RS57827B1 - Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana - Google Patents

Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana

Info

Publication number
RS57827B1
RS57827B1 RS20181290A RSP20181290A RS57827B1 RS 57827 B1 RS57827 B1 RS 57827B1 RS 20181290 A RS20181290 A RS 20181290A RS P20181290 A RSP20181290 A RS P20181290A RS 57827 B1 RS57827 B1 RS 57827B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
amino acid
seq
acid residues
pglyrp1
antibody
Prior art date
Application number
RS20181290A
Other languages
English (en)
Inventor
Vibeke Westphal Stennicke
Christine Brender Read
Joe Kuijper
Xiaoting Tang
Mark Heipel
Siv Annegrethe Hjorth
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of RS57827B1 publication Critical patent/RS57827B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
OBLAST NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na oblast imunologije. Konkretnije, predmetni pronalazak se odnosi na metodu za identifikaciju liganda koji je sposoban da stimuliše aktivirajući receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama (Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells - TREM-1), kao i antitela koja vezuju ligand za TREM-1. Takva antitela su sposobna da modulišu aktivaciju mijeloidnih ćelija i, prema tome, inflamatorne odgovore.
STANJE TEHNIKE
[0002] Protein 1 prepoznavanja peptidoglikana (inače poznat kao PGLYRP1, PGRP-S, TNFSF3L, PGRP, TAG7 i PGRPS) je eksprimiran u neutrofilima i oslobođen po njihovoj aktivaciji. PGLYRP1 je veoma obilan u obolelom tkivu i pokazano je da igra bitnu ulogu u uklanjanju bakterijskih infekcija pomoću urođenog imunskog sistema. Familija PGLYRP proteina (PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3, PGLYRP4) sva interaguje sa bakterijskim peptidoglikanima (PGNs) ali postoje značajne razlike u PGN vezujućim mestima proteina. PGLYRP1 ima dodatnu petlju za koju se pretpostavlja da čini mesto vezivanja za nepoznati efektorski ili signalni protein (J. Mol. Biol. 347:683-691 (2005)). PGLYRP1 je visoko konzerviran protein, protein dužine od 196 aminokiselina koji se sastoji od signalnog peptida i domena za vezivanje peptidoglikana.
[0003] Identifikacija signalnog mehanizma posredovanog od strane PGLIRP1 je važna kako bi se razumelo i time manipulisalo funkcijom ovog proteina u različitim infektivnim i inflamatornim bolestima.
[0004] TREM-1, isto tako, ima dobro opisane efekte u imunskoj modulaciji ali, do sada, mehanizam koji dovodi do TREM-1 posredovane imunske funkcije nije bio shvaćen. TREM-1 je receptor eksprimiran na mijeloidnim ćelijama, kao što su monociti, makrofagi i neutrofili. To je transmembranski protein koji se sastoji od 234 aminokiseline, uključujući jedan vanćelijski imunoglobulinski domen i kratak citoplazmatični rep. TREM-1 nema očigledan signalni motiv već, kada je aktiviran, formira dimere/multimere i posreduje u signalizaciji povezivanjem sa signalnim adapterskim proteinom koji sadrži ITAM, DAP12.
Nizvodna signalizacija može uključiti fosforilaciju Syk i Zap70. Nizvodna signalizacija može uključiti aktivaciju NFAT, ELK, NK-kapaB transkripcionog faktora. Kada se TREM-1 aktivira, on pokreće oslobađanje proinflamatornih citokina, kao što su TNF-α (TNF-alfa), IL-8 i monocitni hemotaktički protein-1, iz mijeloidnih ćelija.
[0005] TREM-1 je pozitivno regulisan kod pacijenata sa sepsom, reumatoidnim artritisom (RA) i inflamatornom bolesti creva (IBD) i dokaz povećanja podržava teoriju da TREM-1 doprinosi razvoju i progresiji inflamatornih bolesti. Pokazano je dalje da blokiranje TREM-1 signalizacije ima terapijsku aktivnost u in vivo modelima miševa za RA i IBD.
[0006] Način delovanja TREM-1 aktivacije je ostao nedostupan jer ligand koji aktivira TREM-1 nije poznat u oblasti. Stoga, postoji potreba u oblasti za načinima identifikacije liganda od TREM-1. Postoji potreba u oblasti za metodom za identifikovanje molekula, kao što je antitelo, koje je sposobno da smanji, blokira ili ometa interakciju TREM-1 sa njegovim ligandom. Postoji potreba u oblasti za molekulom, kao što je antitelo, koji je sposoban da veže ligand od TREM-1 i time smanji, blokira ili ometa stimulaciju TREM-1 pomoću njegovog liganda. Postoji potreba u oblasti za molekulom, kao što je antitelo, koji je sposoban da veže ligand od TREM-1. Postoji potreba u oblasti za molekulom, kao što je antitelo, koji je sposoban da veže ligand od TREM-1 i time blokira TREM-1 aktivaciju i signalizaciju. Postoji potreba u oblasti za molekulom, kao što je antitelo, koji je sposoban da veže ligand od TREM-1 i time smanjuje ili blokira oslobađanje citokina iz mijeloidne ćelije koja eksprimira TREM-1.
[0007] Ovde je stavljena na uvid javnosti metoda i test za identifikaciju liganda od TREM-1 i molekula, kao što su antitela, koja su sposobna za vezivanje liganda od TREM-1. Ovde su opisana antitela koja su sposobna da utiču na TREM-1 aktivaciju. Prema tome, antitela koja su ovde stavljena na uvid javnosti su pogodna za primenu kao farmaceutske supstance. Antitela koja vezuju ligand od TREM-1 i koja smanjuju ili blokiraju interakciju TREM-1 sa njegovim ligandom mogu imati značajan uticaj na kvalitet života pojedinaca sa hroničnim inflamatornim bolestima kao što su reumatoidni artritis, psorijazni artritis i inflamatorne bolesti creva. Osanai et al. su stavili na uvid poliklonska antitela sposobna da se vežu za PGLYRP1 (Infection and Immunity, 2010, tom 79, br. 2, s. 858-866). Obim predmetnog pronalaska je definisan patentnim zahtevima i bilo koja informacija koja nije u okviru patentnih zahteva je obezbeđena samo sa ciljem informisanja.
REZIME
[0008] Pronalazak se odnosi na metodu za identifikovanje liganda od TREM-1 i molekula, kao što su antitela, koja se vezuju za ligand od TREM-1, ovde identifikovan kao PGLYRP1. Pronalazak se takođe odnosi na PGLYRP1 antitela koja mogu biti identifikovana pomoću osmišljene metode. Prema tome, pronalazak se odnosi na PGLYRP1 antitela koja su sposobna da modifikuju aktivaciju TREM-1 pomoću PGLYRP1, kao što su PGLYRP1 antitela koja su sposobna da smanje TREM-1 aktivnost (signalizaciju i/ili aktivaciju) pomoću PGLYRP1. Antitela koja smanjuju TREM-1 aktivnost mogu biti korišćena za lečenje inflamacije.
[0009] Metoda za identifikaciju TREM-1 liganda obuhvata (a) kultivisanje ćelije koja ekprimira TREM-1, signalni protein za TREM-1 i reporterski konstrukt koji je aktiviran pomenutim signalnim proteinom; (b) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, aktivnosti pomenute ćelije koja eksprimira TREM-1 kada je u kontaktu sa ćelijom, jedinjenjem ili tečnošću, kao što je biološka tečnost ili tkivo koje izaziva TREM-1 aktivaciju; (c) stupanje u kontakt kulture iz (b) sa TREM-1-aktivirajućom komponentnom; (d) izolovanje komponente koja vezuje TREM-1 i (e) karakterizaciju izolovane komponente. Ligand za TREM-1, identifikovan pomoću predmetnog pronalaska kao PGLYRP1, može biti korišćen da se modifikuje aktivnost TREM-1.
[0010] Metoda za identifikaciju molekula koji specifično vezuje PGLYRP1 i koji modifikuje TREM-1 posredovanu ćelijsku aktivnost, obuhvata: (a) kultivisanje ćelije u skladu sa bilo kojim od tehničkih rešenja 1-18; (b) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, aktivnosti pomenute ćelije koja eksprimira TREM-1 kada je u kontaktu sa PGLYRP1 i, po izboru, agensom za multimerizaciju kao što je PGN; (c) stupanje u kontakt kulture iz (b) sa molekulom koji specifično vezuje PGLYRP1; i (d) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, da je aktivnost pomenute ćelije koja eksprimira TREM-1 manja ili veća od njene aktivnosti kao što je izmereno u (b).
[0011] Metoda za identifikaciju PGLYRP1 antitela koje modifikuje TREM-1 posredovanu ćelijsku aktivnosti obuhvata: (a) kultivisanje ćelije koja eksprimira TREM-1, signalni protein za TREM-1 i reporterski konstrukt koji je aktiviran pomoću pomenutog signalnog proteina; (b) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, aktivnosti pomenute ćelije koja ekprimira TREM-1 kada je u kontaktu sa PGLYRP1 i, po izboru, u kombinaciji sa agensom za multimerizaciju kao što je PGN; (c) stupanje u kontakt kulture iz (b) sa antitelom koje vezuje PGLYRP1; i (d) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, da aktivnost pomenute ćelije koja eksprimira TREM-1 je manja ili veća od njene aktivnosti kao što je izmereno u (b).
[0012] Jedna metoda za identifikaciju PGLYRP1 antitela koja smanjuje TREM-1 posredovanu ćelijsku aktivnost obuhvata: (a) kultivisanje ćelije kao što je T-ćelija koja eksprimira TREM-1, signalni protein kao što je DAP12 i reporter gen kao što je luciferaza ili beta-galaktozidaza; (b) inkubiranje pomenute ćelije sa aktiviranim neutrofilom i, po izboru, u kombinaciji sa agensom za multimerizaciju kao što je PGN (c) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, luminescencije pomenute ćelije; (d) stupanje u kontakt kulture ćelije i aktiviranog neutrofila sa PGLYRP1 antitelom; i (e) detektovanje, poželjno kvantifikovanje, da luminescencija pomenute ćelije je manja od aktivnosti izmerene u (c).
KRATAK OPIS NACRTA
[0013]
Sl. 1 prikazuje da neutrofili aktiviraju BWZ-TREM-1 reportersku ćelijsku liniju. BWZ reporterska ćelijska linija ekprimira humani TREM-1 i posreduje u aktivaciji NFAT-vezanog beta (β)-galaktozidaza reporterskog gena koji može biti kvantifikovan luminescencijom korišćenjem Beta-Glo test sistem kompleta od Promega, Danska. Slika ilustruje aktivaciju reporterske ćelijske linije kada je kultivisana sa neutrofilima u prisustvu bilo citokinskih koktela koji sadrže TNF-alfa (α), IL-6, IFN-gama (γ) i GM-CSF bilo 'koktela' koji aktiviraju Toll-u slični receptor (TLR) (TLRL i TLR2 smeša (tlrl-kit2hm, Invivogen, Sigma-Aldrich, Danska), kao i u prisustvu odvojenih komponenti ovih aktivacionih smeša.
Sl. 2 prikazuje bojenje na protočnom citometru PGN-stimulisanih neutrofila sa TREM-1-tetramernim rekombinantnim proteinom. Kontrolni protein se ne vezuje (Sl.
2A), dok se TREM-1-tetramer (SEK ID BR: 2) vezuje za podskup PGN-aktiviranih neutrofila (Sl. 2B), i ovo se može takmičiti sa drugim TREM-1 proteinom (Sl.2D) ali ne sa kontrolnim proteinom (Sl.2C), potvrđujući specifičnost interakcije.
Sl. 3: PGLYRP1 je identifikovan Imunoprecipitacijom (IP)/Masenom spektroskopijom (MS) sa TREM-1. Solubilni TREM-Fc je inkubiran sa PGN-aktiviranim neutrofilima, unakrsno-povezanim, imunoprecipitiranim praćeno sa čišćenjem, digestijom tripsinom i masenom spektroskopijom. Imunoprecipitacija TREM-1 vezujućih proteina dala je 3 specifična proteina, 73 proteina se preklapaju sa kontrolnim proteinom, i 72 su precipitirana pomoću kontrolnog proteina samog (pozadinski signal). Tabela prikazuje rezultate iz TREM-1 specifične imunoprecipitacije i kasnije masene spektroskopije.
Sl. 4 prikazuje da se rastvorljivi TREM-1 vezuje za PGLYRP1. Prikazano je i pomoću bojenja na protočnom citometru sa TREM-1 na HEK293 transfektantima koji eksprimiraju rekombinantni PGLYRP1 (Sl. 4A) i pomoću Biacore i ForteBio analiza interakcije između PGLYRP1 i TREM-1 tetramera (SEK ID BR: 2). Rastvorljivi humani PGLYRP1 je vezao imobilisani humani TREM-1 u prisustvu i odsustvu 10 µg/ml rastvorljivog E. coli peptidoglikana (PGN) (Sl. 4B). PGN sam od sebe takođe vezuje imobilisani humani PGLYRP1 (Sl. 4C), i rastvorljivi humani TREM-1 se vezuje za imobilisani PGLYRP1 pre i nakon što je PGLYRP1 površina bila izložena ka i vezana pomoću PGN (Sl.4D).
Sl. 5 prikazuje aktivaciju TREM-1 reporterske ćelijske linije pomoću rekombinantnog PGLYRP1. Stimulacija TREM-1 reporterske ćelijske linije sa rekombinantim PGLYRP1 (kat. br. 2590-PG-050R&D Systems Minneapolois Mineapolis, SAD), kao i PGLYRP1 generisanim interno (SEK ID BR: 1) dovodi do dozno zavisnog odgovora u prisustvu PGN (Sl. 5A). Ovaj PGLYRP1-indukovan odgovor može biti specifično blokiran pomoću TREM-1-Fc fuzionog proteina (Sl. 5B) validirajući TREM-1 specifičan signal.
Sl. 6 prikazuje da monoklonska anti-PGLYRP1 antitela mogu da blokiraju TREM-1 odgovor u reporterskom testu stimulisan sa PGN-aktiviranim neutrofilima.
Primeri supernatanata hibridomskih klonova za antitela testiranih u raznim pločama na njihovu sposobnost da blokiraju aktivacioni signal. Nekoliko antitela (onih ispod tačkaste linije, kao što su F10, F95) su sposobna da blokiraju ovaj signal. Crne tačke predstavljaju izotipsku kontrolu u svakoj ploči (Sl. 6A). Sl. 6B prikazuje testiranje iz druge fuzije koja je dala porast 2 dodatna blokirajuća PGLYRP1 antitela M-hPGRPS-2F5 i -2F7.Testiranje komercijalno dostupnih anti-PGLYRP1 mAbs (monoklonska antitela – monoclonal antibodies, mAbs) pokazuju da ona nisu sposobna da blokiraju ovaj signal čak i pri visokim dozama, dok poliklonska, komercijalno dostupna PGLYRP1 pAb (AF2590, R&D SystemsMinneapolois Mineapolis, SAD) mogu. Sl. 6C prikazuje poređenje komercijalno dostupnog anti-PGLYRP1 mAb 188C424 od Thermo Scientific (Thermo Scientific, Voltam Masačusets, SAD) sa izotipskom kontrolom (MAB002) i poliklonskim anti-PGLYRP1 pAb (AF2590). Sl. 6D prikazuje poređenje komercijalno dostupnog anti-PGLYRP1 mAb 4H230 (US Biological, Salem Masačusets, SAD) sa izotipskom kontrolom (MAB002) i poliklonskim anti-PGLYRP1 pAb (AF2590). Sl. 6E prikazuje poređenje komercijalno dostupnog anti-PGLYRP1 mAb 9A319 (US Biological, Salem Masačusets, SAD) sa izotipskom kontrolom (MAB002) i poliklonskim anti-PGLYRP1 pAb (AF2590), Sl. 6F prikazuje poređenje komercijalno dostupnog anti-PGLYRP1 mAb 6D653 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Kruz Kalifornija, SAD) sa izotipskom kontrolom (MAB002) i poliklonskim anti-PGLYRP1 pAb (AF2590). Blago smanjenje aktivnosti koje je opaženo za SC 6D653 mAb izgleda da je usled formulacije koja sadrži azid pošto PGLYRP1 nezavisni signal koji aktivira TREM-1 sa 1 ug/ml vezanim za ploču anti-TREM-1 mAb pokazuje isti fenomen (Sl. 6G).
Sl.7 prikazuje da TREM-1 ligand prisutan u humanoj RA sinovijalnoj tečnosti je spsoban da stimuliše TREM-1.
Sl. 7 prikazuje da agonističko vezano za ploču anti-TREM-1 mAb (R&D MAB1278, Mineapolis, Mineapolis, SAD) stimuliše TREM-1 (zvezdica) i da je uzorak RA sinovijalne tečnosti (ST) u koji je PGN dodat pokazao aktivnost hTREM-1 liganda koja može biti neutralisana pomoću PGLYRP1 polikonskog antitela (AF2590), ukazujući na to da je TREM-1 aktivnost zavisna od PGLYRP1.
Sl. 8 prikazuje opštu strukturu PGLYPR1 konstrukta Tipa II. IC predstavlja unutarćelijski domen, TM transmembranski domen – od kojih oba potiču od MDL-1 proteinske sekvence, u kombinaciji sa EC (extracellular - vanćelijskim) domenom od hPGLYRP1.
KRATAK OPIS SEKVENCI
[0014]
SEK ID BR: 1 predstavlja aminokiselinsku sekvencu peptidne sekvence zrelog, u punoj dužini hPGLYRP1.
SEK ID BR: 2 predstavlja sekvencu rekombinantnog proteina koja sadrži sledeće elemente: humani TREM-1 ECD, peptid veznik, humani TREM-1 ECD, humani Fc alotip IgG1 sa 7 mutacija koje se razlikuju od divljeg tipa. (L15A, L16E, G18A, A111S, P112S, D137E, L139M)
SEK ID BR: 3 predstavlja humani Fc alotipa IgG1 sa 5 mutacija koje se razlikuju od divljeg tipa: L15A,L16E,G18A,A111S,P112S.
SEK ID BR: 4 predstavlja sekvencu rekombinantnog proteina koja sadrži sledeće elemente od N do C terminusa: 6xHIS oznaka, dve kopije streptavidin vezujućeg proteinskog domena (streptavidin binding protein - SBP), GS veznik, C terminus oligomernog proteina hrskavice (cartilage oligomeric protein - COMP), GS veznik, hDCIR-ECD.
SEK ID BR: 5 predstavlja sekvencu rekombinantnog proteina koja sadrži sledeće elemente: hTREM-1-ECD , GS veznik, C terminus oligomernog proteina hrskavice (COMP), GS veznik, dve kopije streptavidin vezujućeg proteinskog domena (SBP), 6xHIS oznaka.
SEK ID BR: 6 predstavlja sekvencu rekombinantnog proteina koja sadrži sledeće elemente po redosledu od N do C terminusa, humani CD83 ECD, G4Sx3 peptid veznik, humani CD83 ECD, mutant Fc humanog alotipa IgG1.
SEK ID BR: 7 predstavlja humani PGLYRP1 u punoj dužini koja kodira cDNK sekvencu sa C terminalnom GPI signalnom sekvencom. Ova sekvenca je klonirana u pcDNA3.1zeo(+) (Invitrogen: V860-20, Karlsbad, Kalifornija, SAD) preko EcoR1 i Xho1 restrikcionih mesta.
SEK ID BR: 8 predstavlja zreli hTREM-1 ECD u punoj dužini (ak.21-200).
SEK ID BR: 9 predstavlja cDNK za CD33 vodeće tandemske hTREM vanćelijske domene razdvojene pomoću G4Sx3 veznika. Sintetička cDNK sa 5' EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvenca CD33 vodeća sekvenca praćena vanćelijskim domenom humanog TREM-1 (ak17-200) sa umetnutim Kpnl restrikcionim mestom i glicin-glicinglicin-serin razdvojnikom ponovljenim tri puta (G4Sx3) praćeno sa dodatnom kopijom vanćelijskog domena humanog TREM-1 (ak17-200) i Apa1 mesto da bi se dozvolilo kloniranje.
SEK ID BR: 10 predstavlja pentamerni hTREM-COMP-SBP38x2-6HIS. EcoR1 mesto i Kozak su 5' i BamH1 mesto je 3' iz ORF.
SEK ID BR: 11 predstavlja hCD83 tetramer kloniran u pJSV002-hFc6mut vektor sa EcoR1 i Apa1.EcoR1 mesto i Kozak su 5' i Apa1 mesto je 3' iz ORF.
SEK ID BR: 12 predstavlja pentamerni 6HIS-SBP38x2-COMP-hDCIR. EcoR1 mesto i Kozak 5' i BamH1 3' iz ORF.
SEK ID BR: 13 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F36, mAb 0182).
SEK ID BR: 14 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F36, mAb 0182).
SEK ID BR: 15 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F36,mAb 0182).
SEK ID BR: 16 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F36,mAb 0182).
SEK ID BR: 17 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F10).
SEK ID BR: 18 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F10).
SEK ID BR: 19 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F10).
SEK ID BR: 20 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F10).
SEK ID BR: 21 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F105, mAb 0184).
SEK ID BR: 22 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F105, mAb 0184).
SEK ID BR: 23 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F105, mAb 0184).
SEK ID BR: 24 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F105, mAb 0184).
SEK ID BR: 25 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F95).
SEK ID BR: 26 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F95).
SEK ID BR: 27 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F95).
SEK ID BR: 28 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (1F95).
SEK ID BR: 29 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F5).
SEK ID BR: 30 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F5).
SEK ID BR: 31 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F5).
SEK ID BR: 32 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F5).
SEK ID BR: 33 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F7).
SEK ID BR: 34 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F7).
SEK ID BR: 35 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog teškog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F7).
SEK ID BR: 36 predstavlja aminokiselinsku sekvencu varijabilnog lakog lanca monoklonskog PGLYRP1 antitela (2F7).
SEK ID BR: 37 predstavlja aminokiselinsku sekvencu Tipa II 1.0 PGLYRP1.
SEK ID BR: 38 predstavlja aminokiselinsku sekvencu Tipa II 2.0 PGLYRP1.
SEK ID BR: 39 predstavlja aminokiselinsku sekvencu epitopske oznake.
SEK ID BR: 40 predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog PGLYRP2 u punoj dužini.
SEK ID BR: 41 predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog PGLYRP3 u punoj dužini.
SEK ID BR: 42 predstavlja aminokiselinsku sekvencu humanog PGLYRP4 u punoj dužini.
SEK ID BR: 43 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline hCD33-hTrem1 ECD(ak17-200)-Fc6mut.
SEK ID BR: 44 predstavlja aminokiselinsku sekvencu hCD33-hTrem1 ECD(ak17-200)-Fc6mut.
SEK ID BR: 45 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline za hCD33-hTremL1 ECD(ak16-162)-Fc6mut.
SEK ID BR: 46 predstavlja aminokiselinsku sekvencu hCD33-hTremL1 ECD(ak16-162)-Fc6mut.
SEK ID BR: 47 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline za hCD33-hTremL2 ECD(ak19-268)-Fc6mut.
SEK ID BR: 48 predstavlja aminokiselinsku sekvencu hCD33-hTremL2 ECD(ak19-268)-Fc6mut
SEK ID BR: 49 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline hCD33-hTREM2-Fc6mut dimera
SEK ID BR: 50 predstavlja aminokiselinsku sekvencu hCD33-hTREM2-Fc6mut dimera.
SEK ID BR: 51 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline prajmera.
SEK ID BR: 52 predstavlja sekvencu nukleinske kiseline prajmera.
SEK ID BR: 53 predstavlja aminokiselinsku sekvencu od hCD33.
OPIS
[0015] Pronalazak se odnosi na metodu za identifikaciju molekula kao što su antitela koja su sposobna da specifično vezuju signalni partner od TREM-1, ovde identifikovan kao PGLYRP1, i deluju na PGLYRP1 vezivanje sa njegovim signalnim partnerom, TREM-1. PGLYRP1 može biti korišćen za modifikovanje aktivnosti TREM-1. Stoga, pronalazak se odnosi na molekule, kao što su antitela, koja deluju na inflamatorne odgovore koji su posredovani pomoću PGLYRP1. Antitela koja su sposobna da se vezuju za PGLYRP1 i koja deluju na TREM-1 aktivaciju i signaliziranje su napravljena i identifikovana.
[0016] Metoda ili test za identifikaciju liganda za TREM-1 i za identifikaciju molekula, kao što su antitela, koja su sposobna za specifično vezivanje PGLYRP1 i smanjivanje ili blokiranje PGLYRP1 aktivacije TREM-1 mogu biti kreirani kao što sledi:
Prva ćelija ili populacija prvih ćelija je transfektovana sa genima koji kodiraju TREM-1 ili njegove fragmente, signalni protein i reporterski konstrukt. Ćelija može biti hematopoetskog porekla, kao što je mijeloidna ćelija, to može biti T-ćelija ili može biti bilo koji drugi ćelijski tip koji je sposoban da se transfektuje i koji eksprimira takve molekule. Signalni protein može biti bilo koji protein koji je sposoban da prenosi ili sprovodi signal, bilo direktno ili indirektno, od TREM-1 do reporterskog konstrukta i može da uključi DAP10, DAP12, TCR zeta, Fc gamaRIII, Fc receptor, ili bilo koji drugi protein koji je sposoban da prenosi ili sprovodi signal od TREM-1 do reporterskog konstrukta. Alternativno, signalni protein može biti TREM-1/signalni himeramolekul. Reporterski konstrukt sadrži transkripcioni faktor i reporter gen, koji redom kodira reporter protein koji proizvodi detektabilni signal, kao što je signal koji je moguće kvantifikovati. Transkripcioni faktor može biti NFAT ili NFkB ili bilo koji drugi pogodni transkripcioni faktor poznat u oblasti. Reporter gen može da kodira beta (β)-galaktozidazu, luciferazu, zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol transferazu ili bilo koji drugi reporterski protein sposoban za proizvodnju detektabilnog signala. Jedna pogodna linija koja može biti korišćena za ovaj biološki test je BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ T-ćelija (ovde takođe identifikovana kao "BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija"), čije stvaranje je opisano detaljno u primerima. Kada je aktivirana, BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija proizvodi beta (β)-galaktozidazu, čija proizvodnja može biti izmerena korišćenjem opreme ili kompleta poznatih u oblasti, kao što je Beta Glow™ (Promega E4720, Medison, Viskonsin, SAD).
[0017] Prva ćelija ili populacija prvih ćelija može biti aktivirana inkubacijom sa PGLYRP1 i, po izboru, agensom za multimerizaciju. Opcioni agens za multimerizaciju deluje kao skela za PGLYRP1 i može biti peptidoglikan (PGN), neutrofilne vanćelijske zamke (neutrophil extracellular traps - NETs), hijaluronska kiselina, proteoglikanska struktura kao što je verzikan, agrekan, dekorin ilil fibrin, ili bilo koja druga matriksna struktura koja se javlja u prirodi ili molekul koji je sposoban da multimerizuje ili prikazuje PGLYRP1. Prva ćelija može biti aktivirana inkubacijom sa jednom ili više drugih ćelija (ćelijom) koje eksprimiraju PGLYRP1 na njenoj/njihovoj površini, ili unutarćelijski. Primer unutarćelijske ekspresije može biti skladištenje PGLYRP1 u sekretornim granulama. Druga ćelija može biti prema tome bilo koja ćelija (ili populacija ćelija) koja eksprimira ili je transfektovana sa genom koji kodira PGLYRP1 i koji eksprimira PGLYRP1 na svojoj površini. Takva druga ćelija može biti prokariotska ili eukariotska ćelija, kao što je ćelija sisara, kao što je CHO ćelija, BHK ćelija ili HEK ćelija. Druga ćelija može takođe biti aktivirani neutrofil. Neutrofili mogu biti dobijeni iz pune krvi ili tkiva pojedinca i korišćeni ili u smeši ili kao prečišćeni neutrofili. Bilo koji agens koji imitira bakterijsku aktivaciju neutrofila, kao što je peptidoglikan (PGN) iz ćelijskog zida bakterije, kao što je PGN-SA, PGN-EB, PGN-EC, PGN-BS (InVivogen, tlrlpgnsa, San Dijego, Kalifornija), može biti korišćen da se aktivira neutrofil.
[0018] Aktivnost prve ćelije ili populacija prvih ćelija je zatim detektovana i, poželjno, izmerena.
[0019] Kultura prve ćelije i druge ćelije(a) koja eksprimira PGLYRP1 i/ili kultura prve ćelije inkubirane sa PGLYRP1 i, po izboru, agensom za multimerizaciju kao što je PGN, je u kontaktu sa antitelom koje je aktivirano na PGLYRP1. Aktivnost prve ćelije ili populacije prvih ćelija je detektovana, i poželjno izmerena.
[0020] Na ovaj način, antitela koja su sposobna za vezivanje liganda za TREM-1, PGLYRP1, i koja utiču na interakciju PGLYRP1 sa TREM-1 mogu biti identifikovana. PGLYRP1 antitela koja uzrokuju porast u aktivnosti prve ćelije pojačavaju interakciju PGLYRP1 sa TREM-1 i ovde su identifikovana kao "stimulirajuća PGLYRP1 antitela". PGLYRP1 antitela koja uzrokuju smanjenje aktivnosti prve ćelije smanjuju, ometaju, ili blokiraju interakciju PGLYRP1 sa TREM-1 i ovde su identifikovana kao "inhibitorna PGLYRP1 antitela". Inhibitorna PGLYRP1 antitela smanjuju ili blokiraju TREM-1 aktivaciju i signalizaciju.
[0021] Stoga, predmetni pronalazak se odnosi na metodu za karakterizaciju funkcije PGLYRP1 antitela. Antitela sposobna za specifično vezivanje PGLYRP1 i koja imaju bilo kakav efekat na TREM-1 aktivaciju i nizvodnu signalizaciju su ovde označena kao "funkcionalna PGLYRP1 antitela". Stoga, termin "funkcionalna PGLYRP1 antitela" bi trebalo da obuhvati i stimulirajuća PGLYRP1 antitela i inhibitorna PGLYRP1 antitela.
[0022] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja su sposobna za specifično vezivanje PGLYRP1 i smanjivanje, ometanje, ili blokiranje njegove interakcije sa TREM-1, stoga smanjujući TREM-1 aktivaciju i nizvodnu signalizaciju. Antitela pronalaska mogu imati imunoregulatornu funkciju, smanjujući proizvodnju citokina mijeloidnih ćelija koje eksprimiraju TREM-1. Na primer, antitela pronalaska mogu smanjiti ili sprečiti oslobađanje TNF-alfa (α), IL-1beta(b),IL-6, IFN-gama (γ), MIP-1beta (b), MCP-1, IL-8 i/ili GM-CSF iz mijeloidnih ćelija kao što su makrofagi i/ili neutrofili i/ili mijeloidne ćelije u obolelim tkivima kao što je sinovijalno tkivo. Antitela pronalaska mogu biti sposobna da negativno regulišu odgovore neutrofila.
[0023] PGLYRP1 antitela u skladu sa pronalaskom mogu smanjiti ili blokirati TREM-1 aktivaciju pomoću jednog od ili kombinacije nekoliko različitih mehanizama, delujući na TREM-1 direktno ili indirektno. Antitela pronalaska mogu sprečiti PGLYRP1 da stvore funkcionalni kompleks sa TREM-1.
[0024] Antitela pronalaska mogu blokirati PGLYRP1 funkciju smanjivanjem ili blokiranjem TREM-1 aktivacije i nizvodne signalizacije.
[0025] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na inhibitorna PGLYRP1 antitela koja mogu biti identifikovana drugačijim načinima od metode koja je ovde stavljena na uvid javnosti.
[0026] Antitela pronalaska mogu biti sposobna za vezivanje i humanog PGLYRP1 i PGLYRP1 iz vrste drugačije od ljudskog bića. Termin "PGLYRP1", kao što je ovde korišćeno, stoga obuhvata bilo koji oblik koji se prirodno javlja od PGLYRP1 koji može biti izveden iz bilo kog pogodnog organizma, kao što je vrsta beskičmenjaka ili vrsta kičmenjaka. PGLYRP1 za primenu kao što je ovde korišćeno može biti PGLYRP1 kičmenjaka, kao što je PGLYRP1 sisara, kao što je PGLYRP1 iz primata (kao što je čovek, šimpanza, cinomolgus majmun ili rezus majmun); glodara (kao što je miš ili pacov), lagomorfa (kao što je zec), ili artiodaktila (kao što je krava, ovca, svinja ili kamila), između ostalih. Poželjno, PGLYRP1 je humani PGLYRP1 (SEK ID BR: 1). PGLYRP1 može biti zreli oblik PGLYRP1 kao što je PGLYRP1 protein koji je podvrgnut post-translacionoj obradi unutar pogodne ćelije. Takav zreli PGLYRP1 protein može, na primer, biti glikozilovan. PGLYRP1 može biti PGLYRP1 protein u punoj dužini. PGLYRP1 može biti splajsna varijanta.
[0027] Antitela pronalaska mogu takođe biti sposobna za specifično vezivanje varijanti PGLYRP1 kao što je SEK ID BR: 37 (Tip II 1.0 PGLYRP1) i/ili SEK ID BR: 38 (Tip II 1.0 PGLYRP1).
[0028] Antitela pronalaska mogu biti sposobna za uticanje, kao što je inhibiranje/smanjivanje/blokiranje, aktivnosti (signalizacija i/ili aktivacija) i humanog TREM-1 i TREM-1 iz neke druge vrste osim ljudskog bića. Termin "TREM-1", kao što je ovde korišćeno, stoga obuhvata bilo koji oblik TREM-1 koji se prirodno javlja koji može biti izveden iz bilo kog pogodnog organizma. Na primer, TREM-1 za primenu kao što je ovde opisano može biti TREM-1 kičmenjaka, kao što je TREM-1 sisara, kao što je TREM-1 iz primata (kao što je čovek, šimpanza, cinomolgus majmun ili rezus majmun); glodara (kao što je miš ili pacov), lagomorfa (kao što je zec), ili artiodaktila (kao što je krava, ovca, svinja ili kamila), između ostalih. Poželjno, TREM-1 je humani TREM-1. TREM-1 može biti zreli oblik od TREM-1 kao što je TREM-1 protein koji je podvrgnut post-translacionoj obradi unutar pogodne ćelije. Takav zreli TREM-1 protein može, na primer, biti glikozilovan. TREM-1 može biti TREM-1 protein u punoj dužini. TREM-1 može biti splajsna varijanta.
[0029] Termin "antitelo" ovde se odnosi na protein, izveden iz germinativne imunoglobulinske sekvence, koji je sposoban za specifično vezivanje za PGLYRP1 ili njegov deo. Termin obuhvata antitela u punoj dužini bilo kog izotipa (to jest, IgA, IgE, IgG, IgM i/ili IgY) i bilo koji njihov pojedinačni lanac ili fragment. Antitelo koje se specifično vezuje za PGLYRP1, ili njegov deo, može se vezati isključivo za PGLYRP1, ili njegov deo, ili se može vezati za ograničen broj homologih antigena, ili njihovih delova.
[0030] Antitela pronalaska mogu biti monoklonska antitela, u smislu da ona mogu biti direktno ili indirektno izvedena iz pojedinačnog klona B limfocita. Antitelo pronalaska može biti monoklonsko antitelo, pod uslovom da to nije 188C424 (Thermo Scientific), 4H230 ili 9A319 (US Biological) ili Klon 6D653 (Santa Cruz Biotechnology).
[0031] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti izolovana. Termin "izolovano antitelo" odnosi se na antitelo koje je odvojeno i/ili obnovljeno iz druge/drugih komponente(i) njegove prirodne sredine i/ili prečišćeno iz mešavine komponenti u svom prirodnom okruženju.
[0032] Antitela mogu biti rekombinantno eksprimirana u prokariotskim ćelijama, eukariotskim ćelijama ili acelularnom sistemu izvedenom iz ćelijskih ekstrakata. Prokariotska ćelija može biti E. coli. Eukariotska ćelija može biti ćelija kvasca, insekta ili sisara, kao što je ćelija izvedena iz organizma koji je primat (kao što je čovek, šimpanza, cinomolgus majmun ili rezus majmun), glodar (kao što je miš ili pacov), lagomorf (kao što je zec), ili artiodaktil (kao što je krava, ovca, svinja ili kamila). Pogodne ćelijske linije sisara uključuju, ali nisu ograničene na, HEK293 ćelije, CHO ćelije i HELA ćelije. PGLYRP1 antitela mogu takođe biti proizvedena pomoću drugih metoda poznatih prosečnom poznavaocu oblasti, kao što je fagni displej ili displej kvasca. Antitela pronalaska mogu biti aktivirana in vivo imunizovanjem pogodnog sisara sa PGLYRP1, ćelijom koja eksprimira PGLYRP1 ili kombinacijom oba.
[0033] PGLYRP1 antitela mogu biti proizvedena, testirana i prečišćena korišćenjem, na primer, metoda opisanih u Primerima. Ukratko, pogodni miš, uključujući PGLYRP1 nokaut (knockout - KO) miša ili TREM-1 KO miša, može biti imunizovan sa PGLYRP1, ćelijom koja eksprimira PGLYRP1 ili kombinacijom oba. Primarno ispitivanje supernatanata hibridoma može biti izvedeno korišćenjem direktne ELISA ili FMAT i sekundarno ispitivanje može biti izvedeno korišćenjem protočne citometrije. Pozitivni supernatanti hibridoma, kao i prečišćena antitela, mogu zatim biti ispitana na vezivanje za, na primer, PGLYRP1 u punoj dužini. Pozitivni supernatanti hibridoma ili prečišćena antitela mogu zatim biti ispitana na njihovu sposobnost da smanje ili blokiraju PGLYRP1-stimulaciju ćelija koje nose TREM-1. Metoda predmentog pronalaska može biti korišćena u ovu svrhu.
[0034] Antitela pronalaska u punoj dužini mogu da sadrže najmanje četiri polipeptidna lanca: to jest, dva teška (heavy - H) lanca i dva laka (L) lanca koja su međusobno povezana disulfidnim vezama. Jedna pod-klasa imunoglobulina od posebnog farmaceutskog interesa je IgG familija, koja može biti dalje podeljena na izotipove IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. IgG molekuli su sastavljeni od dva teška lanca, međusobno spojena pomoću dve ili više disulfidnih veza, i dva laka lanca, od kojih je svaki zakačen za teški lanac pomoću disulfidne veze. Teški lanac može da sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i do tri konstantna regiona teškog lanca (CH): CH1, CH2 i CH3. Laki lanac može da sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) i konstantni region lakog lanca (CL). VH i VL regioni mogu biti dodatno podeljeni u regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (complementarity determining regions - CDR regioni), koji su isprekidani regionima koji su više konzervirani, nazvanim okvirni regioni (framework regions - FR). VH i VL regioni su tipično sastavljeni od tri CDR regiona i četiri FR regiona, uređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Hipervarijabilni regioni teških i lakih lanaca formiraju [vezujući] domen koji je sposoban za interakciju sa antigenom (PGLYRP1), dok konstantni region antitela može da posreduje u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući ali bez ograničenja na razne ćelije imunskog sistema (efektorske ćelije), Fc receptore i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0035] Primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (tipično VL i VH domeni pojedinačnog kraka antitela), jednolančani Fv (scFv; videti npr. Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; i Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (tipično VH i CHI domen), i dAb (tipično VH domen) fragmente; VH, VL, VhH, i V-NAR domene; monovalente molekule koji sadrže pojedinačni VH i pojedinačni VL lanac; minitela, diatela, triatela, tetratela, i kapa tela (videti, npr. , III et al.. Protein Eng 1997;10:949-57); camel IgG; IgNAR; kao i jedan ili više izolovanih CDR regiona ili funkcionalni paratop, gde izolovani CDR regioni ili antigen-vezujući ostaci ili polipeptidi mogu biti udruženi ili povezani zajedno tako da formiraju funkcionalni fragment antitela. Razni tipovi fragmenata antitela su opisani ili prikazani u, npr., Holliger i Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, i objavljenim Američkim patentnim prijavama 20050238646 i 20020161201.
[0036] Određeni antigen-vezujući fragmenti antitela mogu biti pogodni u kontekstu predmetnog pronalaska, jer je pokazano da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvedena pomoću fragmenata antitela u punoj dužini. Termin "antigen-vezujući fragment" antitela odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen, kao što je humani PGLYRP1 ili PGLYRP1 iz druge vrste, kao što je ovde korišćeno. Primeri antigen-vezujućih fragmenata uključuju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)S, Fv (tipično VL i VH domene pojedinačnog kraka antitela), jednolančani Fv (scFv; videti npr. Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; i Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (tipično VH i CHI domen), i dAb (tipično VH domen) fragmente; VH, VL, VhH, i V-NAR domene; monovalentne molekule koji sadrže pojedinačni VH i pojedinačni VL lanac; minitela, diatela, triatela, tetratela, i kapa tela (videti, npr. , III et al.. Protein Eng 1997;10:949-57); IgG kamile; IgNAR; kao i jedan ili više izolovanih CDR regiona ili fukcionalni paratop, gde izolovani CDR regioni ili antigen-vezujući ostaci ili polipeptidi mogu biti udruženi ili povezani zajedno tako da formiraju fukcionalni fragment antitela. Razni tipovi fragmenata antitela su opisani ili prikazani u, npr., Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, i objavljenim Američkim patentnim prijavama 20050238646 i 20020161201. Ovi fragmenti antitela mogu biti dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika koje su poznate prosečnim poznavaocima oblasti, i fragmenti mogu biti ispitani da li su korisni na isti način kao intaktna antitela.
[0037] Antitelo pronalaska može biti antitelo čoveka ili humanizovano antitelo. Termin "humano antitelo", kao što je ovde korišćeno, bi trebalo da uključi antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su najmanje deo okvirnog regiona i/ili najmanje deo CDR regiona izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. (Na primer, humano antitelo može imati varijabilne regione u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci.) Pored toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela pronalaska mogu da uključe aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani pomoću humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci (npr., mutacije uvedene pomoću nasumične ili mesto-specifične mutageneze in vitro ili pomoću somatske mutacije in vivo).
[0038] Takvo humano antitelo može biti humano monoklonsko antitelo. Takvo humano monoklonsko antitelo može biti proizvedeno pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju koja je dobijena iz transgene životinje koja ne pripada ljudskoj vrsti, npr., transgeni miš, koji ima genom koji sadrži humani transgen teškog lanca i transgen lakog lanca koji je spojen sa imortalizovanom ćelijom.
[0039] Humana antitela mogu biti izolovana iz biblioteka sekvenci sagrađenih na selekcijama humanih germinativnih sekvenci, dalje modifikovanih raznovrsnošću prirodnih i sintetičkih sekvenci.
[0040] Humana antitela mogu biti pripremljena pomoću in vitro imunizacije humanih limfocita praćeno sa transformacijom limfocita sa Epštajn-Bar virusom.
[0041] Termin "derivat humanog antitela" odnosi se na bilo koji modifikovani oblik humanog antitela, kao što je konjugat antitela ili drugi agens ili antitelo.
[0042] Termin "humanizovano antitelo", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na humano/nehumano himerno antitelo koje sadrži jednu ili više sekvenci (CDR regioni) izvedenih iz nehumanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo je, prema tome, humani imunoglobulin (antitelo primaoca) u kome su najmanje ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona ne-humane vrste (antitelo donora) kao što je iz miša, pacova, zeca, ili ne-humanog primata, koji ima željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim slučajevima, FR ostaci humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Primer takve modifikacije je uvođenje jedne ili više takozvanih povratnih mutacija.
[0043] Pored toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu pronađeni u antitelu primaoca ili u antitelu donora. Ove modifikacije su načinjene da dalje poboljšaju performanse antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo će sadržati najmanje jedan - tipično dva - varijabla domena, u kojima svi ili u suštini svi CDR regioni odgovaraju onima od nehumanog imunoglobulina i u kojima su svi ili u suštini svi FR ostaci oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo može, po izboru, takođe sadržati bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), tipično onog iz humanog imunoglobulina.
[0044] Termin "derivat humanizovanog antitela" odnosi se na bilo koji modifikovani oblik humanizovanog antitela, kao što je konjugat antitela ili drugi agens ili antitelo.
[0045] Termin "himerno antitelo", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na antitelo čiji su geni lakog i teškog lanca konstruisani, tipično genetičkim inženjeringom, od gena varijabilnog i konstantnog regiona imunoglobulina koji potiču od različitih vrsta, Na primer, varijabilni segmenti gena iz mišjeg monoklonskog antitela mogu biti spojeni sa humanim konstantnim segmentima.
[0046] Region kristalizirajućeg fragmenta ("Fc region"/"Fc domen") antitela je N-terminalni region antitela, koji sadrži konstantne CH2 i CH3 domene. Fc domen može da interaguje sa receptorima na površini ćelije koji su nazvani Fc receptori, kao i nekim proteinima sistema komplementa. Fc region omogućava antitelima da interaguju sa imunskim sistemom. U jednom aspektu pronalaska, antitela mogu biti projektovana tako da uključe modifikacije unutar Fc regiona, tipično da menjaju jednu ili više njegovih funkcionalnih svojstava, kao što je polu-život u serumu, fiksiranje komplementa, vezivanje Fc-receptora, stabilnost proteina i ili ćelijska citotoksičnost zavisna od antigena, ili nedostatak istog, između ostalog. Pored toga, antitelo pronalaska može biti hemijski modifikovano (npr., jedna ili više hemijskih grupa mogu biti vezane za antitelo) ili se modifikuje da bi se promenila njegova glikozilacija, ponovo da bi se promenila jedna ili više fukcionalnih osobina antitela. Poželjno, modifikovani Fc domen sadrži jednu ili više, a možda sve od sledećih mutacija koje će rezultirati smanjenim afinitetom za određene Fc receptore (L234A, L235E, i G237A) i u smanjenoj C1q-posredovanoj fiksaciji komplementa (A330S i P331S), redom (numerisanje ostatka u skladu sa EU indeksom).
[0047] Izotip antitela pronalaska može biti IgG, kao što je IgG1, kao što je IgG2, kao što je IgG4. Ako je poželjno, klasa antitela može biti "promenjena" poznatim tehnikama. Na primer, antitelo koje je originalno proizvedeno kao IgM molekul može biti klase koja je promenjena u IgG antitelo. Tehnike za promenu klasa takođe mogu biti korišćene da se konvertuje jedna IgG podklasa u drugu, na primer: od IgG1 do IgG2 ili IgG4; od IgG2 do IgG1 ili IgG4; ili od IgG4 do IgG1 ili IgG2. Inženjering antitela za stvaranje himernih molekula sa konstantnim regionom, kombinovanjem regiona iz različitih podklasa IgG, takođe se može izvesti.
[0048] U jednom tehničkom rešenju, zglobni region od CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih ostataka u zglobnom regionu izmenjen, npr., povećan ili smanjen. Ovaj pristup je opisan dalje na primer u Američkom patentu br.5,677,425 od strane Bodmer et al.
[0049] Konstantni region može biti dalje modifikovan da stabilizuje antitelo, npr., da smanji rizik da se bivalentno antitelo razdvaja u dva monovalentna VH-VL fragmenta. Na primer, u konstantnom regionu IgG4, ostatak S241 može biti mutiran u prolinski (P) ostatak da se dozvoli formiranje kompletnog disulfidnog mosta na zglobu (videti, npr., Angal et al., Mollmmunol. 199S; 30:105-8).
[0050] Antitela ili njihovi fragmenti mogu takođe biti definisani u pogledu njihovih regiona koji određuju komplementranost (CDR regioni). Termin "region koji određuje komplementranost " ili "hipervarijabilni region", kada je korišćen ovde, odnosi se na regione antitela u kojima se nalaze aminokiselinski ostaci uključeni u vezivanje antigena. CDR regioni se generalno sastoje od aminokiselinskih ostataka 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; (Kabatet al. (1991) Sequences of Proteins of Imunological Interest, Peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH objava br.91-3242) i/ili ti ostaci formiraju "hipervarijabilnu petlju" (ostaci 26-32 (L1), 50-52 (L2) i 91-96 (L3) u varijabilnom domenu lakog lanca i 26-32 (H1), 53-55 (H2) i 96-101 (H3) u varijabilnom domenu teškog lanca; Chothia i Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Tipično, numerisanje aminokiselinskih ostataka u ovom regionu je izvedeno pomoću metode opisane u Kabatet al., iznad. Fraze kao što je "Kabat pozicija", "Kabat ostatak", i "u skladu sa Kabat-om" ovde se odnosi na sistem numerisanja za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca. Korišćenjem Kabat-ovog sistema numerisanja, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca peptida može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju, ili inserciji u, okvirni region (FR) ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključi aminokiselinske insercije (ostatak 52a, 52b i 52c u skladu sa Kabat-om) posle ostatka 52 iz CDR H2 i insertovane ostatke (npr. ostaci 82a, 82b, i 82c, itd., u skladu sa Kabat-om) posle ostatka 82 FR teškog lanca. Numerisanje ostataka prema Kabatu može biti određeno za dato antitelo ravnanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom numerisanom po Kabat-u.
[0051] Termin ostaci "okvirnog regiona" ili "FR" ostaci se odnosi na one VH ili VL aminokiselinske ostatke koji nisu u okviru CDR regiona, kao što je ovde definisano.
[0052] Antitelo pronalaska može da sadrži CDR region iz jednog ili više specifičnih antitela ovde stavljenih na uvid javnosti, kao što je CDR region unutar SEK ID BRojevima: 15, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 35 ili 36.
[0053] 1F36 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 15 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 16. Antitelo pronalaska može da sadrži ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. 1F36 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 66 i 98 do 108 iz SEK ID BR: 15 i aminokiseline 24 do 34, 51 do 56 i 89 do 97 iz SEK ID BR: 16. Antitelo pronalaska može da sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.
[0054] Antitelo u skladu sa pronalaskom može da sadrži: CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (SYWMN) iz SEK ID BR: 15, gde jedan od ovih amonokiselinskih ostataka može biti supstituisan pomoću različitog aminokiselinskog ostatka; i/ili CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (MIHPSDSETRLNQKFKD) iz SEK ID BR: 15, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 98 do 108 (DYSDYDGFAY]) iz SEK ID BR: 15, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0055] Antitelo u skladu sa pronalaskom može da sadrži: CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 34 (RASQSISDYLH) iz SEK ID BR: 16, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 51 do 56 (ASQSIS) iz SEK ID BR: 16, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 89 do 97 (QNGHSFPLT) iz SEK ID BR: 16, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0056] 1F10 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 19 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 20. Antitelo pronalaska može sadržati ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. 1F10 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 66 i 99 do 109 iz SEK ID BR: 19 i aminokiseline 24 do 33, 49 do 55 i 88 do 96 iz SEK ID BR: 20. Antitelo pronalaska može sadržati 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.
[0057] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DYNMY) iz SEK ID BR: 19, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (YIDPYNGDTSYNQKFKG) iz SEK ID BR: 19, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 109 (GDYGNPFYLDY) iz SEK ID BR: 19, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0058] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 33 (SVSSSVNYMY) iz SEK ID BR: 20, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 49 do 55 (DTSKLPS) iz SEK ID BR: 20, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 88 do 96 (QQWTSNPPT) iz SEK ID BR: 20, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0059] 1F105 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 23 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 24. Antitelo pronalaska može sadržati ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. 1F105 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 66 i 99 do 108 iz SEK ID BR: 23 i aminokiseline 24 do 33, 49 do 55 i 88 do 96 iz SEK ID BR: 24. Antitelo pronalaska može sadržati 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.
[0060] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35(DTYIH) iz SEK ID BR: 23, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (RIDPANDDTKYDPNFQG) iz SEK ID BR: 23, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 108 (SDNSDSWFAY) iz SEK ID BR: 23, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0061] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 33 (SVSSSVNFMN) iz SEK ID BR: 24, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 49 do 55 (DTSKLAP) iz SEK ID BR: 24, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 88 do 96 (HQWSSYSLT) iz SEK ID BR: 24, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0062] 1F95 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 27 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 28. Antitelo pronalaska može sadržati ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. 1F95 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 66 i 99 do 106 iz SEK ID BR: 27 i aminokiseline 24 do 33, 49 do 54 i 87 do 95 iz SEK ID BR: 28. Antitelo pronalaska može sadržati 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.
[0063] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DYNMH) iz SEK ID BR: 27, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG) iz SEK ID BR: 27, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 106 (EVPYYFDY) iz SEK ID BR: 27, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0064] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 33 (VASSSVTYMY) iz SEK ID BR: 28, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 49 do 54 (THPLAS) iz SEK ID BR: 28, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 87 do 95 (PHWNTNPPT) iz SEK ID BR: 28, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0065] 2F5 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 31 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 32. Antitelo pronalaska može sadržati ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. 2F5 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 66 i 99 do 109 iz SEK ID BR: 31 i aminokiseline 24 do 33, 49 do 55 i 88 do 96 iz SEK ID BR: 32. Antitelo pronalaska može sadržati 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.
[0066] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DYYMY) iz SEK ID BR: 31, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (AISDDSTYTYYPDSVKG) iz SEK ID BR: 31, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 109 (GGYGNLYAMDY) iz SEK ID BR: 31, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0067] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 35 (TASSSVSSSYLH) iz SEK ID BR: 32, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 51-57 (STSNLAS) iz SEK ID BR: 32, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 90-98 (HQYHRSPFT) iz SEK ID BR: 32, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0068] 2F7 antitelo ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 35 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 36. Antitelo pronalaska može sadržati ovu varijabilnu sekvencu teškog lanca i/ili ovu varijabilnu sekvencu lakog lanca. 2F5 antitelo ima CDR sekvence prikazane na aminokiselinama 31 do 35, 50 do 66 i 99 do 109 iz SEK ID BR: 35 i aminokiseline 24 do 34, 50 do 56 i 89 do 96 iz SEK ID BR: 36. Antitelo pronalaska može sadržati 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od ovih CDR sekvenci.
[0069] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (NYVMH) iz SEK ID BR: 35, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (WINPFNDGTNYNENFKN) iz SEK ID BR: 35, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina može biti supstituisana različitim aminokiselinskim ostatkom; i/ili CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 109 (SGFITTLIEDY) iz SEK ID BR: 35, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0070] Antitelo u skladu sa pronalaskom može sadržati: CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 34 (KASESVGSFVS) iz SEK ID BR: 36, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 50 do 56 (GASNRYT) iz SEK ID BR: 36, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom; i/ili CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 89 do 96 (GQYYTHPT) iz SEK ID BR: 36, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka može biti supstituisan različitom aminokiselinom.
[0071] Termin "antigen" (Ag) odnosi se na molekularni entitet korišćen da se imunizuje imunokompetentni kičmenjak da proizvede antitelo (Ab) koje prepoznaje Ag (antigen). Ovde, Ag je nazvan i šire i generalno bi trebalo da uključi ciljne molekule koji su specifično prepoznati od strane Ab, tako uključujući fragmente ili podražavanja molekula korišćenog u procesu imunizacije, ili drugom procesu, npr. fagnom displeju, koji se koristi za generisanje Ab.
[0072] Termin "epitop", kao što je ovde korišćeno, je definisan u kontekstu molekularne interakcije između "antigen vezujućeg polipeptida", kao što je antitelo (Ab), i njegov odgovarajući antigen (Ag). Generalno, "epitop" se odnosi na oblast ili region na Ag za koji se Ab specifično vezuje, tj. oblast ili region u fizičkom kontaktu sa Ab. Fizički kontakt može biti definisan korišćenjem raznih kriterijuma (npr., granice rastojanja od 2-6Å, kao što je 3Å, kao što je 4 Å, kao što je 5Å; ili dostupnost rastvarača) za atome u Ab i Ag molekulima. Proteinski epitop može sadržati aminokiselinske ostatke u Ag koji su direktno uključeni u vezivanje za Ab (takođe nazvani imunodominantna komponenta epitopa) i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanje, kao što su aminokiselinski ostaci od Ag koji su efikasno blokirani pomoću Ab, tj. aminokiselinski ostaci u okviru "površine bez rastvarača" i/ili "otiska" od Ab.
[0073] Termin epitop ovde sadrži oba tipa vezujućeg regiona u bilo kom posebnom regionu od PGLYRP1 koje se specifično vezuje za PGLYRP1 antitelo. PGLYRP1 može sadržati nekoliko različitih epitopa, koji mogu uključiti, bez ograničenja, konformacione epitope koji se sastoje od jedne ili više ne-susednih aminokiselina koje se nalaze jedna blizu druge u konformaciji zrelog PGLYRP1 i post-translacione epitope koji se sastoje, bilo u celini ili delom, od molekularnih struktura kovalentno prikačenih za PGLYRP1, kao što su ugljenohidratne grupe. PGLYRP1 može takođe da sadrži linearne epitope.
[0074] Epitop za dati par antitelo (Ab)/antigen (Ag) može biti opisan i okarakterisan na različitim nivoima detalja korišćenjem raznih eksperimentalnih i računarskih metoda epitopskog mapiranja. Eksperimentalne metode uključuju mutagenezu, rendgensku kristalografiju, nuklearnu magnetnu rezonantnu (NMR) spektroskopiju, masenu spektrometriju vodonično deuterijumske razmene (Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry - HX-MS) i različite metode konkurentnog vezivanja; metode koje su poznate u oblasti. Kako se svaka metoda oslanja na jedinstveni princip, opis epitopa je blisko povezan sa metodom pomoću koje je određen. Tako, zavisno od korišćene metode mapiranja epitopa, epitop za dati Ab/Ag par može biti opisan drugačije.
[0075] Na svom najdetaljnijem nivou, epitop za interakciju između Ag i Ab može se opisati prostornim koordinatama koje definišu atomske kontakte prisutne u interakciji Ag-Ab, kao i informacijama o njihovim relativnim doprinosima termodinamici vezivanja. Na manje detaljnom nivou, epitop se može okarakterisati prostornim koordinatama koje definišu atomske kontakte između Ag i Ab. Na još manje detaljnom nivou epitop se može okarakterisati aminokiselinskim ostacima koje on sadrži, kako je definisano specifičnim kriterijumima, kao što je rastojanje između ili dostupnost rastvarača atoma u kompleksu Ab:Ag. Na još manje detaljnom nivou epitop se može okarakterisati kroz funkciju, npr. konkurentnim nadmetanjem sa drugim Abs. Epitop takođe može biti uopštenije definisan da sadrži aminokiselinske ostatke za koje će zamena drugom aminokiselinom promeniti karakteristike interakcije između Ab i Ag.
[0076] U kontekstu kristalne strukture izvedene rendgenskim zracima definisane prostornim koordinatama kompleksa između Ab, npr. Fab fragmenta, i njegovog Ag, termin epitop je ovde, ukoliko nije drugačije određeno ili osporeno kontekstom, specifično definisan kao PGLYRP1 ostaci okarakterisani da imaju teški atom (tj. ne-vodonični atom) unutar rastojanja od, npr., 2-6 Å, kao što je 3 Å, kao što je 4 Å, kao što je 5 Å od teškog atoma u Ab.
[0077] Iz činjenice da su opisi i definicije epitopa, zavisni od metode mapiranja epitopa koja je korišćena, dobijeni na različitim nivoima detalja, sledi da poređenje epitopa za različita Abs na istom Ag može biti slično izvedeno na različitim nivoima detalja.
[0078] Za epitope opisane na aminokiselinskom nivou, npr. određene iz strukture dobijene pomoću rendgenskih zraka, kaže se da su identični ako sadrže isti set aminokiselinskih ostataka. Za epitope se kaže da se preklapaju ako dele najmanje jednu aminokiselinu. Kaže se da su epitopi odvojeni (jedinstveni) ako ne dele ni jedan aminokiselinski ostatak.
[0079] Definicija termina "paratop" je izvedena iz gornje definicije "epitopa" preokrećući perspektivu. Prema tome, termin "paratop" odnosi se na neku oblast ili region na Ab za koje se Ag specifično vezuje, tj. sa kojima on stupa u fizički kontakt sa Ag.
[0080] U kontekstu kristalne strukture izvedene rendgenskim zracima, definisane prostornim koordinatama kompleksa između Ab, kao što je Fab fragment, i njegov Ag, termin paratop je ovde, osim ako nije drugačije određeno ili osporeno kontekstom, specifično definisan kao Ag ostaci okarakterisani da imaju teški atom (tj. ne-vodonični atom) unutar rastojanja od 4 Å od teškog atoma u PGLYRP1.
[0081] Epitop i paratop za dati par antitelo (Ag)/antigen (Ag) mogu biti identifikovani rutinskim metodama. Na primer, uobičajena lokacija epitopa može se odrediti procenom sposobnosti antitela da se veže za različite fragmente ili varijante PGLYRP1 polipeptida. Specifične aminokiseline unutar PGLYRP1 koje uspostavljaju kontakt sa antitelom (epitop) i specifične aminokiseline u antitelu koji stupaju u kontakt sa PGLYRP1 (paratop) mogu takođe biti određene korišćenjem rutinskih metoda. Na primer, antitelo i ciljni molekul mogu biti kombinovani i Ab:Ag kompleks može biti kristalizovan. Kristalna struktura kompleksa može biti određena i iskorišćena za identifikaciju specifičnih mesta interakcije između antitela i njegovog cilja.
[0082] Antitela koja se vezuju za isti antigen mogu se okarakterisati u odnosu na njihovu sposobnost da se istovremeno vezuju za njihov zajednički antigen i mogu biti podvrgnuti "konkurentskom vezivanju"/“binovanju“ ("binning"). U trenutnom kontekstu, termin "binovanje" odnosi se na metodu grupisanja antitela koja se vezuju za isti antigen. „Binovanje" antitela može biti zasnovano na konkurentskom vezivanju dva antitela sa njihovim zajedničkim antigenom u testovima na osnovu standardnih tehnika kao što je površinska plazmonska rezonanca (SPR), ELISA ili protočna citometrija.
[0083] "Bin" je definisan korišćenjem referentnog antitela. Ako drugo antitelo nije sposobno da se veže za antigen u isto vreme kao referentno antitelo, za drugo antitelo se kaže da pripada istom "bin-u" kao referentno antitelo. U ovom slučaju, referentno i drugo antitelo kompetitivno vezuju isti deo antigena i nazvani su "konkurentna antitela". Ako je drugo antitelo sposobno da se vezuje za antigen istovremeno sa referentnim antitelom, za drugo antitelo se kaže da pripada odvojenom "bin-u". U ovom slučaju, referentno i drugo antitelo se ne vezuju konkurentno za isti deo antigena i nazvani su "nekonkurentna antitela".
[0084] “Binovanje" antitela ne obezbeđuje direktnu informaciju u vezi epitopa. Konkurentna antitela, tj. antitela koja pripadaju istom "bin-u" mogu imati identične epitope, preklapajuće epitope ili čak odvojene epitope. Poslednje pomenuto je slučaj ako referentno antitelo vezano za njegov epitop na antigenu preuzima prostor koji je potreban da bi drugo antitelo kontaktiralo sa epitopom na antigenu ("sterička prepreka"). Nekonkurentna antitela generalno imaju odvojene epitope.
[0085] Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti u stanju da se takmiči sa 1F10 za vezivanje za PGLYRP1. Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti u stanju da se takmiči sa 1F36/mAb 0182 za vezivanje za PGLYRP1. Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti u stanju da se takmiči sa 1F95 za vezivanje za PGLYRP1. Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti u stanju da se takmiči sa 1F105/mAb 0184 za vezivanjem za PGLYRP1. Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti u stanju da se takmiči sa 2F5 za vezivanje za PGLYRP1. Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti u stanju da se takmiči sa 2F7 za vezivanje za PGLYRP1. Prema tome, antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može pripadati istom bin-u kao jedno ili više od ovih antitela.
[0086] Termin "afinitet vezivanja" ovde se odnosi na merenje jačine nekovalentne interakcije između dva molekula, npr. antitela, ili njegovog fragmenta, i antigena. Termin "afinitet vezivanja" je korišćen da opiše monovalentne interakcije (unutrašnja aktivnost).
[0087] Afinitet vezivanja između dva molekula, npr. antitela, ili njegovog fragmenta, i antigena, kroz monovalentnu interakciju može biti kvantifikovan određivanjem ravnotežne konstante disocijacije (KD). Zauzvrat, KDmože biti određena merenjem kinetike formiranja kompleksa i disocijacije, npr. pomoću SPR metode. Konstante brzine koje odgovaraju asocijaciji i disocijaciji monovalentnog kompleksa su označene kao konstanta brzine asocijacije ka(ili kon: on - uključeno) i konstanta brzine disocijacije kd(ili koff: off -isključeno), redom. KDje povezana sa kai kdpreko jednačine KD= kd/ ka.
[0088] Praćenjem gornje definicije, afiniteti vezivanja povezani sa različitim molekularnim interakcijama, kao što je upoređivanje afiniteta vezivanja različitih antitela za dati antigen, može se upoređivati poređenjem vrednosti KDza pojedinačne antitelo/antigen komplekse.
[0089] PGLYRP1 antitelo pronalaska može imati KDza svoju metu (PGLYRP1) od 1 x 10<-6>M ili manje, 1 x 10<-7>M ili manje, 1 x 10<-8>M ili manje, ili 1 x 10<-9>M ili manje, ili 1 x 10<-10>M ili manje, 1 x 10<-11>M ili manje, 1 x 10<-12>M ili manje ili 1 x 10<-13>M ili manje.
[0090] Antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti sposobno da se takmiči sa drugim molekulom, kao što je ligand koji se prirodno javlja ili receptor ili drugo antitelo, za vezivanje za PGLYRP1. Stoga, antitelo u skladu sa predmetnim pronalaskom može biti sposobno da veže PGLYRP1 sa većim afinitetom nego što je onaj od drugog molekula koji je takođe sposoban za vezivanje PGLYRP1. Sposobnost antitela da se takmiči sa prirodnim ligandom/receptorom za vezivanje za antigen može biti procenjena određivanjem i poređenjem KDvrednosti za interakcije od interesa, kao što je specifična interakcija između antitela i antigena, sa onom od KDvrednosti interakcije koja nije od interesa.
[0091] Termin "specifičnost vezivanja" se ovde odnosi na interakciju molekula kao što je antitelo, ili njegov fragment, sa pojedinačnim isključivim antitelom, ili sa ograničenim brojem visoko homologih antigena (ili epitopa). Antitela koja su sposobna za specifično vezivanje za PGLYRP1 nisu sposobna da se vezuju za različite molekule. Antitela u skladu sa pronalaskom ne moraju biti sposobna da vežu članove PGLYRP familije kao što su PGLYRP2, PGLYRP3 i PGLYRP4. Antitela u skladu sa pronalaskom ne moraju biti sposobna da vežu članove familije humanog PGLYRP kao što je humani PGLYRP2, humani PGLYRP3 i humani PGLYRP4.
[0092] Specifičnost interakcije i vrednost ravnotežne konstante vezivanja mogu biti određene direktno pomoću dobro poznatih metoda. Standardni testovi za procenu sposobnosti liganada (kao što su antitela) da vežu njihove mete su poznati u oblasti i uključuju, na primer, ELISA testove, Western blotove, RIA testove, i analize protočnom citometrijom. Kinetika vezivanja i afinitet vezivanja antitela takođe mogu biti procenjeni standardnim testovima u oblasti, kao što je SPR.
[0093] Može se izvesti test konkurenstkog vezivanja u kojem se vezivanje antitela za metu upoređuje sa vezivanjem mete pomoću drugog liganda te mete, kao što je drugo antitelo.
[0094] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije i formulacije koje sadrže molekule pronalaska, kao što su PGLYRP1 antitela, polinukleotidi, vektori i ćelije opisani ovde. Na primer, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili više PGLYRP1 antitela pronalaska, formulisanih zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0095] Prema tome, jedan cilj pronalaska je da obezbedi farmaceutsku formulaciju koja sadrži takvo PGLYRP1 antitelo koje je prisutno u koncentraciji od 0.25 mg/ml do 250 mg/ml, i gde navedena formulacija ima pH od 2.0 do 10.0. Formulacija može dalje da sadrži jedan ili više puferskih sistema, konzervans, agens za toničnost, helirajući agens, stabilizator, ili surfaktant, kao i njihove različite kombinacije. Upotreba konzervansa, izotoničnih agenasa, helirajućih agenasa, stabilizatora i surfaktanata u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata prosečnom poznavaocu oblasti. Može se pozvati na Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19. izdanje, 1995.
[0096] U jednom tehničkom rešenju, farmaceutska formulacija je vodena formulacija. Takva formulacija je tipično rastvor ili suspenzija, ali može takođe da uključi koloide, disperzije, emulzije, i više-fazne materijale. Termin "vodena formulacija" je definisana kao formulacija koja sadrži najmanje 50% m/m vode. Isto tako termin "vodeni rastvor" je definisan kao rastvor koji sadrži najmanje 50 % m/m vode, i termin "vodena suspenzija" je definisan kao suspenzija koja sadrži najmanje 50 %m/m vode.
[0097] U drugom tehničkom rešenju, farmaceutska formulacija je formulacija osušena zamrzavanjem, u koju lekar ili pacijent dodaje rastvarače i/ili razblaživače pre upotrebe.
[0098] U dodatnom aspektu, farmaceutska formulacija sadrži vodeni ratsvor takvog antitela, i pufer, gde antitelo je prisutno u koncentraciji od 1 mg/ml ili iznad, i gde pomenuta formulacija ima pH od oko 2.0 do oko 10.0.
[0098] PGLYRP1 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije koje sadrže takva antitela mogu biti korišćena za lečenje inflamatornih bolesti kao što su sledeće: inflamatorna bolest creva (IBD), Kronova bolest (Crohns disease - CD), ulcerozni kolitis (ulcerative colitis - UC), sindrom iritabilnog creva, reumatoidni artritis (RA), psorijaza, psorijazni artritis, sistemski eritemski lupus (SLE), lupus nefritis, dijabetes tipa I, Gravesova bolest, multipla skleroza (MS), autoimuni miokarditis, Kavasaki bolest, koronarna arterijska bolest, hronična opstruktivna bolest pluća, intersticijalna bolest pluća, autoimuni tiroiditis, skleroderma, sistemska skleroza, osteoartritis, atopijski dermatitis, vitiligo, bolest kalem protiv domaćina, Sjogrenov sindrom, autoimuni nefritis, Gudpasterov sindrom, hronična inflamatorna demijelinizirajuća polineuropatija, alergija, astma i druge autoimune bolesti koje su rezultat ili akutne ili hronične inflamacije. PGLYRP1 antitela predmetnog pronalaska i farmaceutske kompozicije koje sadrže takva antitela mogu biti korišćene za lečenje kardiovasularne bolesti, infarkta, ishemijske reperfuzione povrede, upale pluća, sepse i kancera.
[0100] PGLYRP1 antitela pronalaska su pogodna za primenu u lečenju pojedinaca sa inflamatornom bolesti creva. Inflamatorna bolest creva (IBD) je bolest koja može da pogodi bilo koji deo gastrointestinalnog trakta od usta do anusa, uzrokujući širok spektar simptoma. IBD primarno uzrokuje abdominalni bol, dijareju (koja može biti krvava), povraćanje, ili gubitak težine, ali može takođe izazvati komplikacije izvan gastrointestinalnog trakta kao što su kožni osip, artritis, zapaljenje očiju, zamor, i nedostatak koncentracije. Pacijenti sa IBD mogu se podeliti u dve glavne klase, one sa ulceroznim kolitisom (UC) i one sa Kronovom bolešću (CD). Dok CD generalno uključuje ileum i debelo crevo, može uticati na bilo koji region creva, ali je često diskontinuiran (fokusirana područja bolesti se šire kroz crevo), UC uvek uključuje rektum (kolonski) i više je kontinuiran. U CD zapaljenje je transmuralno, što dovodi do apscesa, fistula i striktura, dok se u UC, zapaljenje tipično ograničava na sluznicu. Ne postoji poznat farmaceutski ili hirurški tretman za Kronovu bolest, dok se neki bolesnici sa UC mogu izlečiti hiruškim uklanjanjem debelog creva. Opcije lečenja su ograničene na kontrolisanje simptoma, održavanje remisije i sprečavanje relapsa. Efikasnost u inflamatornoj bolesti creva u klinici može se meriti kao smanjenje skora indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI) za CD koji je skala bodovanja zasnovana na laboratorijskim testovima i upitniku o kvalitetu života. U životinjskim modelima, efikasnost se uglavnom meri povećanjem težine i takođe indeksom aktivnosti bolesti (DAI), što je kombinacija konzistencije stolice, težine i krvi u stolici.
[0101] PGLYRP1 antitela pronalaska su pogodna za primenu u lečenju pojedinaca sa reumatoidnim artritisom. Reumatoidni artritis (RA) je sistemska bolest koja pogađa skoro ako ne celo telo i jedan je od najčešćih oblika artritisa. Okarakterisan je inflamacijom zgloba, koja uzrokuje bol, ukočenost, toplinu, crvenilo i oticanje. Inflamacija je posledica napadanja zglobova inflamatornim ćelijama, i ove inflamatorne ćelije oslobađaju enzime koji mogu razgraditi kost i hrskavicu. Kao rezultat, ova inflamacija može dovesti do ozbiljnog oštećenja kosti i hrskavice i do propadanja zglobova i ozbiljnog bola među drugim fiziološkim efektima. Uključeni zglob može izgubiti svoj oblik i poravnanje, što rezultira bolom i gubitkom kretanja.
[0102] Postoji nekoliko životinjskih modela za reumatoidni artritis poznatih u oblasti. Na primer, u modelu kolagen-indukovanog artritisa (CIA), miševi su razvili inflamatorni artritis koji liči na humani reumatoidni artritis. Pošto CIA deli slična imunološka i patološka svojstva sa RA, to ga čini pogodnim modelom za ispitivanje potencijalnih humanih anti-inflamatornih jedinjenja. Efikasnost u ovom modelu je izmerena smanjenjem u oticanju zgloba. Efikasnost kod RA u klinici je merena sposobnošću da se smanje simptomi kod pacijenata koja se meri kao kombinacija otoka zglobova, brzine sedimentacije eritrocita, nivoa C-reaktivnog proteina i nivoa serumskih faktora, kao što su anti-citrulisana proteinska antitela.
[0103] PGLYRP1 antitela pronalaska su pogodna za primenu u lečenju osoba sa psorijazom. Psorijaza je T-ćelijski posredovan inflamatorni poremećaj kože koji može izazvati prilične neugodnosti. To je bolest za koju trenutno ne postoji lek i utiče na ljude svih uzrasta. Iako osobe sa blagom psorijazom često mogu kontrolisati svoju bolest pomoću topikalnih agenasa, više od milion pacijenata širom sveta zahteva tretmane ultraljubičastim svetlom ili sistemsku imunosupresivnu terapiju. Nažalost, neugodnosti i rizici od ultraljubičastog zračenja i toksičnosti mnogih terapija ograničavaju njihovu dugotrajnu upotrebu. Pored toga, pacijenti obično imaju ponovnu pojavu psorijaze, a u nekim slučajevima se oporave kratko nakon zaustavljanja imunosupresivne terapije. Nedavno razvijen model psorijaze zasnovan na prenosu CD4 T ćelija podražava mnoge aspekte humane psorijaze i stoga se može koristiti za identifikaciju jedinjenja pogodnih za upotrebu u lečenju psorijaze (Davenport et al., Internat. Imunopharmacol 2:653-672, 2002). Efikasnost u ovom modelu je izmerena redukcijom u patologiji kože korišćenjem skor sistema. Slično, efikasnost kod pacijenata je izmerena smanjenjem u patologiji kože.
[0104] PGLYRP1 antitela pronalaska su pogodna za primenu u lečenju osoba sa psorijaznim artritisom. Psorijazni artritis (PA) je vrsta zapaljenskog artritisa koji se javlja u podgrupi pacijenata sa psorijazom. Kod ovih pacijenata, patologija kože/simptomi su praćeni otokom zgloba, sličnog onom koji se viđa kod reumatoidnog artritisa. Karakterišu ga neravne, izdignute, crvene oblasti zapaljenja kože sa skaliranjem. Psorijaza često pogađa vrhove laktova i kolena, skalp, pupak i područja oko genitalija ili anusa. Kod približno 10% pacijenata koji imaju psorijazu se takođe razvija povezano zapaljenje njihovih zglobova.
[0105] Termin "lečenje", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na medicinsku terapiju bilo kog humanog ili drugog životinjskog subjekta kome je to potrebno. Očekuje se da je navedeni subjekat podvrgnut fizičkom pregledu od strane lekara opšte prakse ili veterinara, koji je dao tačnu ili konačnu dijagnozu koja bi ukazala na to da je primena navedenog lečenja korisna za zdravlje pomenutog humanog ili drugog životinjskog subjekta. Vreme i svrha navedenog lečenja mogu se razlikovati od jednog pojedinca do drugog, u skladu sa mnogim faktorima, kao što je dosadašnje stanje zdravlja subjekta. Prema tome, pomenuto lečenje može biti profilaktično, palijativno, simptomatsko i/ili kurativno.
[0106] U pogledu predmetnog pronalaska, profilaktička, simptomatska, i/ili kurativna lečenja mogu predstavljati odvojene aspekte pronalaska.
[0107] Antitelo pronalaska može biti administrirano parenteralno, kao što je intravenski, kao što je intramuskularno, kao što je subkutano. Alternativno, antitelo pronalaska može biti administrirano ne-parenteralnim putem, kao što je peroralno ili topikalno. Antitelo pronalaska može biti administrirano profilaktički. Antitelo pronalaska može biti administrirano terapijski (na zahtev).
PRIMERI
Primer 1: Stvaranje BWZ.36 humaneTREM-1:DAP12 stabilne ćelijske linije
[0108] BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ ćelijska linija (ovde takođe nazvana kao "BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija") je izvedena iz BW5147 T ćelija (ćelijska linija limfoma timusa Musmusculus-a, ATCC TIB-47, LGC Standards, Midlseks, Velika Britanija) i sadrži LacZ reporterski konstrukt regulisan pomoću četiri kopije NFAT promoterskog elementa (videti Karttunen, J. &Shastri, N. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 88, 3972-3976 i Fiering, S., Northrop, J. P., Nolan, G. P., Matilla, P., Crabtree, G. R. &Herzenberg, L. A. (1990) Genes Dev. 4, 1823-1834). TREM/DAP12/pMX-IRES vektor (koji kodira 786 bp od TREM-1 iz SMaI mesta u BamHI mesto korišćenjem TREM-1 cDNK (Ref. ID Banke gena:NM_018643.2, Sino Biological Inc., Peking, Kina) kao šablon i oligo 5' TAGTAGGGATCCGCTGGTGCACAGGAAGG (SEK ID BR: 51) i 5' TAGTAGGCGGCCGCTTCGTGGGCCTAGGGTAC (SEK ID BR: 52) kao prajmeri klonirani u pIREShyg vektor Pristupni br. Banke gena U89672 (Kat. br. 6061-1, Clontech Laboratories, Kalifornija, SAD) je transfektovan u PLAT-E pakujuću ćelijsku liniju (obezbeđena od strane W. Yokoyama, Univerzitet u Vašingtonu; alternativno, Kat. br. RV-101, Cell Biolabslnc, Bio-Mediator KY, Vantaa, Finska) korišćenjem Superfect reagensa za transfekciju (Kat. br. 301305, Qiagen Nordic, Danska). Supernatanti PLAT-E koji sadrže TREM/DAP12/pMX-IRES virusne čestice su korišćene da inficiraju BWZ.36 ćelije kao što sledi: 2x10<5>BWZ.36 ćelije su kultivisane u pločama sa 6 bunarića i medijum je zamenjen sa 1.5 ml supernatanta koji sadrži virusne čestice 8 mg/ml polibrena. Nakon 6-8 sati, 1.5 ml normalnog medijuma je dodato u ploču i ćelije su inkubirane tokom dodatna 24 sata. BWZ.36 ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju TREM-1 su obojene sa anti TREM-1 monoklonskim antitelom (klon21C7; Bouchon et al, 2000, J.Imunoltom. 164 strana4991-4995) i izolovane su pomoću ćelijskog sortiranja.
Primer 2: Kreiranje biološki testa za identifikaciju ćelija koje eksprimiraju ligand za TREM-1
[0109] TREM-1 reporterska ćelijska linija je generisana transfektovanjem ćelijske linije BWZ.36 koja nosi NFAT-lacZ (Sanderson S, Int. Immun. 1994) sa hTREM-1 i DAP12 kao što je opisano u Primeru 1. Ova BWZ.36/hTREM-1:DAP12:NFAT-LacZ ćelijska linija (ovde takođe nazvana kao BWZ/hTREM-1 reporterska ćelija) je visoko reaktivna na antitelom-posredovano unakrsno povezivanje TREM-1, dajući ~ 40-struku indukciju NFAT-pokrenute LacZ proizvodnje stimulisane sa 1-10 µg/ml vezanog za ploču komercijalno dostupnog anti-TREM-1 antitela, kao što je upoređeno sa izotipskom kontrolom. NFAT-pokrenuta LacZ proizvodnja u reporterskim ćelijama može biti testirana korišćenjem kompleta baziranog na luminescenciji, Beta Glow™ (Promega E4720, Medison, Viskonsin). Ploče su obložene sa izotipskom kontrolom ili aTREM-1 MAB1278 (Konc 3 ug/ml u PBS-u, 100 ul/bunariću) (R&D Systems, Mineapolis, SAD) na 4C tokom 16 sati ili tokom 2 sata na 37°C, 5 % CO2 i BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije su odvojene dodavanjem 10 ml Versena (kataloški broj #15040, Gibco, Karlsbad Kalifornija, SAD), zavrtene na 400g tokom 5 min i isprane u PBS-u i medijumu (RPMI-1640 bez fenol crvenog; kat. broj 11835, Gibco, Karlsbad Kalifornija, SAD) pre dodavanja u obložene ploče (1 x 10<6>ćelija/ml, 4x10<4>ćelija/bunariću) do ukupne zapremine 100 ul i inkubirane preko noći (16-20 sati) pri 37°C, 5 % CO2.
[0110] Ove TREM-1 reaktivne ćelije su korišćene da se identifikuju ćelije koje eksprimiraju TREM-1 ligand. Ispostavilo se da je jedna takva ćelija neutrofili iz pune krvi. Neutrofili iz zdravih donora su prečišćeni pomoću sedimentacije fikolom i dekstranom i stimulisani sa PGN (InVivogen, tlrl-pgnsa, San Dijego, Kalifornija, SAD) preko noći. Ukratko, BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije su dodate u aktivirane neutrofilne kulture u odnosu 1:3 reporterska ćelija:neutrofili. Test je izveden u crnim pločama obloženim Poli-D-Lizinom za ćelijske kulture (#356640 od BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija, SAD). TREM-1 aktivacija je očitana nakon 24 sata kultivacije korišćenjem BetaGlo reagensa (E4720 od Promega, Medison, Viskonsin, SAD) i luminescencija je izmerena korišćenjem TopCount Luminescentnog brojača od Perkin Elmer.
[0111] Vitro stimulisani neutrofili su posedovali ligand koji je bio sposoban da indukuje TREM-1 signalizaciju, i neutrofili iz pune krvi zdravih donora su prečišćeni pomoću sedimentacije dekstranom i stimulisani preko noći sa više reagenasa. Jedini reagens koji je bio sposoban da stimuliše TREM-1 reaktivni signal iz neutrofila je bio PGN-SA (Invivogen, tlrl-pgnsa, SanDijego, Kalifornija, SAD) koji podražava bakterijsku aktivaciju ćelija. Ovi aktivirani neutrofili su zatim korišćeni da stimulišu BWZ/hTREM-1 reportersku ćelijsku liniju, istovremenim kultivisanjem ćelija. Ukratko, BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije su dodate u aktivirane neutrofilne kulture u odnosu 1:3 reporterska ćelija:neutrofili. Test je izveden u crnim pločama obloženim Poli-D-Lizinom za ćelijske kulture (kat. br.356640 BD Biosciences, San Hoze,Kalifornija, SAD). TREM-1 aktivacija je očitana nakon 24 sata kultivacije korišćenjem BetaGlo reagensa (kat. br. E4720, Promega, Medison, Viskonsin, SAD) i luminescencija je izmerena korišćenjem TopCount Luminescentnog brojača od (Perkin Elmer, Valtam, Masačusets, SAD). Kao što je prikazano na Sl. 1, značajna indukcija reporterske aktivnosti je opažena u BWZ/hTREM-1 ćelijama istovremeno kultivisanim sa PGN-stimulisanim neutrofilima. Ova indukcija je visoko zavisna od neutrofilne aktivacije. Nije opažen odgovor sa mirujućim neutrofilima (stubić 2 neutrofili). Isto tako, nije opažen odgovor kada su stimulisane BWZ/hTREM-1 reporterske ćelije sa PGN-SA u TLRL koktelu u odsustvu neutrofila (stubić 1- TLRL), demonstrirajući da odgovor nije samo direktan efekat od PGN na BWZ/hTREM-1 ćelije. Aktiviranje neutrofila sa citokinskim koktelom (stubić 3+4 neutrofili citokini) nije dalo pravilan TREM-1 aktivacioni signal takođe.
Primer 3: Vezivanje solubilnog TREM-1 za PGN-aktivirane neutrofile
[0112] PGN-stimulisani neutrofili su bili sposobni da indukuju TREM-1 aktivaciju, ukazujući na prisustvo TREM-1 stimulirajućeg faktora u kulturama PGN-stimulisanih neutrofila. U cilju da se potvrdi prisustvo TREM-1-interagujućih proteina na neutrofilima, PGN-stimulisani neutrofili su obojeni sa rekombinantnim TREM-1-tetramernim proteinom i analizirani pomoću protočne citometrije. Ukratko, granulociti su izlovani iz humane pune krvi dobijene od Astarte Biologics (Redmond,Vašington, SAD) preko metode sedimentacije Fikolom-dekstranom. Krv je stratifikovan na FicollPaque (17-0840-03, GE Healthcare, Piskatavej, Nju Džersi, SAD) gradijentu sa odnosom od 3 dela Fikol-a i 4 dela krvi u epruveti od 50 ml, zatim centrifugirana na 400xg tokom 30 minuta na 22°C, bez pauze. Intermedijerna PBMC traka je nežno uklonjeno aspiracijom. Granulociti stratifikovani na pakovanim RBC su aspirirani i prebačeni u polipropilensku epruvetu od 50 ml. Granulociti i kontaminirajuće RBC ćelije su razblažene do 40 ml sa 1x PBS i praćene dodavanjem 10 ml4% DEKSTRANA 500 (Sigma, 31392, St Luis, Mizuri, SAD) u PBS rastvoru. Nakon mešanja nežnim obrtanjem, epruvete su ostavljene na 22°C tokom 20-30 min. Supernatant bogat granulocitima je zatim prebačen u novu epruvetu i centrifugiran na 250 x g, 5 min, 22°C; supernatant je aspiriran i odbačen. Kontaminirajuće RBC ćelije su uklonjene osmotskom lizom, ukratko, ćelijski pelet je ponovo suspendovan u 7.5 ml 0.2 % NaCl; nežno izmešan tokom 55-60 sekundi i 17.5 ml 1.2 % NaCl. rastvora je dodato. Zapremina je dovedena do 50 ml sa PBS-om i zavrtena na 250 x g tokom 5 min, pelet je ponovo suspendovan u 7.5 ml 0.2 % NaCl da se ponovi liza drugi put. Finalni pelet granulocita je ponovo suspendovan u RPMI/10%FBS-u.
[0113] Izolovani granulociti su kultivisani pri gustini od 3.8 E6/ml u RPMI/10%FBS 10 µg/ml PGN-SA (Invivogentlrl-pgnsa, San Dijego, Kalifornija, SAD) tokom 7 dana. Ćelije su peletirane centrifugiranjem i ponovo suspendovane u PBS/2% FBS za bojenje. Resuspendovani granulociti su zatim postavljeni u ploče sa 96 bunarića (okruglo dno) pri gustini od 100,000/bunariću u prisustvu ili odusustvu 2 µg/ml probe, sa ili bez 100 µg/ml (50X) specifičnog ili nebitnog kompetitorskog proteina.Ćelije su inkubirane sa probom/kompetitorom tokom 1 sata na 4C u zapremini od 50 µl/bunariću. Na kraju inkubacije, 150 µl/bunariću PBS/2%FBS je dodato i ćelije su peletirane. Peletirane ćelije su ponovo suspendovane u 50 µl/bunariću kozjeg anti hFc F(ab')2/PE konjugata (Jackson ImunoResearch 109-116-098, West Grove, Pensilvanija, SAD) i inkubirane na 4°C tokom 30 minuta. 150 µl/bunariću PBS/2%FBS je dodato i ćelije su peletirane. Peletirane ćelije su dalje isprane u 200 ul/bunariću PBS/2%FBS i peletirane. Isprane ćelije su zatim ponovo suspendovane u 100 µl/bunariću fiksativa (1:1 PBS: Cytofix. 554655, BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija, SAD) i inkubirane 5 minuta na sobnoj temperaturi. 100 µl/bunariću PBS/2%FBS je dodato u fiksirane ćelije, zatim su ćelije peletirane.Obojene/fiksirane ćelije su zatim ponovo suspendovane u 100 µl/bunariću PBS/2%FBS za analizu protočnom citometrijom na LSR II protočnom citometru. (BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija, SAD).
Komplet proba:
Kompetitori za hTREM-1 tet/Fc mut:
5
5
[0114] Histogrami su napravljeni od podataka sa protočnog citometra. Pozadinska fluorescencija iz kozjeg anti hFc/PE konjugata je prikazana u svakom histogramu kao pozadina i označena je sa "PE". Identični marker je nacrtan na svakom histogramu da se označi procenat ćelija koji je vezan za sekundarno kozje anti hFc/PE konjugovano antitelo. Negativni kontrolni Fc mut protein je pokazao 2% pozitivnih vezujućih ćelija, što je bilo identično sa pozadinskom fluoresencijom opaženom kod kozjeg anti hFc/PE konjugata samog (Sl. 2A). Kada su ćelije bojene sa 2 µg/ml hTREM-1/tetramerom one su bile 39% pozitivne (Sl. 2B). Kada je vezivanje TREM-1 tetramera izvedeno u prisustvu 100 µg/ml DCIR COMP proteina, ćelije su bile 41% pozitivne potvrđujući da se DCIR nije takmičio za vezivanje sa TREM-1 tetramerom (Sl. 2C). Kada je vezivanje TREM-1 tetramera bilo izvedeno u prisustvu 100 µg/ml TREM-1 COMP, ćelije su bile 10% pozitivne pokazujući da se TREM COMP protein nije takmičio sa TREM-1 tetramerom za vezivanje za ćelije (Sl.
2D).
Primer 4: Identifikacija PGLYRP1 kao neutrofil-eksprimiranog TREM-1 liganda [0115] PGLYRP1 je identifikovan kao TREM-1 kroz primenu imunoprecipitacije povezane sa masenom spektroskopijom (IP-MS). Solubilni TREM-1 tetramer je korišćen kao afinitetni "mamac" molekul da se identifikuje ligand. Ukratko, TREM-1-tetramer-Fc (SEK ID BR: 2) i odvojeno CD83-Fc (SEQ IDNO: 5) su svaki inkubiran u finalnim koncentracijama od 100 µg/ml sa 270 miliona humanih neutrofila, prečišćenih dekstranskom sedimentacijom kao što je opisano iznad, u 1 mL PBS na 4°C, 90 minuta uz blago mućkanje. Nakon peletiranja, ćelije su ponovo suspendovane u 1 mL PBS pufera sa uključivanjem kroslinkera 3,3'-Ditiobis[sulfosukcinimidilpropionat] (DTSSP) (Thermo Scientific: 21578, Rockford, Ilinois, SAD), pri koncentraciji od 2 mM i inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi.Ćelije su isprane 3X sa1 mL PBS praćeno lizom sa 1 mL RIPA pufera (Thermo Scientific, 89901, Rockford, Ilinois, SAD).Lizat je centrifugiran na 15,000 X g tokom 10 minuta na 4°C da se uklone nerastvorljivi materijali.Neutrofilni proteini poprečno ukršteni sa Fc kuplovanim probama su imunoprecipitirani iz supernatanta korišćenjem Protein A Mag Sepharose™ perlica (GE Healthcare Life Sciences, 28-9670-56, Piskatavej, Nju Džersi, SAD ).Ukratko, 50 µL perlica je prvo isprano sa 200 µL PBS,zatim ponovo suspendovano u 1 mL ćelijskog lizata, inkubirano 60 minuta na 4°C, magnetski uhvaćeno, i sekvencijalno isprano 2X sa 200µl RIPA pufera zatim 3X sa 200 µL PBS.Nakon uklanjanja PBS iz finalnog magnetskog hvatanja, proteini su eluirani od magnetnih perlica korišćenjem 200 µL pufera koji sadrži 8 M Ureu, 100 mMTris (pH 8.0), i 15 mM TCEP (Thermo Scientific, 77720, Rokford, Ilinois, SAD) i inkubirani na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta, perlice su uhvaćene i supernatant je prebačen u MicroconUltracel YM-30 filter (Millipore, 42410, Billerica, Masačusets, SAD).Uzorci su se vrteli na 14, 000 x g, 20°C, 30-60 minuta dok nije ništa tečnosti preostalo na vrhu membrane filtera. Zadržani proteini su zatim alkilovani sa 100 µL 50mM IAA (jodoacetamida) u 8 M Urei tokom 30 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Filter je ispran 2X sa 100 µL 50mM NH4HCO3-om i zatim prebačen u novu epruvetu za sakupljanje. 1 µg tripsina (kat. br.V5111, Promega, Medison Viskonsin, SAD) u 60 µL 50 mM NH4HCO3je dodato praćeno inkubacijom na 37°C preko noći.Tripsinska digestija je sakupljena centrifugiranjem na 14,000 xg tokom 30 minuta praćeno ispiranjem filtera sa 50 µL 50 mM NH4HCO3. 10 µL digesta je analizirano pomoću LC/MS/MS korišćenjem LTQ-Orbitrap-XL masenog spektrometra (Thermo Scientific, Woltam, Masačusets, SAD). Podaci su pretraženi prema IPI humanoj bazi podataka (v3.81) korišćenjem SEQUEST-Sorcerer mašine (4.0.4 građa) (SageN, Milpitas, Kalifornija, SAD) i zatim obrađeni pomoću Scaffold 3 (Proteome Software, Portland, Oregon, SAD) da se filtriraju proteinski ID sa lažnom brzinom otkrivanja od 1%. Nakon oduzimanja negativne kontrole, nađeno je da je PGLYRP1 protein sa visokom pouzdanošću specifično povezan sa hTREM-1 tetramerom. Imunoprecipitacija u neutrofilima je pokazala da od 148 identifikovanih proteina, 72 proteina su imunoprecipitirana pomoću kontrolnog konstrukta (CD83) samog, 73 od proteina su identični za TREM-1 i CD83, dok su samo tri bila TREM-1 specifična (Sl. 3). Eksperiment je kasnije bio ponovljen korišćenjem neutrofila iz različitog donora i PGLYRP1 je ponovo identifikovan kao specifično interagujući sa hTREM-1.
Primer 5: Prečišćavanje humanog PGLYRP1 eksprimiranog iz HEK293 6E
[0116] Rekombinantna proteinska sekvenca je konstruisana fuzionisanjem CD33 signalne peptidne sekvence (SEK ID BR: 53) sa kodirajućom sekvencom (SEK ID BR: 1) humanog zrelog PGLYRP1. Dobijeni otvoreni okvir čitanja je kloniran u pcDNA3.1/Zeo(+) vektor (Life Technologies, Karlsbad Kalifornija, SAD) posle CMV promotera. pcDNA3.1-hPGLYRP1 konstrukt je zatim transfektovan u HEK293 6E ćelije sa 293fectinTM (Life Technologies, Karlsbad Kalifornija, SAD) praćem uputstava proizvođača. 5 dana nakon transfekcije, supernatant kulture koji sadrži izlučeni humani PGLYRP1 je sakupljen centrifugiranjem (15,000 rpmX 20 min, 4□C) i zatim očišćen filtracijom sa membranom od celuloznog nitrata od 0.22 µm. Očišćeni supernatant je prvo razblažen 10 puta u 20mM natrijum citrata na pH5.0 i zatim nanet na Hitrap SP HP 5ml kolonu (17-1151-01 GE Healthcare, Upsala, Švedska), praćeno ispiranjem od 5 zapremina kolone sa 20mM natrijum citrata pH5.0. Vezani humani PGLYRP1 je zatim eluiran sa 0~100% linearnim gradijentom od 20mM natrijum citrata pH5.0, 1M NaCl u 30 zapremina kolone. Frakcije koje sadrže dimerne i monomerne oblike humanog PGLYRP1 su udružene odvojeno i koncentrovane do manje od 4ml pomoću Amicon ultra 15 centrifugalnih jedinica (UFC800324 3,000kDa MWCO, Millipore, Hellerup, Danska). Pulovi dimera i monomera su dalje doterani i promenjen im je pufer u fosfatom puferisani fiziološki slani rastvor (Phosphate Buffered Saline - PBS) pomoću Hiload 26/60 Superdex 75 318ml kolone (17-1070-01GE Healthcare,Upsala, Švedska). Nakon koncentrovanja, finalne koncentracije proteina su određene merenjem absorbance na 280nm sa NANODROP UV spektrometrom. Čistoća proteina je procenjena pomoću elektroforeze na natrijum dodecil sulfat poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE).
Primer 6: Ponovno savijanje i prečišćavanje humanog PGLYRP1 eksprimiranog iz E. coli
[0117] Humani PGLYRP1 je eksprimiran kao inkluziona tela u Escherichia coli BL21 (DE3) ćelijama. Bakterije su sakupljene centrifugiranjem, ponovo suspendovane u 50mM Tris-HCl pH8.0, 500mMNaCl, 5mM EDTA, 0.5% Triton X-100 i narušene sonifikacijom. Nerastvorljivi pelet je ispran tri puta sa 50 mMTris, pH 8.0, 1% TritonX-100, 2 M ureom i jednom sa 50 mMTris pH8.0, zatim rastvoren u 50mMTris-HCl, 6M guanidin hidrohloridu, pH7.4, 1mM DTT (finalna proteinska koncentracija 20mg/ml). Za in vitro savijanje, rastvorena humana PGLYRP1 inkluziona tela su razblažena u 50 mMTris, pH8.0, 2mM EDTA, 5mMcistaminu, 0.5mMcistaminu, 0.4M argininu(finalna proteinska koncentracija 1mg/ml). Nakon držanja preko noći na 4°C, smeša u kojoj se vrši savijanje je prečišćena pomoću centrufigiranja/filtracije i zatim razblažena 12 puta u 10mM MES pH3.5 da se smanji provodljivost i pH(finalno pH ~5.8, provodljivost ~6mS/cm). Razblažena smeša u kojoj se vrši savijanje je zatim naneta na Hitrap SP HP kolonu od 5ml (17-1151-01 GE Healthcare, Uppsala, Švedska), praćeno sa ispiranjem od 5 zapremina kolone sa 50 mM MES pH5.8. Vezani humani PGLYRP1 je zatim eluiran sa 0~60% linearnim gradijentom od 50mM MES pH5.8, 1M NaCl u 20 zapremina kolone. Frakcije koje sadrže ponovo savijeni humani PGLYRP1 su udružene i koncentrovane do manje od 4ml pomoću Amicon ultra 15 centrifugalnih jedinica (UFC8003243,000kDa MWCO, Millipore, Hellerup, Danska). Hiload 26/60 Superdex 75 318ml kolona((17-1070-01GE Healthcare,Upsala, Švedska) je zatim korišćena da se dotera i promeni pufer proteinima u fosfatom puferisani fiziološki rastvor (PBS). Većina ponovo savijenih humanih PGLYRP1 proteina je u obliku monomera. Nakon koncentrovanja, finalna koncentracija proteina je određena merenjem apsorbance na 280 nm sa NANODROP UV spektrometrom. Čistoća proteina je procenjena pomoću elektroforeze na natrijum dodecil sulfat poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE).
Primer 7: Imunizacija miševa i identifikacija mAbs
[0118] Prečišćeni humani PGLYRP1 je korišćen da se imunizuju miševi u cilju stvaranja antitela. Ukratko, miševi su imunizovani 3 puta sa 20 µg rekombinantnog PGLYRP1 po imunizaciji. Prva imunizacija je bila subkutana korišćenjem kompletnog Frojndovog adjuvansa (kat. br. 3018, Statens Serum Institut, Kopenhagen, Danska). Sledeće dve imunizacije su bile intraperitonealne korišćenjem nekompletnog Frojndovog adjuvansa (kat. br. 3016, Statens Serum Institut, Kopenhagen, Danska). Deset dana nakon poslednje imunizacije, izvađena je krv iz obraza i serumi su testirani na PGLYRP1 u direktnom ELISA testu.
Primer 8: Vezivanje solubilnog TREM-1 za PGLYRP1
[0119] Jedna uobičajena metoda potvrđivanja nove protein-protein interakcije je putem rekonstituisanja interakcije korišćenjem rekombinantnih reagensa. U tom cilju rekombinantni humani PGLYRP1 je eksprimiran pomoću C-terminalnog epitopa koji signalizira posttranslacionu adiciju glikozilfosfatidilinozitolske (GPI) strukture. Proteini koji sadrže terminalne GPI strukture su ciljani za prikazivanje na plazma membrani. Ova najčešća primenjena tehnika omogućava da se inače solubilni proteini prikazuju i testiraju na vezivanje pomoću tehnika protočne citometrije. Na Sl. 4a, HEK-2936E ćelije su transfektovane sa pCDNA 3.1/zeo(+) hPGLYRP1-GPI (SEK ID BR: 7) 3µg DNK je razblaženo u 100µl Optimem (Kat. br.31985062, Life Technologies, Karlsbad, Kalifornija, SAD).4µl 293fectin (Kat. br. 51-0031, Life Technologies, Karlsbad,Kalifornija, SAD) je dodato u 100µl Optimem (Kat. br.31985062, Life Technologies, Karlsbad, Kalifornija, SAD) i inkubirano na 22°C tokom 5 minuta. Smeša DNK/Optimem i smeša 293fectin/Optimem su kombinovane i inkubirane tokom dodatnih 20 minuta na sobnoj temperaturi.HEK-2936E ćelije su razblažene u 3ml pri 1e6/ml u Freestyle medijumu (Kat. br. 12338, Life Technologies, Karlsbad, Kalifornija, SAD) i nanete u sud sa 6 bunarića (Kat. br. 35-3046,Biosciences San Hoze, Kalifornija, SAD) i zatim DNK/293fectin smeša je dodavana u kapima u ćelije. Ćelije su inkubirane tokom 48 sati na 37°C uz mućkanje. 1 µg/ml humanog TREM-1-G4Sx3-TREM-1/Fc6mut (SEK ID BR: 2) je razblaženo u PBS/2%FBS i 50µl probe je dodato u 80,000 transfektovanih HEK293-6E ćelija u ploči sa 96 bunarića sa okruglim dnom (Kat. br. 3799, Costar, Lowell, Masačusets, SAD.Ćelije su inkubirane na 4°C tokom 1 sata praćeno ispiranjima 2x sa 200µl PBS/2%FBS. 50µl od 1µg/ml PE kozjeg anti-humanog Fc (Kat. br.
109-116-098, Jackson ImunoResearch, West Grove, Pensilvanija, SAD) je dodato i inkubirano tokom dodatnog sata praćeno ispiranjima 2x sa PBS/2%FBS. Ćelije su fiksirane tokom 5min u 1:1 PBS razblaženom BDCytofix-u (Kat. br. 554655, BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija, SAD) i inkubirane tokom 5 minuta praćeno ispiranjem sa 200µl PBS/2%FBS. Ćelije su ponovo suspendovane u 100µl PBS/2%FBS pre nego što su analizirane na FACS LSRII (BD Biosciences, San Hoze, Kalifornija). Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na Sl. 4a gde su neobojene ćelije prikazane punom crnom linijom (G03). TREM-1-G4Sx3-TREM-1/Fc6mut bojenje „mok“ transfektovanih ćelija je prikazano isprekidanom linijom, i ne pokazuje vezivanje u odnosu na neobojene ćelije. Konačno, ćelije transfektovane sa humanim PGLYRP1-GPI snažno vezuju TREM-1-G4Sx3-TREM-1/Fc6mut prikazan tačkastom linijom. Kvantifikacija vezivanja je izražena kao srednji intenzitet fluorescencije (mean fluorescent intensity), MFI.
[0120] Pored protočne citometrije, interakcije protein-protein su takođe uobičajeno procenjene merenjem površinske plazmonske rezonance (SPR). BiacoreT200 (GE Healthcare, Piskatavej, Nju Džersi, SAD) instrument je korišćen da bi se analizirala interakcija između humanog TREM-1 i humanog PGLYRP1 i takođe između humanog PGLYRP1 i sonifikovanog, solubilnog peptidoglikana E. coli (Kat. br. tlrl-ksspgn,lnvivogen, San Dijego, Kalifornija, SAD). Svi testovi su izvedeni na 25°C pri brzinama protoka od 20-30 µL/minuti u 1X HBS-P radnom puferu (Kat. br. BR-1006-71, GE Healthcare, Piskatavej, Nju Džersi, SAD ).
[0121] Na Sl. 4B, 4641.1 RU humanog TREM-1 tetramera (SEK ID BR: 2) je amin vezano za Biacore CM5 čip (Kat. br. BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piskatavej, Nju Džersi, SAD) praćenjem metoda preporučenih od strane proizvođača. PGLYRP1 (Kat. br.
2590-PG,R&D Systems, Mineapolis, SAD) je razblažen do 150 nM u 1X HBS-P radnom puferu (Kat. br. BR-1006-71, GE Healthcare, Piskatavej, Nju Džersi, SAD ) u prisustvu ili odsustvu 10 µg/mL solubilnog peptidoglikana E. coli (Kat. br. tlrl-ksspgn, Invivogen, San Dijego,Kalifornija, SAD) i ubrizgan preko TREM-1 površine. Podatak je referencom umanjena naspram aktivirane i blokirane (sa etanolaminom) referentne površine. Iako PGLYRP1 vezuje TREM-1 i u prisustvu i u odsustvu PGN, čini se da postoji značajan efekat aviditeta kada je PGLYRP1 unakrsno vezan pomoću PGN.
[0122] Na Sl. 4C, 274.8 RU PGLYRP1 dimera (SEK ID BR: 1) je amin vezano za Biacore CM5 čip (Kat. br. BR-1005-30, BR-1000-50, GE Healthcare, Piskatavej, NJ). Solubilni peptidoglikan E. coli (Kat. br. tlrl-ksspgn, Invivogen, San Dijego,Kalifornija, SAD) je razblažen do 10 µg/mL u 1X HBS-P radnom puferu (Kat. br. BR-1006-71, GE Healthcare, Piskatavej, Nju Džersi, SAD ) i ubrizgan preko PGLYRP1 površine. Podatak je referencom umanjena naspram aktivirane i blokirane (sa etanolaminom) referentne površine.
[0123] Na Sl. 4D, isti čip je korišćen kao na Sl. 4C, (274.8 RU PGLYRP1 dimera, (SEK ID BR: 1). TREM-1 dimer (SEK ID BR: 8) je razblažen do 150 nM u 1X HBS-P radnom puferu (BR-1006-71,GE Healthcare,Piskatavej, Nju Džersi, SAD ) i ubrizgan je i pre i posle ponovljenih ubrizgavanja peptidoglikana (prikazano na Sl. B). Podatak je referencom umanjena naspram aktivirane i blokirane (sa etanolaminom) referentne površine i signal ubrizgavanja puferske slepe probe je takođe oduzet. TREM-1 prikazuje jasno vezivanje za imobilisani PGLYRP1. Solubilni TREM-1 dimer se vezuje slično za imobilisani PGLYRP1 sam ili za PGLYRP1 koji je bio nanet sa PGN-om. Sveukupno vezivanje površinski imobilisanog TREM-1 receptora pomoću solubilnog PGLYRP1 i PGN sastoji se od umerenog afiniteta za PGLYRP1:TREM-1 kompleks poboljšanog pomoću efekta aviditeta visoko unakrsno-vezanog PGLYRP1.
Primer 9: Aktivacija TREM-1-odgovora pomoću rekombinantnog PGLYRP1
[0124] Da bi se testiralo da li rekombinantni PGLYRP1 može da aktivira TREM-1 odgovor, BWZ/hTREM-1 reporterska ćelijska linija je zasađena u crne ploče sa 96 bunarića i stimulisana sa rekombinantnim humanim PGLYRP1 (Kat. br. 2590-PG-050, R&D Systems: Mineapolis, Mineapolis) u prisustvu ili odsustvu 10 µg/ml PGN. TREM-1 aktivacija je očitana nakon 24 sata kultivisanja korišćenjem BetaGlo reagensa (Kat. br. E4720, PromegaMedison, Viskonsin, SAD) i luminescencija izmerena korišćenjem TopCount Luminescence brojača od Perkin Elmer. Kao što je prikazano na Sl. 5a, stimulacija TREM-1 reporterske ćelijske linije sa PGLYRP1 indukovala je dozno-zavisnu aktivaciju TREM-1 u prisustvu PGN. Nekoliko različitih PGN su testirani, uključujući PGN-EC (iz E. coli), PGN-SA (iz S. aureus) i PGN-BS (iz B. subtilis) (Invivogen, San Dijego, Kalifornija, SAD), i svi su bili sposobni da olakšaju PGLYRP1-indukovani TREM-1 odgovor.
[0125] Odgovor indukovan pomoću rekombinantnog PGLYRP1 bi mogao biti inhibiran pomoću dodavanja rekombinantnog TREM-1-Fc-fuzionog proteina (SEK ID BR: 2) (Sl.
5b)ili dodavanjem poliklonskog anti-PGLYRP1 antitela (Kat. br. AF-2590,R&D Systems:Mineapolis, MN, SAD) potvrđujući da PGLYRP1 je TREM-1 ligand i da solubilni TREM-1 i anti- PGLYRP1 su potencijalno korisni kao TREM-1 antagonisti.
Primer 10: Oslobađanje TNFalfa iz M1 makrofaga stimulisano pomoću PGLYRP1
[0126] Monociti su diferencirali u M1 makrofage i stimusani sa PGLYRP1 kompleksom dovodeći do oslobađanja TNFalfa u dva različita donora.
[0127] Prosečni poznavaoci oblasti će prepoznati vrednost uspostavljanja kolekcije iz banke sa zamrzivačem primarnih ćelija od više donora tako obezbeđujući prikladnu replikaciju eksperimenata. In vitro izvedeni makrofagi su proizvedeni iz monocita periferne krvi kao što sledi.Negativno obogaćeni monociti su izolovani iz "leukopaka" periferne krvi dobijenog od Research Blood Components (Brighton, MA, SAD) korišćenjem Rosette Sep kompleta (kat. br. Kat. br. 15068 Stem Cell Technologies,Vankuver BC, Kanada) praćenjem uputstava proizvođača. Izolovani monociti su supendovani u 10% DMSO/FBS alikvotima od 50e6 ćelija/ml i postepeno olađeni do -80C. Da bi se proizvele makrofagne ćelije, jedna ili više zamrznutih bočica monocita su brzo otopljene u vodenom kupatilu na 37C, razblažene do 10ml sa medijumom za rast [RPMI 1640 (Kat. br. 72400-047, Life Technologies,Karlsbad Kalifornija, SAD)) sa 10% FBS-om (Kat. br. 03-600-511,ThemoFisher, Voltam Masačusets SAD) i centifugirane 5 minuta na 250g.Ćelije su suspendovane do 2e6 ćelija/ml u medijumu za rast obogaćenom sa 50 ng/ml humanog MCSF (Kat. br. PHC9501, Life Technologies, Karlsbad Kalifornija, SAD), postavljene u tkivnu kulturu koja je tretirana, ploče petri tipa za tkivne kulture i u inkubator sa podešenom vlažnošću koji je programiran da održi „hipoksičnu“ atmosferu od 5% CO2, 2% O2. Trećeg dana u kulturi, ćelije su nahranjene sa dodavanjem jednake zapremine medijuma za rast obogaćenog sa 50 ng/ml humanog MCSF. Nakon 6 dana u kulturi monociti su diferencirali u M0 makrofage. M0 ćelije su dalje diferencirale menjanjem medijuma u medijum za rast obogaćen sa 50 ng/ml humanog IFNg (Kat. br., PHC4031, Life Technologies, Karlsbad Kalifornija, SAD) za M1 makrofage ili 40 ng/ml humanog IL-4 (Kat. br. PHC0045, Life Technologies, Karlsbad Kalifornija, SAD) za M2 makrofage i vraćanjem u inkubator tokom dodatna 22 sata. Sedmog dana, makrofage su pogodno diferencirale da budu primenjene u biološki testu. Ukratko, makrofage su prečišćene iz petri ploča ispiranjem sa 1X PBS-om, praćeno sa 5mM EDTA u PBS-u.Ploče su zatim vraćene na 37C tokom 30 minuta i ćelije su "snažno isprane" sa ploče korišćenjem šprica od 10ml i igle od 22G.Ćelije su zatim razblažene u medijumu za rast, centrifugirane na 250g tokom 5 minuta nakon čega je ćelijski pelet suspendovan do finalne koncentracije od 1e6/ml.
[0128] Makrofagne ćelije pripremljene kao iznad su korišćene u biološki testovima gde citokini kao što je TNF-alfa proizvedeni u odgovoru na stimulaciju ćelija sa TREM-1 ligandom su izmereni u kondicioniranom medijumu pomoću ELISA testa. Takav biološki test je dalje korišćen da se meri blokada stimulacije TREM-1 liganda pomoću TREM-1 specifičnih antitela.TREM ligand ili negativne kontrole su pripremljeni u 4X koncentracijama u medijumu za rast i 50 mikrolitara/bunariću je dodato u mikrotitarske posude sa 96 bunarića. Finalne koncentracije TREM-1 liganda sastojale su se od 7.5ng/ml rekombinantnog humanog PGLYRP1 (generisan kao to je opisano u primeru 5)i 3 µg/ml PGN-BS (Kat. br., tlrlpgnbs,Invivogen,SanDiego Kalifornija, SAD).Ćelije su kultivisane u vlažnim hipoksičnim uslovima kao što je opisano iznad tokom 22 sata nakon čega je kondicionirani medijum sakupljen i nivoi TNF-alfa su izmereni pomoću ELISA, praćenjem uputstava proizvođača (Kat. br. DY210,R&D Systems, Mineapolis MN, SAD).
Ovaj primer pokazuje da je TREM-1 ligand PGLYRP1 sposoban da dalje poveća oslobađanje TNFa iz makrofaga od dva različita donora.
Primer 11: Oslobađanje citokina iz ćelija sinovijalnog tkiva od pacijenata sa RA nakon stimulacije sa PGLYRP1.
[0129] Uzorci sinovijalnog tkiva su dobijeni od pacijenata sa RA tokom potpune zamene kolena. Pojedinačna suspenzija ćelija sinovijalnog tkiva je izolovana digestijom putem 4mg/ml kolagenaze (Kat. br. 11088793001, Roche, Manhajm, Nemačka) i 0.1mg/ml DNaze (Kat. br.11284932001, Roche, Manhajm, Nemačka) tokom 1 sata na 37 stepeni.
Uzorci sinovijalnog tkiva pri 1x10^5/bunariću u medijumu za kulture RPMI (Kat. br.R0883, Sigma Aldrich,Sent Luis, Misuri, SAD) 10% FCS (Kat. br. S0115, BioChrom AG, Grand Isli, NY 14072, SAD) su stimulisani sa 4ug/ml PGLYRP1 i 1ug/ml PGN-ECNDi (Kat. br. tlrl-kipgn, Invivogen,San Dijego, CA 92121, SAD). Nakon inkubacije od 24 h, ćelijski supernatanti su sakupljeni, i citokini su izmereni ili pomoću ELISA testa (TNFa (Kat. br. DY210, R&D Systems, Mineapolis, MN55413 SAD), IL-1b (Kat. br. 88-7010-88, eBioscience, San Dijego CA SAD), GM-CSF (Kat. br. 88-7339-88, eBioscience,San Dijego CA SAD) ili Flowcytomix (TNFa, IL-1b, MIP-1b, MCP-1, IL-6, i IL-8 (Kat. br.BMS, eBioscience,San Dijego Kalifornija SAD).Citokini su izlučeni iz ćelija sinovijalnog tkiva nakon stimulacije sa TREM-1 ligandom.
Ovaj primer pokazuje da će ćelije iz sinovijalnog tkiva od pacijenata sa rematoidnim artritisom odgovoriti na stimulaciju pomoću PGLYRP1 TREM-1 liganda izlučivanjem brojnih citokina.
Primer 12: Identifikacija anti-PGLYRP1 mAbs koja inhibiraju TREM-1 aktivaciju [0130] U cilju identifikacije monoklonskih anti-PGLYRP1 mAbs koja mogu da blokiraju TREM-1 odgovore, balb/c miševi divljeg tipa su imunizovani sa rekombinantnim humanim PGLYRP1. Primarno ispitivanje je odrađeno pomoću direktnog ELISA testa na PGLYRP1 proteinu, i svi PGLYRP1-specifični hibridomski supernatanti su zatim testirani u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom testu da bi se identifikovala monoklonska anti-PGLYRP1 antitela sposobna da inhibiraju TREM-1 aktivaciju indukovanu pomoću PGN-stimulisanih neutrofila, kao što je opisano pod primerom 1. Biološki test je izveden kao što sledi: 40,000 hTREM-1/BWZ.36 ćelija/bunariću je postavljeno u crne ploče sa 96 bunarića sa providnim dnom u prisustvu 75 ng/ml PGLYRP1 (SEK ID BR: 1) sa 2.5 µg/ml PGN-ECndi (Kat. br. tlrl-kipgn,lnvivogen San Dijego, Kalifornija, SAD) da se obezbedi sub-maksimalni pozitivni signal, ili alternativno u prisustvu pod-maksimalnog nivoa (1 µg/ml) na plastici adsorbovanog anti TREM-1 monoklonskog antitela (Kat. br. MAB1278 R&D Systems, Mineapolis, MN, SAD) da se obezbedi pozitivan signal. Ispitivana antitela su titrirana u testu počevši sa 10 µg/ml, sa 5 serijskih 2-strukih razblaženja. Test je inkubiran preko noći na 37C, i razvijen sa Beta Glo (Kat. br. E4740,Promega Medison,Viskonsin, SAD), u skladu sa Beta Glo protokolom, i luminescencija je zabeležena. Podaci su ucrtani korišćenjem Beta Glo relativnih luminescentnih jedinica naspram koncentracije ispitivanih antitela. Ne-neutrališući negativni kontrolni mlgG1 (Kat. br.MAB002, R&D SystemsMineapolis, Mineapolis SAD) i neutrališuće pozitivno kontrolno poliklonsko kozje anti hPGLYRP1 antitelo (Kat. br. AF2590,R&D Systems, Mineapolis, Mineapolis, SAD) su korišćeni na svakoj test ploči. Kao što je prikazano na Sl. 6a, F10, F14, F29, F36, F38, F77, F95 i F105 su identifikovani da mogu da blokiraju TREM-1 odgovor na PGLYRP1. Sl. 6B prikazuje druge supernatante hibridoma PGLYRP1 antitela sposobne da blokiraju TREM-1 zavisni signal. M-hPGRPS-2F5 (SEK ID BRojevi: 31-32 i -2F7 (SEK ID BRojevi: 35-36) su veoma efikasni blokatori. Suprotno, testiranje komercijalno dostupnih monoklonskih anti-PGLYRP1 antitela u istom protokolu testa zajedno sa antiPGLYRP1 kozjom poliklonskom pozitivnom kontrolom (Kat. br. AF2590, R&D SystemsMineapolis,Mineapolis, SAD) pokazalo je da nijedno od ovih ne bi moglo da blokira TREM-1 aktivaciju (Sl. 6C). Anti PGLYRP1 antitela koja su testirana obuhvataju: 188C424 od Thermo Scientific (6D), 4H230 i 9A319 Mabs od US Biological (Sl.
6D,6E); nijedno nije uspelo da blokira PGLYRP1 stimulaciju TREM-1 biološkog testa.Pronađeno je da klon 6D653 od Santa Cruz Biotechnology (Sl. 6F i 6G) blokira test nespecifično na osnovu opažanja da Mab blokira i PGLYRP1 (6F) i anti-TREM-1 stimulaciju (6G) dok pozitivno kontrolno anti PGLYRP1 poliklonsko Ab blokira samo PGLYRP1 posredovanu aktivaciju. Ovo nespecifično blokiranje može biti usled toksičnosti azida na biološki test.
[0131] U zaključku, identifikovano je da PGLYRP1 monoklonska antitela ne vezuju samo PGLYRP1 već takođe neutrališu njegovu TREM-1 signalizacionu aktivnost. Metoda korišćena za identifikaciju ovih molekula obezbeđuje jedinstvenu prednost nad rutinskim metodama korišćenim za identifikaciju PGLYRP1 antitela, dokazano neuspehom dostupnih komercijalnih antitela za neutralizaciju PGLYRP1.
Primer 13:PGLYRP1 antitela blokiraju TREM-1 specifični signal
[0132] PGLYRP1 hibridomski klonovi su sekvencirani i rekombinantno eksprimirani kao hlgG4 antitelo. Dva od ovih mAb0182 (iz 1F36) (SEQ ID 15 i 16) i mAb 0184 (iz 1F105) (SEQ ID 23 i 24) su ponovo testirani u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom testu kao što je opisano u primeru 13.Ova anti-PGLYRP1 antitela blokiraju TREM-1 odgovor u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom testu na dozno-zavistan način.
[0133] Ovaj primer pokazuje da, nasuprot komercijalno dostupnim antitelima za PGLYRP1 prikazanim na slici 6C-G, PGLYRP1 antitela stavljena ovde na uvid javnosti su sposobna da blokiraju TREM-1 specifični signal u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom testu.
Primer 14: Oslobađanje TNF-alfa iz M2 makrofaga stimulisanih pomoću PGLYRP1 [0134] Monociti su diferencirani u M2 makrofage i stimulisani sa PGLYRP1 kompleksom. Antitela (10 µg/ml)mAb -0182 i -0184 usmerena na PGLYRP1 su sposobna za oslobađanje TNF-alfa.M2 makrofage su diferencirane kao što je opisano u Primeru 10. Antitela koja se testiraju su pripremljena u 4X koncentracijama u medijumu za rast i 50 mikrolitara/bunariću je dodato. Krajnji korak u pokretanju biološkog testa je bio dodavanje 100 mikrolitara/bunariću M2 makrofagnih ćelija pripremljenih kao što je opisano iznad.
PGLYRP1 monoklonska antitela (mAb 0182 i mAb 0184) su testirana za neutrališuću aktivnost na M2 makrofagama. Test bunarići u duplikatima (ako nije drugačije naznačeno) su testirani pod sledećim uslovima: bez dodate stimulacije, 7.5ng/ml PGLYRP1 samo, 3 µg/ml PGN-BS (Kat. br. tlrl-pgnbs,lnvivogen San Dijego, Kalifornija, SAD) samo (šestoplikati), PGLYRP1 sa PGN-BS (šestoplikati), i PGLYRP1 sa PGN-BS u prisustvu PGLYRP1 antitela ili kontrolnog antitela hlgG4 izotipa titriranog u koncentracijama između 40 µg/ml i 0.31 µg/ml u 2 strukim razblaženjima.
[0135] Ovaj primer ilustruje da je TREM-1 ligand PGLYRP1 sposoban da dalje poveća oslobađanje TNFa iz M2 makrofaga od dva različita donora i da su antitela stavljena ovde na uvid javnosti sposobna da smanje takvo oslobađanje TNFa. Stoga, ova PGLYRP1 antitela su potencijalno korisna kao TREM-1 antagonisti.
Primer 15: Istraživanje interakcija vezivanja između molekula povezanih sa TREM-1 i PGLYRP1 potvrđuje specifičnost.
[0136] Identifikujući TREM-1 kao sposoban da se veže za PGLYRP1 i aktivira TREM-1 u prisustvu PGN, odlučili smo da utvrdimo da li TREM-1 može da se veže za druge članove PGLYRP familije ili ne.PGLYRP1 je bio veštački usađen u ćelijsku membranu kroz adiciju, na N-terminusu, unutarćelijskog (IC) i transmembranskog domena (TM) izvedenog iz receptora MDL-1 Tipa II. Kasniji konstrukti su označeni Tip II PGLYRP1 (Sl 9a). U Tipu II 1.0 (SEK ID BR: 37), naelektrisana aminokiselina TM nativnog MDL-1 receptora je održana, i efikasna ekspresija ovog proteina, je zavisna od ko-ekspresije DAP12. U 2.0 PGLYRP1 konstruktu Tipa II (SEK ID BR: 38), naelektrisani TM ostatak je supstituisan sa neutralnom aminokiselinom (Lizin u Leucin), omogućavajući da protein bude eksprimiran nezavisno od npr. DAP12, i epitopska oznaka DYKDDDDK (SEK ID BR: 39) je dodata. hPGLYRP2 u punoj dužini (SEK ID BR: 40),hPGLYRP3 (SEK ID BR: 41), i hPGLYRP4 (SEK ID BR: 42]), cDNK su sintetisane kao proteini usidreni u membranu korišćenjem N terminalne fuzije N terminusa 2.0 MDL1 Tipa ll kao što je korišćeno za PGLYRP1 iznad.cDNK su subklonirane u modifikovani pTT5 ekspresioni plazmidni vektor (Zhang J etal. Protein Expression and Purification, tom 65, izdanje 1, maj 2009, str 77-8), i transfektovane kao što je opisano u Primeru 8 u HEK293-6E ćelije pored prazne vektorske negativne kontrole (Mok). Ćelije su testirane pomoću protočne citometrije i na površinsko i za unutarćelijsko vezivanje sledećih proba:kozji anti-humani PGLYRP1 (PGRPS) (Kat. br. AF2590, R&D Systems, Mineapolis, Mineapolis, SAD); Mab anti-humani PGLYRP2 (PGRP-L) (Kat. br.MAB0755,Abnova,Volnat, Kalifornija, SAD); Mab anti-humani PGLYRP3 (PGRP-1a) (Kat. br.MAB0068,Abnova,Volnat, Kalifornija, SAD); Mab anti-humani PGLYRP3 (PGRP-1a) (Kat. br. ab13901, Abcam, Cambridge MA, SAD); zečji anti-humani PGLYRP3 (PGRP-1a) (Kat. br. 18082-1-AP,Protein Tech,Čikago Ilinois, SAD);kozji anti-humani PGLYRP4-biotin (PGRP-1b) (Kat. br.BAF3018, R&D Systems, Mineapolis, Mineapolis, SAD); kozje anti-mišji PGLYRP1 (PGRPS) (Kat. br.AF2696,R&D Systems,Mineapolis, Mineapolis SAD); huTREM-1.Fc dimer (C0099); huTREML1.Fc dimer (C0246); huTREML2.Fc dimer (C0247); huTREM2.Fc dimer (C0248); Protokol vezivanja je izveden kao što sledi, korišćenjem ili cytofix/perm pufera (Kat. br. 51.2090KZ, BD Biosciences,San Hoze Kalifornija, SAD) za unutarćelijsko bojenje ili 2% FBS/PBS za površinsko bojenje: ćelijski peleti su ponovo suspendovani u ploči sa 96 bunarića sa okruglim dnom (početi sa: 160,000 ćelija/bunariću) sa 200 µl cytofix/perm pufera tokom 15 minuta na 22C, isprani dva puta sa 200µl 1x PermWash pufera za ispiranje (razblažen 10x u DiH20), obojeni sa 50µl probe razblažene do 5□g/ml u 1x PermWash puferu za ispiranje, inkubirani tokom 1 sata na 4C, ćelije su zatim isprane sa 200µl 1x PermWash pufera za ispiranje, sekundarna proba je dodata u 50µl 1x PermWash pufera za ispiranje, ćelije su inkubirane na 4C tokom 30 minuta, isprane dva puta sa 200 µl 1x PermWash pufera za ispiranje, peleti su ponovo suspendovani u 50µl razblaženog CytoFix u PBS-u u odnosu 1:1 (BD:554655, San Hoze, Kalifornija, inkubirani tokom 5 minuta na 22C, 150µl PBS/2%FBS je dodat, centrifugiran tokom 5 minuta na 300g, isprani 1x sa 200µl PBS/2%FB Sand ponovo suspendovani u 100µl PBS/2%FBS. Vezivanje je analizirano korišćenjem FACS na LSRII (BD, San Hoze Kalifornija, SAD).
[0137] Kao što je sumarizovano u tabeli ispod, TREM-1 proba se vezala isključivo za hPGLYRP1 i nije detektovano vezivanje članova familije hTREM za PGLYRP2, PGLYRP3 ili PGLYRP4.
[0138] Humani u membranu usidreni PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3 i PGLYRP4 su bili prolazno eksprimirani u HEK293 i ispitani su kako sa interno dobijenim („in-house“) tako i sa komercijalno dostupnim solubilnim receptorima i antitelima u cilju identifikovanja novih interakcija između članova familije. Rezultati vezivanja su izraženi kao "n/d", "-", "+" ili "++++". Rezultati su odnos srednjeg intenziteta florescencije (MFI) bojenja probe prema bojenju negativne kontrole; "-" je jednak odnosu <1,"++++" predstavlja rezultat >30 i "++" predstavlja približno 10-15, "+" predstavlja 2-5 sa statistički značajnom razlikom (p< 0.05).Prosečni poznavaoci oblasti mogu okarakterisati ove rezultate kao negativne, jasne ili nejasne redom.
[0139] TREM-1 se samo vezuje za PGLYRP1 i nijedan od drugih PGLYRP članova, i obrnuto: PGLYRP1 interaguje samo sa TREM-1 i nijednim od drugih TREM članova.
Primer 16:TREM-1 ligand je prisutan u uzorcima RA sinovijalne tečnosti
[0140] Reumatoidni artritis je okarakterisan inflamacijom metakarpofalagealnog (metacarpophalageal - MCP) zgloba u kome aktivirani granulociti igraju značajnu ulogu. PGYLRP1 je ispitan pomoću ELISA i testiran u BWZ/hTREM-1 reporterskom ćelijskom testu iz sinovijalne tečnosti izvučene iz MCP zglobova 9 pacijenata sa RA. Sinovijalna tečnost iz komercijalnog izvora (Asteri, Detroit Mičigan, SAD) je odmrznuta, vorteksovana i serijski razblažena u ELISA puferu i korišćena u PGLYRP1 testu praćenjem uputstava proizvođača (Promega, Medison Viskonsin, SAD)Četiri od 9 pacijenata su pokazali povišene nivoe PGLYRP1:
[0141] Uzorci RA sinovijalne tečnosti su zatim testirani na aktivnost TREM liganda u BWZ reporterskom testu kao što je opisano u Primeru 2. Ukratko sinovijalna tečnost je odmrznuta, vorteksovana i serijski razblažena, testirana u duplikatu /- 10µg/mlPGNECndi (Invivogen, San Dijego, Kalifornija, SAD) sa dodavanjem poliklonskog PGLYRP1 antitela (Kat. br. AF2590,Promega, Medison Viskonsin, SAD) ili negativnog kontrolnog poliklonskog. Na plastiku adherirana monoklonskaTREM-1 i izotipska antitela (R&D Systems, Mineaopolis Mineapolis, SAD) služe kao pozitivne i negativne kontrole redom. Sl.8 ilustruje primer kako je sinovijalna tečnost od pacijenata sa reumatoidnim artritisom sposobna da izazove BWZ/hTREM-1 reporterski ćelijski test na način zavisan od PGLYRP1.
Primer 17:Sklop ekspresionih vektora sisara korisnih u identifikaciji i karakterizaciji PGLYRP1:TREM 1 interakcije
A.) Konstrukcija pJSV002 hTREM-1-G4Sx3-hTREM-1/Fc6mut (SEK ID BR: 9)
[0142] Verzija humanog IgG1 deficijentna za vezivanje Fc receptora je izgrađena elimisanjem pvih 215 aminokiselina humanog IgG1 koji sadrži varijabilni i konstantni jedan (CH1) domen i pravljenjem sledećih aminokiselinskih supstitucija u okviru zgloba, konstantnog 2 i konstantnog 3 domena: (E216G,C220S,L234A,L235E,G237A,A330S,P331S). Ovaj konstrukt je dobio ime Fc6mut pošto je načinjeno 6 mutacija da se moduliše vezivanje za Fc receptore dok je 7. mutacija (E216G) inkorporirana da se kreira aApal restrikciono mesto za kloniranje. Ove mutacije su ugrađene u pJSV002 (modifikovani pTT5, Zhang J etal. Protein Expression and Purification, tom 65, izdanje 1, Maj 2009, str 77-8)dozvoljavaju kloniranje vanćelijskih domena receptora 5' iz Fc6mut kao EcoRI/Apal fragmenata. cDNK je sintetisana sa 5' EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvencom CD33 vodećom sekvencom praćeno sa vanćelijskim domenom humanog TREM-1 (ak17-200) sa umetnutim Kpnl restrikcionim mestom i glicinglicin-glicin-serin razdelnikom koji je ponovljen tri puta (G4Sx3) praćeno sa dodatnom kopijom vanćelijskog domena humanog TREM-1 (ak17-200) i Apa1 mestom da se dozvoli kloniranje uzvodno od Fc6mut.Ova sintetisana DNK je isečena sa EcoRI i ApaI i ligirana u pJSV002 Fc6mut koji je takođe bio pripremljen sa EcoRI/Apal digestijom.Ova ligacija je elektroporisana u DH10B E.coli i naneta na ploče sa agarom i ampicilinom. Pojedinačni klonovi su gajeni preko noći u kulturama sa 2ml LB ampicilin i pripremljeni minipreparacijom praćeno sa restrikcionim ispitivanjem sa EcoRI/Apal da se nađu klonovi sa odgovarajućim insertom od 1219 baznih parova. Ispravni klonovi su sekvencirani, i jedan od ispravnih klonova (#519) je odabran za pripremu dodatne DNK pripremom velikih razmera.
B.) Konstrukcija hTREM-1-COMP-SBP38x2-6His (SEK ID BR: 10)
[0143] Da bi se napravio pentamerni TREM ECD molekul, C terminalna epitopska oznaka je kreirana u pJSV002 ekspresionom vektoru. Sintetička cDNK koja kodira 3' kraj oligomernog proteina hrskavice (COMP) je fuzionisana sa dve kopije streptavidin vezujućeg proteinskog domena (SBP) praćeno sa C-terminalnim 6xHis domenom, ugrađenim u pJSV002 tako da vanćelijski domeni recepora mogu biti klonirani 5' od ovog fragmenta, kao EcoRI/KpnI fragment.Zatim je sintetisana ahTREMcDNK koja sadrži EcoRI restrikciono mesto praćeno sa GCCACC Kozak sekvencom i vanćelijskim domenom humanog TREM-1 sa C-terminalnim Kpnl mestom. Ovaj EcoRI/KpnI fragment je ligiran u pJSV002 COMP-SBP38x2-6His vektor opisan iznad.Ova ligacija je elektroporisana u DH10B E.coli (Life Technolohies, Karlsbad Kalifornija, SAD) i naneta na ploče sa ampicilinom i agarom. Pojedinačni klonovi su gajeni preko noći u kulturama sa 2ml LB ampicilin i pripremljeni minipreparacijom da se nađu klonovi sa odgovarajućim insertom od 616 bp. Ispravni klonovi su sekvencirani, i jedan od ispravnih klonova #525 je odabran za pripremu dodatne DNK pripremom velikih razmera. cDNK u punoj dužini je navedena kao SEK ID BR: 10.
C.) Konstrukcija pJSV002 hCD83-G4Sx3-hCD83/Fc6mut (SEK ID BR: 11)
[0144] Ranije je pokazano da hCD83 tetramer ima slabo vezivanje pomoću FACS analize za širok spektar ćelijskih linija i stoga čini odličnu negativnu kontrolu za IPMS eksperiment opisan u primeru 3. Da bi se napravio ovaj molekul, cDNK je sintetisana sa 5' EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvencom, CD33 vodećom sekvencom praćeno sa vanćelijskim domenom humanog CD83 sa umetnutim Kpnl restrikcionim mestom i glicinglicin-glicin-serin razdelnikom ponovljenim tri puta (G4Sx3) praćeno sa dodatnom kopijom vanćelijskog domena humanog CD83.Ova cDNK je zatim klonirana uzvodno od hFc6mut u pJSV002 ekspresionom vektoru koji je prethodno opisan. Dobijeni zreli protein je naveden kao SEK ID BR: 6 i tandemska sekvenca cDNK CD83 vanćelijskog domena između EcoR1 i Apa1 je prikazana u SEK ID BR: 11.
D.) Konstrukcija pJSV002 NCOMP-hDCIR (SEK ID BR: 12)
[0145] Kao negativna kontrola za hTREM-1-COMP pentamer korišćen u primeru 5, hDCIR-COMP je korišćen. pJSV002 baziran ekspresioni plazmid je kreiran sa sledećim elementima: 6xHIS oznaka praćena sa dve kopije streptavidin vezujućeg proteinskog domena (SBP) fuzionisanog za 3' kraj oligomernog proteina hrskavice (COMP) tako da vanćelijski domeni receptora tipa 2 mogu biti klonirani 3' od ovog fragmenta kao BgIII/BamHI fragmenti i eksprimirani kao pentamerni solublni receptori. PCR fragment je amplifikovan od sintetičkog šablona cDNK da se generiše DNK fragment sa BgIII i BamHI krajevima na 5' i 3' krajevima redom.Ovaj fragment je isečen sa BgIII i BamHI restrikcionim enzimima praćeno sa prečišćavanjem traka. Dobijeni fragment je ligiran u pJSV002 NCOMP koji je prethodno bio isečen sa BgIII i BamHI. Ligacija je elektroporisana u DH10B E.coli i naneta na selekcioni agar sa ampicilinom.Klonovi su izabrani, pripremljeni minipreparacijom i ispitani sa EcoRI i BamHI i klonovi sa odgovarajućim insertom od 1.137kB su sekvencirani. cDNK koja kodira za pun otvoren okvir čitanja uključujući NCOMP-SBP i DCIR sekvencu je označena SEK ID BR: 12 i kodira za prethodno pomenutu sekvencu SEK ID BR: 4 zrelog peptida.
E.) Konstrukcija pNNC649-hTREM1-hFc6mut dimera
[0146] TREM1-Fc dimer je korišćen u Primeru 14 da se potvrdi vezivanje za PGLYRP1 i testira vezivanje za druge članove PGLYRP familije. ApTT5 baziran plazmid (Zhang J etal., Protein Expression and Purification, tom 65, izdanje 1, Maj 2009, str. 77-8)pNNC649 je korišćen da se dozvoli kloniranje vanćelijskih domena receptora u okviru i 5' od Fc6mut. U cilju da se eksprimira hTREM1-Fc6mut, cDNK je sintetisana sa 5' EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvencom i hCD33 vodećom sekvencom praćeno sa vanćelijskim domenom humanog TREM-1 (ak17-200) praćeno sa Kpn1 mestom.Ova cDNK je klonirana u pNNC549 korišćenjem restrikcionog enzima i tehnika DNK ligaze poznatih prosečnim poznavaocima oblasti. cDNK koja kodira za pun otvoren okvir čitanja uključujući CD33 vodeću,hTREM1 ECD i Fc6mut sekvencu je označena SEK ID BR: 12 i kodira za sekvencu SEK ID BR: 44 zrelog peptida.
F.) Konstrukcija pNNC649-hTREML1-Fc6mut dimera
[0147] Sintetička cDNK je napravljena sa 5' EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvencom i hCD33 vodećom sekvencom praćeno sa vanćelijskim domenom humanog TREML1 (ak16-162) praćeno sa Kpn1 mestom. Ova cDNK je klonirana u pNNC549 vektor prethodno opisan korišćenjem restrikcionog enzima i tehnika DNK ligaze poznatih prosečnim poznavaocima oblasti. cDNK koja kodira za pun otvoren okvir čitanja uključujući CD33 vodeću,hTREML1 ECD i Fc6mut sekvencu je označena SEK ID BR: 45 i kodira za zrelopeptidnu sekvencu SEK ID BR: 46.
G.) Konstrukcija pNNC649-hTREML2-Fc6mut dimera
[0148] Sintetička cDNK je napravljena sa 5’ EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvencom i hCD33 vodećom sekvencom praćeno sa vanćelijskim domenom humanog TREML2 (ak19-268) praćeno sa Kpn1 mestom. Ova cDNK je klonirana u pNNC549 vektor prethodno opisan korišćenjem restrikcionog enzima i tehnika DNK ligaze poznatih prosečnim poznavaocima oblasti. cDNK koja kodira za pun otvoren okvir čitanja uključujući CD33 vodeću,hTREML2 ECD i Fc6mut sekvencu je označena SEK ID BR: 47 i kodira za zrelopeptidnu sekvencu SEK ID BR: 48.
H.) Konstrukcija pNNC649-hTREM2-Fc6mut dimera
[0149] Sintetička cDNK je napravljena sa 5’ EcoRI restrikcionim mestom, GCCACC Kozak sekvencom i hCD33 vodećom sekvencom praćeno sa vanćelijskim domenom humanog TREM2 (ak19-174) praćeno sa Kpn1 mestom. Ova cDNK je klonirana u pNNC549 vektor prethodno opisan korišćenjem restrikcionog enzima i tehnika DNK ligaze poznatih prosečnim poznavaocima oblasti. cDNK koja kodira koja kodira za pun otvoren okvir čitanja uključujući CD33 vodeću,hTREM2 ECD i Fc6mut sekvencu je označena SEK ID BR: 49 i kodira za zrelo-peptidnu sekvencu SEK ID BR: 50.
Primer 18: MultimerizovanPGLYRP1 aktivira TREM-1
[0150] Kontra-struktura ili ligand za TREM-1 je identifikovan kroz analize vezivanja i IP/MS proteomiku. Identitet liganda, PGLYRP1 (ili PGRP-S) je potom validiran preko specifične blokade.
[0151] Interesantno, dok vezivanje solubilnog PGLYRP1 može biti dokazano za TREM-1, aktivacija TREM-1 pomoću PGLYRP1 zahteva istovremeno prisustvo agensa za formiranje skela kao što su neutrofilne vanćelijske zamke (NETs) ili PGN.
[0152] Da bi se testiralo da li takvi alternativni, i multimerizovani formati PGLYRP1 mogu vezati i/ili akivirati TREM-1, ćelijski-vezan PGLYRP1 protein je dizajniran i eksprimiran. Dva konceptualno različita PGLYRP1 konstrukta su testirana. U jednom, GPI-usidreni sekvencioni motiv je dodat na C-terminalni kraj PGLYRP1. U drugom, PGLYRP1 je veštački usidren u ćelijsku membranu preko adicije, na N-terminus, unutarćelijskog (IC) i transmembranskog domena (TM) izvedenog od MDL-1 receptora Tipa II. Poslednje pomenuti konstrukti su označeni PGLYRP1 Tipa II (Sl 9a). U Tip II 1.0 (SEK ID BR:37), naelektrisana aminokiselina TM iz nativnog MDL-1 receptora je održana, i efikasna ekspresija ovog proteina, je zavisna od ko-ekspresije DAP12. U PGLYRP1 konstruktu Tipa II 2.0 (SEK ID BR: 38), naelektrisani TM ostatak je supstituisan sa neutralnom aminokiselinom (Lizin u Leucin), omogućavajući proteinu da bude eksprimiran nezavisno od npr. DAP12. cDNK koje kodiraju ove konstrukte su prolazno eksprimirane u HEK293 6E ćelijama, ćelije su sakupljene drugog dana posle transfekcije i analizirana je njihova sposobnost da stimulišu reportersku ćelijsku liniju BWZ/hTREM1. Transfektanti PGLYRP1 Tipa II su ko-inkubirani sa BWZ/hTREM1 reporterskim ćelijama u odsustvu PGN. TREM1 aktivacija je očitana nakon 18 sati korišćenjem BetaGlo reagensa (Kat. br. E4720,Promega, Medison Viskonsin, SAD). Transfektanti koji eksprimiraju PGLYRP1 Tipa II indukovali su aktivaciju TREM-1 u odsustvu PGN, do nivoa 24-puta višeg od opaženog sa kontrolnim ćelijama transfektovanim sa praznim ekspresionim vektorom. Suprotno, GPI-usidreni PGLYRP1, imobilisan preko C-terminusa PGLYRP1, nije posredovao ni u kakvoj TREM-1 aktivaciji. Ekspresija membranski-vezanog i imobilisanog PGLYRP1 proteina na ćelijskoj površini je utvrđena protočnom citometrijom korišćenjem poliklonskog anti-PGLYRP1 antitela (AF2590). Oba proteina, PGLYRP1 i GPI-PGLYRP1 Tipa II, su pokazana da su zaista eksprimirana na ćelijskoj površini.
[0153] Tabela iznad prikazuje da PGLYRP1 vezan za površinu ćelijske membrane preko C-terminalnog GPI usidrenja nije tako potentan u indukovanju TREM-1 aktivnosti kao PGLYRP1 protein Tipa II vezan za ćelijsku membranu preko N-terminalnog dela. Ovo ilustruje značaj slobodnog C-terminalnog PGLYRP1 dela da bi bio sposoban da stimuliše TREM-1.
[0154] Dalje je pokazano da je aktivacija PGLYRP1 Tipa II inhibirana specifično pomoću anti-PGLYRP1 antitela. Dodavanje poliklonskog (Kat. br.AF2590, R&D Systems, Mineapolis Mineapolis, SAD) PGLYRP1 antitela u visokoj koncentraciji (1 µg/100 µl test zapremina) je tako sposobna da potpuno inhibira ovu PGLYRP1 indukovanu aktivnost.
[0155] Sekvence na samom C-terminalnom domenu PGLYRP1 izgledaju kritično za sposobnost aktiviranja TREM-1 receptora. Nekoliko konstrukata, koji dele kao zajedničku karakteristiku, modifikaciju krajnjeg C-terminusa od PGLYRP1, su tako opaženi da ne posreduju u aktivaciji TREM1/BWZ reporterske aktivnosti, dok odgovarajući konstrukti, koji su međutim modifikovani na N-terminusu, ne pokazuju aktivnost.
[0156] Ovo ukazuje na značaj slobodnog C-terminalnog dela PGLYRP1 da bi bio sposoban da stimuliše TREM-1.
Interpretacija i biološke perspektive
[0157] Sposobnost aktiviranja TREM-1 receptora korišćenjem ili nativnog PGLYRP1-liganda u prisustvu PGN ili alternativno, novih PGLIRP1 varijanti koje su pokazane da prevazilaze potrebu za PGN, jasno pokazuje da PGN nije apsolutni ko-faktorski uslov za TREM-1 aktivaciju. Izgleda da zajednička karakteristika raznih molekularnih PGLYRP1 formata za koje je pokazano da dozvoljavaju TREM-1 aktivaciju nezavisnu od PGN predstavlja format visoke gustine koji vodi do hipoteze da predominantna uloga PGN, kada deluje kao ko-faktor za nativni ligand, je da obezbedi skelu za multimerizaciju. In vivo, takva skela može biti obezbeđena pomoću neutrofilnih vanćelijskih zamki (NETs) (Blood2005, 106: 2551-58) ili drugih matriksnih struktura koje se prirodno javljaju, kao što su hijaluronska kiselina, proteoglikanske strukture, kao što je verzikan, agrekan, dekorin, ili fibrin, od kojih svi mogu da multimerizuju ili drugačije prikažu PGLYRP1.
[0158] Ovi podaci sugerišu da modifikacija C-terminalnog dela PGLYRP1 smanjuje TREM-1 aktivaciju koja zauzvrat ukazuje da bi blokiranje C-terminalnog dela PGLYRP1 sa agensom, kao što je antitelo usmereno na C-terminalni deo PGLYRP1, smanjilo TREM-1 interakciju i time TREM-1 stimulaciju.
Primer 19: PGLYRP1 Tipa ll je sposoban da indukuje oslobađanje TNFalfa iz ćelija sinovijalnog tkiva od pacijenata sa reumatoidnim artritisom.
[0159] Uzorci sinovijalnog tkiva su dobijeni od pacijenata sa RA tokom potpune zamene kolena. Pojedinačna suspenzija ćelija sinovijalnog tkiva je izolovana digestijom putem 4mg/ml kolagenaze (Kat. br. 11088793001, Roche, Manhajm, Nemačka) i 0.1mg/ml DNaze (Kat. br. 11284932001, Roche, Manhajm, Nemačka) tokom 1h na 37 stepeni. Ćelije sinovijalnog tkiva (1x10^5/bunariću u medijumu za kulture RPMI (Kat. br. 22400105, Life Technologies, Karlsbad Kalifornija, SAD)+10% FCS (Kat. br.S0115, BioChrom AG, Berlin, Nemačka)su ko-kultivisani sa raznim dozama HEK ćelija prolazno transfektovanim sa PGLYRP1 Tipa II u hipoksičnim uslovima. Nakon inkubacije od 24h, ćelijski supernatanti su sakupljeni, i citokini su izmereni pomoću TNFa ELISA (Kat. br. DY210, R&D Systems, Mineapolis, Mineapolis, SAD).
[0160] Ovaj primer pokazuje da TREM-1 ligand može da indukuje TNF-alfa na doznozavistan način u ćelijama sinovijalnog tkiva od pacijenata sa reumatoidnim artritisom.
Primer 20: PGLYRP1 antitela blokiraju TREM-1 posredovan signal u neutrofilima i smanjuju oslobađanje IL-8
[0161] Imajući u vidu da neutrofili mogu osloboditi PGLYRP1 i da neutrofili takođe eksprimiraju TREM-1 receptor, testirali smo da li PGLYRP1 izveden iz neutrofila može da stimuliše neutrofile na autokrini način. Izolovani neutrofili su stimulisani sa PGN-SA (Kat. br. tlrl-pgnsa, Invivogen, San Dijego Kalifornija, SAD),i oslobađanje IL-8 u medijum za kulture je izmereno. PGLYRP1 antitelo,mAb 0184, je sposobno da smanji PGN-SA-indukovano IL-8 oslobađanje. Neutrofili su izolovani iz pune krvi humanog zdravog donora kao što je opisano u Primeru 3 i ponovo suspendovani u RPMI/10% FBS. Ćelije su nanete u 1.5x10E6 ćelija/ml, i test bunarići u triplikatima su testirani u sledećim uslovima: bez dodate stimulacije, 10µg/ml PGN-SA samo, ili 10µg/ml PGN-SA u prisustvu PGLYRP1 antitela ili kontrolnog antitela hlgG4 izotipa pri 4µg/ml. Uzorci su kultivisani 24 sata u inkubatoru na 37°C, 5% CO2. Supernatanti su zatim sakupljeni i analizirani na IL-8 korišćenjem Bioplex Pro Human Cytokine IL-8 kompleta (Kat. br. 171-B5008M, BioRad, Herkjuliz Kalifornija, SAD).
[0162] Ovaj primer ilustruje da IL-8 oslobađanje iz neutrofila indukovano stimulacijom sa bakterijski izvedenim PGN-SA može biti redukovano anti-PGLYRP1 antitelom. TREM-1 ligand PGLYRP1 je prema tome autokrini stimulus, i PGLYRP1 antitelo stavljeno ovde na uvid javnosti je potencijalno korisno u inhibiranju odgovora neutrofila.

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koje je sposobno za specifično vezivanje PGLYRP1 i smanjivanje PGLYRP1-posredovane TREM-1 aktivnosti.
2. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa patentnim zahtevom 1, koje je sposobno za specifično vezivanje SEK ID BR: 37 (PGLYRP11.0 Tipa II) i/ili SEK ID BR: 38 (PGLYRP12.0 Tipa II).
3. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-2, koje je sposobno da se takmiči sa:
(i) antitelom koje ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 19 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 20;
(ii) antitelom koje ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 15 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 16;
(iii) antitelom koje ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 27 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 28;
(iv) antitelom koje ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 23 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 24;
(v) antitelom koje ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 31 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 32 i/ili
(vi) antitelom koje ima teški lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 35 i laki lanac kao što je prikazano u SEK ID BR: 36 za vezivanje za PGLYRP1.
4. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje sadrži:
(i) CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (SYWMN) iz SEK ID BR: 15, gde jedan od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(ii) CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (MIHPSDSETRLNQKFKD) iz SEK ID BR: 15, gde jedna, dve ili tri od pomenutih aminokiselina je po izboru različiti aminokiselinski ostatak;
(iii) CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 98 do 108 (DYSDYDGFAY]) iz SEK ID BR: 15, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina;
(iv) CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 34 (RASQSISDYLH) iz SEK ID BR: 16, gde jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina;
(v) CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 51 do 56 (ASQSIS) iz SEK ID BR: 16, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina; i
(vi) CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 89 do 97 (QNGHSFPLT) iz SEK ID BR: 16, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina.
5. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje sadrži:
(i) CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DYNMY) iz SEK ID BR: 19, gde jedan od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(ii) CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (YIDPYNGDTSYNQKFKG) iz SEK ID BR: 19, gde jedna, dve ili tri od pomenutih aminokiselina je po izboru različiti aminokiselinski ostatak;
(iii) CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 109 (GDYGNPFYLDY) iz SEK ID BR: 19, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina;
(iv) CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 33 (SVSSSVNYMY) iz SEK ID BR: 20, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina:
(v) CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 49 do 55 (DTSKLPS) iz SEK ID BR: 20, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina; i
(vi) CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 88 do 96 (QQWTSNPPT) iz SEK ID BR: 20, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina.
6. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje sadrži:
(i) CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DTYIH) iz SEK ID BR: 23, gde je jedan od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(ii) CDRH2 sekvencu aminokiselina 50 do 66 (RIDPANDDTKYDPNFQG) iz SEK ID BR: 23, gde jedna, dve ili tri od pomenutih aminokiselina je po izboru različiti aminokiselinski ostatak;
(iii) CDRH3 sekvencu aminokiselinskih ostataka 99 do 108 (SDNSDSWFAY) iz SEK ID BR: 23, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina;
(iv) CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 33 (SVSSSVNFMN) iz SEK ID BR: 24, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina;
(v) CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 49 do 55 (DTSKLAP) iz SEK ID BR: 24, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina; i
(vi) CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 88 do 96 (HQWSSYSLT) iz SEK ID BR: 24, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina.
7. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje sadrži:
(i) CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DYNMH) iz SEK ID BR: 27, gde jedan od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(ii) CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (YVDPYDGGTSSNQKFKG) iz SEK ID BR: 27, gde jedna, dve ili tri od pomenutih aminokiselina je po izboru različiti aminokiselinski ostatak;
(iii) CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 106 (EVPYYFDY) iz SEK ID BR: 27, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina;
(iv) CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 33 (VASSSVTYMY) iz SEK ID BR: 28, gde je jedan, dva ili tri od pomenutih aminokiselinskih ostataka po izboru različita aminokiselina;
(v) CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 49 do 54 (THPLAS) iz SEK ID BR: 28, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina; i
(vi) CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 87 do 95 (PHWNTNPPT) iz SEK ID BR: 28, gde jedan ili dva od pomenutih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina.
8. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje sadrži:
(i) CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (DYYMY) iz SEK ID BR: 31, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(ii) CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (AISDDSTYTYYPDSVKG) iz SEK ID BR: 31, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(iii) CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 109 (GGYGNLYAMDY) iz SEK ID BR: 31, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka je različita aminokiselina;
(iv) CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 35 (TASSSVSSSYLH) iz SEK ID BR: 32, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka je različita aminokiselina;
(v) CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 51-57 (STSNLAS) iz SEK ID BR: 32, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina; i
(vi) CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 90-98 (HQYHRSPFT) iz SEK ID BR: 32, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina.
9. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, koje sadrži:
(i) CDRH1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 31 do 35 (NYVMH) iz SEK ID BR: 35, gde jedan od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(ii) CDRH2 sekvencu koja odgovara aminokiselinama 50 do 66 (WINPFNDGTNYNENFKN) iz SEK ID BR: 35, gde jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina je po izboru različit aminokiselinski ostatak;
(iii) CDRH3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 99 do 109 (SGFITTLIEDY) iz SEK ID BR: 35, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina;
(iv) CDRL1 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 24 do 34 (KASESVGSFVS) iz SEK ID BR: 36, gde jedan, dva ili tri od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina;
(v) CDRL2 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 50 do 56 (GASNRYT) iz SEK ID BR: 36, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina; i
(vi) CDRL3 sekvencu koja odgovara aminokiselinskim ostacima 89 do 96 (GQYYTHPT) iz SEK ID BR: 36, gde jedan ili dva od ovih aminokiselinskih ostataka je po izboru različita aminokiselina.
10. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
11. Monoklonsko antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9, ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 10, za primenu kao lek.
12. Izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9, ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 10, za primenu u lečenju inflamatorne bolesti ili autoimune bolesti koja nastaje od akutne ili hronične inflamacije, kod subjekta kome je to potrebno.
13. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment za primenu ili farmaceutska kompozicija za primenu u skladu sa patentnim zahtevom 12, gde inflamatorna bolest ili autoimuna bolest je odabrana iz grupe koja se sastoji od: inflamatorne bolesti creva, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, sindroma iritabilnog creva, reumatoidnog artritisa, psorijaze, psorijaznog artritisa, sistemskog eritemskog lupusa, lupus nefritisa, dijabetesa tipa I, Gravesove bolesti, multiple skleroze, autoimunog miokarditisa, Kavasakijeve bolesti, koronarne arterijske bolesti, hronične opstruktivne bolesti pluća, intersticijalne bolesti pluća, autoimunog tiroiditisa, skleroderme, sistemske skleroze, osteoartritisa, atopijskog dermatitisa, vitiliga, bolesti kalem-protiv-domaćina, Sjogrenovog sindroma, autoimunog nefritisa, Gudpasterovog sindroma, hronične inflamatorne demijelinizirajuće polineuropatije, alergije, i astme.
14. Metoda proizvodnje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9, koja sadrži antitelo koje se rekombinantno eksprimira ili njegov fragment u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji.
RS20181290A 2012-02-15 2012-11-30 Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana RS57827B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261598968P 2012-02-15 2012-02-15
EP12158974 2012-03-12
US201261672799P 2012-07-18 2012-07-18
EP12795417.0A EP2814842B1 (en) 2012-02-15 2012-11-30 Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1
PCT/EP2012/074093 WO2013120554A1 (en) 2012-02-15 2012-11-30 Antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57827B1 true RS57827B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=48983555

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181290A RS57827B1 (sr) 2012-02-15 2012-11-30 Antitela koja vezuju protein 1 prepoznavanja peptidoglikana

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9663568B2 (sr)
EP (2) EP2814842B1 (sr)
JP (1) JP6400480B2 (sr)
CN (2) CN104203977A (sr)
DK (1) DK2814842T3 (sr)
ES (1) ES2690786T3 (sr)
HR (1) HRP20181817T1 (sr)
LT (1) LT2814842T (sr)
PL (1) PL2814842T3 (sr)
RS (1) RS57827B1 (sr)
SI (1) SI2814842T1 (sr)
SM (1) SMT201800620T1 (sr)
WO (1) WO2013120554A1 (sr)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6400480B2 (ja) 2012-02-15 2018-10-03 ノヴォ ノルディスク アー／エス ペプチドグリカン認識タンパク質１に結合する抗体
CN103484468B (zh) * 2013-09-11 2015-04-08 华南农业大学 一种小菜蛾肽聚糖识别蛋白及其制备方法与应用
SG11201704640SA (en) * 2015-01-12 2017-07-28 Agency Science Tech & Res Monoclonal antibody against muramyl peptides in prevention and treatment of immune-mediated diseases
US11213598B2 (en) * 2015-11-12 2022-01-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Labeled probe and methods of use
CN107417773B (zh) * 2016-05-30 2020-09-08 国盛生化股份有限公司 黏合细胞壁之胜肽
WO2019032624A1 (en) * 2017-08-08 2019-02-14 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DEACTIVATING TREM1-EXPRESSING MESHLOID CELLS
US10836828B2 (en) 2019-02-06 2020-11-17 Pionyr Immunotherapeutics, Inc. Anti-TREM1 antibodies and related methods
CN109879956A (zh) * 2019-03-04 2019-06-14 哈尔滨工业大学 一种肿瘤免疫生物标志物及其应用
CN118307672B (zh) * 2021-07-14 2026-04-17 浙江大学 一种抗人MICA/B α3区的抗体及其应用
CN115873109B (zh) * 2022-05-16 2024-02-09 江苏省中国科学院植物研究所 单克隆抗体及其在制备用于预防/治疗神经系统退行性疾病的生物制品中的应用
WO2025007943A1 (zh) * 2023-07-06 2025-01-09 荣昌生物制药(烟台)股份有限公司 用taci-fc融合蛋白治疗anca相关性血管炎的方法
WO2025042607A1 (en) * 2023-08-18 2025-02-27 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Modulation of pglyrp1 for treatment of cancer and autoimmunity
CN119286795B (zh) * 2024-12-12 2025-02-25 天津一瑞生物科技股份有限公司 鼠抗革兰阳性菌肽聚糖杂交瘤细胞株,单克隆抗体和应用
CN120718152B (zh) * 2025-09-01 2025-11-18 北京大学口腔医学院 一种特异性结合pglyrp1的单克隆抗体及其制备方法和应用
CN120737202B (zh) * 2025-09-01 2025-11-14 北京大学口腔医学院 一种抗pglyrp1抗体及其制备方法和应用
CN120737201B (zh) * 2025-09-01 2025-11-18 北京大学口腔医学院 一种靶向pglyrp1的单克隆抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4736866B1 (en) 1984-06-22 1988-04-12 Transgenic non-human mammals
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
JP2972257B2 (ja) 1990-01-24 1999-11-08 株式会社日立製作所 パケット交換機
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5116742A (en) 1986-12-03 1992-05-26 University Patents, Inc. RNA ribozyme restriction endoribonucleases and methods
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US4813316A (en) 1987-12-10 1989-03-21 Hobart Corporation Control system and method for a food product slicer
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
AU633958B2 (en) 1989-07-25 1993-02-11 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5436146A (en) 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
ATE174058T1 (de) 1989-11-06 1998-12-15 Cell Genesys Inc Herstellung von proteinen mittels homologer rekombination
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
US5780225A (en) 1990-01-12 1998-07-14 Stratagene Method for generating libaries of antibody genes comprising amplification of diverse antibody DNAs and methods for using these libraries for the production of diverse antigen combining molecules
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5393788A (en) 1990-07-10 1995-02-28 Smithkline Beecham Corporation Phenylalkyl oxamides
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
WO1992006180A1 (en) 1990-10-01 1992-04-16 University Of Connecticut Targeting viruses and cells for selective internalization by cells
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
ES2154637T3 (es) 1991-05-14 2001-04-16 Univ Connecticut Aportacion de genes dirigidos que codifican proteinas inmunogenicas.
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
ES2149774T3 (es) 1991-06-05 2000-11-16 Univ Connecticut Aportacion dirigida de genes que codifican proteinas secretoras.
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
AU3434393A (en) 1992-01-17 1993-08-03 Regents Of The University Of Michigan, The Targeted virus
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JPH07505773A (ja) 1992-04-03 1995-06-29 ヤング　アレキサンダー　ティー 標的化されたウイルスベクターを用いた遺伝子治療
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
FR2694851B1 (fr) 1992-08-12 1994-12-23 Sgs Thomson Microelectronics Circuit de tirage vers un état déterminé d'une entrée de circuit intégré.
JPH08501085A (ja) 1992-08-26 1996-02-06 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 抗腫瘍剤としてのサイトカインｉｐ−１０の利用
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
KR950703640A (ko) 1992-10-09 1995-09-20 가일 케이,나우톤. 간 보존 세포(liver reserve cells)
EP1362913B1 (en) 1992-10-30 2006-01-25 The General Hospital Corporation Interaction trap system for isolating proteins
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
CA2153387A1 (en) 1993-01-07 1994-07-21 Hubert Koester Dna sequencing by mass spectrometry
US5424286A (en) 1993-05-24 1995-06-13 Eng; John Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same
US5498531A (en) 1993-09-10 1996-03-12 President And Fellows Of Harvard College Intron-mediated recombinant techniques and reagents
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9517780D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
GB9517779D0 (en) 1995-08-31 1995-11-01 Roslin Inst Edinburgh Biological manipulation
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
IL128332A0 (en) 1996-08-30 2000-01-31 Novo Nordisk As GLP-1 derivatives
US6034217A (en) 1996-09-17 2000-03-07 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Peptidoglycan recognition proteins and their production
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
WO1998039448A2 (en) 1997-03-07 1998-09-11 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US6878687B1 (en) 1997-03-07 2005-04-12 Human Genome Sciences, Inc. Protein HMAAD57
WO1998039446A2 (en) 1997-03-07 1998-09-11 Human Genome Sciences, Inc. 70 human secreted proteins
US20030175858A1 (en) 1997-03-07 2003-09-18 Ruben Steven M. 186 human secreted proteins
US20030049618A1 (en) 1997-03-07 2003-03-13 Ruben Steven M. 186 human secreted proteins
US6420526B1 (en) 1997-03-07 2002-07-16 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
BRPI9809391B8 (pt) 1997-04-14 2021-05-25 Amgen Res Munich Gmbh processo para a produção de um receptor de antígeno anti-humano, anticorpo humano e composição farmacêutica
EP0981548A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc GLYCOSYLATABLE SINGLE CHAIN ANTIGEN-BINDING PROTEINS, MANUFACTURE AND USE THEREOF
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6172211B1 (en) 1997-07-11 2001-01-09 Boehringer Ingelheim International Gmbh Nucleic acid encoding tag7 polypeptide
US20020102542A1 (en) 1997-10-07 2002-08-01 Daikichi Fukushima Polypeptide, cdna encoding the polypeptide, and use of the both
CA2331386A1 (en) 1998-06-26 2000-01-06 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human signal peptide-containing proteins
US6858204B2 (en) 1999-06-30 2005-02-22 Corxia Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20020172952A1 (en) 1999-06-30 2002-11-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030170255A1 (en) 1999-06-30 2003-09-11 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20030211510A1 (en) 1999-06-30 2003-11-13 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6504010B1 (en) 1999-06-30 2003-01-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20020197669A1 (en) 2000-12-13 2002-12-26 Bangur Chaitanya S. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6509448B2 (en) 1999-06-30 2003-01-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
WO2001053312A1 (en) 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20030134283A1 (en) 2000-10-03 2003-07-17 Peterson David P. Genes regulated in dendritic cell differentiation
US7858094B2 (en) 2000-12-08 2010-12-28 Geneprint Corporation TREM-1 splice variant for use in modifying immune responses
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US8231878B2 (en) 2001-03-20 2012-07-31 Cosmo Research & Development S.P.A. Receptor trem (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
CA2342376C (en) 2001-03-20 2013-11-12 Marco Colonna A receptor trem (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
US20040236092A1 (en) 2001-07-13 2004-11-25 Roman Dziarski Peptidologlycan recognition protein encoding nucleic acids and methods of use thereof
WO2003011213A2 (en) 2001-07-30 2003-02-13 Eli Lilly And Company Method for treating diabetes and obesity
CA2459219A1 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
CA2462883A1 (en) 2001-10-12 2003-04-17 Schering Corporation Use of bispecific antibodies to regulate immune responses
EP2261250B1 (en) 2001-12-21 2015-07-01 Human Genome Sciences, Inc. GCSF-Albumin fusion proteins
EP1329227A1 (en) 2002-01-22 2003-07-23 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Diagnostic conjugate useful for intercellular imaging and for differentiating between tumor- and non-tumor cells
US20060263770A1 (en) 2002-03-22 2006-11-23 Marco Colonna Novel receptor trem (triggering receptor expressed on myeloid cells) and uses thereof
AU2003265787A1 (en) 2002-08-29 2004-03-19 Five Prime Therapeutics, Inc. Methods of use for novel human polypeptides encoded by polynucleotides
GB0305478D0 (en) 2003-03-10 2003-04-16 Bioxell Spa Diagnostic and prognostic compounds and method
US20050255114A1 (en) 2003-04-07 2005-11-17 Nuvelo, Inc. Methods and diagnosis for the treatment of preeclampsia
DE10316701A1 (de) 2003-04-09 2004-11-04 Hinzmann, Bernd, Dr. Humane Nukleinsäuresequenzen aus Bronchialkarzinomen
EP1639090A4 (en) 2003-06-09 2008-04-16 Univ Michigan COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER
WO2005040219A1 (en) 2003-10-28 2005-05-06 Novo Nordisk A/S Laminin-5 gamma2-binding peptides, related compositions, and use thereof
EP1692506A4 (en) 2003-11-17 2008-01-09 Janssen Pharmaceutica Nv MODELING A SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE TO INFECTION
GB0401730D0 (en) 2004-01-27 2004-03-03 Bioxell Spa Diagnosis method
CA2557782A1 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
SI1751184T1 (sl) 2004-05-13 2010-01-29 Lilly Co Eli Fgf-21 fuzijski proteini
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
EA011390B1 (ru) 2004-09-02 2009-02-27 Эли Лилли Энд Компани Мутантные белки (мутеины) фактора роста фибробластов 21
GB0426146D0 (en) 2004-11-29 2004-12-29 Bioxell Spa Therapeutic peptides and method
US7655627B2 (en) 2004-12-14 2010-02-02 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006078463A2 (en) 2005-01-21 2006-07-27 Eli Lilly And Company Method for treating cardiovascular disease
TWI372629B (en) 2005-03-18 2012-09-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
WO2006135886A2 (en) 2005-06-13 2006-12-21 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
EP1907858A4 (en) 2005-06-13 2009-04-08 Univ Michigan COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER
WO2007146968A2 (en) 2006-06-12 2007-12-21 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Single-chain multivalent binding proteins with effector function
CA2666667C (en) 2006-10-19 2023-06-20 Baylor College Of Medicine Generating an immune response by inducing cd40 and pattern recognition receptors
US20080247955A1 (en) 2007-01-16 2008-10-09 Jun Kuai Inflammation treatment, detection and monitoring via TREM-1
CA2682147C (en) 2007-03-30 2017-08-08 Ambrx, Inc. Modified fgf-21 polypeptides and their uses
US20100306863A1 (en) * 2007-07-23 2010-12-02 Bioxell S.P.A. Screening, therapy and diagnosis
KR20100058509A (ko) 2007-07-31 2010-06-03 메디뮨 엘엘씨 다중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도
CA2693504A1 (en) 2007-08-03 2009-02-12 Eli Lilly And Company Treatment for obesity
CN101139599A (zh) * 2007-08-07 2008-03-12 西南大学 家蚕肽聚糖识别蛋白基因
US8933197B2 (en) 2007-08-15 2015-01-13 Amunix Operating Inc. Compositions comprising modified biologically active polypeptides
US20100261637A1 (en) 2007-09-05 2010-10-14 Novo Nordisk A/S Peptides derivatized with a-b-c-d- and their therapeutical use
CA2709217C (en) 2007-12-19 2021-01-05 Singulex, Inc. Scanning analyzer for single molecule detection and methods of use
WO2009126380A2 (en) 2008-03-05 2009-10-15 Singulex, Inc. Methods and compositions for highly sensitive detection of molecules
EP2796878A1 (en) 2008-05-23 2014-10-29 Biocartis NV New biomarkers for diagnosis, prediction and/or prognosis of sepsis and uses thereof
NZ603698A (en) 2008-07-08 2014-03-28 Abbvie Inc Prostaglandin e2 dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CN102171365B (zh) 2008-08-25 2014-01-29 森托科尔奥索生物科技公司 用于溃疡性结肠炎和相关疾病的抗tnf治疗的生物标记物
JP5878757B2 (ja) 2008-10-10 2016-03-08 アムジエン・インコーポレーテツド Ｆｇｆ２１変異体およびその使用
WO2010065439A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
CN101619102A (zh) * 2008-12-16 2010-01-06 中国科学院海洋研究所 一种具杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用
BRPI1007313A2 (pt) 2009-01-23 2016-02-10 Novo Nordisk As derivados de fgf21 com ligante de albumina a-b-c-d-e e seu uso.
WO2010132370A2 (en) 2009-05-11 2010-11-18 Government Of The U.S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Soluble tlt-1 for the treatment and diagnosis of sepsis
WO2010141469A2 (en) 2009-06-01 2010-12-09 Case Western Reserve University Protein biomarkers and therapeutic targets for autoimmune and alloimmune diseases
EP2440235A1 (en) 2009-06-11 2012-04-18 Novo Nordisk A/S Glp-1 and fgf21 combinations for treatment of diabetes type 2
AU2010270979B2 (en) 2009-06-22 2015-04-23 Medimmune, Llc Engineered Fc regions for site-specific conjugation
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US8513185B2 (en) 2009-10-13 2013-08-20 Alexander B. Sigalov Inhibition of TREM receptor signaling with peptide variants
KR101251023B1 (ko) 2009-11-05 2013-04-03 주식회사유한양행 신규한 단일클론항체를 포함하는 박테리아 감염 검출용 키트
EP2507381A4 (en) 2009-12-04 2016-07-20 Hoffmann La Roche MULTISPECIFIC ANTIBODIES, ANTIBODY ANALOGS, COMPOSITIONS AND METHODS
US8362210B2 (en) 2010-01-19 2013-01-29 Xencor, Inc. Antibody variants with enhanced complement activity
SG185107A1 (en) 2010-04-30 2012-12-28 Alexion Pharma Inc Antibodies having reduced immunogenicity in a human
WO2012064733A2 (en) 2010-11-09 2012-05-18 Medimmune, Llc Antibody scaffold for homogenous conjugation
WO2012088302A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Half immunoglobulin binding proteins and uses thereof
WO2012088290A2 (en) 2010-12-22 2012-06-28 Abbott Laboratories Tri-variable domain binding proteins and uses thereof
CA2827170A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 David M. Hilbert Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
JP6400480B2 (ja) 2012-02-15 2018-10-03 ノヴォ ノルディスク アー／エス ペプチドグリカン認識タンパク質１に結合する抗体

Also Published As

Publication number Publication date
US20180016326A1 (en) 2018-01-18
EP2814842B1 (en) 2018-08-22
US9663568B2 (en) 2017-05-30
SI2814842T1 (sl) 2018-10-30
WO2013120554A1 (en) 2013-08-22
ES2690786T3 (es) 2018-11-22
CN104203977A (zh) 2014-12-10
PL2814842T3 (pl) 2018-12-31
LT2814842T (lt) 2018-11-12
JP6400480B2 (ja) 2018-10-03
HRP20181817T1 (hr) 2018-12-28
US20150018528A1 (en) 2015-01-15
EP2814842A1 (en) 2014-12-24
EP3456742A1 (en) 2019-03-20
CN108530535B (zh) 2021-02-26
CN108530535A (zh) 2018-09-14
JP2015508763A (ja) 2015-03-23
SMT201800620T1 (it) 2019-01-11
US20190119367A1 (en) 2019-04-25
US10150809B2 (en) 2018-12-11
US10906965B2 (en) 2021-02-02
DK2814842T3 (en) 2018-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10906965B2 (en) Methods of treating autoimmune disease or chronic inflammation wtih antibodies that bind peptidoglycan recognition protein 1
CN113501878B (zh) 针对人tslp的多种抗体及其用途
KR102755473B1 (ko) 인간 il-4ra에 대한 항체 및 이의 용도
US9000127B2 (en) Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
WO2022042690A1 (zh) Ccr8抗体及其应用
US9550830B2 (en) Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
KR102641268B1 (ko) 점도를 감소시키기 위한 trem-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발
CA3164979A1 (en) New polypeptide complex
US12509520B2 (en) Anti-CD3 and anti-CD123 bispecific antibody and use thereof
MX2008014804A (es) Anticuerpos de afinidad elevada a receptor de il-6 humano.
WO2021143914A1 (zh) 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用
EP2975056A1 (en) Site directed mutagenesis of TREM-1 antibodies for decreasing viscosity
WO2016061632A1 (en) Fn14-binding proteins and uses thereof
JP2020172543A (ja) 骨髄細胞で発現されるトリガー受容体１（ｔｒｅｍ−１）に結合し、それを遮断する抗体
KR20220053000A (ko) Cr2 결합 단백질 및 의료 요법에서의 그의 용도
WO2022012639A1 (zh) Pd-1抗原结合蛋白及其应用