitní reakce organizmu, jako reakce na různé imunogeny a aktivační alergické reakce, záněty a revmatické příznaky způsobené nadměrnou reakcí. Zde může být neutrofilní aktivita oslabena vhodně zvýšenými koncentracemi aminoadamantanu a pacientovi se může dostat úlevy. Proti podmínkám vnitřních a vnějších zánětů např. v koleni, kyčli nebo čelisti a rovněž proti autoimunitním chorobám lze zvlášť účinně bojovat lékem obsahujícím aminoadamantan. Další oblast aplikace spočívá v léčbě cizopasných (parazitických) chorob jako je lei shmanióza.

V této souvislosti záleží na úvaze lékaře, jak zajistit vhodnou koncentraci sloučenin aminoadamantanu pro regulaci a ztlumení neutrofilní aktivity volbou vhodného dávkování a formy podávání. Podle dané oblasti aplikace jsou zde možné parenterální (mimostřevní) formy, např. nitrožilní nebo ústní formy aplikace; vhodné jsou rovněž formy se stálým působením. Vynález obsahuje též kombinace sloučenin aminoadamantanu podle tohoto vynálezu a také farmaceuticky přijatelné soli, zejména kyselé adiční soli; zde lze uvést např. hydrochloridy, hydrobroroidy, sírany, octany, jantarany, vínany nebo adiční sloučeniny s kyselinou fumarovou, maleinovou, citrónovou nebo fosforečnou. Farmaceutické směsi mohou rovněž navíc obsahovat neutrofilní aktivátor v závislosti na rozsahu indikací. Pro výrobu léčivého přípravku jsou používány obvyklé farmaceuticky přijatelné nosiče a pomocné látky (ad juvanty) .

Následující příklad dokládá závislost aktivitu zvětšujícího nebo tlumicího účinku derivátů aminoadamantanu pomocí speciální sloučeniny - meman t i nu.

Při k i ad

Princip měřen í:

Stanovení aktivity stimulovaných neurofilů při různých koncentracích memant i nu bylo provedeno měřením chemiluminiscence.

Akt. i vovamé neurof i ly tvoří reaktivní kyslíkaté částice v respirační prasklině, jež jsou zjistitelné jako velmi slabá chemiluminiscence nízkoúrovňová nebo ultraslabá chemiluminiscence. Ke zvětšení výtěžku

fotonů je přidáván luminol jako senzibi1 izátor (na indikátoru závislá chemiluminiscence). Luminol je cyklický hydrazid, jenž může být působením reaktivních kyslíkatých částic oxidován na diazochinon. Nukleof ilníni atakem aniontu peroxidu vodíku je tento diazochinon konvertován dále na hydroxyhydroperoxid, který se rozpadá za uvolňování světelného záření na aminoftaiát.

Neutrof i ly:

PBS-pufr pH (7,4) ;

Lumi nol:

Memant in:

Stimulační prostředek:

Zymosan nebo PMA nebo A 23187 nebo N-FLMP

10® i.A.

až 250 ml mM různé koncentrace

2,5 mg/ml

I mM mM mM

PBS = fyziologický roztok tlumený fosfátem

Analogické reakční směsi mohou být vytvářeny s dalšími sloučeninami adamantanu.

Měření:

Měření bylo prováděno s velmi citlivými, nízký šum registrujícími fotonásobiči, jež konvertují fotony na fotokatodě na primární elektrony a pak je vícenásobně zesilují na signál elektrického impulsu.

Reakce je zahájena stimulačním prostředkem a je měřena bez inkubační doby po dobu 40 minut. (= 80 cyklů).

Výsledky:

U neutrofilů, jež byly aktivovány přirozenými stimulačními prostředky (Zymosan A; A23187; N-formy1-Met-Leu-Phe), může být základní rychlost

RLU ( = relativní světelné jednotky) pomocí 10~ ⁶ M roemantinu dodatečně • φ · · · * · zvětšena (Zymosan A zhruba o 90%; A 23187 asi o 60%; N-FMLP o cca 78% ze základní stimulace) [obr. 2-4]. To svědčí o zvětšené respirační puklině a zvětšené fagocytární aktivitě. Tato reakce neprobíhá při stimulaci s toxickým forbo 1-mystrát-acetátem (asi - 20% základní stimulace) [obr. 5], Naopak memantin téměř zcela utlumí základní stimulaci všech stimulačních prostředků při koncentraci 10^-3.

V kontrolním experimentu může být ukázáno, že memantin sám o sobě nevykazuje žádnou chemiluminiscenci ani ji nezhasí (není ukázáno).

Specifičnost regulace aktivace

Regulační účinek sloučenin aminoadamantanu podle tohoto vynálezu je vysoce specifický pro neutrofily. Tak sloučeniny aminoadamantanu nevykazují žádný vliv na deregulační účinek aktivovaných leukocytů. Z obr. 6 vyplývá, že ACC (1-aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina) ani v relativně vysokých koncentracích sama s memantinem nereaguje. ACC je specifickým indikátorem pro mye1operoxidázu, jež se uvolňuje degranulací leukocytů a tvoří škodlivý chlornan v mimobuněčných prostorech. Myeioperoxidáza reaguje specificky s ACC za vzniku etyl.énu, který může být zjištěn plynovým chromatograf em. Proto vzniklé množství etylénu představuje nepřímou měrnou veličinu pro aktivitu leukocytů.

Naproti tomu indikátor pro respirační puklinu a z toho vznikající kyslíkaté radikály (superoxid, OH-radikály a peroxid vodíku) jsou memantinem aktivovány. To je vidět již při koncentraci pouhých 10^-7 M, jež může snadno získána in vivo. Aktivační účinek může být zviditelněn přidáním iontů Fe³⁺. jež posouvají reakční rovnováhu Haber-Weifiovy reakce od superoxidu a peroxidu vodíku směrem k OH-radikálům. Citlivým indikátorem pro kyslíkaté částice či složky tohoto typu je KMB (a-keto-r-tíobutyrát), jenž se rozpadá mj. na etylén za oxidačních podmínek a jenž může být snadno zjištěn (obr. 7).

Jako kontrola ukazuje obr. 8, že KMB-reakce, ale ne ACC-reakce, je stimulována nejprve přidáním iontů Fe³⁺ při koncentraci > 5 x 10~⁴ M.

Samotné ionty Fe³⁺ nemají žádný vliv.

• · • · » · • · · • · · ♦ * · « · • · • v • · · *

kde Ri,

R3 a R4

Claims (14)

1. Patentově nároky

   1. Použití sloučeniny aminoadamantanu vzorce (I), jsou zvoleny nezávisle na sobě navzájem z -NRsRe , -NRs Re R? ⁺ , vodíku, arylu nebo heteroarylu s až 7

   C1-C2oalkenylu a C1-C2o-alkinylu, články kruhu, kde alkyl-, nerozvětvené

   Ci -C2 o-a 1kylu, alkenylnebo cyklické alkinylskupiny mohou být rozvětvené volitelně substituované halogenem, arylem nebo heteroarylem s až ci články kruhu s podmínkou, že alespoň jeden ze zbytků R1 , R2 , R3 a R« je reprezentován -NR5R6 nebo -NRsR6R7 ⁺ ; a

   R5, Re a R7 jsou zvoleny nezávisle na sobě navzájem z vodíku, arylu nebo heteroarylu až s 7 články kruhu, C1-C2o-alkylu, C1-C2o-alkenylu, C1-C20-alkinylu, kde alkylové, alkenylové a alkinylové zbytky mohou být rozvětvené, nerozvětvené nebo cyklické a volitelně substituované halogenem, arylem nebo heteroarylem s až 7 články kruhu, nebo Rs a Re, spolu s atomem dusíku, tvoří heterocyklickou skupinu s až 7 články kruhu;

   pro přípravu léku užitečného pro regulaci činností již aktivovaných neutrof ilů.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde sloučenina aminoadamantanu o vzorci (I) je zvolena z l-amino-3-etyl~5,7-dimetyl-adaroantanu, l-amino-3-cyklohexy1-adamantanu, l-amino-3-etyl-adamantanu, l-amino-3,5-dimetyl-adamantanu,

   1-ami no-3,5-dietyladamantanu,

   1-N-metylamino-3,5-dimetyl-adamantanu, l-N-etylamino~3,5-dimetyl-adamantanu.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde lék zvětšuje aktivitu neutrofilů zvýšením koncentrace sloučeniny aminoadamantanu o vzorci (I) z 10’⁶ na ΙΟ'⁵ M.
4. 4. Použití podle nároku 3, kde lék je užitečný pro léčbu CGD (agranulomatózy), Wegenerovy granulomatózy a/nebo chorob imunitní nedostatečnosti, zejména AIDS.
5. 5. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde lék zmenšuje aktivitu neutrofilů zvýšením koncentrace sloučeniny aminoadamantanu o vzorci (I) z 10’⁴ na
6. 6. Použití podle nároku 5, kde lék je užitečný pro léčbu chronických nebo akutních zánětů, alergických reakcí, autoimunitnich chorob a parazitických chorob, zejména leishmaniózy.

   10-- Μ.
7. 7. Použití sloučeniny aminoadamantanu, jak je definována v nároku 1 nebo 2, spolu s aktivátorem pro přípravu léku užitečného pro zesílenou, specifickou aktivaci neutrofilú.
8. 8. Použití podle nároku 7, kde aktivátor je vybírán ze Zymosanu, N-formy1-Met-Leu-Phe a A 23187.
9. 9. Použití sloučeniny aminoadamantanu, jak je definována v nároku 1 nebo 2, pro regulaci již aktivovaných neutrofilú ve zkumavce (in vitro).
10. 10. Použití podle nároku 9, kde aktivita neutrofilú je zvýšena nárůstem koncentrace sloučeniny aminoadamantanu o vzorci (T) z 10^-6 na 10*⁵ M.
11. 11. Použití podle nároku 9, kde. aktivita neutrofilú je snížena zvýšením koncentrace sloučeniny aminoadamantanu o vzorci (I) z 10^-4 na ΙΟ’² M.
12. 12. Použití sloučeniny aminoadamantanu, jak je definována v nároku 1 nebo 2, spolu s aktivátorem pro zesílenou, specifickou aktivaci neutrofilú ve zkumavce (in vitro).
13. 13. Použiti podle nároku 12 v detekčním postupu pro zjišťování neutrofilú ve vzorku.
14. 14. Použití podle nároku 12 nebo 13, kde aktivátor je vybírán ze Zymosanu, N-formyl-Met-Leu-Phe a A 23187.