JP2000506721A - 核転移用レシピエント細胞質としての不活性卵母細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 動物胚の再構築方法は、二倍体核を第二減数分裂中期で停止している卵母細胞に転移することからなる。卵母細胞は、ドナー核が一定期間レシピエント細胞質と接触され続けられるように、転移時には活性化されない。二倍体核は、転移時に細胞周期のＧ０期またはＧ１期のいずれかの細胞から得られる。次に、再構築された胚を活性化する。正しい倍数性は、例えばノコダゾールなどの微小管阻害剤の存在下で再構築された胚をインキュベーションすることによって、活性中維持される。さらに、再構築された胚から、１以上の生きた動物が誕生する。本発明は、遺伝的な価値の高い形質転換動物および非形質転換動物の生産に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 核転移用レシピエント細胞質としての不活性卵母細胞 この発明は、以下に制限されるものではないが、遺伝的に選択される及び／ま たは修飾される動物等の動物の生産およびこれらの生産に有用な細胞に関するも のである。 除核された卵母細胞(oocyte)または一細胞接合体へのドナー核(donor nucleus )の転移(Transfer)による哺乳動物の胚(embryo)の再構築(reconstruction)は、 遺伝的に全く同一な個体の生産を可能にする。上記胚の再構築は、研究（即ち、 生物学的コントロールとして）および商業的応用（即ち、遺伝的に価値のある家 畜の増殖、肉製品の均一性、動物の管理）においても明らかに利点を有する。 核の転移による胚の再構築は、核の等価性や「発達中に核は変化するのか」と いう質問に答えるために初めて提案された（Spemann,Embryonic Development an d Induction 210-211 Hofner Publishing Co.，New York(1938)）。だんだんに 進行する胚期から核を転移することにより、核が胚の発達能力を制限する時点を 決定する実験が計画された。技術的制限やシュペーマン（Spemann）の不運な死 によってこれらの研究は１９５２年までには完成されず、この年、カエルにおい て核を性的な成熟体に発達させ得ること（Briggs and King，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 38 455-461(1952)が示された。これらの発見は、一つの個体から生 じた等しく分化全能性を有する核は、除核された卵に転移されると、「遺伝的に 全く同一な」個体のもととなり得るという現在の概念のもととなった。この本当 の意味では、それぞれで不明な細胞質の関与が異なるため上記個体はクローンで はなく、またクロモソーム再編成が示されなけ ればならない。 両生動物の胚クローニグの開示以来、同様の技術が哺乳動物に応用された。こ れらの技術は、二つのカテゴリー１）クロモソームＤＮＡが予め除去された成熟 分裂中期ＩＩの卵母細胞へドナー核を転移すること、２）双方の前核が除去され た受精１細胞接合体へドナー核を転移することに分けられる。有蹄動物において は、前者の方法が選択方法となった。前核置換の場合を除いて後者の方法を使用 して発達が報告されないからである。 一般的に、ドナー核の卵母細胞細胞質への転移は、細胞融合を誘導することに よって達成される。有蹄動物における融合は、そのカプレット（Couplet）の接 触／融合面にＤＣ電気パルスをあてることにより誘導される。細胞融合を誘導す る同様のパルスは、レシピエント卵母細胞もまた活性化する。胚再構築後の発達 は、発達を指揮する核の能力、即ち分化全能性、レシピエント細胞質の発達の適 格性（即ち、卵母細胞の成熟）、卵母細胞活性化、胚培養等の多くの要素に依存 する（reviewed Campbell and Wilmut in Vth World Congress on Genetics as Applied to Livestock 20 180-187(1994)）。 上記に加え、我々は、再構築された胚の最初の細胞周期に、正確な倍数性の維 持が重要であること示した(Campbell et al.,Biol.Reprod.49933-942(1993);Cam pbell et al.，Biol.Reprod.50 1385-1393(1994))。一細胞周期の間、全てのゲ ノムＤＮＡが一回、有糸分裂(mitosis)に先立ち一回のみ複製される。いずれか のＤＮＡが複製に失敗しまたは一回以上複製されると、有糸分裂時のその核の倍 数性は不正確なものとなる。各細胞周期の複製が一回に制限されるメカニズムは 不明確であるが、しかしながら、いくつか証拠は、無傷な核膜の維持がこの調整 に極めて重要であることを示す。除核されたされた分裂中期ＩＩの卵母細胞への ド ナー核の転移後、核に生ずる形態的なできごとは、マウス（Czolowiska et al. ，J．Cell Sci．69 19-34(1984)）、ウサギ（Collas and Robl，Biol．Reprod． 45 455-465(1991)）、ブタ（Prather et al.，J．Exp．Zool．225 355-359(1990 )）、メスウシ（Kanka et al.，Mol．Reprod．Dev．29 110-116(1991)）等の多 くの動物種で研究されている。融合と同時に、直ちにドナー核の外被が破壊され （ＮＥＢＤ）、そのクロモソームが早期に凝縮する（ＰＣＣ）。これらの作用は 、成熟／有糸分裂／減数分裂促進物質（ＭＰＦ）と呼ばれる細胞質活性物質によ って触媒される。この活性が、全ての有糸分裂細胞および減数分裂細胞において 、分裂中期に最高値に達する。成熟した哺乳動物の卵母細胞は、第二減数分裂の 中期（分裂中期ＩＩ）で停止し、高ＭＰＦ活性を有する。受精またはＭＰＦ活性 の活性化減退により、第二減数分裂が完了し第二極体が押し出され、この時クロ マチンが解凝縮し前核形成が起こる。核転移においてＭＰＦレベルが高くＭＥＢ ＤおよびＰＣＣが生じる際に胚が再構築される；これらの後、ＭＰＦ活性が減少 するとクロマチン解凝縮と核の再形成およびＤＮＡ配列の複製が起こる。再構築 された胚において、正確な倍数性は以下のいずれかのようにして維持される；第 一は、定められた細胞周期段階の核、例えばＧ１期の細胞の二倍体核を活性化時 の分裂中期ＩＩである卵母細胞へ転移することにより；または、第二は、レシピ エント卵母細胞を活性化し、ＭＰＦ活性消滅後にドナー核を転移することによる ものである。ヒツジでは、後者の方法は、ドナー細胞核として１６細胞胚(16 ce ll embryos)からの分割球(blastomere)を用いたとき、再構築された胚が胚盤胞 期へ発達する頻度を２１％〜５５％へ増加させる（Campbell et al.，Biol．Rep rod．50 1385-1393(1994)）。 このような再構築された胚の発達頻度の上昇は、いまのところ核の再プログラ ム(reprogramming)の問題を扱ってはいない。発達中にある遺 伝子が「インプリントされる（imprinted）」、即ちもやは転写されないように 変換される。インプリントに関する研究から、このインプリントは生殖細胞形成 （即ち、再プログラム）中に除去されることを示す。一つの可能性としては、減 数分裂を受ける細胞に存在する細胞質因子にクロマチンが接触することによって 、この再プログラムが影響を受けることがある。これはドナー核の発達の時計を 再プログラムするため、核転移による胚の再構築中にこの状況を如何に模倣する かという疑問が生じる。 ここで、分裂中期ＩＩで停止された卵母細胞への核転移が、正常な倍数性（即 ち二倍体）が維持され、かつこの胚が核転移時に活性化されなければ生育可能な 胚をもたらし得ることが示された。活性化が遅滞することにより、核はレシピエ ント細胞質を接触され続けることが可能になる。 本発明の第一の概念によると、付随して卵母細胞を活性化することなく第二減 数分裂の中期(metaphase of the second meiotic division)で停止させられる卵 母細胞中に二倍体核を転移し、再構築された胚が生きた状態で誕生することがで きるようになるのに十分な時間、核をレシピエントの細胞質(cytoplasm)と接触 させ続け、さらに正確な倍数性を維持しつつ再構築された胚を活性化することか らなる、動物胚の再構築方法が提供される。この段階では、再構築された胚は単 細胞である。 原則としては、本発明はニワトリなどの鳥類、両生動物及び魚類などの全ての 動物に応用され得る。しかしながら、実際には、最も商業性の高い有用な利用可 能性が現在期待されるのは、ヒト以外の動物、特にヒト以外の哺乳動物、特に胎 盤のある哺乳動物についてであろう。特に、本発明が、動物をクローニングする ための手段としておよび形質転換動物を生産するための手段として、最も有用で あると考えられるのは、有 蹄動物、特にウシ、ヒツジ、ヤギ、スイギュウ、ラクダ及びブタなどの経済上重 要な有蹄動物を用いるものである。本発明は他の経済上重要な動物種、例えば、 ウマ、ラマまたはラットやマウス等の齧歯動物、またはウサギ等にも適当できる と考えられることに留意すべきである。 本発明は、形質転換、および非形質転換動物の生産に同様に使用できる。形質 転換動物は遺伝的に変換されたドナー細胞から生産される。全体としての方法は 、形質転換（即ち、遺伝的に修飾された）動物の生産に関する既知の方法に比べ て多くの利点を有し、これらを要約すると以下のとおりである： （1）より少ない数のレシピエントで十分である； （2）多数の同遺伝子型創始体(founder)がクローンドナー細胞を用いて得られる ； （3）遺伝子ターゲティングによって微細な遺伝的修飾が可能である； （４）各動物は単一の核由来であるので、本発明によって調製される胚から生産 されるすべての動物は生殖系列を介してその関連する遺伝的修飾を遺伝すべきで ある；これに対して、胚盤胞(blastocyst)注入により修飾された幹細胞群を封入 させた後の前核注入又はキメラ現象による形質転換動物の生産は、すべての細胞 が修飾を有するものではないモザイク動物が一定の割合で生産され、これらは生 殖細胞系を介して修飾を後世に伝えない；および （５）細胞を、全動物を生産する前に遺伝的修飾（例えば、組み込み）の部位で 選択できる。 動物に関して使用される、「形質転換」という言葉は、多くの形質転換動物は 他の種由来の一以上の遺伝子をその生殖系列内に含むものであるが、そのような 一以上の遺伝子をその生殖系列内に含む動物を称するものと限定して解してはな らないことに留意すべきである。むしろ、こ のことばは、組換ＤＮＡ技術による技術的な関与を受けた生殖系列を有する動物 を意味するものとしてより広範な意味で使用される。このため、例えば、その生 殖系列において内因性の遺伝が欠失、複製、活性化または修飾された動物、さら にはその生殖系列に外因性のＤＮＡ配列が付加された動物は、本発明の目的では 形質転換動物である。 動物が形質転換動物である際の本発明の実施態様によると、ドナー核は遺伝的 に修飾される。このドナー核は一以上のトランスジーンを含み、遺伝的修飾は核 の転移及び胚の再構築の前に起こる。接合体のオスまたはメスの前核中への注入 に類似する、マイクロインジェクションが遺伝的修飾方法として使用されるが、 本発明は上記方法に限定されるものではない：例えば、エレクトロポレーション 、ウィルスのトランスフェクションまたはリポフェクション(lipofection)など の、マストランスフォーメーション(mass transformtion)またはトランスフェク ション技術もまた使用できる。 前述した本発明の方法において、二倍体核はドナーから除核されたレシピエン ト卵母細胞へ転移される。転移時に二倍体であるドナーは、再構築された胚の正 確な倍数性を維持するために必要であり；それゆえドナーは、細胞周期のＧ１期 または好ましくは、本日出願した我々の同時継続中のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ ／ＧＢ９６／０２０９９号（ＧＢ９５１７７８０．４号からの優先権主張）の対 象であるように、Ｇ０期のいずれかにある。 有糸核分裂細胞周期は、Ｇ、Ｓ、Ｇ２及びＭの明瞭な４期からなる。「スター ト(start)」と称される、細胞周期の開始はＧ１期で起こり、独特の機能を有す る。他の細胞周期を受けるかの決定または拘束はスタート(start)時になされる 。細胞がいったんスタート(start)を通過すると、プレＤＮＡ(pre-DNA)合成期で ある、Ｇ１期の残りを通過する。 第二段階である、Ｓ期はＤＮＡ合成が行われる時期である。その後、Ｇ２期があ り、ここはＤＮＡ合成と有糸分裂との間の時期である。有糸分裂自体はＭ期で起 こる。静止状態の細胞（静止状態が誘導された細胞および十分分化した細胞など の自然に静止状態にある細胞を含む）は、通常、このような周期の４期のいずれ にも属さないと見なされる；静止状態の細胞はＧ０状態にあると一般的に説明さ れ、このため、静止状態の細胞は上記周期を正常に進行しないことが示される。 静止状態のＧ０細胞の核は、Ｇ１期の細胞の核と同様、２倍のＤＮＡ含量を有す る；双方の二倍体核を本発明において使用することができる。 上記を仮定すると、核ドナーに使用できる細胞に制限はなく；完全にもしくは 部分的に分化した細胞または未分化細胞を、さらにはインビトロで培養されまた はｅｘ ｖｉｖｏで抽出された細胞をも使用することができると考えられる。た だ一つの制限は、ドナー細胞が正常なＤＮＡ含量を有しかつ核学的に正常である ことである。好ましい細胞源は、ＷＯ９６／０７７３２号として公開された、我 々の同時継続中のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９５／０２０９５号に開示さ れる。このような正常な全ての細胞は、生体動物を生産するために必要な全ての 遺伝的情報を含んでいると考えられる。本発明により、このような情報が遺伝子 材料が再度発達させられるようにクロマチン構造を変化させることにより胚を発 達させるために提供されうる。 本発明で有用なレシピエント細胞は、第二減数分裂中期で停止し、除核された 卵母細胞である。ほとんどの脊椎動物では、卵母細胞の成熟はインビボでは卵の 成熟工程のほとんど最終段階にまで進行し停止する。排卵時には、停止された卵 母細胞が卵巣から放出される（受精が起こる際には、卵母細胞は当然剌激され、 減数分裂し終える）。本発明を実際するにあたっては、卵母細胞は、インビトロ またはインビボのいずれか で成熟させてもよく、これらは第一極体の出現時にまたは排卵後速やかに集めら れる。 レシピエントは除核されることが好ましい。核の転移工程におけるレシピエン ト卵母細胞の除核は必須であると通常考えられるが、この判断の実験による確認 は公表されていない。有蹄動物について記載されたオリジナルな方法は、細胞を ２個等分に分割することを伴うが、この際、一方が除核されたと考えられた（Wi lladsen Nature 320（6）63-65(1986)）。この方法は、他方の不明な半分は中期 の器官を有したままであり、細胞質の容積の減少は新たな胚の分化パターンを加 速すると考えるという短所を有する（Eviskov et al.，Development 109 322-32 8(1990)）。 より近年では、異なる方法が最小限の細胞質量で染色体を除去する試みに使用 された。第一極体及び付近の細胞質の吸引により、６７％のヒツジの卵母細胞に おいて中期ＩＩ器官が除去されることが分かった（Smith Biol．Reprod．40 102 7〜1035(1989)）。除核が細胞質の容積を最小限の減少で行われることによる方 法は、ＤＮＡ特異的蛍光色素(Hoechst 33342)を用いるもののみであった（Tsuno da et al.，J.Reprod．Fertil．82 173(1988)）。家畜種では、これは現在定常 的に使用される方法であると考えられる（Prather & First J．Reprod．Fertil ．Suppl．41 125(1990)，Westhusin et al.，Biol．Reprod．(Suppl)42 176(199 0)）。 哺乳動物の非侵襲による除核方法に関してはほとんど報告がなかったが、両生 類では、紫外線の照射が定常的な方法として使用される（Gurdon Q．J．Microsc ．Soc．101 299-311(1960)）。ＤＮＡ特異的蛍光色素の使用中にマウスの卵母細 胞に３０秒以上紫外線を照射すると細胞の発達可能性が下がることは記載された （Tsunoda et al.，J.Reprod．F ertil．82 173(1988)）が、哺乳動物に上記方法を使用する詳細な報告はない。 上述したように、除核は、物理的に、核、前核もしくは赤道板(metaphase pla te)（レシピエント細胞によって異なる）を実際に除去により、または紫外線照 射の使用や他の除核作用による等の機能的に行われる。 除核された後、ドナー核は、卵母細胞の活性化を誘導しない条件下でドナー細 胞に融合することによって、または非活性条件下で注入することによって導入さ れる。再構築胚の正確な倍数性維持のため、ドナー核は融合時に二倍体（即ち、 細胞周期のＧ０期またはＧ１期）でなければならない。 適当なドナー及びレシピエント細胞が同定されれば、前者の核が後者に転移さ れることが必要である。最も簡便には、核の転移は融合によってなされる。活性 化は融合時に行うべきでない。 融合を誘導するのに使用された３種の確立された方法は以下のとおりである： （１）細胞をポリエチレングリコール等の融合促進物質と接触させる； （２）センダイウィルス(Sendai virus)等の非活化ウィルスを使用する；および （３）電気刺激を使用する。 細胞をポリエチレングリコールまたは他のグリコール類等の融合促進物質と接 触させることは、体細胞の融合では一般的な方法であるが、胚と共には広く使用 されていなかった。ポリエチレングリコールは毒性があるため、細胞とは最小期 間接触させる必要があり、化学物質を迅速に除去可能でなければならないことに より透明帯は除去される必要がある（Kanka et al.，Mol．Reprod．Dev．29 110 -116(1991)）。マウスの胚を用いた実験では、非活化センダイウィルス(Sendai virus)は分割段 階の胚由来の細胞の有効な融合手段を提供し（Graham Wistar Inst．Sym．Monog r．9 19(1969)）、この際、活性化は誘導されないという実験上の利点がさらに ある。有蹄動物では、融合は、単為生殖の活性化を誘導するのに使用される同様 の電気刺激によって一般的に達成される（Willadsen Nature 320（6）63-65(198 6)），Prather et al.，Biol．Reprod．37 859-866(1987)）。これらの種では、 センダイウィルス(Sendai virus)は一定の割合で融合を誘導するが、定常的に使 用するには十分な信頼性がない（Willadsen Nature 320（6）63-65(1986)）。 細胞−細胞融合は核を転移するのに好ましい方法であるが、使用できる唯一の 方法ではない。他の適当な技術としては、マイクロインジェクション（Ritchie and Campbell，J.Reproduction and Fertility Abstract Series No.15，p60） が挙げられる。 本発明の好ましい態様において、卵母細胞核体カプレットの融合は、０．３Ｍ マンニトール溶液または０．２７Ｍショ糖溶液中で電気パスルにより活性化無し で行われる；または、核をカルシウム無添加培養液中に注入することによって導 入されてもよい。融合／注入時の卵母細胞の期(age)および融合／注入培養液に カルシウムイオンを含ませないことにより、レシピエント卵母細胞の活性化が防 止される。 実際には、卵母細胞が分裂中期ＩＩに達した後、なるべく早く核除去および転 移を行うことが最もよい。（インビトロにおける）成熟または（インビボにおけ る）ホルモン処理開始後の時期は種により異なる。ウシやヒツジでは、核転移は ２４時間以内に起こることが好ましく；ブタでは、４８時間以内；マウスでは、 １２時間以内；およびウサギでは、２０〜２４時間以内に起こることが好ましい 。転移はもっと遅く行うことができるが、卵母細胞の経過時につれて次第に達成 が困難になる。高ＨＰＦ活性が望ましい。 次に、通常成熟用培地に戻された、融合再構築胚は、再構築胚が実際に生きた 状態で（好ましくは繁殖力のある子孫が）誕生できるようになるのに十分な時間 、ドナー核がレシピエント細胞質と接触するように、活性化されずに維持される 。 活性化前の最適な時間は、種により異なり、実験によって容易に決定すること ができる。ウシでは、６〜２０時間が適当である。この時間は、多分クロモソー ム形成がなされる時間よりは短くてはならず、かつカプレットが自発的に活性化 する、または最悪の場合では死ぬほど長くされるべきではない。 活性化のとき、公知のまたは他の適当な活性化方法を用い得る。近年の実験に より、単為生殖の活性化の必要条件は想像していたより複雑であったことが示さ れた。活性化はすべてか無の現象であり、前核の形成が誘導可能な大多数の処理 はすべて「活性化」を引き起こすと考えられた。しかしながら、ウサギの卵母細 胞に繰り返し電気パルスをさらすことにより、適当な一連のパルスの選択及びＣ ａ²⁺の制御のみが２倍数化卵母細胞の妊娠中期までの発達を促進できることが明 らかになった（Ozil Development 109 117-127(1990)）。受精中、細胞内のカル シウム濃度は繰り返し一時的に上昇する（Cutbertson & Cobbold Nature 316 54 1-542(1985)）が、電気パルスは同様にしてカルシウム濃度の上昇を引き起こす と考えられる。カルシウム一過性パターンが種によって変化するという証拠があ り、最適な電気パルスパターンは同様にして変化すると考えられる。ウサギにお けるパルス間の間隔は約４分であり（Ozil Development 109 117-127(1990)）、 マウスでは１０〜２０分である（Cutbertson & Cobbold Nature 316 541-542(19 85)）が、ウシではこの間隔は約２０〜３０分であるという初期の考察がある（R obl et al.，in Symposium on cloning mammals by Nuclear Transplantation C olo rado State University，24-27(1992)）。ほとんどの公開された実験では、活性 化は単一の電気パルスで誘導されたが、新たな考察から、発達する再構築された 胚の割合は複数のパルスにさらすことにより上昇することが示唆される（Collas & Robl Biol．Reprod．43 877-884(1990)）。場合によっては、パルス数、場の 強度及びパルス期間及び培地のカルシウム濃度を最適化するために、定常的に調 節を行う。 本発明の実施において、正確な倍数性が活性化の間中維持されていなければな らない。多発性前核（multiple pronuclei）の生産を防止しこれにより正確な倍 数性の維持するために、微小管重合を阻害するまたは安定化することが望ましい 。これは有効濃度（およそ５μｇ／ｍｌなど）のノコダゾール等の微小管阻害剤 の適用によって達成される。コルヒチンやコルセミド等の微小管阻害剤もある。 または、タキソール等の微小管安定化剤を使用してもよい。 微小管の分子成分（チューブリン）は、重合と非重合状態との間で動的平衡状 態をとる。ノコダゾールなどの微小管阻害剤は、微小管へのチューブリン分子の 添加を阻害し、これにより平衡が妨害され、さらに微小管解重合およびスピンド ルの破壊が起こる。微小管の解重合を完了する、またはほとんど完了させるのに 十分な時間を活性化する前にあけて、微小管阻害剤を添加することが好ましい。 ほとんどのバイ、２０〜３０分で十分である。タキソール等の微小管安定化剤は スピンドルの分解を妨害し、それゆえ多発性前核の生産を防止する。微小管安定 化剤は、微小管阻害剤に関して使用されるのと同様の条件下で好ましく使用され る。 微小管阻害剤または安定化剤は、活性化後前核形成まで存在し続けなければな らない。微小管阻害剤または安定化剤は、その後であってかつ最初の分裂が行わ れる前に除去されなければならない。 本発明の好ましい態様によると、成熟開始してから３０〜４２時間 （ウシ及びヒツジ、即ち、核転移後６〜１８時間）後に、再構築された卵母細胞 は、公知のプロトコルを用いて活性化される。ノコダゾール中の培養は、活性化 が剌激された後４〜６時間（種と卵母細胞の経過時（age）に依存する）続けら れる。 本発明の第二の概念によると、前記の方法により調製された生存可能な再構築 された動物胚が提供される。 本発明の第三の概念によると、以下からなる、動物の調製方法が提供される： （ａ）上記したようにして動物胚を再構築する；および （ｂ）動物を胚から自然に誕生するまで発達させる(develop to term)；および （ｃ）必要であれば、このようにして形成された動物から繁殖する。 段階（ａ）は上記で詳細に説明された。 本発明の上記概念の方法における、第二段階である、段階（ｂ）は、動物を胚 から自然に誕生するまで発達させる(develop to term)ものである。これは、直 接あるいは間接的になされてもよい。直接的な発達では、段階（ａ）による再構 築された胚を、単に、発達を行わせる必要性のある範囲を越えるような干渉はさ らに伴わずに発達させる。しかしながら、間接的な発達では、胚は、十分な発達 が起こる前にさらに操作されてもよい。例えば、収率を上げることを目的として 、胚を分割(split)させたり、細胞をクローニングにより拡張(clonally expande d)したりしてもよい。 またはあるいは上記に加えて、ドナーのクローニングによる拡張(clonal expa nsion)による本発明の手段によって生存胚の収率を上げることも可能であるおよ び／または使用する際には一連の（核の）転移のプロセスからなる。現在達成さ れる胚盤胞の形成速度の制限は、大部分の胚 は「リプログラム(reprogram)」しない（許容できる数は行うが）という事実に よるものであるかもしれない。このような場合には、以下のようにして速度を上 げてもよい。それ自身で発達する各胚を３２〜６４細胞期の核ドナーとして使用 してもよい；または、内細胞塊細胞を胚盤胞段階で使用してもよい。これらの胚 が確かに遺伝子の発現をリプログラムした(reprogram)胚を示しかつこれらの核 が事実リプログラムされる（reprogram）（そうであると考えられる）際には、 各発達胚は核転移プロセスの効率によってこのように増殖(multiply)してもよい 。得られると考えられる促進の度合いは細胞型によって異なる。ヒツジでは、１ ６細胞胚の単一の割球を前活性化(preactivated)「ユニバーサルレシピエント(U niversal Recipient)」卵母細胞に転移することにより５５％の胚盤胞段階の胚 を得ることが容易に可能である。このため、単一の細胞から発達した各胚が１６ 細胞段階で８になるという仮説は理にかなっている。これらの図説はおおよその ガイドではあるが、より後半の発達段階では利点の範囲はその段階でのプロセス の有効性によることは明らかである。 収率を向上させる便利性があるのとは別に、再構築された胚は、胚盤胞まで、 インビボまたはインビトロで培養されてもよい。 経験から、核の転移により誘導される胚は正常な胚とは異なり、場合によって は胚が（少なくともインビボで）一般的に培養される条件以外のインビボでの培 養条件から利益を得るまたはこのような培養条件を必要とすることが示唆される 。上記に関する理由は不明である。定常的なウシの胚の処置では、再構築された 胚（一度にこれらの多く）を５〜６日間ヒツジの卵管内で培養した(ウィラセン 前述したように、In Mammalian Egg Transfer（Aadams，E.E.，ed.）185 CRC Rr ess，Boca Raton，Florida(1982))。しかしながら、本発明を実施するにあたっ ては、 胚を保護するために、転移前に寒天等の保護培地内に胚を埋め込んだ後、一時的 なレシピエントから回収した後寒天から取り出すことが好ましい。保護寒天また は他の培地の機能は以下の２点である：第一に、透明帯を一緒に保持することに より胚にとって構造上の助けとして作用する；および第二に、レシピエント動物 の免疫システムの細胞に対してバリアーとして作用する。この方法は胚盤胞を形 成する胚の割合を上げるが、多くの胚が失われてしまうという短所がある。 インビトロの条件を使用する際には、当該分野において定常的に使用される条 件が非常に好ましい。 胚盤胞段階では、胚は、自然に誕生するまで発達するための適切性に関してス クリーニングされる。具体的には、胚を形質転換し、安定した組込体(integrant )に関するスクリーニング及び選択が行われた際になされるであろう。非形質転 換遺伝子マーカーに関するスクリーニングもまたこの段階で行われてもよい。し かしながら、本発明の方法はより初期段階でドナーをスクリーニングすることが 可能であるので、これは通常好ましい。 スクリーニングが行われた際には、スクリーニング後に、胚盤胞胚を自然に誕 生するまで発達させる。これは、通常、インビボで行われる。胚盤胞までの発達 をインビトロで行った際には、最終のレシピエント動物への転移はこの段階で行 われる。胚盤胞までの発達がインビボで行われた際には、原則としては胚盤胞は 胚盤胞前宿主(pre-blastocyst host)中で自然に誕生するまで発達させる(develo pment to term)ことができるが、実際には、胚盤胞は一般的に（一時的な）胚盤 胞前(pre-blastocyst)レシピエントから除去され、保護培地から取り出した後、 （永久）胚盤胞後(post-blastocyst)レシピエントに転移される。 本発明の上記概念の最適な段階（ｃ）では、動物を前記段階によって 生産された動物から繁殖させてもよい。このようにして、動物は、目的とする遺 伝特性を有する動物の群れ(herd)またはフロック(flock)を確立するのに使用さ れ得る。 遺伝的に同一の細胞の源由来の核を転移した後に生産される動物は同一の核を 共有するが、これらの動物は異なる卵母細胞由来であるので厳密な意味では同一 ではない。上記異なるオリジンの意味は明確ではないが、商業上の特性に影響を 及ぼす。アイオワステートユニヴァシティブリーディングハード(Iowa State Un iversity Breeding Herd)における乳牛のミトコンドリアＤＮＡの近年の分析か ら、ミルク及び生殖行動と関連があることが明らかになった（Freeman & Beitz ．In Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation(Seidel，G.E .Jr.，ed.)17-20，Colorado State University，Colorado（1992））。同様の効 果がウシ集団を通して存在することが確認され、特定の状況では卵母細胞の選択 を考慮することが可能であるまたは必要であるかどうかを考えられ続けている。 ウシを飼育する地域では、遺伝的なメリットの高いドナーから大多数の胚を生産 できることは、全国的な群れに遺伝的な改良を普及させる上でかなり有益である と考えられる。用途のスケールは各胚のコスト及び自然に誕生するまで発達する ことが可能な転移された胚の割合によって異なる。 詳細な説明および要約により、以下のスキームにより、形質転換及び非形質転 換動物の具体的な生産方法を説明する。この方法は以下の５段階からなると考え られる： （１）二倍体ドナー細胞の単離； （２）必要であれば、例えば、選択マーカーを使用してまたは使用せずに、適当 な構築物によるトランスフェクションによる、トランスジェネシス(transgenesi s)； （２ａ）必要であれば、安定した組込体に関するスクリーニング及び選択−マ イクロインジェクションの場合には省略； （３）核の転移による胚の再構築； （４）胚盤胞までの、インビボまたはインビトロでの、培養； （４ａ）必要であれば、安定した組込体−（２ａ）で行われる際には省略 −または他の目的とする特性に関するスクリーニング及び選択； （７）必要であれば、最終レシピエントへの転移。 このプロトコルは、核転移に関する既に発表された方法に比べて以下の多く多 くの利点を有する； １）ドナー核のクロマチンは、適当な時間、活性化なしにレシピエント卵母細胞 の成熟分裂細胞質を接触できる。これは、クロマチン構造の変化によるドナー核 の「再プログラム」を増加させる。 ２）Ｇ０／Ｇ１期の核が転移されたときに再構築された胚で正確な倍数性が維持 される。 ３）従前の研究により、ウシ／ヒツジ卵母細胞の活性化の応答性は時間経過とと もに向上することが示された。先に観察されたひとつの問題としては、除核され た時間のたった卵母細胞では、成熟分裂のスピンドル極体の複製が起こり、多極 紡錘体が観察されることがある。しかしながら、我々は、再構築されかつ高ＭＰ Ｆレベルで維持される胚では、核外被の破壊及びクロマチン凝縮が起こるものの 、器質化したスピンドルが認められないことを報告する。成熟前に凝縮したクロ モソームは密着束(tight bunch)中に残るため、我々は、老化プロセスの利点を 享受することができ、さらに再構築された胚の倍数性に悪影響を与えることなく 再構築された卵母細胞の活性化応答を向上することができる。 本発明の第四の概念によると、上記で調製された動物が提供される。 本発明の各概念の好ましい特徴が、他の概念に準用される。 本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutan dis)、他の各概念と同様である。 本発明を下記実施例を参照しながら説明するが、下記実施例は詳細に説明する ためのものであり、本発明を制限するものではないと考えられる。以下の説明に おいて、以下の添付図面を引用する。 図１は、インビトロにおけるウシの卵母細胞の成熟速度を示すものである。実施例１：ウシ卵母細胞を用いた「ＭＡＧＩＣ」方法 本実験方法の被検体であるレシピエント卵母細胞は、ＭＡＧＩＣ（Metaphase A rrested G1/G0 AcceptIng Cytoplast）シピエントと称される。 インビトロでの卵母細胞の成熟中の核と細胞質内とで生じる事象を研究した。 加えて、様々な期で再構築された胚における融合及び活性化の役割もまた研究し た。これらの研究から、卵母細胞の成熟は非同調であるが、成熟卵母細胞集団は 形態学的に１８時間後に選別することができることが示された（図１）。卵母細胞の形態学的選別 図１において、卵巣を地方の畜殺場から得て、実験室まで移動する間２８〜３ ２℃に維持した。卵丘細胞卵母細胞複合体(cumulus oocyte complex)（ＣＯＣ’ ｓ）を、皮下針（１．２ｍｍ内径）を用いて直径３〜１０ｍｍの卵胞から吸引し 、滅菌プラスチック製万能容器(universal container）に置いた。この万能容器 を加温チャンバー（３５℃）中に置き、卵胞材料を１０〜１５分間静置した後、 上清の３／４を注ぎ出した。残りの卵胞材料を１０％ウシ血清を補足した等容の 解離用培地(dissection medium)（イーグル塩(Eagles salts)(ギブコ(Gibco))、 ７５． ０ｍｇ／ｌ カナマイシン、３０．０ｍＭ ヘペス(Hepes)を含むＴＣＭ１９９ 、ｐＨ７．４、浸透圧 ２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ Ｈ₂Ｏ）で希釈し、８５ｍ ｍペトリ皿に移し、解剖顕微鏡でＣＯＣ’ｓを調べた。 卵丘細胞の少なくとも２〜３ｍｍの緻密層を有する複合体を選択し、解離用培 地で３回洗浄し、１０％ウシ血清及び１×１０⁶顆粒膜細胞／ｍｌを補足した成 熟用培地（イーグル塩(Eagles salts)(ギブコ(Gibco))、７５ｍｇ／ｌ カナマ イシン、３０ｍＭ ヘペス(Hepes)、７．６９ｍＭ ＮａＨＣＯ₃を含むＴＣ培地 １９９、ｐＨ７．８、浸透圧２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｋｇ Ｈ₂Ｏ）に移し、必要 になるまで、空気における５％ＣＯ₂雰囲気中で３９℃でロッキングテーブル(ro cking table)上で培養した。卵母細胞を成熟用皿（maturation dish）から取り 出し、５％の黄色ワセリンと９５％のワックスとの混合物を使用して取り付けら れたカバースリップ(coverslip)下のエタノールで清浄されたガラススライド上 に湿式マウントした。次に、マウントされた胚を新たに調製したメタノール：氷 酢酸（３：１）中で２４時間固定し、４５％アセトオルセイン（Sigma）で染色 し、ニコンマイクロフォト−ＳＡ（Nikon Micropht-SA）を用いて位相及びＤＩ Ｃ顕微鏡によって試験した。図１は、ＭＩＩ期の卵母細胞及び極体が目視できる 卵母細胞の割合（％）を示すものである。ウシ卵胞卵母細胞の活性化 ２４時間まで成熟させ続ける際には、これらの卵母細胞はカルシウムを含むマ ンニトール中で極めて低い割合（２４％）で活性化する（表１ａ）。しかしなが ら、カルシウム及びマグネシウムを電気パスル適用培地から除去すると活性化が 防止される。 表１ａは、様々な時間インビトロで成熟させたウシの卵胞卵母細胞の活性化を 示すものである。卵母細胞を成熟用培地から取り出し、活性化 用培地で一回洗浄し、活性化用チェンバー中に置き、８０μ秒、１．２５ｋｖ／ ｃｍの単一の電気パルスを与えた。 ^* 多くの２以上の前核偽除核ウシ卵母細胞(sham enucleated bovine oocvte)の活性化応答性 表１ｂは、成熟開始後約２２時間（ｈｐｍ）で偽性的に除核した(sham enucle ated)インビトロで成熟させたウシ卵母細胞の活性化の応答性を示すものである 。除核を目的として、小容の細胞質を赤道板を含まずに吸引するため、卵母細胞 は厳密に処理された。操作終了後、卵母細胞に１．２５ＫＶ／ｃｍの単一のＤＣ パルスを与え、成熟用培地に戻し、３０ｈｐｍおよび４２ｈｐｍ後に卵母細胞群 をマウントし、固定し、アセトオルセインで染色した。これらの結果は、全細胞 数に対する前核を有する細胞数として個々の５実験での各時間における卵母細胞 の数を示す。 ｈｐｍ＝成熟開始後時間(hours post onset of maturation)除核卵母細胞の前核成形 表２は、ウシの初期線維芽細胞と融合され（２４ｈｐｍ）続いて活性化された （４２ｈｐｍ）除核卵母細胞における前核形成を示すものである。この結果は５ つの別個の実験をあらわす。卵母細胞は二群に分けられ、グループＡは、活性化 前に１時間および活性化後に６時間ノコダゾール中で培養された。グループＢは 、ノコダゾール処理を行わなかった。活性化された卵母細胞を、固定化し、活性 化してから１２時間後にアセトオルセインで染色した。次に、各単為生殖生物に おける前核（ＰＮ）数を位相差顕微鏡下で計測した。結果は、１以上の前核を含 む活性化卵母細胞割合（％）として表される。 器質化されたスピンドルが存在せずかつ極体が存在しないことから、倍数性を 再構築された胚で維持するためには、二倍体、即ちＧ０／Ｇ１期の核が上記細胞 質状態中に転移される必要があることが示唆される。活性化された卵母細胞を微 小管阻害剤であるノコダゾールの存在下で５時間、活性化剌激の前後１時間イン キュベートすることにより、小核（micronuclei）の形成が防止される（表２） ことから、ドナー核が細胞周期のＧ０／Ｇ１期にあるときは、再構築された胚の 正確な倍数性が維持される。結果 これらの結果から、以下のことが示される： ｉ）卵母細胞は成熟開始後１８時間で除核できる（図１）； ｉｉ）除核卵母細胞は０．３Ｍマンニトールまたは０．２７Ｍショ糖のいずれか でドナー分割細胞／細胞と融合できる、またはドナー細胞または核は活性化反応 を伴わずにカルシウム非含有培地中に注入され得る； ｉｉｉ）再構築された胚または除核されパルスを受けた卵母細胞は成熟用培地中 で培養でき、自発的な活性化を受けない； ｉｖ）転移された核は核の外被膜の破壊（ＮＥＢＤ）及びクロモソーム凝縮を受 けることが観察される。器質化された有糸分裂／減数分裂のスピンドルは、転移 された核の細胞周期にかかわらず観察される； ｖ）このように操作されたカプレット(couplet)は、操作されない対照卵母細胞 と同等の頻度で３０時間および４２時間で活性化するであろう； ｖｉ）極体は、転移された核の細胞周期の段階にかかわらず、次の活性化の後は 観察されない； ｖｉｉｉ）後に続く活性化時に、１〜５個の小核が１再構築接合子あたり形成さ れる（表２）。「ＭＡＧＩＣ」方法を用いたウシ胚の再構簗 予備試験において、この技術を、５日間血清欠乏によって細胞周期のＧ０期に 同調させた初期線維芽細胞を用いてウシ胚の再構築に適用した。結果を表３に要 約する。 表３は、血清欠乏された（Ｇ０期の）ウシ初期線維芽細胞の核を除核した不活 性化ＭＩＩ卵母細胞に転移することによって再構築されたウシ胚の発達を示すも のである。胚は２４ｈｐｍで再構築され、融合カプレットは４２ｈｐｍで活性化 された。融合カプレットを、ノコダゾール（５μｇ／ｍｌ）を含むＭ２培地中で 、活性化前１時間および活性化後５時間インキュベートした。カプレットは、１ ．２５ＫＶ／ｃｍの単一のＤＣパルスで８０μ秒間活性化された。 実施例２：ヒツジ卵母細胞を用いた「ＭＡＧＩＣ」方法 実施例１と同様の観察結果が、予めインビボで成熟させたヒツジ卵母細胞でも 得られた。新たに排卵させた卵母細胞は、プロスタグランジン処理してから２４ 時間後の過剰に刺激されたメスヒツジの輸卵管から洗い流すことによって回収で きる。フラッシング溶液としてカルシウムマグネシウム非含有ＰＢＳ／１．０％ ＦＣＳを使用することによって、卵母細胞の活性化が妨げる。卵母細胞はカルシ ウム非含有培地中で除核でき、ドナー細胞を活性化を伴わずに前述のように導入 できる。器質化さ れたスピンドルは観察されず、多数の核が後の活性化の際に形成され、これはノ コダゾール処理によって抑制される。結果 ヒツジでの予備実験で、１回の妊娠で１頭の生きた子羊が誕生した。この結果 を表４及び５に要約する。 表４は、胚由来の確立された細胞系を非活性化され除核されインビボで成熟さ れたヒツジの卵母細胞に転移することによって再構築されたヒツジ胚の発達を示 すものである。卵母細胞は、過剰に刺激されたスコティッシュブラックフェイス （Scottish Blackface）メスヒツジから得、細胞系は、ウェルシュマウンテン（ Welsh mountain）メスヒツジから得られた９日胚の胚盤から確立した。再構築さ れた胚は、一時的なレシピエントメスヒツジの結紮された卵管中で６日間培養さ れ、回収され、発達について評価される。 表５は、同調された最終のレシピエントブラックフェイス(blackface)メスヒ ツジの子宮角へのすべての桑実胚／胚盤胞段階の再構築された胚の転移後の妊娠 の誘導を示すものである。この表は、転移された各群の全胚数ならびにメスヒツ ジ及び胚に関する妊娠頻度を示すものであり、多くの場合、２個の胚を各メスヒ ツジに転移した。一回の双子の妊娠があり、この際、１匹の生きた仔羊が誕生し た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 バイオテクノロジー アンド バイオロジ カル サイエンセスリサーチ カウンシル イギリス国，スウィンドン エスエヌ２ １ユーエッチ，ノース スター アベニュ ー，ポラリス ハウス (72)発明者 キャンベル，キース，ヘンリー，ストック マン イギリス国，ミドロチアン イーエッチ25 ９ピーエス，ロスリン，ロスリン イン スティテュート（エジンバラ) (72)発明者 ウィルマット，イアン イギリス国，ミドロチアン イーエッチ25 ９ピーエス，ロスリン，ロスリン イン スティテュート（エジンバラ)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．付随して卵母細胞を活性化することなく第二減数分裂の中期で停止させら れる卵母細胞中に二倍体核を転移し、胚が生きた状態で誕生することができるよ うになるのに十分な時間、核をレシピエントの細胞質と接触させ続け、さらに正 確な倍数性を維持しつつ再構築された胚を活性化することからなる、動物胚の再 構築方法。 ２．該動物が有蹄動物である、請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．該動物がメスウシ若しくはオスウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ラクダまたは スイギュウである、請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．ドナー核が遺伝的に修飾される、請求の範囲第１項から第３項のいずれか に記載の方法。 ５．二倍体核が静止細胞から得られる、請求の範囲第１項から第４項のいずれ かに記載の方法。 ６．レシピエント卵母細胞が除核される、請求の範囲第１項から第５項のいず れかに記載の方法。 ７．核の転移が細胞融合によって達成される、請求の範囲第１項から第６項の いずれかに記載の方法。 ８．該動物がメスウシまたはオスウシであり、かつドナー核が活性化前６〜２ ０時間の間レシピエント細胞質と接触し続けられる、請求の範囲第１項から第７ 項のいずれかに記載の方法。 ９．正確な倍数性が微小管の阻害によって活性化中維持される、請求の範囲第 １項から第８項のいずれかに記載の方法。 １０．該微小管の阻害がノコダゾールの使用によって達成される、請求の範囲第 ９項に記載の方法。 １１．正確な倍数性が微小管の安定化によって活性化中維持される、請 求の範囲第１項から第８項のいずれかに記載の方法。 １２．該微小管の安定化がタキソールの使用によって達成される、請求の範囲第 １１項に記載の方法。 １３．以下からなる、動物の調製方法： （ａ）請求の範囲第１項から第１２項のいずれかに記載の方法により動物胚を再 構築する； （ｂ）動物を胚から自然に誕生するまで発達させる；および （ｃ）必要であれば、このようにして形成された動物から繁殖する。 １４．該動物胚が胚を十分発達させる前にさらに操作される、請求の範囲第１３ 項に記載の方法。 １５．一以上の動物が胚由来である、請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．生きた状態で誕生させることができかつ請求の範囲第１項から第１２項の いずれかに記載の方法によって調製される再構築された動物胚。 １７．請求の範囲第１３項から第１５項のいずれかに記載の方法によって調製さ れる動物。 １８．請求の範囲第１６項に記載の胚から発達させた動物。