CZ65897A3 - Method of transferring molecules into cytosol of cells, set for making the method and a mixture for modification neoplastic or other cellular processes - Google Patents

Description

Způsob převodu molekul do cytozolu buněk,, souprava pro lesho^- :--,.

provádění a směs pro modifikaci novotvarých nebo jiných ^5 M, i?

buněčných procesů. * Ϊ · G1SQG ί

η ! π .·

Oblast techniky i $

y..........' , ,. . J.......-.(:0. ?

Vynález se týká způsobu převodu molekul do cytozolu buněk pomocí sloučenin zvyšujících fotocitlivost a světla absorbovaného sloučeninou zvyšující fotocitlivost, soupravy pro provádění tohoto způsobu a směsi pro modifikaci novotvarých nebo jiných buněčných procesů u teplokrevních živočichů nebo kultur buněk obsahující jak sloučeninu, která má. být uvolněna do cytozolu, tak látku zvyšující fotocitlivost a nosiče.

Dosavadní stav techniky

Většina molekul neproniká snadno do membrán buněk. Metody zavádění molekul do cytozolu živých buněk tvoří užitečné nástroje pro zpracování a studii biologických dějů. Mezi dnes nejobvykleji používané postupy patří mikroinjekce, stínově zprostředkovaná fuze pomocí červených krvinek a liposomová fuze, osmotická lyse pinosomů, plnění škrábáním, elektroporace, tranfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým a viry. Tyto způsoby jsou užitečné pro zkoumání buněk v kultuře, ač jsou v mnoha případech nepraktické, časově náročnější, neúčinné nebo způsobují podstatné ničení buněk. Nejsou tudíž optimální pro použití v biologickém a lékařském výzkumu nebo při léčení, při kterém buňky musí zůstat funkční. Je dobře známo, že porfyriny a mnoho dalších sloučenin zvyšujících fotocitlivost, vyvolává cytotoxické efekty na buňkách a tkáních. Tyto efekty jsou založeny na skutečnosti/ že sloučeniny zvyšující fotocitlivost, ·

vylučují při vystavení světlu ¹O2 singlety, které rozkládají membrány buněk a strukturu buněk a při rozsáhlé destrukci nakonec buňky zničí. Tyto efekty byly využity při léčbě několika druhů novotvarových onemocnění. Léčba je známá pod jménem fotodynamická terapie (Photodynamic Therapy, dále jen PDT) a je založena na injekci fotocitlivého a nádor lokalizujícího barviva, následované vystavením nádorové oblasti světlu. Cytotoxický efekt je zprostředkován zejména tvorbou singletového oxidu. Meziprodukt této reakce má v buňkách velmi krátkou Životnost (<0,04 με). Proto je základní cytotoxický efekt PDT uskutečněn během vystavení světlu a to velmi blízko míst tvorby ¹O2, ^O₂ reaguje s proteiny (his-tidinem, triptofanem, metioninem, cysteinem, tyrosinem), DNA (guaninem), nenasycenými mastnými kyselinami a cholesterolem a oxiduje je. Jedna z výhod PDT je, že tkáň nevystavená světlu zůstane nezasažena. Existuje rozsáhlá dokumentace, týkající se použití PDT na zničení nežádoucí populace buněk, například novotvarových buněk.

Několik vynálezů se týká samotných fotodynamických sloučenin nebo spojených s imunoglobuliny zaměřenými na determinanty receptoru novotvarové buňky, čímž se komplex stane buňkově více specifický. Určité fotodynamické sloučeniny, jako např. odvozeniny hematoporfyrinu, které jsou zaměřeny na ničení nežádoucích buněk jsou popsány v norském patentu číslo 173319, v norských patentových přihláškách 900731, 902634, 901018, 941548, 851897, 934837, 924151 a 891491. V PCT/US93/00683 je popsán systém dodávky léku, který pozůstává z protirakovinového léku a fotoaktivačnícho léku připojeného na kopolymerní nosiče. Po podání vstoupí tento komplex do nitra buňky pinocytozou nebo fagocytozou a umístí se uvnitř endosomů a lyzosomů. V lyzosomech je vazba mezi protinovotvarovou sloučeninou a polymerem hydrolyzována a dříve uvedená látka může pasivně difundovat přes lyzosomovou membránu do cytózólu. Tato metoda je tedy omezena namalé molekulární sloučeniny, které jsou schopné difundovat fnapřič lyzosomriími membránami . .Po·'povolení určitého Časového'.:' ’' · zpoždění na difúzi se použije světelný zdroj o příslušné vlnové ' i délce á energii pro aktivaci fotoaktivaČní sloučeniny. Sloučený efekt protirakovinového léku a fotoaktivaČního léku zničí buňku. Všechna známá použití fotoaktivních sloučenin jsou tedy zaměřena na rozsáhlé ničení 'struktury buněk' vedoucí až ke zničení buňky.

Není. známa metoda -uvolnění membrány nepropustné, molekulám .do .....čyťozolu po místním prolomení endosomních a/nebo lyzosomních membrán. Cílem tohoto vynálezu je tedy poskytnout způsob na' 'dopravu” moíekůl','dócytozolu 'živých” buněk?'vkultuře ňebo^ve tkáních, vystavením'buněk'fotoaktivaČní sloučenině.a molekula (ly) , která (-é) má (maj i) být dopravena (-ny).do cytozolu, .jejichž, příjem'můž.e být. usnadněn různými', nosiči, vystavením” . buňky světlu o vhodné vlnové délce a energii.pro'narušení

-erido s oinní ch-a—1-y-z o s omn-í-ch—membrán-a_ úvol-nění- moleku 1-do-cyt oz olu bez zničení funkčnosti většiny buněk.·.· Látky zvyšující =>.

fotocitlivo.sť a.molekula..(-y) , která (-é) má (mají) být dopraveny do cytozolu moho.u být sloučeny ’ nebo: samostatné- .

, · * ;

aplikovány .společně, s/vhodnými 'nosiči, volitelně usnadňujícími· ·: ' 'i · , ^{1 u} ’ ' . k. d j .

absorpci molekul;- které jsou předmětem zájmu.

Podstata vynálezu 'Shora věděný číT^j e dosažen způsobem převodu'molekul do cytozolu buněk pomocí sloučenin zvyšujících fotocitlivost a <> ^v světla absorbovaného'sloučeninou zvyšující fotocitlivost podle j

vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že sloučenina zvyšující fotocitlivost opčně vektorové molekuly a dopravovaná(é) molekula (y) , vzájemně sloučené nebo oddělené,·' jsou aplikovány na. živé

'. J* buňky; a^: jsou potom ehdocyticky nebo jiným způsobem přemístěny do- endosomů, lyzosomů nebo-jiných mezibuněčných, membránou omezených .komůrek, přičemž jsou· buňky vystaveny světlu o vhodné vlnové délce podle absorpčního spektra sloučeniny zvyšující fotocitlivost v rozličných dávkách, závislých na požadované míře přežití tak, aby membrány endosomních, lyzosomních nebo jiných mezibuněčných komůrek se narušily, a do cytozolu zaváděné molekuly se uvolní do cytozolu, a aby samotná světlem aktivovaná sloučenina zvyšující fotocitlivost nezničila většinu buněk.

Podle výhodného provedení jsou molekuly uvolňované v cytozolu zvoleny ze skupiny obsahující DNA, oligo(deoxy) nukleotidy, mRNA, protisměrné DNA, cukry, proteiny, peptidy, membránou nepropustné léky, jiné membránou nepropustné molekuly a kovalentně nebo nekonvlentně vázané kombinace shora uvedených molekul, ze skupiny látek modifikujících syntetickou aktivitu proteinu, sloučenina uvolňovaná do cytozolu může být s výhodou . gelonin, saporin nebo agrostin nebo jakákoliv jejich kombinapé, použité sloučeniny zvyšující fotocitlivost mohou být zvoleny ze skupiny obsahující porfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporfyriny, naftalocyaniny, kationová barviva,·.. tetracykliny a lozosomotropické slabé zásady a jejich deriváty, použitá sloučenina zvyšující fotocitlivost může být tetrafenylporfin s 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích (TPPS^a)> mezotetrafenyiporfin se 4 sulfonanovými skupinami (TPPS₄) nebo ftalocyanin hliníku se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých kruzích (AlPcS2_a) nebo jakákoliv jejich kombinace, použité vektorové molekuly mohou být molekuly směřující na pracovní polohu nebo'ZlepŠovatelé, kteří usnadňují absorpci sloučeniny zvyšující fotocitlivost nebo molekul, které mají být uvolněny do cytozolu, frakce přežívajících buněk může být regulována volbou dávky světla ve vztahu ke koncentraci fotocitlivost zvyšující sloučeniny. Předmětem vynálezu je rovněž směs pro modifikaci novotvarých nebo jiných buněčných procesů u teplokrevních živočichů nebo kultur buněk obsahující jak sloučeninu, která má být uvolněna do cytozolu, tak látku zvyšující fotocitlivost a nosiče, která ' obsahuje’-’Člén zvolený ze-skupiny-složené z-hosiče-na usnadnění translokace do/mězibuněčných komůrek, jako např. endosomy,· lyzosomy nebo'jiné me2ibuněčné komůrky, mající navíc připojené jak'sloučeniny modifikující buněční proces,- které mají být _ uvolněny do cytozolu, .tak.-i sloučeninu zvyšujicí fotocitlivost, které po aktivaci světlem prolomí membrány mězibuněčných*- komůrek; několik z -řečených ríos i čú z nichž nej méně..jeden nosičmá navíc připojenou sloučeninu, která má být uvolněna· do cytozolu, a'jiný podobný nebo odlišný nosič·-má-navíc připojený-.

· f-otoci.tíivost zvyšuj ící sloučeninu; a· oddělenou směs nosičů, která má- být spolu' se sloučeninou uvolněna do ..cytozolu, a fotocitlivost zvyšující sloučeninu, s výhodou- může být. řečená·, 'sloučenina, která má.být uvolněna do. cytozol.u, .pr.otinovotvarová sloučenina, pr ot inovo tvarová sloučenina může být- gelonin,

-slouČenlnav—kter-á-^má^bý-t-uvolněna^do-cytozolu—může—být—zvolena—— ze skupiny obsahující .DNA, oligo(dexy)nukleitidy, mRNA,. protisměrnou-DNA, cukry, proteiny, peptidy, membránou nepropustné, léky, jiné membránou.:nepropustné..molekuly,...

.kovalehtně nebo.neko.valentně'. vázané kombinace shora uvedených , '' . Γ i molekul, sloučenina zvyšující fotocitlivost může být zvolena ze skupiny obsahuj ící porfyriny.,„ftalocyaniny, .purpuriny, chloriny, benzoporfyriny, naftalocyáni-ny, kationová barviva, tertracykliny a lyzosomotropicky slabé zásady a jejich deriváty,, může být tetrafenylporfin. š dvěmi sulfonanovými skupinami na přilehlých feňýloýyčh skůpiňáčh~hebo”móhou být’ ríosičěf zvoleny z molekul””” směřujících na pracující polohu nebo zlepšovatelů, které usnadňují absorpci sloučenin zvyšujících fotocitlivost nebo molekuly, které mají být uvolněny do cytozolu. Předmětem vynálezu je rovněž souprava pro provádění tohoto způsobu ' obsahující sloučeninu-zvyšující fotocitlivost a ,j iné sloučeniny modifikující přenos přes membránu buňky, usnadňující určité populace buněk nebo jiné související funkce. Podle uvedeného způsobu dopravy molekul do'cytozolu- živých buněk, budou molekuly dostupné v cytozolu a buňka si udrží svou funkčnost. Toho. se dociluje vystavením buňky (buněk) fotoaktivační sloučenině, která bude absorbována buňkou a bude umístěna v endosomech, lyzosomech nebo jiných buněčných komůrkách, sloučené nebo odděleně, spolu s nosnými molekulami, cílovými imunoglobuliny a molekulami, které, se mají dopravit do cytozolu, a vystavením buněk světlu o vhodné vlnové délce pro aktivaci sloučeniny zvyšující fotocitlivost tak, že jsou prolomeny jen endosomní, lyzosomní a j iné buněčné komory a molekuly budou uvolněny v cytozolu beze ztráty funkčnosti buňky akcí fotoaktivované sloučeniny a případnou akcí obsahu endosomu a/nebo lyzosomu,

Přehled obrázků na výkrese

Vynález je dále detailně popsán a ilustrován vyobrazeními, kde obr.1 ukazuje, jak mohou být molekuly zavedeny do cytozolu buňky podle tohoto vynálezu. Látka (S) zvyšující fotocitlivost a volitelné molekuly (M) jsou endocytovány buňkami (I, představuje invaginaci. plazmy membrány spouštějící endocytický postup) a obě látky končí ve stejných vezikulách (váčcích) (II). Po vystavení těchto vezikulí světlu se membrány vezikulí prolomí a obsah se uvolní (III). Obr.2 představuje syntézu proteinu v buňkách ΝΉΙΚ 3025 po ošetření geloninem za nepřítomnosti nebo přítomnosti TPPS_2a světla po dobu 50 s. Na obr.2 jsou použity tyto značky: o, TPPS_2a + světlo; ·, -TPPS_2a - světlo, V, +TPPS_2a - světlo; ▼, -TPPS_2a + světlo. Tyto buňky byly přes noc ošetřeny pomocí 3,2 μg/ml TPPS_2a a indikovanou koncentrací geloninu a ve všech případech vystaveny stejné dávce světla. Syntéza proteinu byla měřena měřením vtělení ³[H] leucinu do proteinů, 24 hodin po vystavení světlu. Obr.3 představuje křivky dávkové reakce buněk ošetřených jen TPPS_2a a světlem (O) nebo v kombinaci s 0,2 gg/ml (V) nebo 2,0 hg/ml geloninu, jak popsáno v obr.2. Obr.4 představuje syntézu· v buňkách.NHIK 3025 .po ošetření pomocí 3,2gg/ml TPPS_2a a světla za nepřítomnosti nebo přítomnosti 0,2. μ9/ιη1 geloninu. Použité značky: ·, TPPS_2a - gelonin; TPPS_2a + gelonin.' Buňky byly ošetřeny přes noc pomocí TPPS_2a v nepřítomnosti nebo přítomnosti geloninu a vystaveny naznačeným dávkám světla.

Syntéza proteinu byla měřena vtělením ³[H]· leucinu do proteinu. Obr.5 představuje syntézu v-buňkách V7 9po ošetření pomocí 25 μg/ml AlPcS₂ a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 μί/ιηΐ geloninu, Použité značky: · látka zvyšující-fotocitlivost ’+' toxinfO látka zvyšující ‘fotocitlivost. Obr .6 představuje syntézu v buňkách H146 po ošetření pomocí' 0,3 μ9/ιπ1 TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 μg/ml.geloninu.

Použité značky: jako v obr,5. Obr . 7 představuje syntézu,v buňkách V79 po ošetření pomocí 1 p.g/ml TPPS_2a a světlem v -nepř ít omno s-t-i- -nebo - -p-ř-í-t omno s-t-i—l—^g/-m 1 -g e i on i nu. -Pou-ž-i-1 é—z-na-Č ky-:— jako v obr.5. Obr,8 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 3,2 gg/ml TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 μ9/τη1 agrostinu. Použité'značky: jako v obr.5..

Obr.9 představuje'syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 3,2 μ3/ιη1 TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 μ9/πι1 saporinu. Použité značky: jako v obr.5. obr. 10 představuje syntézu v buňkách NHIK 3025 po ošetření pomocí 0,25 μg/.ml 3-THPP a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 μς/ιηΐ geloninu. Použité značky: jako v obr.5. Obr.11 představuje syntézu v buňkách“'COS-7po''ošetřenípomocí' 3' jig/ml’ TPPS_2a a světlem v nepřítomnosti nebo přítomnosti 1 μ9/πι1 geloninu; použité značky: jako v obr.5. Obr.12 představuje syntézu v buňkách’ NHIK 3025 po ošetření geloninem v nepřítomnosti nebo přítomnosti TPPS₄ a osvětlení po dobu 50 s. Použité značky:.· TPPS4 + světlo; ▼- ΤΡΡΞ4 - světlo; 0 + RPPS₄· - světlo. Buňky byly ošetřeny přes noc 75 μς/ιηΐ TPPS4.a naznačenou koncentrací geloninu a ve všech případech byly vystaveny stejné dávce světla. Syntéza proteinu byla měřena měřením vtělení ⁵[H] leucinu do proteinu 24 hodin po vystavení světlu. Obr.13 představuje syntézu v buňkách OHS po ošetření 3 μ9/κι1 TPPS2_a P° dobu 18 hodin, následovaném 4 hodinami bez přítomnosti TPPS2_a a za nepřítomnosti nebo přítomnosti 3 gg/ml geloninu před vystavením světlu. Buňky byly inkubovány po stejné 4 hodiny v 50 μΜ chlorochininu nebo 10 mM NH4CI pro zabránění degradace lyzosomního proteinu. Je plně doloženo, že celá řada léků, včetně di- a tetrasulfo-nátovaného hliníku ftalocyaninu, sulfonátováných tetrafenylprofinů (TPPS_n), nilské modře, e₆ derivátů chloru, uroporfinu I, fylloerythrinu a případně hematoporfyrinu a metylové modře jsou umístěny v endosomech a v lyzosomech buněk v kultuře. Ve většině případů je to způsobeno endocytickou aktivitou. Vynálezci prokázali, že vystavení buněk obsahujících látky zvyšující fotocítlivost ve svých lyzosomech vede k propustnosti lyzosomů a uvolnění látky zvyšující fotocítlivost. V některých případech, jako např. u TPPS2_a a TPPS]_, podstatná Část aktivity lyzosomního enzymu-byla po PDTý zjištěna v cytozolu, což naznačuje, že obsah lyzosomů lze , _ uvolnit do cytozolu beze ztráty jeho aktivity. Tento efekt barviv zvyšujících fotocítlivost lze podle této studie použít všeobecně na uvolnění endocytozovaných molekul z endosomů a lyzosomů. Zavedení molekul do buněční cytoplazmy se docílí v prvé řadě vystavením buněk nebo tkáně barvivu zvyšujícímu fotocítlivost, molekulu(y), kterou(é) chceme dodat do cytozolu buněk s nebo bez nosných molekul a imunoglobinů, které by všechny měly být přednostně umístěny v endosomech a/nebo lyzosomech. V druhé řadě se buňky nebo tkáň vystaví světlu o vhodné vlnové délce a energii pro vyvolání fotodynamické reakce. Tato fotodynamická reakce povede k prolomení lyzosomních a/nebo endosomních membrán a obsah těchto vezikulí bude uvolněn do cytozolu. Principy tohoto vynálezu jsou naznačeny na obr.1. Je nutné, aby látka zvyšující fotocítlivost a molekula, které se mají zavést do buněk, byly umístěny v těchže komůrkách. Je rovněž nutné zdůraznit, že externě přidané molekuly se mohou hromadit v mezibuněčných komůrkách, jiných než jsou lyzosomy a endosomy, jako např. v Golgiho aparatuře a v endoplasmatickém retikulu. V takových případech lze fotocitlivost zvyšující sloučeniny, nacházející se ve stejných komůrkách,, použít ve spojení se světlem pro stejné účely za předpokladu, že kombinace

.. světelné, dávky a. fotocitlivost zvyšující sloučenina .nezničí funkčnost buněk. Tento vynález je založen na naší in vitro demonstraci, podle které fotocitlivost zvyšující látka, jako např.'· TPPS_2a ’ (terafenylporfin's 2' sulfonemóvými ’skupinami' nebo přilehlými fenylovými skupinami) v kombinaci se světlem mohou vyvolat uvolnění funkčně neporušeného obsahu lyzosomu bez ' zničení' ' velkého podílů .buněk.’ ’ Téhož. efektu lže,,' dócilitúpoužitim. jiných fotocitlivost zvyšujícími sloučeninami' samotnými nebo ve _____._spoj ení_n'ebo..vazbě_.s__j_inými_.molekulami^a^částicemi—použitými-.-......

jako vektory pro nasměrování fotocitlivost zvyšujících -látek na endosom 'a/nebo. lyzosomu nebo. j ínéjnez.'ibuněčné, komůrky.. Takovými vektory mohou.:býť. tkáň nebo .buněčně, specifické;protilátkyinebo' jiné ligandy, které se vážou-na povrch buněk, čímž-zvyšují absorpci fotocitlivost zvyšujících látek receptory zprostředkované éndočytozy. Jiným vektorem by mohlo být použití rekonstruovaných částic LDL. Tyto Částice jsou rovněž absorbovány receptory zprostředkované endocytozy. Tímto způsobem lze zvýšit počet fotocitlivost zvyšujících molekul na LDL

- - - čás t ici “a vazbu na- čás tice LDL“ v po r ovnání ~s ‘př edvazbou na .....

původní LDL. Vynález není omezen na použití in vitro, ale může být také použit in vivo, bud na ošetření na místě, nebo na ex vivo ošetření, následované injekcí ošetřených buněk. Absorpce do endosomú a lyzosomu může být zlepšena stejným způsobem, který byl popsán pro in vitro ošetření. Ošetřit lze všechny tkáně, pokud fotocitlivost zvyšující látka je absorbována cílovými buňkami a světlo je dodáno správně. Vynález je založen jak na fotocitlivost zvyšující látce tak i na světle. Světlo musí být absorbováno fotocitlivost zvyšující látkou nebo musí nepřímo vyvolat vybuzený stav látky zvyšující fotocitlivost. Oblast vlnové délky bude proto záviset na fotocitlivost zvyšující látce. Expoziční světlo nemusí být monochromatické nebo kolimační. Lze použít každý zdroj světla vyzařující příslušnou vlnovou délku. Překvapující je, že fotodynamická akce podle tohoto vynálezu zřejmě neutralizuje potenciálně cytotoxický efekt uvolňování lyzosomního obsahu. Vynálezci tak prokázali, že vzniku lyzosomního katepsinu je podstatně zabráněno fotodynamickou akcí TPPS2_a v kultuře buněk NHIK 3025. To tvoří překvapující jev tohoto vynálezu a pomáhá udržet životnost a funkčnost buněk po dopravě molekul do cytozolu narušením endosomních a /nebo lyzosomních membrán.

Příklady experimentálního a klinického využití

Tento vynález je dále objasněn následujícími příklady, aniž by byl na ně. omezen:

1) Léčení rakoviny

Několik fotocitlivost zvyšujících látek se přednostně usazuje v novotvarových tkáních, přičemž selektivita nádoru nad okolní tkáň má obvykle faktor 2-3, avšak v některých případech, jako např. u.mozkových tkání, tento faktor může být vyšší, konkrétně až do 30. Molekuly, které mohou být klinického zájmu pro léčení rakoviny, ale jsou omezeny nízkou nebo žádnou absorpcí·, v cytozolu, mohou být zavedeny do cytozolu pomocí tohoto vynálezu. Gelonin, jak ukázáno v níže uvedém příkladu, je příklad takové molekuly. Rovněž mohou být použity některé další molekuly, a.to bud' samostatně nebo ve spojení s jinými molekulami (jako např. protilátkami, transferinem, látkami zvyšujícími fotocitlivost, aponemB na rekonstruovaných LDL částicích). Výhoda takového kombinovaného ošetření--by-spočívala’.ν: 1) zlepšeném cyt-o toxickém efektu v hlubších vrstvách novotvarové tkáně, jelikož nízké a , i .subtoxické-dávky světla jsou dostatečné na narušení lyzosomů a endosomů; 2) zlepšené specifičnosti toxinu, jelikož PDT je,,· aplikována jen na oblast novotvarové oblasti.

• . f .

. ' . * . . ; . · . .. . ζρ, . ·· · ·> .«v > ‘

2) Genová terapie ‘ . ..

Genová terapie, tj terapeutický přenos genů do buněk pacienta, •tvoři slibnou metodu pro, léčení-g.enetichých'poruch, jako .jsou ·->· -..např··.- rakovina··,.cystiekď-fibrozifcida^kárdiovaskulární- * η·“” -r - · ----onemocnění a mnoho dalších'nemocí. Hlavní.dnešní problém je transfekce, která musí nastat in vivo, nebo v některých t případech-^;j-i-lze · provést ex’*vivo. · Dnes ’ nej'častěj'i'~používaný.7''' -í vektor., tj . struktura, která pomáhá dodat molekuly DNA do buněk, j-sou řoz-íiČné druhy virů, zejména retro-a,endoviry. Nevýhody ·__· těchto metod,jsou nízká stabilita vektoru, .omezená specifičnost, nízká, výtěžnost’ a zavedení DNA viru do lidské tkáně. DNA může být zavedena do buněk, buď jako protismyslná DNA nebo jako celé geny, prostřednictvím fotochemicky. vyvolaného narušení endosomů a/nebo' lyzosomů. Ošetření může být provedeno in vivo.

_ ' „ '' - . . . A. .. „ . .

3) Experimentální využití

Tento vynález může být použit na zavedení široké Škály molekul do buněk v,kultuře, jako např. genů,protilátek, upravenými ;

...... -proteiny... a -sloučeninami·, kter é -j sou- obvykle-membránou- -pl-a-zmat-u-------nepropustné.

Příklad 1. Tento příklad dokládá, že fotodynamické ošetření uvolňuje sloučeninu zabraňující syntézu proteinu do cytozolu.

Řada rostlinných toxinů ničí buňky tím, že vniká do cytozolu a enzymaticky deaktivuje ribozomní ' funkci , Nejcytotoxictěj ší rostlinné proteiny jsou tvořeny 2 polypeptidními řetězci, A a B, vzájemně vázanými dvojsiřičitanovými můstky.Funkce řetězce B je vázat protein na povrch buněk, zatímco řetězec A obsahuje enzymatickou aktivitu. Gelonin je rostlinný toxin, který účinně brání syntéze proteinu v bezbuněčném sytému, ale má jen malý nebo žádný vliv na neporušené buňky. Nízký cytotoxický vliv na neporušené buňky je pravděpodobně způsoben nedostatkem řetězce B v geloninu. Buňky NHIK 3025 byly inkubovány s TPPS2a (vzorec I) a geloninem, odděleně nebo společně, po dobu 18 hodin a následně 1 hodinu v TPPS2_a a bězgeloninovém prostředí dříve, než byly buňky vystaveny světlu. Syntéza proteinu byla měřena 24 hodin po vystavení světlu. Fotodynamické ošetření, které ničí 10-20% samotných buněk, snížilo syntézu proteinu o 30-40% (obr.2). Z obr.2 vyplývá, že samotný gelonin v přítomnosti nebo nepřítomnosti světla zabraňuje· do jisté míry syntézu proteinu. Syntéza proteinu může být zcela zamezena 5 kombinací PDT a geloninu o IC5Q = 0,2 gg/ml geloninu. V nepřítomnosti fotodynamického ošetření gelonin tedy v podstatě nevnikl do cytozolu. Tento příklad naznačuje, že lze použít TPPS2_a a světla po zavedení funkčně neporušených makromulekul do buněčného . cytozolu.

Příklad 2 Tento příklad ukazuje, jak může být dávka světla (o vlnové délce, která je absorbována barvivém) použita na rozhodnutí o velikosti přežívající frakce buněk. Buňky NHIK 3025 byly inkubovány s TPPS_2a a geloninem podle plánu příkladu 1. Klonogenické přežití buněk bylo měřeno 24 hodin po vystavení světlu. Z obr.3 vyplývá, že praktický všechny buňky byly zničeny·pomocí ŤPPS_2a a světla při,prodloužení expozice světlu.

»

To je v souladu s předchozím stavem techniky týkající se ničení nežádoucích buněk pomocí PDT. Přidáním geloninu klesne míra' přežití z.důvodu ú-tlumového vlivů geloninu na syntézu proteinu,’ což značí, že gelonin je nyní uvolněn v cytozolu. Zvýšená koncentrace přidaného geloninu vede k více geloninu v cytozó-lů, jak naznačeno zvýšenou citlivostí buněk na 'fotodeaktiváČi Tento vynález tedy v každém případě nabízí možnost nastaveni hladíny ‘přežití a volbu kombinace . f otočí tli KQjs.t_..Z-vyš.uj-í.c.íl-:______— sloučeniny· a vystavení světlu, která zachová Životnost žádané frakce buněk.

Příklad 3 Tento příklad,předvádí, jak měnící se dávka osvětlení řídí množství geloninu uvolněného v cytozolu, stanoveného relativní' syntézou proteinu. Buňky NHIK 3025 byly inkubovány pomocí TPPS_2a a geloninem podle plánu příkladu. Z obr.4 vyplývá, že shora uvedená toxická dávka 50 s zvýšila frakci geloninu v cytozolu, stanovenou relativní syntézou proteinu. ..Příklad ..4 -11. předvádí použi-tí způsobu-podle·-vynálezu na' různých druzích buněk a s různými fotocitlivost'zvyšujícími látkami a toxiny. Mezibuněční umístění fotocitlivost zvyšujících látek je lyzosomní (TPPS₄., TPPS_2a, AlPcS_2a) a extralyzosomní (3-THPP). Použité značky znamenají: AlPcS_2a .je ftalocyanin hliníku s 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích; TPPS4. je mezotetrafenylporfin se 4 sulfonanovým skupinami;

TPPS_2a je mezotetrafenylporfin se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích;.3-THPP je tetrahydroxylfenyl14 porfin. Použité druhy buněk jsou karcinomatózní buňky v místě.z lidského hrdla (NHIK 3025), plicní fibroblasty z čínského křečka (V79), SV-40 transformovaná játra z africké zelené opice (CV1opičí fibroblastům podobné buňky) (Cos-7), lidské osteosarkomní buňky (OHS) a malé buňky plicní rakoviny (H146). všechny pokusy byly vedeny jako v příkladu č. 1.

Příklad 4 Tento příklad se týká použití látek: AlPcS2_a zvyšujících fotocitlivost ve V79 buňkách s nebo bez geloninu jako toxinu (obr.5). Volbou specifické dávky osvětlení (ozařovací doby) je předvedeno, že bez toxinu dochází k velmi malému poškození buňky, jak doloženo malým snížením syntézy . proteinu, zatímco s geloninem je syntéza proteinu hluboce snížena. To ukazuje, jak jsóu molekuly geloninu .přenášeny doi' cytoplazmy buňky prostřednictvím lyzósomů bez podstatného poškození buněk, přestože mezibuňková. lokalizace ALPcS2_a je lyzosomní (Moan,J., Berg,K,; Anholt,H. a Madslien,K.: (1994).

Sulfonated aluminium phtalocyanines as sensitzers for phototherapy. Effects of smáli light doses on localization, dye fluorescence and photosensitivity in V79 cells. Sufonanované ftalocyaniny hliníku jako zvyšovače citlivosti pro. fotochemoterapii.(Vliv malých dávek světla na lokalizaci, fluorescenci barviv a fotocitlivost v buňkách V79].

Int. J.Cancer 58: 865-870).

Příklad 5 Tento příklad předvádí přenos toxinu geloninu do buněk H146 bez podstatného ovlivnění životnosti buněk. (Obr.6) Je známo, že TPPS_2a je lyzosomně umístěna v buňce. (Berg,K.,. Western,A., Bommer,J. aMoan,J,: (1990) Intracellular localisation of sulfonated meso-tetraphenylporphines in human carcinoma cell line. [Mezibuňkové umístění sulfonanovaného mezotetrafenylporfinu v lidském karcinomním druhu buněk.] Photochem.Photobiol. 52: 481-487; Berg,K., Madslien,K., .15

Bommer,J.C., Oftebro', R··., Winkelman, J.C. a Moan, J. : (1991)

Light induced relocalizatión of sulfonated mesotetraphenylporphines in NHIK 3025 cells and effects-of dose fractionation. [Světlem vyvolaná relokalizace sulfonanovaných mezotetrafenyl- , porfinů v buňkách-NHIK 3025 a vlivy frakcionalizace dávkování.] Photochém.· Photóbiól. 53/·’20'3^:210;' Bérg,K; . a Moan,J: (1994) Lysosomes·.as., photochemic.al.· tar.get.s__.. [Lyzosomy jako fotochemické cíle.]· Int. J.Cancer 59·: 814-822) .- - , ·

Příklad 6 'Tento příklad předvádí způsob podle vynálezu/ v — — - buňkách V79 za použití,TPPS_2a jako látky zvyšující fotocitlivost (obr.8). . • 4 rf

Příklad 7 Tento příklad předkládá, přenos·, toxinu agrostin do buněk ΝΗΪΚ 3 025 pomocí' látky TPP_2A .zvyšující fotocitlivost ' ' (obr.9). ' .

Příklad 8 Tento příklad, představuje přenos, toxinu. sáporin do NHIK 3025 buněk pomocí; TRP_2a _.(obr . 9) .......

Příklad 9 Toto je porovnávací příklad předvádějící, Že u’ látky zvyšující fotocitlivost (3-THPP)·, která nevstupuje do endocytických vezikulí (tj.endosomů a lyzosomů) (Peng,Q., Danielsen,H.E. a Moan,J.: (1994) Potent photosensitizers for

-photody-nam-i-c--ther-apy of- cancer : -App-licab-ions- of -eonfocal- laser scanning microscopy for fluorescence detection of photosensitizing fluorophores in neoplastic cells and tissues. [Schopné látky zvyšující fotocitlivot pro fotodynamickou terapii rakoviny: Aplikace konfokální (souohniskové) laserové snímací mikroskopie pro fluorescenční detekci fluoronosičů zvyšujících fotocitlivost v novotvarových buňkách a tkáních.]: Proceedings of Microscopy, Holography and Interferometry in Biomedicine.

SPIE. svazek '2083:71-82), .neexistuje podstatný rozdíl mezi vlivem

3-THPP s nebo bez geloninu na syntézou proteinu (obr.10). Tudíž gelonin není dopravován do cytozolu buněk.

Příklad 10 Tento příklad předkládá přenos geloninu do buněk COS-7 pomocí TPPS_2a podle vynálezu (obr.11).

Příklad 11 Tento příklad předkládá přenos geloninu do buněk OHS pomocí TPPS_2a podle vynálezu (obr.13). U tohoto druhu buněk dochází k podstatné degradaci proteinu v lyzosomech, které jsou v tomto příkladu potlačeny 4-hodinovou inkubací buněk buď v 50 μΕ chlorochininu nebo v 10 mM NH4CI.

Příklad 12 Tento příklad předvádí, podobně jako v příkladu 1, přenos geloninu do buněk NHIK 3025 jako funkci koncentrace geloninu, když jsou buňky inkubovány s TPPS4 a s různými koncentracemi geloninu a vystaveny světlu (obr.12). Při inkubaci buněk jen se samostatným geloninem a vystavení světlu, nebo inkubací s TPPS4 a geloninem,bez vystavení světlu, nedochází,,k přenosu geloninu do buněk. Příklady ukazují, Že různé molekuly mohou být zavedeny do cytozolu širokého sortimentu buněk pomocí různých látek zvyšujících fotocitlivost a světelných dávek. Exogenní molekuly mohou být zavedeny do buněčného cytozolu po dávkách látek zvyšujících fotocitlivost a osvětlení, které neničí buňky, pokud jsou zaváděné molekuly a fotocitlivost zvyšující látky dopravovány do těchže komůrek buněk.

Fotochemický efekt na biologické komůrky závisí na daném množství fotocitlivost zvyšující látky v této komůrce, na dávce použitého světla a na spektrálních vlastnostech světelného zdroje. Nej lepší způsob vyhodnocení fotochemických účinků na buňky v kultuře je proto měření přežití buňky 24-hodin nebo déle po ošetření. Jak uvedeno shora, existuje dobrá korelace mezi vlivem na ničení buněk a potlačením syntézy proteinů 24 hodin po ošetření, jak uvedeno shora (data však nejsou uvedena).

Claims (16)

1. Způsob převodu molekul do cytozolu živých buněk pomocí £ £ fotocitlivost zvyšujících sloučenin a světla absorbovaného sloučeninou-zvyšuj ící fotocitiivost,/ - . °^'^υΐ4·· ''I v y. .-.z n a .č. u, j -d- c'--í- s·· e že......... / ‘ ΐ ' ‘ .

. . ___ .......... -- - - -......- - π '< í i * sloučenina zvyšující fotocitlivost opčně vektorové molekuly a , dopravovaná(é) molekula(y), vzájemně, sloučené nebo. oddělené, -/2 jsou aplikovány na živé buňky,y a jsou,potom,•eridocytieky-nebo.- jiným způsobem přemístěny do endosomů, lyzósomů nebo jiných mezibuněčných, membránou omezených komůrek, přičemž jsou buňky vystaveny světlu o vhodné, vlnové jdélc.e.-.po.dle^absorpčního^spektra ^k v ’ ^T sloučeniny zvyšující fotocitlivost v rozličných dávkách,

-záv.islých-na-požadované- mí-ř-e-př-ežití-3ak-,- /abyúmemhráný^;~ÍT’'?··· ehdós omnich, ‘ ly z osomni ch nebo jiných mezibuněčných komůrek se narušily·, a do cytozolu· zaváděné molekuly'se uvolní do cytozolu, a aby samotná světlem aktivovaná sloučenina, zvyšující fotocitlivost nezničila většinu buněk.

2. Způsob podle nároku l,

-Vy znač u- j- i- c- í - . s e - Ví m, že molekuly uvolňované v cytozolu jsou zvoleny ze skupiny obsahující DNA,, oligo (deoxy) nukleotidy, mRNA, protisměrné DNA, cukry, proteiny, peptidy,membránou nepropustné, léky iné. ._r membránou nepropustné molekuly a kovalentně-nebo' nekovalentně vázané kombinace shora uvedených molekul.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že molekuly uvolňované do cytozolu jsou zvoleny ze skupiny látek modifikujících syntetickou aktivitu proteinu;

MICHAEL FISCJiW Dipi.-w y

4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že sloučenina uvolňovaná do cytozolu je gelonin,' saporin nebo agrostin nebo jakákoliv jejich kombinace.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující, se ‘tím, že.

použité- sloučeniny zvyšující fotocitlivost jsou zvoleny ze skupiny obsahující pórfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporfyriny, naftalocyaniny, kationová barviva, tetracykliný a lozosomotropické slabé zásady a jejich deriváty.

6. Způsob podle nároku 5,' . . *

Vyznačující se tím, že použitá sloučenina zvyšující fotocitlivost je tetrafenylporfin s 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových kruzích (TPPS2_a), mezotetrafenylporfin se 4 sulfonanovými skupinami ^Λ (TPPS₄) nebo ftalocyanin hliníku se 2 sulfonanovými skupinami na přilehlých kruzích (AlPcSsa) nebo jakákoliv, jejich kombinace.

7. Způsob podle nároku 1, . · „ vyznačující se tím, že použité vektorové molekuly jsou na pracovní polohu směřující molekuly nebo zlepšovatelé, kteří usnadňují absorpci sloučeniny zvyšující fotocitlivost nebo molekul, které mají být uvolněny do cytozolu.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující. se tím, že frakce přežívajících buněk je regulována volbou dávky světla ve vztahu ke koncentraci fotocitlivost zvyšující sloučeniny.

.

9. Směs pro modifikaci novotvarých nebo jiných buněčných procesů u teplokrevních Živočichů nebo kultur buněk obsahující jak složku, - která má být- uvolněna do cytózólu, tak látku zvyšující’ ' fotocitlivost a nosiče, vyznačující se- tím, že 'obsahuje člen zvolený zé skupiny složené'z nosiče'ria‘usnadnění translokace do mezibuněčných komůrek, j ako.,např ... endošpmy lyzosomy nebo jiné mezibuněčné komůrky, mající navícpřipojené jak sloučeniny modifikující buněční proces, které mají být * £ uvolněny-do-cytózólu·,-tak- i sloučeninu· zvyšující -ίοϋοσίΡΤίνοεΡ*/^ .které po aktivaci světlem prolomí membrány mezibuněčných' komůrek; několika řečených nosičů z nichž nejméně jeden nosič má navíc -přípoj enou- sloučeninu,· ktěrá~má býť uvolněna’ .do cytozclů,'” > >1« a jiný podobný nebo odlišný nosič má navíc'připojenou sloučeninu zvyšuj ici 'fotocitlivost; a ,oddě~lenou směs- nosřčú/ která' má._bý_ť?_í spolu ,se. sloučeninou, uvolněna do cytózólu -a sloučeniny zvyšující fotocitlivost

I

10. Směs podle nároku.9, .. vyznačující se tím,·' že řečená sloučenina, která má být uvolněna do-cytózólu, je. protinovotvarová sloučenina.

11. Směs-podle nároku 10,. . : v~y— z-n. a č u g~í -c- -í- s^-e- -t -í-m-,---že - - — - - ------ --p- protinovotvarová .sloučenina je gelonin. i

MICHAEL H

12. Směs podle nároku 9, vyznačující se tím, že sloučenina, která má být uvolněna do cytozolu, je zvolena ze skupiny obsahující DNA, oligo(dexy)nukleitidy, mRNA, protisměrnou DNA, cukry, proteiny, peptidy, membránou nepropustné léky, jiné membránou nepropustné molekuly, kovalentně nebo nekovalentně vázané kombinace shora uvedených molekul.

13. Směs podle nároku 9, *

vyznačující se tím, že sloučenina zvyšující fotocítlivost je zvolena ze skupiny obsahující porfyriny, ftalocyaniny, purpuriny, chloriny, benzoporfyriny, naftalocyaniny, kationová barviva, tertracykliny a lyzosomotropicky slabé zásady a jejich deriváty.

14. Směs podle nároku 11, vyznačující se tím,že sloučenina zvyšující fotocítlivost je tetrafenylporfin s dvěmi sulfonanovými skupinami na přilehlých fenylových skupinách. '

15. Směs podle nároku 9, ’ , vyznačující se tím, že nosiče jsou zvoleny z molekul směřujících na pracující polohu nebo zlepšovatelů, které usnadňují absorpci sloučenin zvyšujících fotocítlivost nebo molekuly, které mají být uvolněny do cytozolu.

16. Souprava pro provádění způsobu podle nároku 1, vyznačující se tím, še obsahuje sloučeninu zvyšující fotocítlivost a jiné sloučeniny modifikující přenos přes membránu buňky, usnadňující určitá-— populace buněk nebo jiné související funkce. 1 ty