CZ60498A3 - Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra - Google Patents

Description

Neaktivované oocyty jako cytoplastové recipienty pro přenos jádra

Oblast techniky

Tento vynález se týká vytváření zvířat, která zahrnují, aniž by tím byly omezeny, geneticky selektovaná a/nebo modifikovaná zvířata a dále se týká buněk, použitelných pro jejich vytváření.

Dosavadní stav techniky

Rekonstrukce savčích embryí přenosem dárcovského jádra do enukleovaného oocytu nebo do jednobuněčné zygoty dovoluje vytváření geneticky identických individuí. To představuje jasnou výhodu jak pro výzkum (to jest jako biologické kontrolní vzorky), tak i pro komerční aplikace (to jest multiplikace geneticky cenného dobytka, uniformita produkce masa, řízení chovu zvířat).

Rekonstrukce embrya přenosem jádra byla nejprve navržena (Spemann, Embryonic Development and Introduction, 210-211, * Hofner Publishing Co., New York (1938)) ve snaze odpovědět otázku ekvivalence jádra neboli mění se jádro během vývoje?. Přenášením jádra ze stále pokračujících embryonických fází měly tyto pokusy určit ve kterém okamžiku se jádro stane omezeným ve svém vývojovém potenciálu. Vzhledem k technickým omezením a nešťastné smrti Spemanna nebyly tyto studie dokončeny dříve než v roce 1952, kdy bylo na žábě demonstrováno, že jistá jádra se mohou přímo • · · · · · • · · · · · • ·

vyvinout do pohlavně zralého dospělého živočicha (Briggs a King, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 38, 455-461 (1952)). Jejich poznatky vedly k současnému konceptu že ekvivalentní totipotentní jádra z jednoho individua mohou, když jsou přenesena do enukleovaného vajíčka, umožnit vznik geneticky identických individuí. Přesně vzato tato individua nebudou klony, neboť neznámý cytoplasmatický příspěvek u nich může být proměnlivý a také by bylo třeba dokázat nepřítomnost jakékoli změny chromosomálního uspořádání.

Od demonstrace embryonálního klonování u obojživelníků byly podobné techniky aplikovány na savčí druhy. Tyto techniky spadají do svou kategorií:

1) Přenos dárcovského jádra do oocytu ve stadiu zralé metafáze II, kterému byla odebrána jeho chromosomální DNA a

2) přenos dárcovského jádra do oplodněné jednobuněčné zygoty, za které byla odebrána obě prvojádra.

U kopytníků se první možnost stala jedinou, neboť v případě druhé nebyl pozorován žádný vývoj jindy než když byla vyměněna prvojádra.

Přenosu dárcovského jádra do oocytové cytoplasmy je obecně dosaženo indukcí buněčné fúze. U kopytníků je fúze indukována aplikací stejnosměrného elektrického impulzu rovinou kontaktu/fúze dvojice. Týž impulz, který indukuje buněčnou fúzi, také aktivuje přijímající oocyt. Následující vývoj rekonstruovaného embrya závisí na velkém množství faktorů, které zahrnují schopnost jádra k přímému vývoji, to jest totipotencí, vývojovou schopnost cytoplasmy příjemce (neboli oocytovou zralost), oocytovou aktivaci, kultivaci embrya (přehled viz Campbell a Wilmut, Vth World Congress on • · · · · ·

Genetics as Applied to Livestock, 20, 180-187 (1994))

Kromě výše uvedeného bylo také autory prokázáno, že zachovávání správné ploidity v průběhu prvního buněčného cyklu rekonstruovaného embrya má zásadní důležitost (Campbell a kol., Biol. Reprod. 49, 933-942 (1993));

Campbell a kol., Biol. Reprod., 50, 1385-1393 (1994)). V průběhu jednoho buněčného cyklu musí být všechna genomická DNA replikována jednou a pouze jednou předtím, než dojde k mitóze. Jestliže se buď některá část DNA nereplikuje a nebo je replikována více než jednou, potom bude ploidita tohoto jádra v okamžiku mitózy nesprávná. Mechanismus, kterým je replikace omezena na jediné provedení v průběhu každého buněčného cyklu je však nejasná, nicméně existuje několik důkazů, naznačujících že pro tento průběh je důležité udržovat neporušenou jadernou membránu. Morfologické události, ke kterým dochází v dárcovském jádru po transferu do enukleovaného oocytu v metafázi II byly studovány u řady druhů, mezi jiným u myši (Czolowiska a kol., J. Cell Sci, 69, 19-34 (1984)), králíka (Collas a Robi, Biol. Reprod.,

45, 455-465 (1991)), prasete (Prather a kol., J. Exp. Zool., 225, 355-358 (1990)), krávy (Kaňka a kol., Mol. Reprod.

Dev., 29, 110-116 (1991)). Okamžitě po fúzi se obal dárcovského jádra rozpadá (NEBD - nuclear envelope break down) a chromosom předčasně kondenzuje (PCC - premature chromosom condensation). Tyto efekty jsou katalyzovány cytoplasmatickou aktivitou, nazývanou maturační/ mitózní/ meiózní promotorovy faktor (MPF). Tato aktivita se nachází ve všech mitotických a meiotických buňkách, které dosáhly své maximální aktivity v průběhu metafáze. Zralé savčí oocyty jsou uzavřeny v průběhu metafáze v druhém meiotickém dělení (metafáze II) a mají vysokou MPF aktivitu. Po oplodnění nebo aktivaci MPF aktivita klesá, druhé meiotické dělení je ukončeno a je vyloučeno druhé polární tělísko, chromatiny dekondenzují a dochází k vytváření prvojádra. V embryích rekonstruovaných přenosem jádra v okamžiku když je úroveň MPF vysoká dochází k NEBD a PCC; po těchto událostech následují, když MPF aktivita opadá, dekondenzace chromatinů a přetváření jádra a následná DNA replikace. Správná ploidita v rekonstruovaných embryích může být udržována jedním ze dvou následujících způsobů; předně přenosem jádra v definované etapě buněčného cyklu, například diploidní jádro buněk v etapě G1 do metafáze II oocytů v okamžiku aktivace a za druhé aktivací přijímajícího oocytu a přenosem dárcovského jádra po odeznění MPF aktivity. U ovce tento druhý přístup vedl k vzrůstu frekvence vývoje do blastocystové etapy z 21 % na 55 % rekonstruovaných embryí, pokud byly používány blastomery z 16 buněčných embryí jako v roli buněčných dárců (Campbell a kol., Biol. Reprod., 50, 1385-1393 (1994)).

Toto zlepšení frekvence vývoje rekonstruovaného embrya se až dosud netýkalo otázky přeprogramování jádra. V průběhu vývoje jsou některé geny otištěny, to jest jsou změněny tak, že již dále nejsou transkribovány. Studie této otázky ukazují, že toto otištění je odstraněno v průběhu vytváření zárodečných buněk (to jest přeprogramování). Jednou z možností je, že toto přeprogramování je ovlivněno vystavením chromatinů cytoplasmatickým faktorům, které jsou přítomny v buňce, podstupující meiózu. To přináší otázku, jak můžeme napodobit tuto situace během rekonstrukce embryí přenosem jádra, aby byly přeprogramovány vývojové hodiny dárcovského jádra.

• · • · • · · ·

• « • · »·· · 9

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že přenos jádra do oocytu, uzavřeného v metafázi II může dát vzniknout životaschopnému embryu, pokud je udržována normální ploidita (to jest diploidita) a jestliže embryo není aktivováno v okamžiku přenosu jádra. Zpoždění aktivace dovoluje jádru zůstat vystaveno cytoplasmě příjemce.

První předmět vynálezu se týká způsobu rekonstituce zvířecího embrya, který spočívá v přenesení diploidního jádra do oocytu, který setrvává v metafázi druhého meiotického dělení, aniž by došlo k související aktivaci oocytu, v uchovávání jádra vystaveného cytoplasmě příjemce po dobu dostatečnou k tomu, aby rekonstituované embryo se stalo schopné dát vzniknout živému tvoru a v následném aktivování rekonstituovaného embrya za současného udržování správné ploidity. V této etapě je rekonstituované embryo jediná buňka.

Vynález je v principu aplikovatelný na všechna zvířata, v to počítaje ptáky, jako je domestikovaná drůbež, dále druhy obojživelníků a ryb. V praxi však je v současné době spatřována oblast největší komerční využitelnosti vynálezu v aplikaci na zvířata, jiná než člověk, speciálně na savce, jiné než člověk, obzvláště placentální savce. Nejpravděpodobnější využití vynálezu se zdá být možné u kopytníků, především u ekonomicky významných kopytníků jako je kráva, ovce, kozy, buvol, velbloudi a prasata a to jak jako prostředek pro klonování zvířat, tak i jako prostředek • · · ·

A · A A • · ·· · · · · · • A · · A A A AAAA A • A AAA AAA

AAAA A AA AAAA AA AA pro vytváření transgenních zvířat. Je nutné uvést, že použití vynálezu je pravděpodobné i v případě dalších ekonomicky významných zvířat, jako jsou například koně, lamy nebo hlodavci, například krysy nebo myši nebo králíci.

Vynález je také možno aplikovat při produkci transgenních stejně tak jako netransgenních zvířat. Transgenní zvířata mohou být produkována z geneticky změněných dárcovckých buněk. Celá procedura má celou řadu výhod ve srovnání s konvenční procedurou transgenních (to jest geneticky modifikovaných) zvířat, které mohou být přehledně sumarizovány následujícím způsobem:

(1) je potřeba menšího počtu příjemců, (2) vícenásobní syngeničtí členové zakládající generace mohou být vytvořeni použitím klonových dárcovských buněk, (3) je umožněna drobná genetická změna genovým cílením, (4) všechna zvířata produkovaná podle tohoto vynálezu by měla přenášet odpovídající genetickou modifikaci zárodečnou linií, neboť každé zvíře je odvozeno z jediného jádra; na rozdíl od toho produkce transgenních zvířat injekcí prvojader nebo chimérismem po inklusi modifikovaného kmene buněčné populace blastocystovou injekcí produkuje část mozaikových zvířat, u nichž ne všechny buňky obsahují modifikaci a nemusí přenášet modifikaci zárodečnou linií; a (5) pro místo genetické modifikace (například integrace) mohou být buňky selektovány před vytvořením celého zvířete.

Je třeba uvést, že výraz transgenní ve vztahu ke zvířeti nesmí být chápán jako omezující ve smyslu popisu zvířat obsahujících v jejich zárodečné linii jeden nebo více genů jiného druhu, ačkoliv mnoho transgenních zvířat skutečně obsahuje takový gen nebo geny. Uvedený výraz je třeba chápat • · · · širším způsobem jako vztahující se k jakémukoli zvířeti, jehož zárodečná linie byla podrobena technickému zákroku pomocí rekombinantní DNA technologie. Tak například zvíře, v jehož zárodečné linii byl vynechán, duplikován, aktivován nebo modifikován endogenní gen je transgenním zvířetem ve smyslu předkládaného vynálezu stejně tak jako zvíře, jehož zárodečná linie obsahuje přidanou exogenní DNA sekvenci.

V provedení předkládaného vynálezu, ve kterém se jedná o transgenní zvíře, je dárcovské jádro geneticky modifikováno. Dárcovské jádro může obsahovat jeden nebo více transgenů a genetická modifikace může být provedena před přenosem jádra a rekonstitucí embrya. Ačkoliv může být jako metoda genetické modifikace použita mikroinjekce, která je analogická injekci do samčího nebo samičího prvojádra zygoty, vynález není omezen na tuto metodologii; mohou být použity také hromadné transformační nebo transfekční techniky, například elektroporace, virální transfekce nebo lipofekce.

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu, který byl popsán výše, je diploidní jádro přeneseno z dárce do enukleovaného oocytu příjemce. Je nutné využít dárců, kteří jsou diploidní v okamžiku přenosu, aby se udržela správná ploidita rekonstituovaného embrya; dárci proto mohou být buď ve fázi G1 nebo výhodně ve fázi GO, jak je to popsáno v současně podávané přihlášce vynálezu, číslo PCT přihlášky vynálezu PCT/GB96/02099, podané týž den jako tato přihláška vynálezu (a nárokující prioritu GB přihlášky 9517780.4).

Buněčný cyklus mitotické buňky má čtyři různé fáze, označené G, S, G2 a M. Počáteční událost v buněčném cyklu, nazývaná

44 44 44

4 4 4 4 4 4

4 4444

4 4 4444 4

4 4 4 4 4

4444 44 44 start, nastává v G1 fázi a má jednoznačně určenou funkci. Rozhodnutí nebo úmysl podstoupit další buněčný cyklus je provedeno v okamžiku start. Jakmile buňka prošla etapou start, prochází zbytkem G1 fáze, což je fáze před syntézou DNA. Druhá fáze, nazývaná fáze S, je ta, ve které dochází k syntéze DNA. Ta je následována fází G2, což je časový interval mezi syntézou DNA a mitózou. K samotné mitóze dochází ve fázi M. Buňky v klidovém stavu (mezi něž patří jak buňky, u nichž byl klidový stav indukován, tak i buňky které se nacházejí v klidovém stavu přirozeně, jako jsou některé plně diferencované buňky) jsou obecně považovány za buňky, které nejsou v žádné ze čtyř fází buněčného cyklu; obvykle jsou popisovány jako buňky ve stavu GO, což znamená, že nebudou normálně postupovat buněčným cyklem. Jádro GO buňky v klidovém stavu má podobně jako jádro G1 buňky diploidní DNA obsah; oba druhy takových diploidních jader mohou být použity podle předkládaného vynálezu.

Až na výše uvedené se předpokládá, že není žádné podstatné omezení, kladené na buňky, které mohou být používány jako dárce jádra: mohou být používány plně nebo částečně diferencovatelné buňky nebo nediferencované buňky a jak buňky kultivované in vitro, tak buňky abstrahované ex vivo. Jediným omezením je, že dárcovská buňka má normální DNA obsah a je karyotypicky normální. Výhodný zdroj buněk je popsán v současně podanou přihláškou autorů PCT patentová přihláška č. PCT/GB95/02095, která byla publikována jako WO 96/07732. Předpokládá se, že každá taková normální buňka obsahuje veškerou genetickou informaci, která je potřebná pro produkci dospělého zvířete. Předkládaný vynález dovoluje, aby tato informace byla poskytnuta vyvíjejícímu se embryu změnou struktury chromatinu tak, že genetický • 0 999 9 ··· · • · • 0 I materiál může přesměrovat vývoj.

Buňky, které mohou sloužit jako příjemci podle předkládaného vynálezu jsou enukleované oocyty, které jsou uzavřeny v metafázi druhého meiotického dělení. U většiny obratlovců zrání oocytu postupuje in vivo do tohoto velmi pozdního stádia procesu zrání vajíčka a potom se zastavuje. Při ovulaci jsou uzavřené oocyty uvolněny z vaječníku (a jestliže došlo k oplodnění, oocyt je přirozeně stimulován k dokončení meiózy. Při postupu podle předkládaného vynálezu oocyty mohou být dozrálé buď in vitro nebo in vivo a jsou sbírány při objevení se prvního polárního tělíska nebo co nejdříve po ovulaci.

Příjemce je výhodně enukleován. I když se obecně předpokládá, že enukleace přijímajícího oocytu v průběhu přenosu jádra je podstatná, neexistuje žádné publikované potvrzení tohoto úsudku. Původní procedura, popsaná pro kopytníky zahrnuje rozštěpení buňky na dvě části, přičemž jedna z nich je pravděpodobně enukleovaná (Willadsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)). Nevýhodou této procedury je, že druhá neznámá část má stále metafázový aparát a že se předpokládá, že snížení objemu cytoplasmy vede k akceleraci způsobu diferenciace nových embryí (Eviskov a kol., Development, 109, 322-328 (1990)).

Později byly použity jiné procedury ve snaze odstranit chromosomy spolu s minimálním množstvím cytoplasmy. Bylo zjištěno, že aspirace (odsátí) prvního polárního tělíska a sousedící cytoplasmy odstraní aparát metafáze II u 67 % ovčích oocytu (Smith a Wilmut, Biol. Reprod., 40, 1027-1035

• · · · (1989)). Pouze použití DNA-specifického fluorochromu (Hoechst 33342) byla metoda, která dovolila enukleaci, která zaručila minimální snížení cytoplasmatického objemu (Tsunoda a kol., J. Reprod. Fertil., 82, 173 (1988)). U dobytka je to pravděpodobně v současné době rutinně používaná metoda (Prather a First, J. Reprod. Fertil. Suppl., 41, 125 (1990), Westhusin a kol., Biol. Reprod. (Suppl.), 42, 176 (1990)).

Bylo velmi málo zpráv, popisujících neinvazivní přístup k enukleaci u savců, zatímco u obojživelníků je ozařování ultrafialovým světlem používáno jako rutinní procedura (Gurdon, Q. Microsc. Soc., 101, 299-311 (1960)). Neexistují detailní zprávy o použití tohoto přístupu u savců, ačkoliv v průběhu použití DNA specifického fluorochromu bylo pozorováno, že vystavení myších oocytů ultrafialovému světlu po více než 30 sekund redukuje vývojový potenciál buňky (Tsunoda a kol., <J. Reprod. Fertil., 82, 173 (1988)).

Jak je popsáno výše, enukleace může být dosaženo fyzicky, aktuálním odstraněním jádra, prvojádra nebo metafázové destičky (v závislosti na přijímající buňce) nebo funkčně, jako je použití ultrafialového záření nebo jiný enukleující vliv.

Po enukleaci je vloženo dárcovské jádro buď fúzí do dárcovské' buňky za podmínek, které neindukují aktivaci oocytu nebo injekcí za neaktivujících podmínek. Aby byla zachována správná ploidita rekonstruovaného embrya, dárcovské jádro musí být v okamžiku fúze diploidní (to jest musí se nacházet ve fázi G0 nebo Gl buněčného cyklu).

···· • · 0 • · • · • · • ••a · ·· ·· • · · 4» • · · • · · ·

0 0 00 0000 • 9 9 9

9 99

0000 0

0 0 • 0 00

Jakmile byly připraveny vhodná dárcovská buňka a vhodná přijímající buňka, je nutné, aby bylo jádro dárcovské buňky přeneseno do přijímající buňky. Přenos jádra je nejvýhodněji dosažen fúzí. V okamžiku fúze nesmí existovat aktivace.

Existují tři uznávané metody, které jsou používány pro indukci fúze:

(1) vystavení buněk chemické látce, vyvolávající fúzi, jako je například polyethylenglykol;

(2) použití inaktivovaného viru, jako je například Sendai virus;

(3) použití elektrické stimulace.

Vystavení buněk chemické látce, vyvolávající fúzi, jako je polyethylenglykol nebo jiné glykoly, je rutinní procedura pro fúzi somatických buněk, ale nebyla široce používána u embryí. Jelikož polyethylenglykol je toxický, je nutné buňky vystavit jeho působení po minimální možný čas a nutnost být schopen odstranit rychle chemickou látku může způsobit, že se odstraní zóna pellucida (Kaňka a kol., Mol. Reprod. Dev. , 29, 110-116 (1991)). Při experimentech s myšími embryi se ukázalo, že inaktivovaný Sendai virus je účinný prostředek pro fúzi buněk embryí ve stavu štěpení (Graham, Wistar Inst. Symp. Monogr., 9, 19 (1969)) a tato metoda přináší další experimentální výhodu, spočívající v tom, že není indukována aktivace. U kopytníků je fúze obvykle dosahována stejnou elektrickou stimulací, jaká je používána k indukci parthogenní aktivace (Willandsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)), Prather a kol., Biol. Reprod., 37, 859-866 (1987)). U těchto druhů Sendai virus indukuje fúzi v části případů, • · • · · · · · • · · · · ·

ale není dostatečně spolehlivý pro rutinní aplikaci (Willandsen, Nátuře, 320 (6), 63-65 (1986)).

I když fúze buňka-buňka je výhodným způsobem ovlivnění přenosu jádra, není to jediná metoda, která může být použita. Jiné použitelné techniky zahrnují mikroinjekci (Ritchie a Campbell, J. Reproduction and Fertility Abstracts, Series No.15, str. 60).

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je fúze oocytové karyoplasmové dvojice dosažena v nepřítomnosti aktivace elektropulzací v 0,3M roztoku mannitolu nebo v 0,27M roztoku sacharózy; alternativně může být jádro vloženo injekcí v médiu, neobsahujícím vápník. Stáří oocytu v okamžiku fúze/injekce a nepřítomnost vápníkových iontů v médiu fúze/injekce zabraňuje aktivaci přijímajícího oocytu.

Při praktickém provádění je nejlepší, aby enukleace a přenos jádra následovaly co nejdříve poté, kdy oocyt dosáhne metafáze II. Doba, ze kterou k tomu dojde po začátku zrání (in vitro} nebo po podání hormonů (in vivo} závisí na živočišném druhu. Pro krávu a ovce by mělo k přenosu jádra dojít do 24 hodin; u prasete do 48 hodin; u myši do 12 hodin; a u králíka do 20-24 hodin. I když k přenosu může dojít i později, stává se stále obtížnějším dosáhnout přenosu, když oocyt stárne. Je žádoucí vysoká MPF aktivita.

Následně je fúzí rekonstruované embryo, které je obvykle navráceno do maturačního média, udržováno aniž by bylo aktivováno, aby bylo dárcovské jádro vystaveno cytoplasmě příjemce po dobu, která je dostatečná k tomu, aby rekonstruované embryo se nakonec stalo schopné dát vzniknout

živému tvorovi (výhodně plodnému potomkovi).

Optimální časový interval před aktivací se mění od jednoho druhu k druhému a může být snadno určen experimenty. Například pro krávu je vhodnou dobou od 6 do 20 hodin. Tento časový interval by pravděpodobně neměl být menší než je doba, za kterou může vzniknout chromosom a neměla by být tak dlouhá, aby jedna z částí dvojice se spontánně aktivovala nebo, v krajním případě, aby odumřela.

V okamžiku, kdy nastane vhodná doba pro aktivaci, může být použit kterýkoli konvenční nebo jiný vhodný protokol. Nedávno provedené experimenty ukazují, že požadavky na parthenogenní aktivaci jsou komplikovanější, než bylo původně předpokládáno. Předpokládalo se, že aktivace je jev typu všechno nebo nic a že všechna z velkého počtu působení, které jsou schopna indukovat vytváření prvojádra skutečně způsobí aktivaci. Vystavení králičích oocytů působení opakovaných elektrických pulsů však ukázalo, že pouze volba vhodné série pulsů a řízení množství iontů Ca²⁺ je schopno vyvolat vývoj diplodizovaných oocytů do střední gastruly (Ožil, Development, 109, 117-127 (1990)). V průběhu oplodnění dochází k přechodným vzrůstům koncentrace mezibuněčného vápníku (Cutbertson a Cobbold, Nátuře, 316, 541-542 (1985) ) a předpokládá se, že elektrické pulsy způsobují podobný vzrůst koncentrace vápníku. Existují důkazy, že průběh přechodných vzrůstů koncentrace vápníku se mění v závislosti na živočišném druhu a očekává se, že optimální průběh elektrických pulsů se mění podobným způsobem. Interval mezi pulsy u králíka je přibližně 4 minuty (Ožil, Development, 109, 117-127 (1990)) a u myši 10 až 20 minut (Cutbertson a Cobbold, Nátuře, 316, 541-542 • · • · • · • · • · «I · ·· · · · (1985)), zatímco existují předběžná pozorování, ukazující, že u krávy je tento interval přibližně 20 až 30 minut (Robi a kol., Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, ed.), Colorado State University, 24-27 (1992)). U většiny publikovaných experimentů byla aktivace indukována jediným elektrickým pulsem, ale nová pozorováni naznačuji, že počet rekonstituovaných embryi, která se vyvinou, se zvýši vystavením více pulsům (Collas a Robi, Biol. Reprod., 43, 877-884 (1990)). V každém individuálním případě mohou být provedeny rutinní úpravy pro optimalizaci počtu pulsů, intenzity pole a trvání pulsů a vápníkové koncentrace v médiu.

Při postupu podle vynálezu musí být zachovávána správná ploidita v průběhu aktivace. Je žádoucí inhibovat nebo stabilizovat mikrotubulovou polymeraci, aby se předešlo vytváření vícenásobných prvojader a tím aby se udržela správná ploidita. Toho může být dosaženo aplikací mikrotubulárního inhibitoru, jako je například nocodazol v účinné koncentraci (jako je okolo 5 mg/ml). Kolchicin a kolcemid jsou další mikrotubulové inhibitory. Alternativně může být použit mikrotubulový stabilizátor, jako je například taxol.

Molekulární složka mikrotubulů dynamické rovnováhy nepolymerovaným stavem, nocodazol, zabraňují (tubulin) je ve stavu mezi polymerovaným stavem a

Mikrotubulové inhibitory, jako je adici tubulinových molekul do mikrotubulů, čímž narušují rovnováhu a vedou k depolymeraci mikrotubulu a destrukci vřetena. Je výhodné přidat mikrotubulový inhibitor dostatečně dlouho před aktivací, aby se zajistila úplná nebo skoro úplná depolymerace •· ····

I · · · • · 4 • · ·

I · · · 4 • · 4 « · · · mikrotubulů. Dvacet až třicet minut se zdá být dostatečná doba ve většině případů. Mikrotubulový stabilizátor jako je taxol zabraňuje rozpadu vřetene a může také zabránit vytváření vícenásobných prvojader. Použití mikrotubulových stabilizátorů je výhodné za stejných podmínek jako je tomu u použití mikrotubulových inhibitorů.

Mikrotubulový inhibitor nebo stabilizátor by měl zůstat přítomen po aktivaci až do vytvoření prvojádra. Poté by měl být odstraněn a mělo by k tomu v každém případě dojít dříve, než dojde k prvnímu dělení.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou rekonstruované oocyty umístěny 30-42 hodin po začátku zrání (u krávy nebo ovce, to jest 6-18 hodin po přenosu jádra) do média, obsahujícího nocodazol (5 mg/ml) a aktivovány použitím konvenčních protokolů. Inkubace v nocodazolu může pokračovat po 4-6 hodin následujících po aktivačním stimulu (v závislosti na živočišném druhu a stáří oocytů).

Druhý předmět předkládaného vynálezu se týká životaschopného rekonstituovaného zvířecího embrya, které bylo získáno výše uvedeným způsobem.

Třetí předmět vynálezu se týká způsobu vytvoření zvířete, který sestává z následujících kroků:

(a) rekonstituce zvířecího embrya výše uvedeným způsobem a (b) způsobením vývoje uvedeného zvířete z embrya a (c) popřípadě rozmnožováním takto vzniklého zvířete.

• · • · · · · ·

Krok (a) byl detailně popsán výše.

Druhý krok, označený (b) , způsobu podle tohoto předmětu vynálezu znamená způsobit vývoj zvířete z embrya do dospělé formy. Toho může být dosaženo přímou nebo nepřímou cestou. Při přímém vývoji je rekonstituované embryo z kroku (a) jednoduše ponecháno vyvíjet se bez jakékoli intervence s výjimkou těch, které mohou být nutné k tomu aby k vývoji zvířete došlo. Při nepřímém způsobu však může docházet k další manipulaci s embryem předtím, než je jeho úplný vývoj dokončen. Embryo může být například rozštěpeno a buňky mohou být klonově pomnoženy, aby bylo dosaženo zvýšeného výtěžku.

Alternativně nebo dodatečně může být pro dosažení zvýšeného výtěžku životaschopných embryí pomocí předkládaného vynálezu použito klonální expanze dárců a/nebo použití procesu sériového přenosu (jader). Omezení v současnosti dosaženého počtu vytváření blastocyst může spočívat v tom, že u většiny embryí nedochází k přeprogramování (ačkoliv k němu dochází u přijatelného počtu embryí). Pokud nastává tento případ, může výtěžek zvýšen následujícím způsobem. Každé embryo, které se samo vyvine může být použito jako dárce jádra v etapě, kdy je jeho velikost 32-64 buněk; alternativně mohou být buňky vnitřní buněčné masy použity v blastocystové etapě. Jestliže tato embrya skutečně jsou ta, u kterých dochází k expresi přeprogramovaného genu a tato embrya jsou skutečně přeprogramována (což se zdá pravděpodobné), pak každé vyvíjející se embryo může být tímto způsobem znásobeno účinností procesu přenosu jádra. Stupeň zesílení, jehož je pravděpodobné dosáhnout, je závislý na typu buněk. U ovce je snadno možné dosáhnout 55% embryí v blastocystové etapě přenosem jediné blastomery z 16 buněčného embrya na

preaktivovaný oocyt, který je univerzální příjemce. Je tedy možno uvažovat o tom, že každé embryo vyvinuté z jediné buňky může dát vzniknout osmi v 16 buněčném stádiu. I když jsou tato čísla pouze hrubý odhad, je zřejmé, že v pozdějších vývojových stádiích bude zlepšení způsobu záviset na účinnosti procesu v tomto stádiu.

Bez ohledu na možná opatření pro zvýšení výtěžku může být rekonstituované embryo kultivováno in vivo nebo in vitro na blastocystu.

Zkušenost ukazuje, že embrya získaná přenosem jádra se odlišují od normálních embryí a někdy jim prospívají nebo jsou dokonce nutné kultivační podmínky in vivo jiné než jsou podmínky u embryí, které jsou normálně kultivovány (přinejmenším in vivo). Důvod tohoto jevu není znám. Při rutinní multiplikací hovězích embryí byla rekonstituovaná embrya (větší množství najednou) kultivována v ovčích vejcovodech po 5 až 6 dní (jak popsal Willadsen, v Mammalian Egg Transfer (Adams, E.E., ed.), 185, CRC Press, Boča Raton, Florida (1982)). Při postupu podle předkládaného vynálezu je však ve snaze chránit embryo žádoucí je vložit do ochranného média jako je agar před přenosem a potom disektovat z agaru po získání z přechodného příjemce. Funkce ochranného média jako je agar je dvojí: předně působí jako strukturální pomoc embryu tím, že se jeho zóna pellucida udržuje pohromadě; a za druhé působí jako bariéra pro buňky imunitního systému přijímajícího zvířete. I když tento přístup zvyšuje počet embryí, které vytvoří blastocysty, nevýhodou je, že řada embryí může být ztracena.

Pokud jsou použity podmínky in vitro, pak postupy běžně « » · * • · · · • · · · • · · · a • · · • · · Β používané podle stavu techniky jsou dobře přijatelné.

V blastocystovém stádiu může být embryo zkoumáno s ohledem na jeho schopnost dospět. Typicky bude tento postup použit, pokud se jedná o transgenní embryo a bude prováděno zkoumání a selekce stabilních integrantů. V této etapě může být také prováděn výběr podle netransgenních markérů. Jelikož však způsob podle vynálezu dovoluje výběr dárců v časnější etapě, bude výhodně postupováno tímto způsobem.

Po výběru embryí, pokud byl prováděn, bude blastocystové embryo ponecháno, aby dospělo. To bude obecně prováděno in vivo. Jestliže k vývoji do etapy blastocysty proběhlo in vitro, dojde v této etapě k přenosu do konečného zvířecího příjemce. Jestliže k vývoji do etapy blastocysty došlo in vivo, pak i když v principu je možno ponechat blastocystu dokončit její vývoj v pre-blastocystovém příjemci, běžně je blastocysta vyjmuta z (dočasného) pre-blastocystového příjemce a po disekci z ochranného média je umístěna do (trvalého) post-blastocystového příjemce.

V případném kroku (c) vynálezu mohou být předcházejících kroků podle tohoto předmětu předkládaného zvířata získaná způsobem podle množena. Tímto způsobem je možno vytvořit stádo zvířat, která mají požadovanou charakteristiku nebo charakteristiky.

genetickou

Zvířata produkovaná přenosem jádra ze zdroje geneticky identických buněk sdílejí totéž jádro, ale nejsou striktně identické, neboť jsou odvozeny z různých oocytu. Význam tohoto různého původu není jasný, ale může ovlivnit komerční znaky. Nedávno provedené analýzy mitochondriální DNA u *

4 4 4 ·

4 « «· 4 · dojnic na chovném stádu Iowa State University odhalily souvislost s dojivostí a reprodukční schopností (Freeman a Beitz, v Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, G.E., Jr. ed.) , 17-20, Colorado State University, Colorado (1992)). Je třeba ale potvrdit, že k podobným efektům v populaci dobytka dochází a uvážit, zda je možné nebo nutné ve specifických situacích provádět selekci oocytů. V oblasti pěstování dobytka může mít schopnost produkovat velké množství embryí od dárců s velkou genetickou hodnotou velkou potenciální hodnotu pro rozšíření genetických zlepšení v celostátním měřítku. Rozsah aplikace bude záviset na ceně každého embrya a počtu přenesených embryí, která jsou schopna dokončit úplně svůj vývoj.

Pro ilustraci a jako shrnutí podává následující schéma typický způsob, kterým mohou být připravena transgenní a netransgenní zvířata. Na způsob je možno pohlížet jako na proces, zahrnující pět kroků:

(1) isolace diploidní dárcovské buňky;

(2) případná transgeneze, například transfekcí vhodného konstruktu, který obsahuje nebo neobsahuje selekční markéry;

(2a) případné prohledávání a selekce na stabilní integranty

- přeskočeno pro mikroinjekce;

(3) rekonstituce embrya přenosem jádra;

(4) kultivace, in vivo nebo in vitro, do etapy blastocysty; (4a) případné prohledávání a selekce na stabilní integranty

- vynecháno, pokud byl prováděn krok 2a - nebo na další požadované vlastnosti;

• *

- 20 • 4 4 4

4 4 · 9 9

4 4

4·· ·

4 ·

4 • 4

4

4444

4»

4 4 4 • 4 4 4

9 9 9 9

4 4

4 4 · (5) přenos, je-li to třeba, do konečného příjemce.

Tento protokol má řadu výhod ve srovnání s dříve publikovanými metodami přenosů jádra:

1) Chromatin dárcovského jádra může být vystaven meiotické cytoplasmě v přijímajícím oocytu za nepřítomnosti aktivace po odpovídající dobu. To může zvýšit přeprogramování v dárcovském jádru změnou struktury chromátinu.

2) Správná ploidita rekonstituovaného embrya je dodržena, pokud je přeneseno G0/G1 jádro.

3) Dřívější studie ukázaly, hovězích/ovčích oocytů se dříve pozorovaný problém že aktivační citlivost zvyšuje se stářím. Jeden spočíval v tom, že u neenukleovaných starých oocytů docházelo k duplikaci meiotických vřeténkových polárních tělísek a byla pozorována multipolární vřeténka. Autoři ale zjistili, že u embryí rekonstruovaných a udržovaných při vysoké MPF úrovni nebyla pozorována organizovaná vřeténka, i když docházelo k rozpadu obalu a kondenzaci chromatinu. Předčasně kondenzovaný chromatin zůstával v těsném klubku a proto autoři mohli využít výhod procesu stárnutí a zvýšit aktivační odezvu rekonstruovaného oocytu, aniž by došlo k nepříznivému ovlivnění ploidity rekonstruovaného embrya.

Čtvrtý předmět vynálezu se týká zvířete, připraveného výše uvedeným způsobem.

• * · · · « « 9 9 9 9 · 9 9 9

9 9 9 9 ·· ····

Výhodné rysy kteréhokoliv předmětu vynálezu představují i výhodné rysy ostatních předmětů vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález nyní bude popsán s odvoláním na uvedené příklady provedení vynálezu, které jsou podány za účelem ilustrace předmětu vynálezu, ale nepředstavují omezení jeho rozsahu. V následujícím textu bude použito odvolání na přiložené vyobrazení, ve kterém obr. 1 představuje rychlost zrání hovězích oocytů in vitro.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Procedura MAGIC, využívající hovězích oocytů

Přijímající oocyty podle tohoto příkladu jsou označeny jako MAGIC (Metaphase Arrested G1/G0 acceptlng Cytoplast) příjemci.

Byly studovány jaderné a cytoplasmatické události v průběhu in vitro zrání oocytů. Navíc byla také zkoumána role fúze a aktivace embryí, rekonstruovaných v různém stáří. Studie ukázaly, že zrání oocytů je asynchronní, avšak populace zralých oocytů může být morfologicky selektována po 18 • · hodinách.

Morfologická selekce oocytů

Obrázek 1 popisuje vaječníky, které byly získány na místních jatkách a při transportu do laboratoře udržovány při teplotě 28-32 °C. Z folikulů o průměru 3-10 mm byly hypodermickou jehlou (vnitřní průměr 1,2 mm) odsáty komplexy oocytárních vyklenutí (cumulus) a umístěny do sterilních plastových univerzálních zásobníků. Univerzální zásobníky byly umístěny do vyhřívané komory (35 °C) a folikulární materiál byl ponechán sedimentovat po 10 - 15 minut a pak byly odlity tři čtvrtiny supernatantu. Zbývající folikulární materiál byl zředěn stejným objemem disekčního média (TCM 199 s Earlovou solí (Gibco) , 75,0 mg/1 kanamycinu, 30,0 mM Hepes, pH 7,4, osmolarita 280 mOsmol/kg H₂O), doplněného 10 % hovězím sérem, přenesen na 85 mm Petriho misku a pod disekčním mikroskopem byly vyhledávány komplexy oocytárních vyklenutí.

Byly vybrány komplexy s alespoň 2-3 kompaktními vrstvami buněk, promývány třikrát v disekčním médiu a přeneseny do maturačního média (TC médium 199 s Earlovou solí (Gibco), 75,0 mg/1 kanamycinu, 30,0 mM Hepes, 7,69 mM NaHCO₃, pH 7,8, osmolarita 280 mOsmol/kg H₂O), doplněného 10 % hovězím sérem a 1 x 10⁶ buněk membrána granulosa/ml a kultivovány na kmitačce při teplotě 39 °C a v atmosféře 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu. Oocyty byly odebrány z maturační misky a za vlhka umístěny na ethanolem vyčištěné skleněné destičky pod ochranným krytem, který byl připevněn směsí 5 % petrolejového želé a 95 % vosku. Nanesená embrya potom byla fixována po 24 hodin v čerstvě připravené směsi methanolu a ledové kyseliny octové (3:1), označena 45 % aceto-orceinem • 0 0000 » 0 · 0 * • · *

• 000 0

00 ·· ··

0 0 0 000 0

0 · 0·0* • Φ 0 0 0000 ·

0 0 0 0 0

0000 0» ·· (Sigma) a zkoumána fázovým kontrastem a DIC mikroskopií použitím mikroskopu Nikon Microphot-SA. Graf na obr. 1 ukazuje procento oocytů v Mil a oocytů s viditelným polárním tělískem.

Aktivace hovězích folikulárních oocytů

Jestliže zrání pokračuje až do 24 hodin, tyto oocyty se aktivují ve velmi malém počtu (24 %) v mannitolu obsahujícím vápník (Tabulka la) . Odstranění vápníku a hořčíku z elektropulzačního média zabraňuje jakékoli aktivaci.

Tabulka la ukazuje aktivaci hovězích folikulárních oocytů, které zrály in vitro po různé doby. Oocyty byly odstraněny z maturačního média, jednou promývány v aktivačním médiu, umístěny do aktivační komory a podrobeny jedinému elektrickému pulzu o intenzitě 1,25 kV/cm po dobu 80 ms.

Tabulka la

Aktivační odezva předstíraně enukleovaných hovězích oocytů

Počet oocytů (N)	Hodin po začátku zrání (hpm) [stáří (hod)]	Vytváření prvojader (% aktivace)
73	24	24,6
99	30	84,8
55	45	92,7’

* 2 nebo více projader • · · · · · • ·

• · » · · · · ·♦ * · · 4 ···« « • « · · · · ·· ·♦·» · · · ·

Tabulka lb ukazuje aktivační odezvu oocytů, které zrály in vitro, předstíraně enukleovaných přibližně 22 hodin po začátku zrání (hpm). Oocyty byly zpracovávány stejně jako pro enukleaci, bylo odsáto malé množství cytoplasmy, neobsahující metafázovou destičku. Po manipulaci byly oocyty vystaveny jedinému stejnosměrnému pulsu intenzity 1,25 kV/cm a navráceny do maturačního média a 30 hpm respektive 42 hpm byly oocyty uloženy, fixovány a označeny aceto-orceinem. Výsledky ukazují počet oocytů v každý okamžik z pěti individuálních pokusů jako množství buněk, které měly prvojádra vzhledem k celkovému množství buněk.

Tabulka lb

Pokus	Počet buněk s prvojádrem / celkový počet buněk 30 hpm	Počet buněk s prvojádrem / celkový počet buněk 42 hpm
1	1/8	—
2	0/24	0/30
3	0/21	0/22
4	0/27	0/25
5	0/19	0/1

hpm = hodin po začátku zrání (maturace)

Vytváření prvojádra v enukleovaném oocytu.

Tabulka 2 ukazuje vytváření prvojádra v enukleovaných oocytech, fúzovaných k primárním hovězím fibroblastům (24 • 4 •4 4444 • 4

9

4

4 • 4 4 4 4

4« 44 · · *

I « »

4 4 «

4 4

4444

4 · · ·

4 4 4 « • 4 ·

4 ·4 hpm) a poté aktivovaných (42 hpm). Výsledky představují pět oddělených experimentů. Oocyty byly rozděleny do dvou skupin, skupina Ά byla inkubována v nocodazolu po 1 hodinu před aktivací a po 6 hodin po aktivaci. Skupina B byla bez působení nocodazolem. Aktivované oocyty byly fixovány a označeny aceto-orceinem 12 hodin po aktivaci. Počet prvojader (PN) v každém parthenátu byl potom určován pod fázovým kontrastem. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento aktivovaných oocytů, obsahujících jedno nebo více prvojader.

Tabulka 2

	Celkově	1 PJ	2 PJ	3 PJ	4 PJ	>4 PJ
Skupina A	52	100	0	0	0	0
Skupina B	33	45,2	25,8	16,1	3,2	9,7

Nepřítomnost organizovaného vřeténka a nepřítomnost polárního tělíska naznačuje, že k tomu, aby byla zachována ploidita v rekonstruovaném embryu je nutné, aby byly v této cytoplasmatické situaci byla přenášena pouze G0/G1 jádra. Inkubace aktivovaných oocytů v přítomnosti mikrotubulového inhibitoru nocodazolu po pět hodin, jednu hodinu před a potom po aktivačním stimulu zabraňuje vytváření mikrojader (Tabulka 2) a tudíž pokud je dárcovské jádro v G0/G1 fázi buněčného cyklu, je zachovávána správná ploidita rekonstruovaného embrya.

4· ·· ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 99 • * 99 9 9 9 9999 ·

9 9 9 9 9 9 9

9999 9 99 9999 99 ··

Výsledky

Tyto výsledky ukazují, že:

i) tyto oocyty mohou být enukleovány 18 hodin po započetí zrání (obr. 1);

ii) enukleované oocyty mohou být fúzovány s dárcovskými blastomerami/buňkami buď v 0,3 M mannitolu nebo v 0,27 M sacharóze a alternativně mohou být dárcovské buňky nebo jádra injektována v médiu prostém vápníku za nepřítomnosti jakékoli aktivační odezvy;

iii) rekonstruovaná embrya nebo enukleované pulsované oocyty mohou být kultivovány v maturačním médiu a nepodstoupí spontánní aktivaci;

iv) je pozorováno, že přenesená jádra podstupují rozpad obalu jádra (NEBD) a chromosomovou kondenzaci. Není pozorováno žádné organizované meiotické/mitotické vřeténko, bez ohledu na etapu buněčného cyklu přeneseného jádra;

v) takto zpracované dvojice se aktivují po 30 hodinách a po 42 hodinách se stejnou frekvencí jako nezpracované kontrolní oocyty;

ví) po následné aktivaci nebylo pozorováno žádné polární tělísko, bez ohledu na' bez ohledu na etapu buněčného cyklu přeneseného jádra;

• 9

- 27 4 • 499

9« 94 94 »4

444« · 4 4 « • 44 9 9 4 49

4 4 9 4494 · viii) po následné aktivaci ve vytvořilo 1-5 mikrojader na rekonstruovanou zygotu (Tabulka 2).

Rekonstrukce hovězích embryi použitím procedury MAGIC

V předběžných experimentech byla tato technika aplikována na rekonstrukcí hovězích embryí použitím primárních fibroblastů synchronizovaných v GO fázi buněčného cyklu sérovým hladověním po dobu pěti dnů. Výsledky jsou sumarizovány v Tabulce 3.

Tabulka 3 ukazuje vývoj hovězích embryí rekonstruovaných přenosem jádra hovězích primárních fibroblastů po sérovém hladovění (GO) do enukleovaných desaktivovaných Mil oocytů. Embrya byla rekonstruována v okamžik 24 hpm a fúzované dvojice byly aktivovány v 42 hpm. Fúzované dvojice byly inkubovány v nocodazolu (5 mg/ml) v M2 médiu po jednu hodinu před aktivaci a po pět hodin po aktivaci. Dvojice byly aktivovány jediným stejnosměrným pulsem o intenzitě 1,25 kV/CM a trvání 80 ms.

Tabulka 3

Číslo pokusu	Počet blastocyst/ celkový počet fúzovaných dvojic	% blastocyst
1	1/30	3,3
2	4/31	12,9

0« 0000

00 00 0* «0 f 0000 0000

00 000 00 0 0 00 0 00 0000 * 0 0 000 000 • 000 0 00 0000 0* ·*

Příklad 2: MAGIC procedura s použitím ovčích oocytů

Pozorování podobná těm, která byla učiněna v příkladě 1, byla dosažena s ovčími oocyty, které zrály in vivo. Čerstvě ovulované oocyty byly získány propláchnutím z vejcovodů superstimulovaných samic ovce 24 hodin po podání prostaglandinu. Použití PBS prostého vápníku a hořčíku /0,1 % FCS jako proplachovacího média zabránilo oocytové aktivaci. Oocyty byly enukleovány v médiu prostém vápníku a dárcovské buňky byly vloženy výše uvedeným způsobem v , Nebylo pozorováno žádné organizované jádra se vytvořila po následné nepřítomnosti aktivace, vřeténko, vícenásobná aktivaci, což může být potlačeno ošetřením nocodazolem.

Výsledky

V předběžných experimentech s ovcí jedno těhotenství vedlo k narození jednoho živého jehněte. Výsledky jsou přehledně uvedeny v Tabulce 4 a Tabulce 5.

Tabulka 4 ukazuje vývoj ovčích embryí rekonstruovaných přenosem z embrya odvozené buněčné linie do inaktivovaných enukleovaných ovčích oocytů, které zrály in vivo. Oocyty byly získány ze superstimulované ovčí samice Scottish blackface, buněčná linie byla získána z embryonálního disku 9 dní starého embrya získaného z ovčí samice Welsh mountain. Rekonstruovaná embrya byla kultivována v podvázaném vejcovodu dočasného příjemce, představovaného ovčí samicí, po 6 dní a po opětovném vyjmutí by určen dosažený vývoj.

•0 000·

00 00 0 0»0· 0 00 · 0000 0 00 0 0 · 00·· 0 • 0 0 0 · · · • 00 ···· 0· ··

Tabulka 4

Datum přenosu jádra	Číslo stádia	Počet morul, blastocyst/ Celkový počet
11.1.95	6	4/28
19.1.95	7	1/10
31.1.95	13	0/2
02.2.95	13	0/14
07.2.95	11	1/9
9.2.95	11	1/2
14.2.95	12
16.2.95	13	3/13
Celkově		10/78 (12,8 %)

Tabulka 5 ukazuje indukcí těhotenství následujícího po přenosu všech rekonstruovaných embryí ve stádiu morula/blastocysta do děložního rohu synchronizovaných samic Scotish blackface. embryí z každé přenesené k počtu ovcí a vzhledem konečných příjemců - ovčích Tabulka ukazuje celkový počet skupiny, frekvenci těhotenství embryí; ve většině případů byla do každé samice přenesena dvě embrya. Bylo dosaženo jedno dvojité těhotenství, které vedlo k narození jednoho živého jehněte.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob rekonstituce zvířecího embrya, vyznačující se tím, že zahrnuje přenos diploidního jádra do oocytu, který je uzavřen v metafázi druhého meiotického dělení, aniž by přenos byl doprovázen aktivací oocytů, uchovávání jádra vystaveného cytoplasmě příjemce po časový interval dostatečný k tomu, aby embryo se stalo schopné vyvinout se k porodu živého zvířete a nakonec aktivaci rekonstituovaného embrya při zachovávání správné ploidity.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zvíře je kopytník.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že zvíře je kráva nebo býk, prase, koza, ovce, velbloud nebo bůvol.
4. 4. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že dárcovské jádro je geneticky modifikováno.
5. 5. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že diploidní jádro je získáno z buňky v klidovém stavu.
6. 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že přijímající oocyt je enukleovaný.
7. 7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že přenosu jádra je dosaženo buněčnou fúzí.

   00 0000

   0« 00 00 ·« · 0 · · 0 0 0 0 0 o o ·· ·· ·····

   Jó ~ «0 0 0 0 ♦ · 000 0 0 • 0 000 00·

   0«0« 0 00 0000 00 ·0
8. 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že zvíře je kráva nebo býk a dárcovské jádro je udržováno vystavené cytoplasmě příjemce po dobu od 6 do 20 hodin před aktivací.
9. 9. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že správná ploidita je v průběhu aktivace udržována inhibici mikrotubulů.
10. 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že inhibice mikrotubulů je dosaženo aplikací nocodazolu.
11. 11. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že správná ploidita je v průběhu aktivace udržována stabilizací mikrotubulů.
12. 12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že stabilizace mikrotubulů je dosaženo aplikací taxolu.
13. 13. Způsob přípravy zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    (a) rekonstituce zvířecího embrya způsobem podle kteréhokoli z předcházejících nároků;

    (b) způsobením vývoje uvedeného zvířete z embrya až k porodu; a (c) popřípadě rozmnožováním takto vzniklého zvířete.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že zvířecí embryo je dále manipulováno před dokončením jeho úplného vývoje.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že z embrya «· «««· • · ·· 99 99

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 · ·· • · 9 9 9 9 9 99 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9 9

    9999 9 99 9999 99 99 je odvozeno více než jedno zvíře.
16. 16. Rekonstituované zvířecí embryo, schopné se vyvinout k živému porodu a připravené způsobem podle kteréhokoli z nároků 1 až 12.
17. 17. Zvíře připravené způsobem podle kteréhokoli z nároků 13 až 15.
18. 18. Zvíře vyvinuté z embrya podle nároku 16.