CZ79196A3 - Subtilisine bpn°variants with reduced adsorption and increased hydrolysis, cleaning agent containing such variants and a gene encoding said variant - Google Patents

Subtilisine bpn°variants with reduced adsorption and increased hydrolysis, cleaning agent containing such variants and a gene encoding said variant Download PDF

Info

Publication number
CZ79196A3
CZ79196A3 CZ96791A CZ79196A CZ79196A3 CZ 79196 A3 CZ79196 A3 CZ 79196A3 CZ 96791 A CZ96791 A CZ 96791A CZ 79196 A CZ79196 A CZ 79196A CZ 79196 A3 CZ79196 A3 CZ 79196A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
glu
amino acid
asp
ser
asn
Prior art date
Application number
CZ96791A
Other languages
English (en)
Inventor
Philip Frederick Brode Iii
Bobby Lee Barnett
Donn Nelton Rubingh
Original Assignee
Procter & Gamble
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Procter & Gamble filed Critical Procter & Gamble
Publication of CZ79196A3 publication Critical patent/CZ79196A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A61K8/66—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Tento vynález se týká subtilisinových BPN' variant se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou, čistícího prostředku obsahujícího tyto varianty a genu kódujícího tuto variantu.
Dosavadní stav technikv
Enzymy tvoří největší skupinu přirozeně se vyskytujících proteinů. Každá skupina enzymů obvykle katalýzuje (urychluje reakce bez toho, aby byla spotřebovávána) jiný druh chemické reakce. Jedna skupina enzymů, známá jako proteasy, je známa pro svoji schopnost hydrolyzovat (rozkládat sloučeninu na dvě nebo více jednodušších sloučenin s tím, že se přijímá H a OH část molekuly vody na stranách vazby, která je štěpena) jiné proteiny. Tato schopnost hydrolyzovat proteiny se s výhodou provádí zahrnutím přirozeně se vyskytujících a synteticky připravených proteas jako přísad do pracích detergentních prostředků. Mnoho skvrn na šatech je proteinového původu a proteasy se širokou specifičností mohou podstatně zlepšit odstraňování těchto skvrn.
Naneštěstí hladina účinnosti těchto proteinů v jejich přirozeném bakteriálním prostředí se často nepřenáší na relativně nepřirozené prací prostředí. Konkrétně takové vlastnosti proteas, jako je tepelná stabilita, stabilita při různém pH, stabilita při oxidaci a substrátová specifičnost, nejsou nutně optimalizovány pro použití mimo přirozené prostředí enzymu.
Aminokyselinová sekvence proteasy určuje vlastnosti proteas. Změna aminokyselinové sekvence proteasy může měnit vlastnosti enzymu do různého stupně nebo dokonce může enzym deaktivovat, podle umístění, povahy a/nebo velikosti změny aminokyselinové sekvence. Existuje několik přístupů pro měnění přírodní aminokyselinové sekvence proteas při pokusech zlepšit jejich vlastnosti s cílem zvýšit účinnost proteas v pracím prostřed! o Mezi tyto přístupy patří měnění aminokyselinové sekvence tak,, aby se zvýšila tepelná stabilita a aby se zlepšila stabilita k oxidaci za rozdílných podmínek.
Přes různé přístupy popsané v oblasti techniky existuje stále ještě neustálá potřeba nových efektivních variant proteas užitečných pro čištění rozmanitých povrchů.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je získat varianty subtilisinového enzymu, které mají zlepšenou hydrolýzu při srovnání s přírodním typem tohoto enzymu.
Předmětem předloženého vynálezu je také získat takové čistící protředky, které obsahují tyto varianty subtilisinového enzymu.
Předložený vynález se týká subtilisinových BPN' variant, které obsahují v alespoň jedné, dvou nebo třech aminokyselinových polohách jiné aminokyseliny než ty, které se vyskytuji v přírodním subtilisinovém BPN' (tj. jde o substituci) ve specificky identifikovaných polohách, při čemž tyto BPN' varianty mají sníženou adsorpci k nerozpustnému substrátu a zvýšenou hydrolýzu tohoto nerozpustného substrátu při srovnání s přírodním subtilisinovým BPN'. Tento vynález se týká také genů, které kódují tyto subtilisinové BPN' varianty. Tento vynález se týká také prostředků obsahujících tyto subtilisinové BPN' varianty pro čištění rozmanitných povrchů.
Tento vynález se týká subtilisinových enzymů, zvláště BPN', které jsou modifikovány mutací různých nukleotidových sekvencí, které kódují tento enzym, tedy modifikováním aminokyselinové sekvence enzymu. Modifikované subtilisinové enzymy (zde dále uváděné jako ”BPN' varianty”) podle předloženého vynálezu mají sníženou adsorpci k nerozpustnému substrátu a zvýšenou hydrolýzu tohoto nerozpustného substrátu při srovnáni s přírodním subtilisinem. Předložený vynález se týká také genů mutantu kódujícího tyto BPN' varianty.
Subtilisinové enzymy podle vynálezu patří do skupiny enzymů známých jako proteasy. Proteasa je katalyzátor štěpení peptidových vazeb. Jedním typem proteas je serinová proteasa. Serinová proteasa se odlišuje tím, že má v aktivním místě esenciální serinový zbytek.
Je dobře dokumentováno, že se enzymová rychlost hydrolýzy rozpustných substrátů zvyšuje s koncentrací enzymu. Zdálo by se tedy přijatelné, že u substrátů navázaných na povrch, jak se s nimi setkáváme při mnoha čistících aplikacích, by se rychlost hydrolýzy zvyšovala se zvyšující se koncentrací na povrchu. Bylo ukázáno, Že tomu tak skutečně je (Brode P.F. III a D.S.Rauch, Langmuir, Subtilisin BPN': Activity on an Immofoilized Substráte” 8, 1325 (1992).). Ve skutečnosti byla zjištěna lineární závislost rychlosti na povrchové koncentraci pro nerozpustné substráty, jestliže se mění koncentrace enzymu na povrchu (Rubingh D.N., Bauer M.D.: ”Catalysis of Hydrolysis by Proteases at the Protein-Solution Interface” v Polymer Solutions, Blends and Interfaces, I. Noda a D.N.Rubingh (red.), Elsevier, str. 464 (1992).). Když byla při výzkumu variant proteas, které poskytují lepší čistění, hledána aplikace tohoto principu, překvapivě jsme nezjistili, že enzymy, které více adsorbují, poskytují lepší čištění. Ve skutečnosti jsme překvapivě zjistili opak tohoto případu: snížená adsorpce enzymu na substrát vedla ke zvýšené hydrolýze substrátu (tj. k lepšímu čištění).
Bez ohledu na teorii předpokládáme, že zlepšené provedení, jestliže se srovnává jedna varianta s druhou, je výsledkem skutečnosti, že enzymy, které méně adsorbují, jsou také méně pevně vázány a jsou tedy mobilnější na povrchu, ze kterého se má od4 stranit nerozpustný proteinový substrát. Při srovnatelných koncentracích enzymového roztoku je tato zvýšená pohyblivost dostatečná pro to, aby převážila jakoukoliv výhodu, které se dosáhne vyšší koncentrací enzymu na povrchu.
Zde popsané mutace jsou navrženy pro změnu (tj. snížení) adsorpce enzymu ke špíně navázané na povrch. V BPN' aminokyseliny od polohy 200 do polohy 220 tvoři velkou vnější smyčku na molekule enzymu. Bylo objeveno, že tato smyčka hraje významnou úlohu při adsorpci molekuly enzymu na peptid navázaný na povrch. Specifické mutace v této smyčce mají na tuto adsorpci významný vliv. Bez toho, abychom se vázali na teorii, se předpokládá, že tato smyčka je důležitá pro adsorpci BPN' molekuly alespoň ze dvou důvodů. Za prvé, aminokyseliny, které obsahují tuto vnější smyčku, mohou tvořit těsné kontakty s jakýmikoliv povrchy, k nimž molekuly směřují. Za druhé, blízkost této smyčky k aktivnímu místu a vazebné kapse BPN' molekuly jí dává roli v katalyticky produktivní adsorpci enzymu na substráty vázané na povrch (peptidové/proteinové ušpinění).
Pojem varianta tak, jak se zde používá, znamená enzym, který má aminokyselinovou sekvenci, která se liší od přírodní sekvence.
Pojem mutanta BPN' genu tak, jak se zde používá, znamená gen kódující BPN' variantu.
Pojem přírodní subtilisinový BPN znamená subtilisinový enzym sekvence identifikační číslo 1
Ala Gin Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gin Ile Lys Ala Pro Ala 15 10 15
Leu His Ser Gin Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val 20 25 30
Ile Asp Ser Gly Ile 35 Asp Ser Ser His Pro Asp Leu 40 Lys Val Ala 45
Gly Gly Ala Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gin Asp
50 55 60
Asn Asn Ser His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu
65 70 75
Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu
SO 85 90
Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gin Tyr Ser
95 100 105
Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp
110 115 120
Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu
125 130 135
Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala Ser Gly Val Val Val Val
140 145 150
Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly Ser Ser Ser Thr Val
155 160 165
Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala Val Gly Ala Val
170 175 180
Asp Ser Ser Asn Gin Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Pro Glu
185 190 195
Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gin Ser Thr Leu Pro 200 205 210
Gly Asn Lys Tyr Gly 215 Ala Tyr Asn Gly Thr Ser 220 Met Ala Ser Pro 225
His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn
230 235 240
Trp Thr Asn Thr Gin Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr
245 250 255
Lys Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val
260 265 270
Gin Ala Ala Ala Gin
275
(sekvence id. č. 1).
Aminokyselinová sekvence subtilisinového BPN' je dále popsána Wellsem J. A., Ferrarim E., Hennerem D.J., Estellem D.A. a Chenem E.Y. v práci: Nucleic Acids Research 2, 7911 (1993), která je zde zařazena jako citace.
Pojem přírodní aminokyselinová sekvence zahrnuje jak shora uvedenou sekvenci identifikační číslo 1 tak sekvenci identifikační číslo 1 s jinými modifikacemi aminokyselinové sekvence než v kterékoliv z poloh 199 až 220.
Pojem hydrofilnější aminokyselina tak, jak se zde používá, znamená jakoukoliv jinou aminokyselinu s větší hydrofilností než předmětná aminokyselina, jak je to uvedeno v tabulce hydrofilností níže. Následující tabulka hydrofilností (tabulka
1) uvádí aminokyseliny v pořadí zvyšující se hydrofilnosti (viz Hopp T.P. a Woods K.R.: Prediction of Protein Antigenic Determinante from Amino Acid Sequences, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 78. 3824 (1981), zahrnuté sem jako citace).
Ί
Tabulka 1
aminokyselina hydrofilnost
Trp “3,4
Phe -2,5
Tyr -2,3
Leu, Ile -1,8
Val -1,5
Met -1,3
Cys -1,0
Ala, His -0,5
Thr -0,4
Pro, Gly -0,0
Gin, Asn 0,2
Ser 0,3
Arg+, Lys+,
Glu', Asp' 3,0
Tabulka 1 také ukazuje, která aminokyselina nese náboj (tato vlastnost je odvozena od pH v rozmezí asi 8 až 9) . Positivně nabité aminokyseliny jsou Arg a Lys, negativně nabité aminokyseliny jsou Glu a Asp, zbývající aminokyseliny jsou neutrální. Ve výhodném provedení podle předloženého vynálezu je substituující aminokyselina buď neutrální nebo negativně nabitá, výhodněji negativně nabitá (tj. Glu nebo Asp).
Tak například konstatování substituovat Gin stejně hydrofilní nebo hydrofilnější aminokyselinou, která je neutrální nebo má negativní náboj, znamená, že Gin by byl substituován Asn (která je stejně hydrofilní jako Gin) nebo Ser, Glu nebo Asp (které jsou hydrofilnější než Gin). Každá z nich je neutrální nebo nese negativní náboj a má větší hydrofilnost při srovnání s Gin. Podobně konstatování substituovat Pro hydrofilnější aminokyselinou, která je neutrální nebo má negativní náboj znamená, že Pro by měl být substituován Gin, Asn, Ser, Glu nebo δ
Asp.
V této části spisu budou popsány varianty, které obsahuji alespoň jednu substituci aminokyselin.
V jednom provedení podle předloženého vynálezu BPN' varianta obsahuje přírodní aminokyselinovou sekvenci, při čemž tato přírodní aminokyselinová sekvence je substituována v jedné nebo více Z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220, při čemž tato BPN' varianta má sníženou adsorpci na nerozpustný substrát nebo zvýšenou hydrolýzu nerozpustného substrátu při srovnání s přírodním subtilisinovým BPN'. Výhodnými polohami, které mají substituované aminokyseliny, jsou 199, 200, 201,
202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212 nebo 215, výhodněji 200, 201, 202, 205 nebo 207.
Substituující aminokyselinou pro polohu 199 je s výhodou Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 200 je s výhodou His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 201 je s výhodou Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 202 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 203 je s výhodou Met, Cys, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 204 je s výhodou
Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 205 je s výhodou
Leu, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo
Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 206 je s výhodou Pro, Asn nebo Ser.
Substituující aminokyselinou pro polohu 207 je s výhodou Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 208 je s výhodou Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 209 je s výhodou Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 210 je s výhodou Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 211 je s výhodou Ala, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 212 je s výhodou Gin, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 213 je s výhodou Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 214 je s výhodou Phe, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Asp nebo Glu.
Thr,
Substituující aminokyselinou pro polohu 215 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 216 je s výhodou His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 218 je s výhodou
Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 219 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 220 je s výhodou Pro, Gly, Gin, Asn, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199(, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 219 a 220 je výhodnější s odkazem na tabulku 1 neutrální nebo negativně nabitá a stejně hydrofilní nebo hydrofilnější, s výhodou hydrofilnější, aminokyselina než je aminokyselina v příslušné poloze přírodního subtilisinového BPN'.
Substituující aminokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 219 a 220 je ještě výhodněji Asp nebo Glu a substituující aminokyselinou pro polohu 204 nebo 218 je Gluo
V této části spisu budou popsány varianty, které obsahuji alespoň dvě substituce aminokyselin.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu BPN' varianta obsahuje přírodní aminokyselinovou sekvenci, při čemž tato přírodní aminokyselinová sekvence je substituována ve dvou nebo více polohách z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220, při čemž tato BPN' varianta má sníženou adsorpci na nerozpustný substrát a zvýšenou hydrolýzu nerozpustného substrátu při srovnání s přírodním subtilisinovým BPN'. Výhodnými polohami, které mají substituované aminokyseliny, jsou polohy 199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212 nebo 215, výhodněji 200, 201, 202, 205 nebo 207.
Substituující aminokyselinou pro polohu 199 je s výhodou Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 200 je s výhodou His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 201 je s výhodou Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 202 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 203 je s výhodou Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 204 je s výhodou Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 205 je s výhodou Leu, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 206 je s výhodou Pro, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 207 je s výhodou Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 208 je s výhodou Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 209 je s výhodou Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 210 je s výhodou Ala, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituujíc! aminokyselinou pro polohu 211 je s výhodou
Ala, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 212 je s výhodou Gin, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 213 je s výhodou Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituujíc! aminokyselinou pro polohu 214 je s výhodou Phe, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 215 je s výhodou Thr, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 216 je s výhodou His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 217 je s výhodou Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 218 je s výhodou Gin, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 219 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 220 je s výhodou Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220 je s výhodou s odkazem na tabulku 1 neutrální nebo negativně nabitá a stejně hy13 drofilní nebo hydrofilnější, výhodněji hydrofilnější aminokyselina než je aminokyselina v příslušné poloze přírodního subtilisinového BPN'.
Substituující aminokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220 je ještě výhodněji Asp nebo Glu.
V této části spisu budou popsány varianty, které obsahují alespoň tři substituce aminokyselin.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu BPN' varianta obsahuje přírodní aminokyselinovou sekvenci, při čemž tato přírodní aminokyselinová sekvence je substituována ve třech nebo více polohách z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220, při čemž tato BPN' varianta má sníženou adsorpci na nerozpustný substrát nebo zvýšenou hydrolýzu nerozpustného susbtrátu při srovnání s přírodním subtilisinovým BPN'. Výhodnými polohami, které mají substituované aminokyseliny, jsou polohy 199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212 nebo 215, výhodněji 200, 201, 202, 205 nebo 207.
Substituující aminokyselinou pro polohu 199 je s výhodou Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 200 je s výhodou His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 201 je s výhodou Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 202 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 203 je s výhodou
Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 204 je s výhodou Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 205 je s výhodou Leu, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 206 je s výhodou Pro, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituujíc! aminokyselinou pro polohu 207 je s výhodou Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 208 je s výhodou Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 209 je s výhodou Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 210 je s výhodou Ala, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 211 je s výhodou Ala, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 212 je s výhodou Gin, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 213 je s výhodou Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 214 je s výhodou Phe, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin,
Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 215 je s výhodou Thr, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 216 je s výhodou His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 217 je s výhodou Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 218 je s výhodou Gin, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 219 je s výhodou Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituující aminokyselinou pro polohu 220 je s výhodou Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
Substituujíc! aminokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220 je s výhodou s odkazem na tabulku 1 neutrální nebo negativně nabitá a stejně hydrofxl“ ní nebo hydrofilnější, s výhodou hydrofilnější, aminokyselina než je aminokyselina v příslušné poloze přírodního subtilisino· vého BPN'.
Substituující aminokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220 je ještě výhodněji Asp nebo Glu.
Příklady provedeni vynálezu
V této části budou popsány přípravy enzymových variant.
Příklad 1
Geny mutantu BPN'
Fagemid (pSS-5) obsahující přírodní subtilisinový BPN' gen (Mitchinson C. a J.A.Wells: Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN', Biochemistry 28, 4807 (1989).) se transformuje do Escherichia coli ung-kmen CJ236. Pomocí VCSM13 pomocného fágu se připraví jednovláknový uracil-obsahující DNA templát (Kunkel T.A., Roberts J.D., Zakour R.A.: Rapid and @fficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymology 154. 367 (1987) podle modifikace Yuckenberga P.D., Witneyho F., Geisselsodera J. a McClaryho J.: Site-directed in vitro mutagenesis using uracíl-containing DNA and phagemid vectors, Directed Mutagenesis - A Practical Approach, M.J.McPherson (red.), str. 27 až 48 (1991), obě práce jsou zde zahrnuty jako citace). Pro přípravu všech mutanta (v podstatě tak, jak je popsáno Yuckenbergem a spol.: viz shora 1991) se používá modifikace místně řízené mutagenese jediného primeru způsobem podle Zollera a Smithe (Zoller M.J., Smith M.s Oligonucletide-directed mutagenesis using M13-derived vectors s an efficient and generál proceduře for the production of point mutations in any fragment of DNA, Nucl. Acids Res. 10. 6487 (1982) , tato práce je zde zahrnuta jako odkaz) . Oligonukleotidy se připravují syntetizátorem Applied Biosystem lne. 38OB DNA synthesizer. Reakční produkty mutagenese se transformují do Escherichia coli kmene MM294 (Americká sbírka typů kultur,, Eo coli 33625). Všechny mutanty se potvrdí DNA sekvenováním. Isolovaná DNA se tranformuje do Bacillus subtilis expresního kmene BG2036 (Yang M.Y., Ferrari E., Henner D.J.: Cloning of the Neutrál Protease Gene of Bacillus subtillis and the Use of the Cloned Gene to Create an In Vitro-derived Deletion Mutation, J. Bacteriol. 160, 15 (1984).). Pro stejné mutanty se při přípravě uracilového templátu použije modifikovaný pSS-5 s posunutovou mutací stop kodonu na aminokyselině 217. Oligonukleotidy jsou určeny pro restaurování příslušné čtecí oblasti v poloze 217 a jsou také kódovány pro náhodné substituce v polohách 199,
200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220 (ekvimolární a/ /nebo proměnné směsi všech čtyř nukleotidů pro všechny tři báze v těchto kodonech). Mutace, které opravují posunutý stop kodon a produkují funkční enzym, se identifikují jejich schopností štěpit kasein. Náhodné substituce se stanoví DNA sekvenováním.
Příklad 2
Fermentace
Buňky Bacillus subtilis (BE2036) obsahující příslušný subtilisinový mutant se nechají vyrůst do střední log fáze v jednom litru kultury LB-glukosová živná půda a naočkují se do fermentoru Biostat ED (B. Braun Biotech, lne., Allentown, Pensylvánie) v celkovém objemu 10 litrů. Fermentační medium obsahuje kvasinkový extrakt, škrob, protipěnivé činidlo, pufry a stopy minerálů (viz Fermentation: A Practical Approach, B. McNeil, Harvey L.M. (red.), (1990).). Živná půda se během fermentace udržuje na konstantním pH 7,0. Pro antibiotickou selekci mutovaného plasmidu se přidá chloramfenikol. Buňky se nechají růst přes noc při 37 °C do A600 kolem 60. Potom se isolujíc
Příklad 3
Čištění
Aby se získal čistý enzym fermentační živné prostředí se zpracuje podle následujících stupňů. Živné prostředí se zbaví buněk Bacillus subtilis odstřeďováním a vyčeří se odstraněním jemných částic membránou zadržující částice o molekulové hmotnosti nad 100 000. Následuje odstřeďování membránou, která zadržuje částice o molekulové hmotnosti 10 000. Dialysou se sníží iontová síla. 0,025M MES pufrem (2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina) se pH upraví na hodnotu 5,5. Enzym se dále vyčistí nanesením buď na kolonu s iontoměničem nebo na kolonu s afinitním adsorpčním nosičem. Z kolony se eluuje gradientem chloridu sodného nebo propylenglykolu (viz Scopes R.K.: Protein Purification Principles and Practice, Springěr Verlag, New York (1984), tato publikace je zde zahrnuta jako citace).
Pro stanovení koncentrace aktivního enzymu ve frakcích isolovaných během gradientově eluce se použije pNA test (DelMar E.G., Largman C., Brodrick J.W., Geokas M.C.: Anal. Biochento 99. 316 (1979); tato práce je zde zahrnuta jako citace.). Tímto testem se měří rychlost, kterou se uvolňuje p-nitroanilin podle toho, jak enzym hydrolyzuje rozpustný syntetický substrát, sukčiny1-alanin-alanin-prolin-fenylalanin-p-nitroanilid (sAAPF-pNA) . Rychlost vzniku žlutého zabarvení při hydrolyzační reakci se měří spektrofotometrem při 410 nm. Tato rychlost je úměrná koncentraci aktivního enzymu. Pro stanovení celkové koncentrace proteinu se použije měření absorbance při 280 nm. Poměr aktivní protein/celkový protein udává čistotu enzymu. Používá se pro identifikování frakcí, které se spojí jako zásobní roztok.
Abychom se během skladování vyhnuli autolyse enzymu, přidá se ke spojeným frakcím získaným z chromatograf ické kolony stejná hmotnost propylenglykolu. Po ukončení čištění se čistota zásobního enzymového roztoku zkontroluje SDS-PAGE (elektroforesa na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným). Absolutní koncentrace enzymu se stanoví titrací aktivních míst trypslnovým inhibitorem typu II-T: vejce krůty od firmy Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri). Změřené faktory konverse ukazují, které změny v molekule enzymu v různých polohách vedou k enzymové variantě se zvýšenou aktivitou na rozpustný substrát pNA při srovnáni s přírodním typem.
Při přípravě pro použití se enzymový zásobní roztok eluuje kolonou s nosičem Sephadex-G25 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) . Odstraní se tak propylenglykol a vymění se pufr. MES pufr v zásobním roztoku enzymu se vymění za O,1M Tris pufr (trishydroxymethylaminomethan) obsahující 0,01M chlorid vápenatý a pH se kyselinou chlorovodíkovou upraví na 8,6. Všechny pokusy se provádějí při pH 8,6 v Tris pufru udržovaném na 25 °C.
V následujících příkladech budou charakterizovány enzymové varianty.
Příklad 4
Příprava modelového povrchu
Jako nosič pro kovalentní připojení substrátu sAAPF-pNA získaného od firmy Bachem, lne. (Torrence, Kalifornie) se použije aminopropyl-sklo s kontrolovanou velikostí pórů (CPG) získané od firmy CPG lne. (Fairfield, New Jersey) . Reakce se provádí v dimethylsulfoxidu. Jako kondenzační činidlo se použije hydrochlorid l-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]karbodiimidů (EDC). Po ukončení reakce (sledováno testem pNA) se nadbytek rozpouštědla odstraní a CPG:sAAPF-pNA se promyje dimethylsulfoxidem (DMSO) a dvakrát předestilovanou vodou. Následuje vysušení v sušárně v proudu dusíku při 70 °C. Reakční schéma a příprava imobilizovaného substrátu se provádí podle Brodeho P.F.III a D.S.Raucha: Subtilisin BPN': Activity on an Immobílized Substráte, Langmuir 8, 1325 (1992); tato práce je zde zahrnuta jako odkaz.
CPG povrch má 62 000 ± 7 000 pNA molekul/μιη2. Plocha povrchu 50,0 m2/g uvedená CPG lne pro CPG se nemění. To ukazuje, že tento postup použitý pro přidání sAAPF-pNA k CPG nepoškozuje porézní strukturu (střední průměr je 48,6 nm) .
Příklad 5
Test hydrolýzy na povrchu
Adsorpce enzymové varianty a hydrolýza peptidu navázaného na CPG se mohou měřit v jediném pokusu použitím CPG:sAAPF-pNA. K baňce, která obsahuje Tris pufr a CPG:sAAPF-pNA, z nichž byly odstraněny plyny, se přidá malý objem zásobního roztoku enzymo20 vé varianty. Tato baňka se třepe 90 minut. Během této doby se třepačka v různých časových intervalech zastavuje - například každé dvě minuty během stadií adsorpční hydrolýzy (např. prvních 20 minut a každých 10 minut ke konci pokusu). CPG:sAAPF-pNA se nechá usadit a odebere se vzorek. Jak experimentální postup tak výpočet adsorpce a hydrolýzy se provedou podle postupu, který popsali Brode a spol: viz shora 1992.
U všech enzymů se sleduje stabilita proti autolýze. Žádný enzym by neměl během pokusu vykazovat znatelné autolytické ztráty. Adsorpce enzymu se tedy může stanovovat měřením vyčerpání roztoku. Rozdíl mezi původní koncentrací enzymové varianty a koncentrací změřenou v každém jednotlivém bodu udává množství adsorbovaného enzymu. Množství pNA hydrolyzovaného z povrchu se změří odečtením absorbance podílu vzorku při 410 nm. Celkové množství hydrolyzovaného pNA se vypočte přidáním množství odebraného jako vzorek a množství zbývajícího v baňce. Tato hodnota se opraví odečtením množství pNA, které je hydrolyzováno Tris pufrem při pH 8,6, jestliže není přítomen žádný enzym. Tato hydrolýza se pohybuje mezi 7 a 29 % z celkové hydrolýzy podle účinnosti enzymu.
Příklad 6
Kinetická analýza rozpustného substrátu
Rychlosti hydrolýzy rozpustného substrátu sAAPF-pNA se sledují ze zvýšení absorbance jako funkce času při 410 nm měřením na spektrofotometru DU-70. Koncentrace enzymu se udržuje konstantní. Připraví se vzorek s koncentrací v rozmezí od 6 do 10nM, při čemž koncentrace substrátu se pro každé kinetické stanovení mění od 90 do 700 μΜ sAAPF-pNA. Adsorbce se stanovuje každou vteřinu po dobu 900 vteřin. Tato data se přenesou na Lotus™ (Lotus Development Corporation, Cambridge, Massaschusetts). Analýza kinetických parametrů se provádí standardní analýzou (Lineweaver Burk), při které data počáteční části analýzy (obvykle první minuta) na lineární regresní křivce dá21 vají v0. Data v0 a s0 se vynesou standardním inverzním způsobem. Získají se Kj, a kkat.
V další části jsou uvedeny příklady BPN' variant.
Příklady BPN' variant podle předloženého vynálezu, které mají sníženou adsorpci na substráty vázané na povrch a zvýšenou hydrolýzu substrátů navázaných na povrchu, jsou uvedeny níže v tabulce 2. Při popisu příslušných mutací se původní aminokyselina, která se vyskytuje v přírodní sloučenině, uvádí jako první údaj, číslo polohy této aminokyseliny jako druhý údaj a substituující aminokyselina jako třetí údaj.
Tabulka 2
Příklady BPN' variant
Jediná mutace:
Lys213Glu
Ala216Glu
Ala216Asp
Ala216Gly
Ser204Glu
Val203Glu
Dvojí mutace:
Tyr217Leu
Lys213Glu + Ile205Leu + Ile205Leu + Pro210ALa + Lys213Glu + Tyr214Phe + Gln206Glu + Ala216Glu + Gln206GlU + Gln206Glu +
Ala216Glu
Ala216Asp
Gly215Thr
Ala216Glu
Tyr217Asn
Ala216Glu
Tyr217Leu
Tyr217Leu
Lys312Glu
Tabulka 2 (pokračování)
Trojí mutace:
Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu
Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu
Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu
Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu
Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Leu
Čtyři mutace:
Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu
Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu
Gln204Glu + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu
Pět mutací:
Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu
Podle jiného provedení předloženého vynálezu se do prostředků užitečných pro čištěni rozmanitých povrchů, které potřebují odstranit proteinové znečištěniny, používá efektivní množství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu. Mezi tyto čistící prostředky patří detergentní prostředky pro čištění tvrdých povrchů bez omezení formy (např. kapalné nebo granulované), detergentní prostředky pro čištění látek bez omezení formy (např. granulované a kapalné prostředky nebo prostředky ve formě kostek), prostředky pro mytí nádobí (neomezené pokud jde o formu), orální čistící prostředky bez omezení formy (např. prostředek pro čištění zubů, zubní pasta a ústní voda), čistící prostředky pro zubní protézy bez omezní formy (např. kapalné prostředky, tablety) a čistící prostředky pro čištění kontaktních čoček bez omezení formy (např. kapalina, tableta) . Pojem '‘efektivní množství enzymové varianty tak, jak se zde používá, znamená takové množství enzymové varianty, které je nutné k dosažení enzymové aktivity nutné pro specifický čistící prostředek. Tato efektivní množství jsou snadno zji23 stitelná odborníkem z oblasti techniky a závisí na mnoha faktorech, jako je příslušná použitá enzymová varianta, typ čištění, specifické složení čistícího prostředku, zda jde o kapalinu nebo zda jde o suchou formu (např. granule, kostku) a podobně. Čistící prostředky podle předloženého vynálezu s výhodou obsahují 0,0001 až 10 % hmotn. jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, výhodněji od 0,001 do 1 %, ještě výhodněji od 0,01 do 0,1 % hmotn. Některé příklady různých čistících prostředků, v nichž se mohou používat enzymové varianty podle předloženého vynálezu, jsou zde dále diskutovány podrobněji. Všechny díly, procenta a poměry v tomto spisu jsou hmotnostní, pokud není uvedeno jinak.
Pojem čistící prostředky neurčené pro látky tak, jak se zde používá, znamená čistící prostředky pro tvrdé povrchy, prostředky pro mytí nádobí, orální čistící prostředky, čistící prostředky pro zubní protézy a čistící prostředky pro kontaktní čočky.
čistící prostředky pro tvrdé povrchy, nádobí a látky: Enzymy podle předloženého vynálzeu se mohou používat v jakémkoliv detergentním prostředku, kde je žádoucí vysoké pěnění a dobré odstraňování nerozpustného substrátu. Enzymové varianty podle předloženého vynálezu se tedy mohou používat s různými konvenčními složkami. Získají se tak úplné čistící prostředky pro tvrdé povrchy, pro mytí nádobí, pro praní látek a podobné. Prostředky mohou existovat ve formě kapalin, granulí, kostek a podobně. Tyto prostředky se mohou vyrábět jako moderní koncentrované detergenty, které obsahují až od 30 do 60 % hmotn. povrchově aktivních činidel.
Čistící prostředky podle vynálezu mohou popřípadě obsahovat a s výhodou obsahují různá aniontová, neiontová, obojetná atd. povrchově aktivní činidla. Tato povrchově aktivní činidla jsou v prostředcích typicky přítomna v množstvích od 5 do 35 % hmotn. z celkové hmotnosti prostředku.
Mezi neomezující příklady povrchově aktivních činidel užitečných podle tohoto vynálezu patří konvenční alkyl(s 11 až 18 atomy uhlíku)benzensulfonáty a primární a náhodné alkylsulfáty, sekundární (2,3)alkylsulfáty (s 10 až 18 atomy uhlíku) obecných vzorců CH3(CH2)x(CHOSO3)'M+)CH3 a CH3(CH2)y(CHOSO3'M+) CH2CH3 ? v nichž x a (y+1) znamenají alespoň číslo 7, s výhodou alespoň 9, a M znamená ve vodě rozpustný kation, zvláště kation sodíku, alkylalkoxysulfáty s 10 až 18 atomy uhlíku (zvláště 1 až 5 ethoxysulfáty), alkylalkoxykarboxyláty s 10 až 18 atomy uhlíku (zvláště 1 až 5 ethoxykarboxyláty), alkylpolyglykosidy s 10 a2 18 atomy uhlíku a jejich odpovídající sulfatované polyglykosídy, α-sulfonované estery mastných kyselin s 12 až 18 atomy uhlíku, alkyl a alkylfenolalkoxyláty s 12 až 18 atomy uhlíku (zvláště ethoxyláty a směsné ethoxy/propoxyderiváty), betainy s 12 až 18 atomy uhlíku a sulfobetainy (sultainy) s 12 až 18 atomy uhlíku, aminoxidy s 10 až 18 atomy uhlíku a podobné. Alky llkoxy sulfáty (AES) a alkylalkoxykarboxyláty (AEC) jsou výhodné pro použití podle vynálezu. Výhodné je také použití těchto povrchově aktivních činidel v kombinaci se shora uvedeným aminoxidovým a/ /nebo betainovým nebo suitainovým povrchově aktivním činidlem; závisí to na požadavcích toho, kdo tyto prostředky připravuje. Dalši konvenčně použitelná povrchově aktivní činidla jsou uvedena ve standardních textech. Mezi zvláště užitečná povrchově aktivní činidla patří N-methylglukamidy s 10 až 18 atomy uhlíku popsané v USA patentu 5 194 639 Connora a spol. z 16. března 1993, který je zde zahrnut jako citace»
V prostředcích podle vynálezu mohou být obsaženy rozmanité jiné složky užitečné v detergentních čistících prostředcích včetně jiných složek, nosičů, hydrotropů, činidel pro opracování, barviv nebo pigmentů, rozpouštědel pro kapalné prostředky atd. Jestliže je žádoucí zvýšit pěnění, zahrnou se do prostředku podporovatelé pěnění, jako jsou alkoholamidy s 10 až 16 atomy uhlíku, typicky v množství l až 10 % hmotn. Typickými skupinami těchto zesilovačů pěnění jsou monoethanol a diethanolamidy s 10 až 14 atomy uhlíku. Výhodné je také použití těchto zesilovačů pěnění s vysoce pěnivými povrchově aktivními činidly, jako jsou shora uvedené aminoxidy, betainy a sultainy. Jestliže je to žádoucí, mohou se pro dosaženi dalšího pěnění přidávat rozpustné hořečnaté soli, jako je MgCl2, MgSO4 a podobné, typicky v množstvích od 0,1 do 2 % hmotn.
Kapalné detergentní prostředky mohou obsahovat vodu a další rozpouštědla a nosiče. Vhodnými jsou primární nebo sekundární alkoholy s nízkou molekulovou hmotností, jako například methanol, ethanol, propanol a isopropanol. Monohydroxyalkoholy jsou výhodné pro rozpouštění povrchově aktivních činidel, ale mohou se používat i polyoly, jako polyoly s 2 až 6 atomy uhlíku a 2 až 6 hydroxylovými skupinami (např. 1,3-propandiol, ethylenglykol, glycerin a 1,2-propandiol) . Prostředky mohou obsahovat od 5 do 90, s výhodou od 10 do 50 % hmotn. těchto nosičů.
Detergentní prostředky podle vynálezu se s výhodou připravují tak, aby během použití ve vodných čistících postupech měl vodný roztok pH mezi 6,8 a 11,0. Konečné produkty se typicky připravují s tímto rozmezím pH. Mezi způsoby, kterými se reguluje pH na doporučenou hodnotu, patří použití pufrů, alkalií, kyselin atd. Tyto způsoby jsou velmi dobře známy odborníkům z oblasti techniky.
Jestliže se připravují čistící prostředky pro tvrdé povrchy a prostředky pro čištění látek podle předloženého vynálezu, mohou se používat různé stavební složky v množství 5 až 50 % hmotn. Mezi typické stavební složky patří 1 až lO/xm zeolity, polykarboxyláty, jako citrát a oxidosukcináty, vrstvené křemičitany, fosforečnany a podobné. Další konvenční složky jsou uvedeny v standardních předpisech.
Podobně se mohou v těchto prostředcích používat různé další enzymy, jako jsou celulasy, lipasy, amylasy a proteasy, typicky v množstvích od 0,001 % do l % hmotn. Různé čistící prostředky a enzymy pečující o látky jsou dobře známy v oblasti techniky pracích detergentních činidel.
V prostředcích se mohou používat různé bělící sloučeniny, jako jsou peruhličitany, perboritany a podobné, typický v množstvích od 1 do 15 % hmotn. Jestliže je to žádoucí, tyto prostředky mohou obshaovat také bělící aktivátory, jako je tetraačetylethylendiamin, nonanoyloxybenzensulfonát a podobné, které jsou také známy z oblasti techniky. Typicky se používají množství od 1 do 10 % hmotn.
V těchto prostředcích se mohou používat různá činidla uvolňující ušpinění, zvláště typu aniontových oligoesterů, různá komplexující činidla, zvláště aminofosfonáty a ethylendiamindisukcináty, různá činidla odstraňující ušpinění hlinkami, zvláště ethoxylovaný tetraethylenpentamin, různá dispergační činidla, zvláště polyakryláty a polyaspartáty, různá zjasňovacl činidla, zvláště aniontová zjasňovací činidla, různí potlačovatelé pěněni, zvláště silikony a sekundární alkoholy, různá činidla pro změkčování látek, zvláště smektitové hlinky, a podobná činidla v rozmezí od 1 do 35 % hmotn. Stadardní předpisy a publikované patenty obsahují mnoho podrobných popisů těchto konvenčních materiálů.
V čisticích prostředcích podle tohoto vynálezu se mohou používat také stabilizátory enzymů. Mezi takové stabilizátory enzymů patří propylenglykol (s výhodou od 1 do 10 % hmotn»), mravenčan sodný (s výhodou od 0,1 do 1 % hmotn.) a mravenčan vápenatý (s výhodou od 0,1 do 1 % hmotn.).
Pojem čisticí prostředky pro tvrdé povrchy tak, jak se zde tento pojem používá, znamená kapalné a granulované detergentní prostředky pro čištění tvrdých povrchů, jako jsou podlahy, zdi, obklady koupelen a podobné. Čistící prostředky pro tvrdé povrchy podle předloženého vynálezu obsahují efektivní nožství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, s výhodou od 0,001 do 10 %, výhodněji od 0,01 do 5, ještě výhodněji od 0,05 do 1 % hmotn. aktivního enzymu z celkové hmotnosti prostředku. Vedle jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu tyto čisticí prostředky pro tvrdé povrchy typicky obsahují povrchově aktivní činidlo a ve vodě rozpustnou maskovací stavební složku. V některých speciálních produktech, jako jsou rozprašovače pro čištění oken, se však někdy povrchově aktivní činidla nepoužívají, protože mohou zanechávat filmový/šmouhovitý zbytek na povrchu skla.
Povrchově aktivní složka, jestliže je přítomna, může být obsažena v množství i jenom 0,1 % hmotn. z celkové hmotnosti prostředku. Typicky však tyto prostředky obsahují od 0,25 do 10, výhodněji od 1 do 5 % hmotn. povrchově aktivního činidla.
Prostředky typicky obsahují od 0,5 do 50 % hmotn. detergentní složky, s výhodou od 1 do 10 % hmotn.
S výhodou by se pH mělo pohybovat v rozmezí od 8 do 12. Pro úpravu pH se mohou, pokud je to nutné, používat konvenční činidla pro úpravu pH, jako je NaOH, Na2CO3 nebo HC1.
V prostředku mohou být obsažena rozpouštědla. Mezi užitečná rozpouštědla patří, ale nejsou na ně omezena, glykolethery, jako je monohexylether diethylenglykolu, monobutylether diethy lenglykolu, monobutylether ethylenglykolu, monohexylether etfaylenglykolu, monobutylether propylenglykolu a monobutylether dipropylenglykolu, a dioly, jako je 2,2,4-trimethyl-l,3-pentandi” ol a 2-ethyl-l,3-hexandiol. Jestliže se používají, potom jsou tato rozpouštědla přítomna v množství typicky od 0,5 do 15, s výhodou od 3 do 11 % hmotn.
V předložených prostředcích se mohou používat také vysoce těkavá rozpouštědla, jako je isopropanol nebo ethanol, aby se usnadnilo rychlé odpaření prostředku z povrchů, jestliže se povrch po plné aplikaci prostředku na povrch neoplachuje. Jestliže se používají, potom jsou těkavá rozpouštědla v prostředku přítomna v množství typicky od 2 do 12 % hmotn.
Provedení čistících prostředků pro tvrdé povrchy podle předloženého vynálezu je ilustrováno následujícími příklady.
Příklady 7 až 12
Kapalné čistící prostředky pro tvrdé povrchy
složka 7 příklad číslo: 12
8 9 10 11
Lys213Glu 0,05 0,50 0,02 0,03 0,10 0,03
Ile205Leu + Ala216Asp - - - - 0,20 0,02
Na2DIDA*
EDTA** - - 2,90 2,90 -
citrát sodný - - - - - 2,90 2,90
alkylbenzensulfonát
sodný s 12 at. C 1,95 - 1,95 - 1,95 -
alkylsulfát sodný s
12 at. C - 2,20 - 2,20 - 2,20
ethoxysulfát*** sodný
s 12 at C - 2,20 - 2,20 - 2,20
dimethylaminoxid s
12 at C - 0,50 - 0,50 - 0,50
kumesulfonát sodný 1,30 - 1,30 - 1,30
hexylkarbitol*** 6,30 6,30 6,30 6,30 6,30 6,30
voda doplnit do 100 % hmotn •
N-diethylenglykol-N,N-iminodiacetát dvojsodný čtyřsodná sůl ethyldiamindioctové kyseliny *** monohexylether diethylenglykolu všechny prostředky mají pH upraveno na hodnotu 7
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 7 až 10 jsou substituovány Lys213Glu s v podstatě podobnými výsledky.
BPNZ varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 11 až 12 jsou substituovány Lys213Glu a Ile205Leu + Ala216Asp s v podstatě podobnými výsledky.
Příklady 13 až 18
Sprej ové prostředky pro čištění tvrdých povrchů a pro odstraňování plísně v domácnosti složka příklad číslo:
13 14 15 16 17 18
Lys213Glu + Tyr217Leu 0,50 0,05 0,60 0,30 0,20 0,30
Ala216Glu - - - - 0,30 0,10
oktylsulfát sodný 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
dodecylsulfát sodný 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
hydroxid sodný 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80 0,80
křemičitan (sodný) 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04
parfém 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35 0,35
voda doplnit do 100 % hmotn.
Produkt má pH asi 7.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 13 až 16 jsou substituovány Lys213Glu + Tyr217Leu s v podstatě podobnými výsledky.
Jakékoliv kombinace BPN' variant uvedených v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 17 až 18 jsou substituovány Lys213Glu + Tyr217Leu a Ala216Glu s v podstatě podobnými výsledky.
V další části popisu jsou uvedeny prostředky pro mytí nádobí. Prostředky pro mytí nádobí obsahují jednu nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu. Pojem prostředek pro mytí nádobí” tak, jak se zde používá, znamená všechny formy prostředků pro čištění nádobí včetně, ale bez omezení jenom na ně, granulovaných a kapalných forem. Provedení prostředků pro mytí nádobí podle předloženého vynálezu jsou ilustrována následujícími příklady.
Příklady 19 až 24 neoplachujerostředky pro mytí nádobí
složka 19 příklad číslo: 24
20 21 22 23
Glu206Pro + Gly211Ala
+ Ala216Glu 0,05 0,50 0,02 0,40 0,10 0,03
Ile205Leu + Ala216Asp N-methylglukamid “ 0,40 0,02
s 12 až 14 at. C 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90 0,90
ethoxysulfát s 12
át. C 12,00 12,00 12,00 12,00 12,00 12,00
2-methylundekanová
kyselina 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50
ethoxykarboxylát s
12 at. C 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50 4,50
alkoholethoxylát s
12 at. C 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
aminoxid s 12 at. C 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00 3,00
kumensulfonát sodný 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00
ethanol 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
hořečnatý ion (jako
chlorid hořečnatý) 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20
vápenatý ion (jako
chlorid vápenatý) 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40 0,40
voda doplnit do 100 % hmotn.
Produkt má pH upraveno na hodnotu 7.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 19 až 22 jsou substituovány Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu s v podstatě podobnými výsledky.
Jakékoliv kombinace BPN' variant uvedených v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 23 až 24 jsou substituovány Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu a Ile205Leu + Ala216Asp s v podstatě podobnými výsledky.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu jsou uvedeny prostředky pro čištění látek, které obsahují jednu nebo vlče enzymových variant podle předloženého vynálezu. Pojem prostředek pro čištění látek tak, jak se zde používá, znamená všechny formy detergentních prostředků pro čištění látek včetně, ale bez omezení jenom na ně, granulovaných a kapalných forem a forem ve tvaru kostek.
Granulované prostředky pro čištění látek podle předloženého vynálezu obsahují efektivní množství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, s výhodou od 0,001 do 10 % hmotn., výhodněji od 0,005 % do 5 %, výhodněji od 0,01 % do 1 % hmotn. aktivního enzymu z hmotnosti prostředku. Vedle jedné nebo více enzymových variant granulované prostředky pro čištění látek typicky obsahují alespoň jedno povrchově aktivní činidlo, jednu nebo více stavebních složek a v některých případech bělící činidlo.
Granulované prostředky pro čištění látek podle předloženého vynálezu jsou ilustrovány následujícími příklady.
Příklady 25 až 28
Granulované prostředky pro čištění látek
složka 25 příklad 26 číslo; 27 28
Ala216Asp 0,10 0,20 0,03 0,05
Ala216Gly - - 0,02 0,05
lineární alkylbenzensul- fonát s 13 at. C 22,00 22,00 22,00 22,00
fosforečnan (jako trifosforečnan sodný) 23,00 23,00 23,00 23,00
uhličitan sodný 23,00 23,00 23,00 23,00
křemičitan sodný 14,00 14,00 14,00 14,00
zeolit 8,20 8,20 8,20 8,20
chelatační čindilo (diethylentriaminpentaoctová kyselina) 0,40 0,40 0,40 0,40
síran sodný 5,50 5,50 5,50 5,50
voda doplnit do 100 hmotn.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 25 až 26 jsou substituovány Ala216Asp s v podstatě podobnými výsledky.
Jakékoliv kombinace BPN' variant uvedených v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 27 až 28 jsou substituovány Ala216Asp a Ala216Gly s v podstatě podobnými výsledky.
Příklady 29 až 32
Granulované prostředky pro čištění látek
složka 1 29 příklad číslo: 32
30 31
Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr 217Leu 0,10 0,20 0,03 0,05
Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu - - 0,02 0,05
alkylbenzensulfonát s 12 at. C 12,00 12,00 12,00 12,00
zeolit A (1 až 10 μη) 26,00 26,00 26,00 26,00
2-butyloktanová kyselina 4,00 4,00 . 4,00 4,00
sodná sůl sekundárního alkyl-
sulfátu s 12 až 14 at. C 5,00 5,00 5,00 5,00
citrát sodný 5,00 5,00 5,00 5,00
optické zjasňovadlo 0,10 0,10 0,10 0,10
síran sodný 17,00 17,00 17,00 17,00
voda doplnit do 100 hmotn.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 29 až 30 jsou substituovány Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217L@u s v podstatě podobnými výsledky.
Jakékoliv kombinace BPN' variant uvedených v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 31 až 32 jsou substituovány Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu a Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu s v podstatě podobnými výsledky.
Kapalné prostředky pro čištění látek podle předloženého vynálezu obsahují efektivní množství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálzeu, s výhodou od 0,005 do 5 % hmotn., výhodněji od 0,01 % do 1 % hmotn. aktivního enzymu z hmotnosti prostředku. Tyto kapalné prostředky pro čištění látek typicky dále obsahují aniontové povrchově aktivní činidlo, mastnou kyselinu, ve vodě rozpustnou detergentní stavební složku a vodu.
Kapalné prostředky pro čištění látek podle předloženého vynálezu jsou ilustrovány následujícími příklady.
Příklady 33 až 37
Kapalné prostředky pro čištění látek
složka příklad číslo:
33 34 35 36 37
Pro210Ala + Gly215Thr 0,05 0,03 0,30 0,03 0,10
Pro210Ala + Lys213Glu +
Ala216Glu + Tyr217Leu - - - 0,01 0,20
alkylsulfát sodný
s 12 až 14 at. C 20,00 20,00 20,00 20,00 20,00
2-butyloktanová kyselina 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00
citrát sodný 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
alkoholethoxylát s
10 at. C 13,00 13,00 13,00 13,00 13,00
monoethanolamin 2,50 2,50 2,50 2,50 2,50
voda/propylenglykol/ethanol
(100:1:1) doplnit do 100 % hmotn.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 33 až 35 jsou substituovány Pro210Ala + Gly215Thr s v podstatě podobnými výsledky.
Jakékoliv kombinace BPN' variant uvedených v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 36 až 37 jsou substituovány Pro210Ala + Gly215Thr a Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217L®u s v podstatě podobnými výsledky.
Prostředky pro čištění látek ve tvaru kostky podle předloženého vynálezu vhodné pro ruční praní ušpiněných látek obsahují efektivní množství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, s výhodou od 0,001 do 10 % hmotn., výhodněji od 0,01 % do 1 % hmotn. z hmotnosti prostředku.
Prostředky pro čištění látek ve tvaru kostky podle předlo ženého vynálezu jsou ilustrovány následujícími příklady.
Příklady 38 až 41
Prostředky pro čištění látek ve formě kostky složka příklad číslo:
38 39 40 41
Lys213Glu + Ala216Glu 0,3 - 0,1 0,02
Tyr214Phe + Tyr217As - - 0,4 0,03
alkylsulfát sodný s 12
až 16 at. C 20,00 20,00 20,0 20,00
N-methylglukamid s 12
až 14 at. C 5,00 5,00 5,0 5,00
alkylbenzensulfonát sodný
s 11 až 13 at. C 10,00 10,00 10,0 10,00
uhličitan sodný 25,0 25,0 25,0 25,00
difosforečnan sodný 7,0 7,0 7,0 7,00
trifosforečnan sodný 7,0 7,0 7,0 7,00
zeolit A (0,1 až 10 gm) 5,0 5,0 5,0 5,00
karboxymethylcelulosa 0,2 0,2 0,2 0,20
polyakrylát (mol.hmotn.1400) 0,2 0,2 0,2 0,20
kokosový monoethanolamid 5,0 5,0 5,0 5,00
zjasňovací činidlo, parfém 0,2 0,2 0,2 0,20
síran vápenatý 1,0 1,0 1,0 1,00
síran hořečnatý 1,0 1,0 1,0 1,00
voda 4,0 4,0 4,0 4,00
plnidlo* doplnit do 100 % hmotn.
Může být vybráno z vhodných materiálů, jako je CaCO3, talek, hlinka, křemičitany a podobné.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 38 až 39 jsou substituovány Lys213Glu + Ala216Glu s v podstatě podobnými výsledky.
Jakékoliv kombinace BPN' variant uvedených v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 40 až 41 jsou substituovány Lys2l3Glu + Ala216Glu a Tyr214Phe + Tyr217Asn s v podstatě podobnými výsledky.
Vedle shora uvedených čistících prostředků pro tvrdé povrchy, prostředků pro mytí nádobí a prostředků pro čištění látek se může do rozmanitých jiných čistících prostředků, kde je žádána hydrolýza nerozpustného substrátu, zahrnout jedna nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu. Tyto další čistící prostředky zahrnují, ale nejsou omezeny jenom na ně, orální čistící prostředky, prostředky pro čištění zubních protéz a prostředky pro čištěni kontaktních čoček.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu se do prostředků užitečných pro odstraňovaná proteinových znečištěnin ze zubů nebo zubních protéz zahrne jedna nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu. Pojem orální čisticí prostředky tak, jak je zde používán, znamená prostředky pro čištění zubů, zubní pasty, zubní gely, zubní prášky, ústní vody, ústní spreje, ústní gely, žvýkací gumy, pastilky, sáčky, tablety, biogely, profylaktické pasty, zubní léčivé roztoky a podobné. Orální čistící prostředky podle předloženého vynálezu obsahují od 0,0001 do 20 % hmotn. jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, výhodněji od 0,001 do 10 % hmotn., ještě výhodněji od 0,01 % do 5 % hmotn. z hmotnosti prostředku, a famaceuticky přijatelný nosič. Pojem farmaceuticky přijatelný tak, jak se zde používá, znamená, že léčivá látka, léčivý přípravek nebo inertní složky, které tento pojem popisuje, jsou vhodné pro použití v kontaktu s tkáněmi člověka a nižších živočichů bez nepatřičné toxicity, neslučitelnosti, nestability, dráždění, alergické odpovědi a podobných, při odůvodněném poměru prospěch/riziko.
Farmaceuticky přijatelné orální čisticí nosné složky orálních čistících složek budou v orálních čistících prostředcích typicky obvykle obsaženy v množství od 50 do 99,99 % hmotn., s výhodou 65 až 99,99, výhodněji 65 až 99 % hmotn. z celkové hmotnosti prostředku.
Farmaceuticky přijatelné nosné složky a případné složky, které mohou být zahrnuty v orálních čistících prostředcích podle předloženého vynálezu, jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky. Rozmanité typy prostředků, nosných složek a případných složek užitečných pro orální čistící prostředky jsou popsány v USA patentu 5 096 700 Seibela, vydaném 17. března 1992, v USA patentu 5 028 414 Sampatkumara, vydaném 2. července 1991, a v USA patentu 5 028 415 Benedicta, Bushe a Sunberga, vydaném 2. července 1991. Všechny jsou zde uvedeny jako citace.
Provedení orálních čistících prostředků podle předloženého vynálezu je ilustrováno následujícími příklady.
Příklady 42 až 45
Prostředek pro čištění zubů složka příklad číslo:
43 44 45
Ile205Leu + Pro210Ala +
Lys213Glu + Ala216Glu +
Tyr217Leu 2,000 3,500 1,500 2,000
sorbitol (70% vodný roztok) 35,000 35,000 35,000 35,000
PEG-6* (polyethylen
glykol 1,000 1,000 1,000 1,000
křemičitanové dentální**
abrasivo 20,000 20,000 20,000 20,000
fluorid sodný 0,243 0,243 0,243 0,243
oxid titaničitý 0,500 0,500 0,500 0,500
sodná sůl sacharinu 0,286 0,286 0,286 0,286
alkylsulfát sodný (27,9%
vodný roztok) 4,000 4,000 4,000 4,000
ochucovací činidlo 1,040 1,040 1,040 1,040
karboxyvinylový*** po-
lymer 0,300 0,300 0,300 0,300
. **** karegenan 0,800 0,800 0,800 0,800
voda doplnit do 100 % hmotn.
PEG-6 znamená polyethylenglykol s mol. hmotn. 600. Vysrážený oxid křemičitý identifikovaný jako Zeodent 119 od
J.M.Hubera.
Carbopol od B.F.Goodrich Chemical Company.
**** Karagenan lota od Hercules Chemical company.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech až 45 jsou substituovány Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu s v podstatě podobnými výsledky.
Příklady 46 a2 49 Prostředek ústní vody
složka 46 příklad číslo 47 48 • • 49
Ala216Gly 3,00 7,50 1,00 5,00
ADA 40 alkohol 8,00 8,00 8,00 8,00
ochucovací činidlo 0,08 0,08 0,08 0,08
emulgační čindilo 0,08 0,08 0,08 0,08
fluorid sodný 0,05 0,05 0,05 0,05
glycerin 10,00 10,00 10,00 10,00
sladidlo 0,02 0,02 0,02 0,02
kyselina benzoová 0,05 0,05 0,05 0,05
hydroxid sodný 0,20 0,20 0,20 0,20
barvivo 0,04 0,04 0,04 0,04
voda doplnit do 100 % hmotn.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 46 až 49 jsou substituovány Ala216Gly s v podstatě podobnými výsledky.
Příklady 50 až 53
Prostředek ve formě pastilky
složka příklad číslo:
50 51 52 53
Tyr214Phe + Tyr217Asn 0,01 0,03 0,10 0,02
sorbitol 17,50 17,50 17,50 17,50
manitol 17,50 17,50 17,50 17,50
škrob 13,60 13,60 13,60 13,60
sladidlo 1,20 1,20 1,20 1,20
ochucovací činidlo 11,70 11,70 11,70 11,70
barvivo 0,10 0,10 0,10 0,10
voda doplnit do 100 % hmotn.
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 50 až 53 jsou substituovány Tyr214Phe + Tyr217Asn s v podstatě podobnými výsledky.
Příklady 54 až 57
Prostředek ve formě žvýkačky složka příklad číslo:
54 55 56 57
Ile205Val + Pro210Ala
+ Lys213Glu 0,03 0,02 0,10 0,05
krystaly sorbitolu 38,44 38,40 38,40 38,40
základ přírodní gumy*
Paloja-T 20,00 20,00 20,00 20,00
sorbitol (70% vodný roztok) 22,00 22,00 22,00 22,00
manitol 10,00 10,00 10,00 10,00
glycerin 7,56 7,56 7,56 7,56
ochucovací činidlo 1,00 1,00 1,00 1,00
dodáván L.A.Dreyfus Company
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 54 až 57 jsou substituovány Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu s v podstatě podobnými výsledky.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu jsou uvedeny prostředky pro čištění zubních protéz mimo ústní dutinu, které obsahují jednu nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu. Tyto prostředky pro čištění zubních protéz obsahují efektivní množství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, s výhodou od 0,0001 do 50 % hmotn. jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, výhodněji od 0,001 % do 35 %, ještě výhodněji od 0,01 % do 20 % hmotn. z hmotnosti prostředku, a nosič pro čištění zubní protézy. V oblasti techniky jsou známy razné formy prostředka pro čištění zubních protéz, jako jsou efervescentní tablety a podobné (viz například USA patent 5 055 305 Younga, který je zde zahrnut jako citace). Obvykle obsahují jednu nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu pro odstraňování proteinových skvrn ze zubních protéz.
Provedení prostředku pro čištění zubních protéz podle předloženého vynálezu je ilustrováno následujícími příklady.
Příklady 58 až 61
Dvouvrstvá efervescentní tableta pro čištěnízubních protéz složka příklad číslo:
58 59 60 61
kyselá vrstva:
Ala216Glu 1,0 1,5 0,01 0,05
kyselina vinná 24,0 24,0 24,00 24,00
uhličitan sodný 4,0 4,0 4,00 4,00
kyselina sulfamová 10,0 10,0 10,00 10,00
PEG 20,000 4,0 4,0 4,00 4,00
hydrogenuhličitan sodný 24,5 24,5 24,50 24,50
persíran draselný 15,0 15,0 15,00 15,00
hydrogendifosforečnan
sodný 7,0 7,0 7,00 7,00
pyrogenní oxid křemičitý 2,0 2,0 2,00 2,00
TAED* 7,0 7,0 7,00 7,00
ricinoleylsulfosukcinát 0,5 0,5 0,50 0,50
ochucovací činidlo 1,0 1,0 1,00 1,00
alkalická vrstva:
monohydrát perboritanu
sodného 32,0 32,0 32,00 32,00
hydrogenuhličitan sodný 19,0 19,0 19,00 19,00
EDTA 3,0 3,0 3,00 3,00
trifosforečnan sodný 12,0 12,0 12,00 12,00
PEG 20,000 2,0 2,0 2,00 2,00
persiran draselný 26,0 26,0 26,00 26,00
uhličitan sodný 2,0 2,0 2,00 2,00
pyrogenní oxid křemičitý 2,0 2,0 2,00 2,00
barvivo/ochucovací činidlo 2,0 2,0 2,00 2,00
Tetraacetylethylendiamin
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 58 až 61 jsou substituovány Ala216Glu s v podstatě podobnými výsledky.
V jiném provedení podle předloženého vynálezu čistící prostředky pro kontaktní čočky obsahují jednu nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu. Tyto prostředky pro čištění kontaktních čoček obsahují efektivní množství jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, s výhodou od 0,01 do 50 % hmotn. jedné nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu, výhodněji od 0,01 % do 20 %, ještě výhodněji 1 až 5 % hmotn. z hmotnosti prostředku, a nosič pro čištění kontaktních čoček. V oblasti techniky jsou známy různé formy prostředků pro čištění kontaktních čoček, jako jsou tablety, kapaliny a podobné (viz například USA patent 4 863 627 Daviese, Meakena a Reese, vydaný 5. září 1989, USA patent číslo Re 32 672 Hutha, Lama a Kiraie, znovu vydaný 24. května 1988, USA patent 4 690 493 Scháfera, vydaný 2. září 1986, USA patent 4 690 793 Ogunbiyiho a Smithe, vydaný 1. září 1987, USA patent 4 614 549 Ogunbiyiho, Reidhammera a Smithe, vydaný 30. září 1986, a USA patent 4 285 738 Ogata, vydaný 25. srpna 1981, všechny jsou zde zahrnuty jako citace). Obvykle obsahují jednu nebo více enzymových variant podle předloženého vynálezu pro odstraňování proteinových skvrn z kontaktních čoček.
Provedení prostředku pro čištění kontaktních čoček podle předloženého vynálezu je ilustrováno následujícími příklady.
Příklady 62 až 65
Enzymatický čistící roztok pro kontaktní čočky
složka 62 příklad číslo:
63 64 65
Ile205Leu + Ala216Asp 0,01 0,5 0,1 2,0
glukosa 50,00 50,0 50,0 50,0
neiontové povrchově aktivní
činidlo (kopolymer
polyoxyethylen/poly-
oxypropylen 2,00 2,0 2,0 2,0
aniontové povrchově aktivní
činidlo 1,00 1,0 1,0 1,0
chlorid sodný 1,00 1,0 1,0 1,0
borax 0,30 0,3 0,3 0,3
voda do 100 % hmotn 9
BPN' varianty uvedené v tabulce 2, mimo jiné, v příkladech 62 až 65 jsou substituovány Ile205Leu + Ala216Asp s v podstatě podobnými výsledky.
I když je tento vynález popsán příslušnými provedeními, odborníkům v oblasti techniky bude zřejmé, že lze udělat různé změny a modifikace tohoto vynálezu, aniž by se tím odchýlili od duchu a rozsahu tohoto vynálezu. Připojené nároky jsou myšleny tak, že pokrývají všechny takové modifikace, které jsou v rozsahu tohoto vynálezu.

Claims (19)

  1. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýše-l nou hydrolýzou obsahující přírodní aminokyselinovou sekvenci, která je substituována v jedné nebo více polohách Z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220, při čemž substituující aminokyselinou pro polohu 199 je Cys, 9 6 Jíl s i σι^οα i i: s b j 'í‘2 Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 200 je His,
    Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 201 je Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 202 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 203 je Met, Cys, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu,
    substituující aminokyselinou pro pro polohu polohu 204 205 je je Glu, Leu, substituujíc! aminokyselinou Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituuj ící aminokyselinou pro polohu 206 je Pro, Asn : nebo Ser, substituuj ící aminokyse1inou pro polohu 207 je Asp nebo Glu, substituuj ící aminokyselinou pro polohu 208 je Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, , Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 209 je Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, r Asp nebo Glu, substituuj ící aminokyselinou pro polohu 210 je Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituuj ící aminokyselinou pro polohu 211 je Ala, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 212 je Gin, Ser, Asp nebo Glu,
    . substituující aminokyselinou pro polohu 213 je Trp,
    Phe, Tyr, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 214 je Phe, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 215 je Thr, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 216 je His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 218 je Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 219 je Pro,
    Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu a substituující aminokyselinou pro polohu 220 je Pro,
    Gly, Gin, Asn, Asp nebo Glu, při čemž tato BPN' varianta má sníženou adsorpci na nerozpustný substrát a zvýšenou hydrolýzu nerozpustného substrátu při srovnání s přírodním subtilisinovým BPN'.
  2. 2. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 1, v nichž substituující aminokyselinou pro polohu 206 je Asn nebo Ser, substituující aminokyselinou pro polohu 211 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 214 je Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Asp nebo Glu a substituující aminokyselinou pro polohu 215 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu.
  3. 3. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 2, které jsou v poloze 216 substituovány Ala.
  4. 4. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 2, v nichž substituující ami47 nokyselinou pro kteroukoliv z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 219 a 220 je Asp nebo Glu a substituující aminokyselinou pro polohu 204 nebo 208 je Glu, při čemž k substituci s výhodou dochází v jedné nebo více polohách z poloh 199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212 nebo 215, výhodněji v jedné nebo více polohách z poloh 200, 201, 202, 205 nebo 207.
  5. 5. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 1, s jednou substitucí aminokyseliny, kterou je
    Glu za Lys v poloze 213, Glu za Ala v poloze 216, Asp za Ala v poloze 216, GlU za Ser v poloze 204 nebo Glu za Val v poloze 203.
  6. 6. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou obsahující přírodní aminokyselinovou sekvenci, která je substituována ve dvou nebo více polohách Z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220, při čemž substituující aminokyselinou pro polohu 199 je Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 200 je His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 201 je Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 202 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 203 je Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 204 je Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 205 je Leu,
    Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 206 je Pro, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituuj ící aminokyselinou pro polohu 207 je Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 208 je Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 209 3e Ile, Val, Met, Cys., Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 210 je Ala, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 211 j e Ala, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 212 je Gin, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 213 je Trp, Phe, Tyr, Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His , Thr, Pro,
    Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 214 je Phe,
    Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 215 je Thr, Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 216 je His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 217 je Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Thr, Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 218 je Gin, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 219 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu a substituující aminokyselinou pro polohu 220 je Pro, Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, při čemž tato BPN' varianta má sníženou adsorpci na neroz49 pustný substrát a zvýšenou hydrolýzu nerozpustného substrátu při srovnání s přírodním subtilisinovým BPN'.
  7. 7. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 6 se dvěma substitucemi aminokyselin.
  8. 8. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 7 se dvěma substitucemi aminokyselin, kterými jsou substituce
    Ala za Pro v poloze 210 a Thr za Gly v poloze 215, Phe za Tyr v poloze 214 a Asn za Tyr v poloze 217, Glu za Gin v poloze 206 a Glu za Ala v poloze 216, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217, Glu za Gin v poloze 206 a Leu za Tyr v poloze 217, GlU za Gin v poloze 206 a Glu za Lys v poloze 213, Glu za Lys v poloze 213 a Leu za Tyr v poloze 217, Leu za Ile v poloze 205 a Glu za Ala v poloze 216 Leu za Ile v poloze 205 a Asp za Ala v poloze 216.
  9. 9. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 7, v nichž substituující aminokyselinou pro polohu 206 je Asn nebo Ser, substituující aminokyselinou pro polohu 210 je Gly, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 211 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, substituující aminokyselinou pro polohu 214 je Leu, Ile, Val, Met, Cys, Ala, His, Pro, Gly, Gin, Asn, Asp nebo Glu a substituující aminokyselinou pro polohu 215 je Pro, Gin, Asn, Ser, Asp nebo Glu, při čemž k substituci s výhodou dochází ve dvou nebo více polohách Z poloh 199, 200, 201, 202, 205, 207, 208, 209, 210, 211, 212 nebo 215, výhodněji ve dvou nebo více polohách z poloh 200, 201, 202, 205 nebo 207.
  10. 10. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 9, v nichž substituující aminokyselinou pro kteroukoliv polohu z poloh 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 a 220 je Asp nebo Glu.
  11. 11. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 10 se substitucí Glu za Lys v poloze 213 a Glu za Ala v poloze 216.
  12. 12. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 6 se třemi substitucemi aminokyselin.
  13. 13. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 12 se třemi substitucemi aminokyselin, kterými jsou substituce
    Pro za Gin v poloze 206, Ala za Gly v poloze 211 a Glu za Ala v poloze 216,
    Val za Ile v poloze 205, Ala za Pro v poloze 210 a Glu za Lys v poloze 213,
    Glu za Gin v poloze 206, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217,
    Glu za Gin v poloze 206, Glu za Lys v poloze 213 a Leu za Tyr v poloze 217 nebo
    Glu za Lys v poloze 213, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217.
  14. 14. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 6 se čtyřmi nebo pěti substitucemi aminokyselin.
  15. 15. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpcí a zvýšenou hydrolýzou podle nároku 14 se čtyřmi substitucemi aminokyselin, kterými jsou substituce
    Ala za Pro v poloze 210, Glu za Lys v poloze 213, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217,
    Glu za Gin v poloze 206, Glu za Lys v poloze 213, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217 nebo Glu za Ser v poloze 204, Glu za Gin v poloze 206, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217.
  16. 16. Subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýšenou hydroiýzou podle nároku 14 s pěti substitucemi aminokyselin, kterými jsou substituce
    Leu za Ile v poloze 205, Ala za Pro v poloze 210, Glu za
    Lys v poloze 213, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217 nebo
    Glu za Ser v poloze 204, Glu za Gin v poloze 206, Glu za
    Lys v poloze 213, Glu za Ala v poloze 216 a Leu za Tyr v poloze 217.
  17. 17. Čistící prostředek vybraný ze skupiny sestávající z čistícího prostředku pro tvrdé plochy, prostředku pro mytí nádobí, orálního čistícího prostředku, prostředku pro čištění zubních protéz a prostředku pro čištění kontaktních čoček, vyznačující se tím, že tento čistící prostředek obsahuje subtilisinovou BPN' variantu se sníženou adsorpci a zvýšenou hydroiýzou podle nároku 1, 7, 12 nebo 14 a nosič čistícího prostředku.
  18. 18. Prostředek pro čištění tvrdých ploch, vyznačující se tím, že obsahuje subtilisinovou BPN' variantu se sníženou adsorpci a zvýšenou hydroiýzou podle nároku 1, 7, 12 nebo 14 a nosič čistícího prostředku pro tvrdé plochy.
  19. 19. Gen mutantu BPN' kódující subtilisinové BPN' varianty se sníženou adsorpci a zvýšenou hydroiýzou podle nároku 1,
CZ96791A 1993-09-15 1994-08-31 Subtilisine bpn°variants with reduced adsorption and increased hydrolysis, cleaning agent containing such variants and a gene encoding said variant CZ79196A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12143793A 1993-09-15 1993-09-15
US28746194A 1994-08-11 1994-08-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ79196A3 true CZ79196A3 (en) 1996-06-12

Family

ID=26819467

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ96791A CZ79196A3 (en) 1993-09-15 1994-08-31 Subtilisine bpn°variants with reduced adsorption and increased hydrolysis, cleaning agent containing such variants and a gene encoding said variant

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0719339B1 (cs)
JP (1) JPH09502610A (cs)
CN (1) CN1057123C (cs)
AT (1) ATE343636T1 (cs)
AU (1) AU7870394A (cs)
BR (1) BR9407502A (cs)
CA (1) CA2170491C (cs)
CZ (1) CZ79196A3 (cs)
DE (1) DE69434873T2 (cs)
ES (1) ES2275265T3 (cs)
HU (1) HUT74222A (cs)
MA (1) MA23330A1 (cs)
NO (1) NO961067L (cs)
WO (1) WO1995007991A2 (cs)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6436690B1 (en) 1993-09-15 2002-08-20 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6440717B1 (en) 1993-09-15 2002-08-27 The Procter & Gamble Company BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6599730B1 (en) * 1994-05-02 2003-07-29 Procter & Gamble Company Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
ZA952220B (en) * 1994-05-02 1995-12-14 Procter & Gamble Bpn' variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6455295B1 (en) 1995-03-08 2002-09-24 The Procter & Gamble Company Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117350A0 (en) 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) 1995-03-09 2002-11-05 Procter & Gamble Company Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
IL117352A0 (en) * 1995-03-09 1996-07-23 Procter & Gamble Thermitase variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US5718895A (en) * 1995-11-16 1998-02-17 Alcon Laboratories, Inc. Enzymes with low isoelectric points for use in contact lens cleaning
DE19617229A1 (de) * 1996-04-30 1997-11-06 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Ethylenpolymerisaten im Hochdruck
US6908757B1 (en) 1998-03-26 2005-06-21 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
US6569663B1 (en) 1998-03-26 2003-05-27 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid substitutions
US6946128B1 (en) 1999-07-22 2005-09-20 The Procter & Gamble Company Protease conjugates having sterically protected epitope regions
BR0012660A (pt) 1999-07-22 2002-04-09 Procter & Gamble Variante de protease tipo subtilisina; composição de limpeza; e composição de cuidado pessoal
MXPA02000842A (es) 1999-07-22 2002-07-30 Procter & Gamble Conjugados de proteasa que tienen sitios de corte protegidos estericamente.
CN1373802A (zh) 1999-07-22 2002-10-09 宝洁公司 在特定表位区域具有氨基酸缺失和取代的枯草杆菌蛋白酶变体
BR9917481A (pt) * 1999-09-09 2002-05-21 Procter & Gamble Composição detergente contendo uma protease
US20050101012A1 (en) 2001-03-12 2005-05-12 Gerold Schuler CD4+CD25+ regulatory T cells from human blood
DE10153792A1 (de) * 2001-10-31 2003-05-22 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten
DE10162727A1 (de) 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
DE10162728A1 (de) 2001-12-20 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
EP1321513A1 (en) * 2001-12-21 2003-06-25 Direvo Biotech AG Subtilisin variants with improved characteristics
DE10163884A1 (de) 2001-12-22 2003-07-10 Henkel Kgaa Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease
US8222033B2 (en) 2002-08-12 2012-07-17 Argos Therapeutics, Inc. CD4+CD25− T cells and Tr1-like regulatory T cells
CA2534629C (en) * 2003-08-06 2016-01-19 University Of Maryland Biotechnology Institute Engineered proteases for affinity purification and processing of fusion proteins
CA2690055A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Danisco Us Inc. Methods for improving protein performance
DE102007044415A1 (de) 2007-09-17 2009-03-19 Henkel Ag & Co. Kgaa Leistungsverbesserte Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen
CN102046783A (zh) * 2008-06-06 2011-05-04 丹尼斯科美国公司 包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法
EP2166076A1 (en) 2008-09-23 2010-03-24 The Procter & Gamble Company Cleaning composition
RU2560978C2 (ru) * 2008-11-11 2015-08-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Протеазы, содержащие одну или несколько комбинируемых мутаций
WO2013120948A1 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 Novozymes A/S Subtilisin variants and polynucleotides encoding same
EP4525615A2 (en) 2022-05-14 2025-03-26 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4990452A (en) * 1986-02-12 1991-02-05 Genex Corporation Combining mutations for stabilization of subtilisin
BR9006827A (pt) * 1989-06-26 1991-08-06 Unilever Nv Composicoes detergentes enzimaticas
EP0563169B2 (en) * 1990-12-21 2006-04-12 Novozymes A/S ENZYME MUTANTS HAVING A LOW DEGREE OF VARIATION OF THE MOLECULAR CHARGE OVER A pH RANGE

Also Published As

Publication number Publication date
BR9407502A (pt) 1997-01-07
EP0719339A1 (en) 1996-07-03
MA23330A1 (fr) 1995-04-01
ES2275265T3 (es) 2007-06-01
ATE343636T1 (de) 2006-11-15
WO1995007991A2 (en) 1995-03-23
DE69434873T2 (de) 2007-09-06
HU9600667D0 (en) 1996-05-28
NO961067D0 (no) 1996-03-15
DE69434873D1 (de) 2006-12-07
WO1995007991A3 (en) 1995-04-13
CN1057123C (zh) 2000-10-04
CA2170491C (en) 2001-10-30
EP0719339B1 (en) 2006-10-25
HUT74222A (en) 1996-11-28
CA2170491A1 (en) 1995-03-23
JPH09502610A (ja) 1997-03-18
AU7870394A (en) 1995-04-03
NO961067L (no) 1996-05-15
CN1134728A (zh) 1996-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ79196A3 (en) Subtilisine bpn°variants with reduced adsorption and increased hydrolysis, cleaning agent containing such variants and a gene encoding said variant
US6599730B1 (en) Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6436690B1 (en) BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted
US6455295B1 (en) Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6451574B1 (en) Proteinase K variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6475765B1 (en) Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
CZ105396A3 (en) Cleaning agent, agent for cleaning fabrics, agent for washing dishes, washing agent, method of cleaning fabrics, method of washing dishes and washing process
EP0758373A1 (en) Fabric cleaning compositions containing subtilisin bpn' variants
CZ280097A3 (cs) Varianty termitasy mající sníženou adsorbci a zvýšenou hydrolýzu
WO1996028558A9 (en) Thermitase variants having decreased adsorption and increased hydrolysis
US6440717B1 (en) BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic