ES2275265T3 - Variantes de subtilisina bpn con adsorcion reducida e hidrolisis mejorada. - Google Patents
Variantes de subtilisina bpn con adsorcion reducida e hidrolisis mejorada. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2275265T3 ES2275265T3 ES94929758T ES94929758T ES2275265T3 ES 2275265 T3 ES2275265 T3 ES 2275265T3 ES 94929758 T ES94929758 T ES 94929758T ES 94929758 T ES94929758 T ES 94929758T ES 2275265 T3 ES2275265 T3 ES 2275265T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ala216glu
- bpn
- lys213glu
- tyr217leu
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
- A61K8/66—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
- C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
- C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
- C11D3/16—Organic compounds
- C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
- C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
- C11D3/38609—Protease or amylase in solid compositions only
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Birds (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A VARIANTES DE LA SUBTISILINA BPN'' QUE COMPRENDEN AL MENOS UNA O MAS POSICIONES DE AMINOACIDOS QUE TIENEN UN AMINOACIDO DIFERENTE QUE EL QUE SE PRODUCE EN LA SUBTISILINA BPN'' DE TIPO SALVAJE (POR EJ., UNA SUSTITUCION) EN LAS POSICIONES 100-220 MEDIANTE LO CUAL LA VARIANTE DE LA BPN'' TIENE UNA ABSORCION DECREMENTADA Y UNA HIDROLISIS INCREMENTADA DE UN SUBSTRATO INSOLUBLE COMPARADA CON LA SUBTISILINA BPN'' DE TIPO SALVAJE.
Description
Variantes de subtilisina BPN' con adsorción
reducida e hidrólisis mejorada.
La presente invención se refiere a variantes
enzimáticas novedosas útiles en numerosas composiciones limpiadoras,
y a dichas composiciones limpiadoras.
Las enzimas constituyen la clase más numerosa de
proteínas naturales. Cada clase de enzima generalmente cataliza
(acelera una reacción sin ser consumida) una clase diferente de
reacción química. Una clase de enzimas conocidas como proteasas son
conocidas por su capacidad de hidrolizar (romper un compuesto en dos
o más compuestos más simples captando las partes H y OH de una
molécula de agua en cada parte del enlace químico escindido) otras
proteínas. Se ha aprovechado esta capacidad de hidrolizar proteínas
incorporando proteasas naturales y proteasas manipuladas mediante
ingeniería de proteínas como un aditivo para preparaciones
detergentes para el lavado de ropa. Muchas de las manchas que se
producen en las prendas de vestir son proteináceas y las proteasas
de amplia especificidad pueden mejorar básicamente la eliminación
de dichas manchas.
Desgraciadamente, el nivel de eficacia de estas
proteínas en su entorno bacteriano natural frecuentemente no es
igual en el entorno de lavado relativamente artificial.
Específicamente, las características de las proteasas, tales como
estabilidad térmica, estabilidad frente al pH, estabilidad oxidativa
y especificidad por el sustrato no están necesariamente optimizadas
para su uso fuera del entorno natural de la enzima.
La secuencia de aminoácidos de la proteasa
determina las características de la proteasa. Un cambio en la
secuencia de aminoácidos de la proteasa puede alterar las
propiedades de la enzima en diverso grado, o incluso puede
inactivar la enzima, dependiendo de la ubicación, naturaleza y/o
magnitud del cambio en la secuencia de aminoácidos. Se han
utilizado diversos métodos para alterar la secuencia de aminoácidos
de las proteasas de tipo silvestre en un intento de mejorar sus
propiedades y con el objetivo de aumentar la eficacia de la proteasa
en el entorno de lavado. Estos métodos incluyen la alteración de la
secuencia de aminoácidos para mejorar la estabilidad térmica y
mejorar la estabilidad frente a la oxidación en condiciones bastante
diversas.
A pesar de los diversos métodos descritos en la
técnica, sigue existiendo la necesidad de nuevas variantes de
proteasas eficaces útiles para la limpieza de una diversidad de
superficies.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar variantes de la enzima subtilisina que tengan una
capacidad de hidrólisis mejorada con respecto a la enzima de tipo
silvestre.
También es un objeto de la presente invención
proporcionar composiciones limpiadoras que comprendan estas
variantes de la enzima subtilisina.
La presente invención se refiere a una variante
de subtilisina BPN' que comprende una secuencia de aminoácidos de
tipo silvestre, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos de
tipo silvestre comprende una de las siguientes mutaciones
específicas, en donde en primer lugar se indica el aminoácido
original de tipo silvestre, en segundo lugar el número de posición
y en tercer lugar el aminoácido sustituido:
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación simple:
- Lys213Glu;
- Ala216Glu;
- Ala216Asp;
- Ala216Gly;
- Ser204Glu;
- Val203Glu;
\newpage
- mutación doble:
- Lys213Glu + Tyr217Leu;
- Ile205Leu + Ala216Glu;
- Ile205Leu + Ala216Asp;
- Pro210Ala + Gly215Thr;
- Lys213Glu + Ala216Glu;
- Tyr214Phe + Tyr217Asn;
- Gln206Glu + Ala216Glu;
- Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Ala216Glu;
- Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Lys213Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación triple:
- Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu;
- Lys213Glu + Ala216glu + Tyr217Leu;
- Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu;
- Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación cuádruple:
- Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217 Leu;
- Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Ser204Glu + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217 Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación quíntuple:
- Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; y
- Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu,
caracterizada porque las variantes
BPN' tienen una menor adsorción y una mayor capacidad de hidrólisis
de un sustrato insoluble en comparación con la subtilisina BPN' de
tipo silvestre. La presente invención también se refiere a una
composición limpiadora seleccionada del grupo que consiste en una
composición limpiadora para superficies duras, una composición para
lavado de vajillas, una composición limpiadora oral, una
composición limpiadora para dentaduras postizas y una composición
limpiadora para lentillas de contacto, caracterizada porque la
composición limpiadora comprende dicha variante BPN' y un vehículo
limpiador de superficies
duras.
Esta invención se refiere a las enzimas
subtilisina, en particular la BPN', que han sido modificadas por
mutación de varias secuencias de nucleótidos que codifican la
enzima, modificando así la secuencia de aminoácidos de la enzima.
Las enzimas subtilisina modificadas (en lo sucesivo, "variantes
BPN'") de la presente invención tienen una menor adsorción y una
mayor capacidad de hidrólisis de un sustrato insoluble que la
subtilisina de tipo silvestre. La presente invención también se
refiere a los genes mutantes que codifican dichas variantes
BPN'.
Las enzimas subtilisina de esta invención
pertenecen a una clase de enzimas conocidas como proteasas. Una
proteasa es un catalizador para la escisión de enlaces peptídicos.
Un tipo de proteasa es una serina proteasa. Una serina proteasa se
distingue por el hecho de que existe un residuo de serina esencial
en el sitio activo.
La observación de que la velocidad de hidrólisis
de sustratos solubles de una enzima aumenta con la concentración
enzimática está bien documentada. Por lo tanto sería plausible que
para los sustratos unidos a una superficie, tales como los que se
encuentran en muchas aplicaciones de limpieza, aumentara la
velocidad de hidrólisis al aumentar la concentración superficial.
Se ha demostrado que este es el caso. (Brode, P.F. III and D.S.
Rauch, Langmuir, "Subtilisin BPN': Activity on an Immolbilized
Substrate", vol. 8, págs. 1325-1329 [1992]). De
hecho, se ha observado una dependencia lineal de la velocidad con la
concentración superficial en sustratos insolubles cuando se varía
la concentración superficial de la enzima. (Rubingh, D. N. and M. D.
Bauer, "Catalysis of Hydrolysis of Proteases at the
Protein-Solution Interface", en Polymer Solution,
Blends and Interfaces, Ed. de I. Noda y D. N. Rubingh, Elsevier,
pág. 464 [1992]). Sorprendentemente, al intentar aplicar este
principio en la búsqueda de variantes de proteasas que tuvieran una
capacidad limpiadora mejor, no hemos observado que las enzimas que
se adsorban más tengan un mayor rendimiento. De hecho, hemos
observado que sorprendentemente se produce el caso contrario: una
menor adsorción de una enzima a un sustrato provocaba un aumento de
la hidrólisis del sustrato (es decir, mayor capacidad
limpiadora).
limpiadora).
Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree
que el mejor rendimiento, cuando se compara una variante con otra,
se debe al hecho de que las enzimas que adsorben menos están también
menos fuertemente unidas y, por consiguiente, son mucho más móviles
sobre la superficie de la cual se quiere eliminar el sustrato
proteico insoluble. Con concentraciones similares de la solución
enzimática, esta mayor movilidad es suficiente para compensar
cualquier ventaja conferida por la dispensación de una concentración
más alta de la enzima sobre la superficie.
Las mutaciones descritas en la presente memoria
están diseñadas para cambiar (es decir, disminuir) la adsorción de
la enzima a la suciedad unida a la superficie. En la BPN', los
aminoácidos de la posición 200 a la posición 220 forman un gran
bucle exterior sobre la molécula de la enzima. Se ha descubierto que
este bucle juega un papel significativo en la adsorción de la
molécula de la enzima a un péptido unido a la superficie y las
mutaciones específicas en este bucle tienen un efecto significativo
sobre esta adsorción. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree
que este bucle es importante para la adsorción de la molécula de
BPN' por al menos dos razones: En primer lugar, los aminoácidos que
comprenden este bucle exterior pueden establecer contactos estrechos
con cualquiera de las superficies a las cuales está expuesta la
molécula. En segundo lugar, la proximidad de este bucle al sitio
activo y al bolsillo de unión de la molécula de BPN' es la
responsable de la adsorción catalíticamente productiva de la enzima
a los sustratos unidos a la superficie (suciedad
peptídica/proteica).
En la presente memoria, "variante"
significa una enzima que tiene una secuencia de aminoácidos que
difiere de la del tipo silvestre.
En la presente memoria, "gen BPN' mutante"
significa un gen que codifica una variante BPN'.
En la presente memoria, "subtilisina BPN' de
tipo silvestre" se refiere a una enzima subtilisina representada
por la SEC. nº 1. La secuencia de aminoácidos de la subtilisina BPN'
ha sido descrita también por Wells, J. A., E. Ferrari, D. J.
Henner, D.A. Estell y E. Y. Chen, Nucleic Acids Research, vol. II,
7911-7925 (1983).
En la presente memoria, la expresión
"secuencia de aminoácidos de tipo silvestre" abarca la SEC. nº
1 así como la SEC. nº 1 con modificaciones en la secuencia de
aminoácidos en otras posiciones que no sean las
199-220.
En la presente memoria, "aminoácido más
hidrófilo" se refiere a cualquier otro aminoácido con mayor
hidrofilicidad que un aminoácido que se presenta en la tabla de
hidrofilicidad siguiente. La siguiente tabla de hidrofilicidad
(Tabla 1) presenta los aminoácidos en orden descendente de
hidrofilicidad creciente (véase Hopp, T.P. y Woods, K.R.,
"Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid
Sequences", Proceedings of the National Academy of Science USA,
vol. 78, págs. 3824-3828, 1981, incorporado como
referencia en la presente memoria).
La Tabla 1 también muestra los aminoácidos que
llevan carga (esta característica está basada en un pH de
aproximadamente 8-9). Los aminoácidos cargados
positivamente son Arg y Lys, los aminoácidos cargados negativamente
son Glu y Asp y el resto de los aminoácidos son neutros. En una
realización preferida de la presente invención, el aminoácido que
se sustituye es neutro o está cargado negativamente, más
preferiblemente está cargado negativamente (es decir, Glu o
Asp).
Un fagémido (pSS-5) que contiene
el gen de la subtilisina BPN' de tipo silvestre (Mitchinson, C. y J.
A. Wells, [1989], "Protein Engineering of Disulfide Bonds in
Subtilisin BPN", Biochemistry, vol. 28, págs.
4807-4815) se transforma en la cepa CJ236 de
Escherichia coli ung y se produce un molde de ADN
monocatenaria que contiene uracilo utilizando el fago auxiliar
VCSM13 (Kunkel, T.A., J.D. Roberts y R.A. Zakour, "Rapid and
efficient site-specific mutagenesis without
phenotypic selection", Methods in Enzymology, vol. 154, págs.
367-382, [1987]; modificado por Yuckenberg, P.D.,
F. Witney, J. Geisselsoder y J. McClary,
"Site-directed in vitro mutagenesis using
uracil-containing DNA and phagemid vectors"
Directed Mutagenesis – A Practical Approach, ed. M.J. McPherson,
págs. 27-48, [1991]). Se utiliza una modificación de
la mutagénesis dirigida al sitio con cebador único del método de
Zoller y Smith (Zoller, M.J. y M. Smith,
"Oligonucleotide-directed mutagenesis using
M13-derived vectors: an efficient and general
procedure for the production of point mutations in any fragment of
DNA", Nucleic acids research, vol. 10, págs.
6487-6500, [1982]) para producir todos los mutantes
(básicamente como ha sido descrito por Yuckenberg y col.,
1991, ver más arriba). Los oligonucleótidos se preparan utilizando
un sintetizador de ADN 380B de Applied Biosystem Inc. Los productos
de reacción de la mutagénesis se transforman en la cepa MM294 de
Escherichia coli (American Type Culture Collection E.
Coli. 33625). Todos los mutantes se confirman por secuenciación
de ADN y el ADN aislado se transforma en la cepa de expresión BG2036
de Bacillus subtilis (Yang, M. Y., E. Ferrari y D. J.
Henner, [1984], "Cloning of the Neutral Protease Gene of
Bacillus subtillis and the Use of the Cloned Gene to Create
an In Vitro-derived Deletion Mutation", Journal of
Bacteriology, vol. 160, págs. 15-21). Para algunos
de los mutantes se utiliza un pSS-5 modificado con
una mutación por cambio de marco que produce un codón de terminación
en el aminoácido 217 para obtener el molde de uracilo. Los
oligonucleótidos se diseñan para restaurar el marco de lectura
correcto en la posición 217 y también se codifican para
sustituciones al azar en las posiciones 199, 200, 201, 202, 203,
204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216,
217, 218, 219 y 220 (mezclas equimolares y/o variables de los
cuatro nucleótidos para las tres bases en estos codones). Las
mutaciones que corrigen el cambio de marco que produce un codón de
terminación y dan lugar a una enzima funcional se identifican por su
capacidad de digerir la caseína. Las sustituciones al azar se
determinan por secuenciación del ADN.
Las células de Bacillus subtilis (BE2036)
que contienen un mutante de la subtilisina de interés se cultivan
hasta una fase semilogarítmica en un litro de cultivo de caldo de
LB-glucosa y se inoculan en un fermentador Biostat
ED (B. Braun Biotech, Inc., Allentown, Pennsylvania) en un volumen
total de 10 litros. El medio de fermentación contienen extracto de
levadura, almidón, antiespumante, tampones y minerales traza (véase
Fermentation: A Practical Approach, Ed. B. McNeil y L M. Harvey,
1990). El caldo se mantiene a un pH constante de 7,0 durante el
ciclo de fermentación. Se añade cloranfenicol para una selección por
antibióticos del plásmido mutagenizado. Las células se cultivan
durante la noche a 37ºC hasta una A_{600} de aproximadamente 60 y
se cosechan.
Para obtener la enzima pura el caldo de
fermentación se pasa por las siguientes etapas: del caldo se retiran
las células Bacillus subtilis por centrifugación y se
clarifica eliminando las partículas finas con una membrana de corte
de 100K. A continuación, se concentra en una membrana de corte de
10K y se realiza una diálisis de flujo para reducir la fuerza
iónica y ajustar el pH a 5,5 utilizando un tampón MES 0,025M (ácido
2-N-morfolino)etanosulfónico). La enzima se purifica
adicionalmente cargándola en una columna de cromatografía de
intercambio catiónico o en una columna de cromatografía de
adsorción por afinidad y eluyéndola de la columna con NaCl o un
gradiente de propilenglicol (véase Scopes, R. K., Protein
Purification Principles and Practice,
Springer-Verlag, Nueva York [1984]).
Se utiliza el ensayo pNA (DelMar, E.G.,
C. Largman, J.W. Brodrick y M.C. Geokas, Anal. Biochem., vol. 99,
págs. 316-320, [1979]) para determinar la
concentración de enzima activa en las fracciones recogidas durante
la elución en gradiente. Este ensayo mide la velocidad a la que se
libera la p-nitroanilina a medida que la enzima hidroliza el
sustrato sintético soluble,
succinil-alanina-alanina-prolina-fenilalanina-p-nitroanilida
(sAAPF-pNA). La velocidad de producción del color amarillo
debido a la reacción de hidrólisis se mide a 410 nm en un
espectrofotómetro y es proporcional a la concentración de la enzima
activa. Además, se utilizan las mediciones de la absorbancia a 280
nm para determinar la concentración total de proteína. La relación
enzima activa/proteína total proporciona la pureza de la enzima y se
utiliza para identificar las fracciones que se van a combinar para
la solución madre.
Para evitar la autolisis de la enzima durante el
almacenamiento, se añade un peso igual de propilenglicol a las
fracciones combinadas obtenidas de la columna de cromatografía. Una
vez completado el procedimiento de purificación, la pureza de la
solución madre de la enzima se verifica con SDS-PAGE
(electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de dodecilo
sódico) y se determina la concentración absoluta de la enzima
mediante un método de valoración volumétrica del sitio activo
utilizando un inhibidor de la tripsina de tipo II=T: clara de huevo
de pavo adquirida a Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri).
Los factores de conversión medidos mostrarán cuáles de los cambios
hechos en la molécula de la enzima en las diversas posiciones
producen una variante enzimática con mayor actividad, con respecto
al tipo salvaje, frente al sustrato soluble pNA.
En la preparación para su uso, la solución madre
de la enzima se eluye a través de una columna de exclusión por
tamaño Sephadex-G25 (Pharmacia, Piscataway, New
Jersey) para separar el propilenglicol y cambiar el tampón. El
tampón MES de la solución madre de la enzima se cambia por un tampón
Tris (Tris(hidroximetil-aminometano) 0,1 M
que contiene CaCl_{2} 0,01 M y el pH se ajusta a 8,6 con HCl.
Todos los experimentos se llevan a cabo a pH 8,6 en tampón Tris
atemperado a 25ºC.
Se utiliza un frasco de vidrio de porosidad
controlada (CPG) de aminopropilo adquirido a CPG Inc. (Fairfield,
New Jersey) como soporte para unir covalentemente el sustrato de
sAAPF-pNA adquirido a Bachem, Inc. (Torrence, California).
La reacción se lleva a cabo en dimetilsulfóxido y (clorhidrato de
1-etil-3-[3-(dimetilamino)propil]
carbodiimida) (EDC) como agente acoplador. Una vez finalizada la
reacción (controlada mediante el ensayo pNA), se elimina el
exceso de disolvente y el CPG:sAAPF-pNA se aclara con
dimetilsulfóxido (DMSO) y agua doblemente destilada. A continuación
se seca en horno con purgado de N_{2} a aproximadamente 70ºC. El
esquema de reacción y la preparación del sustrato inmovilizado se
realizan como se describe en Brode, P.F. III y D.S. Rauch,
"Subtilisin BPN': Activity on an Immobilized Substrate,"
Langmuir, vol. 8, págs. 1325-1329, (1992).
La superficie del CPG tendrá 62.000 \pm 7.000
moléculas de pNA/\mum^{2}. La superficie no variará con
respecto al valor de 50,0 m^{2}/g notificado por CPG Inc. para el
CPG recibido. Esto sugiere que el procedimiento utilizado para
añadir sAAPF-pNA al CPG no daña la estructura porosa
(diámetro medio US 486 A).
Utilizando CPG:sAAPF-pNA, se puede medir
la adsorción de una variante enzimática y la hidrólisis del péptido
unido al CPG en un único experimento. Se añade un pequeño volumen de
solución madre de la variante enzimática a un matraz que contiene
tampón Tris y CPG:sAAPF-pNA que ha sido desgasificado. El
matraz se agita en un agitador con acción de muñeca durante un
período de 90 minutos durante el cual el agitador se para a
diferentes intervalos de tiempo (por ejemplo, cada 2 minutos
durante las primeras etapas de la hidrólisis de adsorción, p. ej.,
los 20 primeros minutos, y cada 10 minutos hacia el final del
experimento). Se deja en reposo el CPG:sAAPF-pNA y se toma
una muestra de la solución. Tanto el procedimiento experimental como
el cálculo de la adsorción y la hidrólisis se llevan a cabo como
describen Brode y col., 1992, citado más arriba.
Se controla la estabilidad de todas las enzimas
frente a la autolisis y durante el transcurso de este experimento
no debería observarse una pérdida autolítica apreciable. Por
consiguiente, la adsorción de la enzima se puede determinar
midiendo el agotamiento de la solución. La diferencia entre la
concentración inicial de la variante enzimática y la concentración
medida en cada punto temporal proporciona la cantidad de variante
enzimática adsorbida. La cantidad de pNA hidrolizado en la
superficie se mide tomando una lectura de absorbancia en una
alícuota de la muestra a 410 nm. La cantidad total de pNA
hidrolizado se calcula añadiendo la cantidad muestreada y la
cantidad que queda en el matraz. Este valor se corrige restando la
cantidad de pNA que es hidrolizada por el tampón Tris a pH
8,6 cuando no hay presente enzima. Esta hidrólisis de la base es de
7% a 29% de la hidrólisis total, dependiendo de la eficacia de la
enzima.
Las velocidades de hidrólisis del sustrato
soluble sAAPF-pNA se controlan midiendo el aumento de
adsorbancia en función del tiempo a 410 nm en un espectrofotómetro
DU-70. La concentración de la enzima se mantiene
constante y se prepara para que esté en el intervalo de
6-10 nanomolar mientras que la concentración del
sustrato varía de 90-700 \muM de sAAPF-pNA
en cada determinación cinética. Se mide la adsorbancia cada segundo
durante un período de 900 segundos y los datos se transfieren a una
hoja de cálculo Lotus™ (Lotus Development Corporation, Cambridge,
Massachusetts). El análisis de los parámetros cinéticos se realiza
mediante el análisis de Lineweaver Burk estándar en el cual los
datos de la parte inicial del ciclo (generalmente el primer minuto)
se ajustan a una recta de regresión para v_{o}. Los datos v_{o}
y s_{o} se representan en la forma inversa estándar para obtener
K_{M} y k_{cat}.
En la Tabla 2 siguiente se presentan las
variantes BPN' de la presente invención que tienen una menor
adsorción y una mayor capacidad de hidrólisis de los sustratos
unidos a la superficie. Al describir las mutaciones específicas se
indica en primer lugar el aminoácido original de tipo silvestre, en
segundo lugar el número de posición y en tercer lugar el aminoácido
sustituido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
En otra realización de la presente invención, se
incluye una cantidad eficaz de una o más variantes enzimáticas de
la presente invención en composiciones útiles para limpiar diversas
superficies en las cuales sea necesario eliminar manchas
proteináceas. Dichas composiciones limpiadoras incluyen
composiciones detergentes para limpiar superficies duras en una
forma no limitada (p. ej., líquidas y granuladas); composiciones
detergentes para limpiar tejidos, en una forma no limitada (p. ej.,
formulaciones granuladas, líquidas y en pastilla); composiciones
para lavado de vajillas (en una forma no limitada); composiciones
limpiadoras orales, en una forma no limitada (p. ej., formulaciones
para dentífrico, pasta dental o colutorio); composiciones
limpiadoras de dentaduras postizas, en una forma no limitada (p.
ej., líquido, pastilla); y composiciones limpiadoras para lentillas
de contacto, en una forma no limitada (p. ej., líquido, pastilla).
En la presente memoria, "cantidad eficaz de la variante
enzimática" se refiere a la cantidad de variante enzimática
necesaria para alcanzar la actividad enzimática necesaria en la
composición limpiadora específica. Dichas cantidades eficaces serán
fácilmente determinadas por un experto en la técnica y dependen de
muchos factores, tales como la variante enzimática utilizada, la
aplicación de limpieza, la composición específica de la composición
limpiadora y si se requiere una composición líquida o seca (p. ej.,
granulada, en pastilla) y similares. Preferiblemente las
composiciones limpiadoras de la presente invención comprenden de
aproximadamente 0,0001% a aproximadamente 10% de una o más
variantes enzimáticas de la presente invención, más preferiblemente
de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, más preferiblemente
aún de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1%. A continuación
se describirán más detalladamente varios ejemplos de diversas
composiciones limpiadoras en donde se pueden utilizar las variantes
enzimáticas de la presente invención. Todas las partes, porcentajes
y relaciones utilizados en la presente memoria son en peso, salvo
que se indique lo contrario.
En la presente memoria, "composiciones
limpiadoras no adecuadas para tejidos" incluyen composiciones
limpiadoras para superficies duras, composiciones para lavado de
vajillas, composiciones limpiadoras orales, composiciones
limpiadoras de dentaduras postizas y composiciones limpiadoras para
lentillas de contacto.
Las enzimas de la presente invención se pueden
usar en cualquier composición detergente donde se desee una alta
formación de jabonaduras y una buena eliminación del sustrato
insoluble. Por tanto, las variantes enzimáticas de la presente
invención se pueden usar con diversos ingredientes convencionales
para proporcionar limpiadores de superficies duras, composiciones
para lavado de vajillas y composiciones para lavado de tejidos
totalmente formuladas y similares. Dichas composiciones pueden
estar en la forma de líquidos, gránulos, pastillas y similares.
Dichas composiciones se pueden formular como detergentes
"concentrados" modernos que contienen hasta 30%-60% en peso de
tensioactivos.
Las composiciones limpiadoras de la presente
invención pueden opcionalmente, y preferiblemente, contener diversos
tensioactivos aniónicos, no iónicos, de ion híbrido, etc. Dichos
tensioactivos están presentes de forma típica a niveles de
aproximadamente 5% a aproximadamente 35% de las composiciones.
Ejemplos no limitativos de tensioactivos útiles
en la presente invención incluyen los alquil
C_{11}-C_{18} bencenosulfonatos convencionales
y alquilsulfatos primarios y aleatorios, los alquil
C_{10}-C_{18} sulfatos (2,3) secundarios de
fórmulas
CH_{3}(CH_{2})x(CHOSO_{3})^{-}M^{+})CH_{3}
y CH_{3}(CH_{2})y(CHOSO_{3}^{-}M^{+})
CH_{2}CH_{3} en donde x e (y+1) son números enteros de al menos
aproximadamente 7, preferiblemente de al menos aproximadamente 9 y
M es un catión hidrosoluble, especialmente sodio, los alquilalcoxi
C_{10}-C_{18} sulfatos (especialmente los etoxi
sulfatos EO 1-5), alquil
C_{10}-C_{18} alcoxi carboxilatos (especialmente
los etoxi carboxilatos EO 1-5), los alquil
C_{10}-C_{18} poliglicósidos y sus
correspondientes poliglicósidos sulfatados, ésteres
C_{12}-C_{18} de ácido graso alfa sulfonados,
alquil y alquil C_{12}-C_{18} fenol alcoxilatos
(especialmente etoxilatos y mixtos etoxi/propoxi), betaínas
C_{12}-C_{18} y sulfobetaínas
("sultaínas"), óxidos de amina
C_{10}-C_{18} y similares. Los alquil alcoxi
sulfatos (AES) y los alquil alcoxi carboxilatos (AEC) son los
preferidos en la presente invención. (También se prefiere el uso de
dichos tensioactivos junto con los tensioactivos de tipo óxido de
amina, betaína o sultaína anteriormente mencionados, dependiendo
del deseo del formulador). Otros tensioactivos convencionales útiles
se describen en los textos estándar. Los tensioactivos
especialmente útiles incluyen las N-metil
C_{10}-C_{18} glucamidas descritas en la
patente US-5.194.639, concedida a Connor y col. el
16 de marzo de 1993.
En las composiciones de la presente invención se
puede incluir una amplia variedad de otros ingredientes útiles en
las composiciones limpiadoras detergentes, incluyendo otros
ingredientes activos, vehículos, hidrótropos, mejoradores del
proceso, tintes o pigmentos, disolventes para formulaciones
líquidas, etc. Si se desea un aumento adicional de la formación de
jabonaduras, se pueden incorporar a las composiciones reforzadores
de la formación de las jabonaduras, como las alcohol
C_{10}-C_{16} amidas, de forma típica a niveles
de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%. Las monoetanol y
dietanol C_{10}-C_{14} amidas ilustran una clase
típica de dichos reforzadores de la formación de las jabonaduras.
También es ventajoso el uso de dichos reforzadores de formación de
las jabonaduras con un adyuvante de alta formación de jabonaduras y
tensioactivos tales como los óxidos de amina, las betaínas y las
sultaínas mencionadas anteriormente. Si se desea, se pueden añadir
sales de magnesio solubles, tales como MgCl_{2}, MgSO_{4} y
similares a niveles, de forma típica, de aproximadamente 0,1% a
aproximadamente 2%, para proporcionar una formación de las
jabonaduras adicional.
Las composiciones detergentes líquidas de la
presente invención pueden contener agua y otros disolventes como
vehículos. Son adecuados los alcoholes primarios o secundarios de
bajo peso molecular, por ejemplo metanol, etanol, propanol e
isopropanol. Los alcoholes monohídricos son preferidos para disolver
los tensioactivos, aunque también se pueden usar polioles tales
como los que contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 6
átomos de carbono y de aproximadamente 2 a aproximadamente 6 grupos
hidroxi (p. ej., 1,3-propanodiol, etilenglicol,
glicerina y 1,2-propanodiol). Las composiciones
pueden contener de aproximadamente 5% a aproximadamente 90%, de
forma típica de aproximadamente 10% a aproximadamente 50%, de dichos
vehículos.
Las composiciones detergentes de la presente
invención estarán preferiblemente formuladas de modo que durante el
uso en operaciones de limpieza acuosa el agua de lavado tendrá un pH
entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 11,0. Los productos
terminados están, por lo tanto, formulados de forma típica en este
intervalo. Las técnicas para el control del pH en los niveles de
uso recomendados incluyen el uso de tampones, álcalis, ácidos, etc.
y son bien conocidas por los expertos en la técnica.
A la hora de formular las composiciones
limpiadoras para superficies duras y las composiciones limpiadoras
para tejidos de la presente invención, el formulador podría desear
emplear diversos aditivos reforzantes de la detergencia a niveles
de aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, en peso. Los aditivos
reforzantes de la detergencia típicos incluyen las zeolitas de
1-10 micrómetros, policarboxilatos tales como los
citratos y oxidisuccinatos, silicatos laminares, fosfatos, y
similares. Otros aditivos reforzantes de la detergencia
convencionales figuran en los formularios convencionales.
Igualmente, el formulador podría desear utilizar
diversas enzimas adicionales, tales como celulasas, lipasas,
amilasas y proteasas en dichas composiciones, de forma típica a
niveles de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1%, en peso. En
la técnica de los detergentes para lavado de ropa son bien conocidas
diversas enzimas detersivas y para el cuidado de tejidos.
En dichas composiciones se pueden utilizar
diversos compuestos blanqueantes, tales como percarbonatos,
perboratos y similares, de forma típica a niveles de
aproximadamente 1% a aproximadamente 15%, en peso. Si se desea,
dichas composiciones pueden contener también activadores del
blanqueador, tales como tetraacetil etilendiamina,
nonaoiloxibenceno sulfonato y similares, los cuales son también
conocidos en la técnica. Los niveles de uso oscilan de forma típica
de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, en peso.
En dichas composiciones pueden utilizarse
diversos agentes para liberar la suciedad, especialmente del tipo
oligoéster aniónico, diversos agentes quelantes, especialmente los
amino fosfonatos y etilendiaminodisuccinatos, diversos agentes
eliminadores de la suciedad arcillosa, especialmente
tetraetilenpentamina etoxilada, diversos agentes dispersantes,
especialmente poliacrilatos y poliaspartatos, diversos
abrillantadores, especialmente abrillantadores aniónicos, varios
supresores de las jabonaduras, especialmente siliconas y alcoholes
secundarios, diversos suavizantes de tejidos, especialmente
arcillas tipo esmectita y similares, a niveles que oscilan de
aproximadamente 1% a aproximadamente 35%, en peso. Los formularios
convencionales y las patentes publicadas contienen múltiples
descripciones detalladas y estos materiales convencionales.
En las composiciones limpiadoras de la presente
invención también se pueden utilizar estabilizantes enzimáticos.
Dichos estabilizantes enzimáticos incluyen propilenglicol
(preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%),
formiato sódico (preferiblemente de aproximadamente 0,1% a
aproximadamente 1%) y formiato cálcico (preferiblemente de
aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%).
En la presente memoria "composición limpiadora
para superficies duras" se refiere a composiciones detergentes
líquidas y granuladas para limpiar superficies duras como suelos,
paredes, baldosas de cuartos de baño y similares. Las composiciones
limpiadoras para superficies duras de la presente invención
comprenden una cantidad eficaz de una o más variantes enzimáticas
de la presente invención, preferiblemente de aproximadamente 0,001%
a aproximadamente 10%, más preferiblemente de aproximadamente 0,01%
a aproximadamente 5%, más preferiblemente aún de aproximadamente
0,05% a aproximadamente 1%, en peso de enzima activa de la
composición. Además de comprender una o más variantes enzimáticas
de la presente invención, dichas composiciones limpiadoras para
superficies duras comprenden de forma típica un tensioactivo y un
aditivo reforzante de la detergencia secuestrante hidrosoluble. Sin
embargo, en determinados productos especializados, como limpiadores
para pulverizar ventanas, los tensioactivos a veces no son
utilizados ya que éstos pueden dejar un residuo de película o vetas
en la superficie del cristal.
El componente tensioactivo, cuando está
presente, puede comprender una cantidad tan pequeña como 0,1% de las
composiciones de la presente invención, aunque las composiciones
contendrán de aproximadamente 0,25% a aproximadamente 10%, más
preferiblemente de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, de
tensioactivo.
De forma típica las composiciones contendrán de
aproximadamente 0,5% a aproximadamente 50% de un aditivo reforzante
de la detergencia, preferiblemente de aproximadamente 1% a
aproximadamente 10%.
Preferiblemente el pH debería estar en el
intervalo de aproximadamente 8 a 12. En caso de que sea necesario
un ajuste, se pueden usar agentes para ajustar el pH convencionales,
tales como hidróxido sódico, carbonato sódico o ácido
clorhídrico.
Los disolventes se pueden incluir en las
composiciones. Los disolventes útiles incluyen, aunque no de forma
limitativa, glicol éteres tales como dietilenglicol monohexil éter,
dietilenglicol monobutil éter, etilenglicol monobutil éter,
etilenglicol monohexil éter, propilenglicol monobutil éter,
dipropilenglicol monobutil éter y dioles, tales como
2,2,4-trimetil-1,3-pentanodiol
y
2-etil-1,3-hexanodiol.
Cuando se usan, dichos disolventes están presentes de forma típica
a niveles de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15%,
preferiblemente de aproximadamente 3% a aproximadamente 11%.
Además, en las presentes composiciones se pueden
usar disolventes muy volátiles como el isopropanol o el etanol para
facilitar una evaporación más rápida de la composición en las
superficies si estas no se aclaran después de la aplicación de la
composición "pura" sobre la superficie. Cuando se usan, los
disolventes volátiles están presentes de forma típica a niveles de
aproximadamente 2% a aproximadamente 12% en las composiciones.
La realización de composición limpiadora para
superficies duras de la presente invención se ilustra mediante los
siguientes ejemplos.
Ejemplos
7-12
En los ejemplos 7-10, las
variantes BPN' presentadas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Lys213Glu, con resultados prácticamente
similares.
En los ejemplos 11-12, cualquier
combinación de las variantes BPN' presentadas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Lys213Glu y Ile205Leu + Ala216Asp, con
resultados prácticamente similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
13-18
En los ejemplos 13-16, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Lys213Glu + Tyr217Leu, con resultados prácticamente
similares.
En los ejemplos 17-18, cualquier
combinación de las variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Lys213Glu + Tyr217Leu y Ala216Glu, con
resultados prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
las composiciones para lavado de vajillas comprenden una o más
variantes enzimáticas de la presente invención. En la presente
memoria, "composición para lavado de vajillas" se refiere a
todas las formas de composiciones para limpiar platos, incluyendo de
forma no excluyente, las formas granuladas y líquidas. La
realización de la composición para lavado de vajillas de la presente
invención está ilustrada por los ejemplos que se presentan a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
19-24
En los ejemplos 19-22, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu, con resultados
prácticamente similares.
En los ejemplos 23-24, cualquier
combinación de las variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu e
Ile205Leu + Ala216Asp, con resultados prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
las composiciones limpiadoras de tejidos comprenden una o más
variantes enzimáticas de la presente invención. En la presente
memoria, "composición limpiadora de tejidos" se refiere a
todas las formas de composiciones detergentes para limpiar tejidos,
incluyendo de forma no excluyente, formas granuladas, líquidas y en
pastilla.
Las composiciones limpiadoras de tejidos
granuladas de la presente invención contienen una cantidad eficaz
de una o más variantes enzimáticas de la presente invención,
preferiblemente de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 10%,
más preferiblemente de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 5%,
más preferiblemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%,
en peso de enzima activa de la composición. Además de una o más
variantes enzimáticas, las composiciones limpiadoras de tejidos
granuladas comprenden al menos un tensioactivo, uno o más aditivos
reforzantes de la detergencia y en algunos casos, un agente
blanqueante.
La realización de composición limpiadora de
tejidos granulada de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
Ejemplos
25-28
En los ejemplos 25-26, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Ala216Asp, con resultados prácticamente
similares.
En los ejemplos 27-28, cualquier
combinación de las variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Ala216Asp y Ala216Gly, con resultados
prácticamente similares.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
29-32
En los ejemplos 29-30, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu, con resultados
prácticamente similares.
En los ejemplos 31-32, cualquier
combinación de las variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu e
Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu, con resultados prácticamente
similares.
Las composiciones limpiadoras de tejidos
líquidas de la presente invención comprenden una cantidad eficaz de
una o más variantes enzimáticas de la presente invención,
preferiblemente de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 5%, más
preferiblemente de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, en
peso de enzima activa de la composición. Dichas composiciones
limpiadoras de tejidos líquidas comprenden además de forma típica un
tensioactivo aniónico, un ácido graso, un aditivo reforzante de la
detergencia hidrosoluble y agua.
La realización de la composición limpiadora de
tejidos líquida de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
\newpage
Ejemplos
33-37
En los ejemplos 33-35 las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Pro210Ala + Gly215Thr, con resultados prácticamente
similares.
En los ejemplos 36-37, cualquier
combinación de las variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Pro210Ala + Gly215Thr y Pro210Ala +
Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu, con resultados prácticamente
similares.
Las composiciones limpiadoras de tejidos en
pastilla de la presente invención adecuadas para el lavado a mano
de tejidos manchados contienen una cantidad eficaz de una o más
variantes enzimáticas de la presente invención, preferiblemente de
aproximadamente 0,001% a aproximadamente 10%, más preferiblemente de
aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, en peso de la
composición.
La realización de la composición limpiadora de
tejidos en pastilla de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
Ejemplos
38-41
En los ejemplos 38-39 las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Lys213Glu + Ala216Glu, con resultados prácticamente
similares.
En los ejemplos 40-41, cualquier
combinación de las variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre
otras, están sustituidas por Lys213Glu + Ala216Glu y Tyr214Phe +
Tyr217Asn, con resultados prácticamente similares.
Además de las composiciones limpiadoras de
superficies duras, de vajillas y de tejidos descritas más arriba,
se pueden incorporar una o más variantes enzimáticas de la presente
invención a otras muchas composiciones limpiadoras cuando se desee
la hidrólisis de un sustrato insoluble. Dichas composiciones
limpiadoras adicionales incluyen, aunque no de forma limitativa,
composiciones limpiadoras orales, composiciones limpiadoras de
dentaduras postizas y composiciones limpiadoras para lentillas de
contacto.
En otra realización de la presente invención, se
incluye una cantidad farmacéuticamente aceptable de una o más
variantes enzimáticas de la presente invención en composiciones
útiles para eliminar las manchas proteináceas en dientes o
dentaduras postizas. En la presente memoria, "composiciones
limpiadoras orales" se refiere a dentífricos, pastas dentales,
geles dentales, polvos dentales, colutorios, pulverizadores bucales,
geles bucales, chicles, gominolas, bolsitas, pastillas, biogeles,
pastas profilácticas, soluciones para el tratamiento dental y
similares. Preferiblemente, las composiciones limpiadoras orales de
la presente invención comprenden de aproximadamente 0,0001% a
aproximadamente 20% de una o más variantes enzimáticas de la
presente invención, más preferiblemente de aproximadamente 0,001% a
aproximadamente 10%, más preferiblemente aún de aproximadamente
0,01% a aproximadamente 5%, en peso de la composición y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. En la presente memoria,
"farmacéuticamente aceptable" significa que los fármacos,
medicamentos o ingredientes inertes que describe el término son
adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y
animales inferiores sin provocar una toxicidad, incompatibilidad,
inestabilidad, irritación, respuesta alérgica inadecuada, y
similares, y con una relación ventaja/riesgo razonable.
De forma típica, los componentes vehículo para
la limpieza oral farmacéuticamente aceptables de los componentes
limpiadores orales de las composiciones limpiadoras orales
comprenderán generalmente de aproximadamente 50% a aproximadamente
99,99%, preferiblemente de aproximadamente 65% a aproximadamente
99,99%, más preferiblemente de aproximadamente 65% a
aproximadamente 99%, en peso de la composición.
Los componentes vehículo farmacéuticamente
aceptables y los componentes opcionales que se pueden incluir en
las composiciones limpiadoras orales de la presente invención son
bien conocidos por los expertos en la técnica. Una amplia variedad
de tipos de composición, componentes vehículo y componentes
opcionales útiles en las composiciones limpiadoras orales se
describen en la patente US-5.096.700, concedida a
Seibel el 17 de marzo de 1992; la patente
US-5.028.414, concedida a Sampathkumar el 2 de julio
de 1991, y la patente US-5.028.415, concedida a
Benedict, Bush y Sunberg el 2 de julio de 1991.
La realización de composición limpiadora oral de
la presente invención está ilustrada por los siguientes
ejemplos.
\newpage
Ejemplos
42-45
En los ejemplos 42-45 las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu +
Tyr217Leu, con resultados prácticamente similares.
Ejemplos
46-49
En los ejemplos 46-49, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Ala216Gly, con resultados prácticamente
similares.
Ejemplos
50-53
En los ejemplos 50-53, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Tyr214Phe + Tyr217Asn, con resultados prácticamente
similares.
Ejemplos
54-57
En los ejemplos 54-57, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu, con resultados
prácticamente similares.
En otra realización de la presente invención,
las composiciones limpiadoras de dentaduras postizas para limpiar
dentaduras postizas fuera de la cavidad oral comprenden una o más
variantes enzimáticas de la presente invención. Dichas
composiciones limpiadoras de dentaduras postizas comprenden una
cantidad eficaz de una o más variantes enzimáticas de la presente
invención, preferiblemente de aproximadamente 0,0001% a
aproximadamente 50% de una o más variantes enzimáticas de la
presente invención, más preferiblemente de aproximadamente 0,001% a
aproximadamente 35%, más preferiblemente aún de aproximadamente
0,01% a aproximadamente 20%, en peso de la composición y un
vehículo limpiador de dentaduras postizas. En la técnica se conocen
diversos formatos de composición limpiadora para dentaduras
postizas tales como pastillas efervescentes y similares (véase por
ejemplo la patente US-5.055.305, Young), las cuales
son generalmente adecuadas para la incorporación de una o más
variantes enzimáticas de la presente invención para eliminar manchas
proteináceas de las dentaduras postizas.
La realización de composición limpiadora para
dentaduras postizas de la presente invención está ilustrada por los
siguientes ejemplos.
Ejemplos
58-61
En los ejemplos 58-61, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Ala216Glu, con resultados prácticamente
similares.
En otra realización de la presente invención,
las composiciones limpiadoras para lentillas de contacto comprenden
una o más variantes enzimáticas de la presente invención. Dichas
composiciones limpiadoras para lentillas de contacto comprenden una
cantidad eficaz de una o más variantes enzimáticas de la presente
invención, preferiblemente de aproximadamente 0,01% a
aproximadamente 50% de una o más variantes enzimáticas de la
presente invención, más preferiblemente de aproximadamente 0,01% a
aproximadamente 20%, más preferiblemente aún de aproximadamente 1%
a aproximadamente 5%, en peso de la composición y un vehículo para
la limpieza de lentillas de contacto. En la técnica son bien
conocidos diversos formatos de composiciones limpiadoras para
lentillas de contacto, tales como pastillas, líquidos y similares
(véase por ejemplo, US-4.863.627, concedida a
Davies, Meaken y Rees el 5 de septiembre de 1989;
US-Re. 32.672, concedida de nuevo a Huth, Lam y
Kirai el 24 de mayo de 1988; US-4.609.493,
concedida a Schafer el 2 de septiembre de 1986;
US-4.690.793, concedida a Ogunbiyi y Smith el 1 de
septiembre de 1987; US-4.614.549, concedida
Ogunbiyi, Riedhammer y Smith el 30 de septiembre de 1986, y
US-4.285.738, concedida a Ogata el 25 de agosto de
1981), las cuales son generalmente adecuadas para la incorporación
de una o más variantes enzimáticas de la presente invención para
eliminar las manchas proteináceas de lentillas de contacto.
La realización de composición limpiadora para
lentillas de contacto de la presente invención está ilustrada por
los siguientes ejemplos.
Ejemplos
62-65
En los ejemplos 62-65, las
variantes BPN' mostradas en la Tabla 2, entre otras, están
sustituidas por Ile205Leu + Ala216Asp, con resultados prácticamente
similares.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: SERINA PROTEASA CON MENOR ADSORCIÓN Y MAYOR CAPACIDAD DE HIDRÓLISIS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: THE PROCTER & GAMBLE COMPANY
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 11810 EAST MIAMI RIVER ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROSS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: OH
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 45061
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- DATOS SOBRE EL APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CORSTANJE, BRAHM J.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 34.804
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DATOS DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 513-627-2858
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 513-627-0260
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 275 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. nº 1:
Claims (4)
1 Una variante BPN' que comprende una secuencia
de aminoácidos de tipo silvestre, caracterizada porque la
secuencia de aminoácidos de tipo silvestre comprende una de las
siguientes mutaciones específicas, en donde se indica en primer
lugar el aminoácido original de tipo silvestre, en segundo lugar el
número de posición y en tercer lugar el aminoácido sustituido:
- mutación simple:
- Lys213Glu;
- Ala216Glu;
- Ala216Asp;
- Ala216Gly;
- Ser204Glu;
- Val203Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación doble:
- Lys213Glu + Tyr217Leu;
- Ile205Leu + Ala216Glu;
- Ile205Leu + Ala216Asp;
- Pro210Ala + Gly215Thr;
- Lys213Glu + Ala216Glu;
- Tyr214Phe + Tyr217Asn;
- Gln206Glu + Ala216Glu;
- Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Lys213Glu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación triple:
- Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu;
- Lys213Glu + Ala216glu + Tyr217Leu;
- Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu;
- Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación cuádruple:
- Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
- Ser204Glu + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
\vskip1.000000\baselineskip
- mutación quíntuple:
- Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; y
- Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu,
caracterizada porque las
variantes BPN' tienen una menor adsorción y una mayor capacidad de
hidrólisis de un sustrato insoluble que la subtilisina BPN' de tipo
silvestre.
2. Una composición limpiadora seleccionada del
grupo que consiste en una composición limpiadora para superficies
duras, una composición para lavado de vajillas, una composición
limpiadora oral, una composición limpiadora para dentaduras postizas
y una composición limpiadora para lentillas de contacto,
caracterizada porque la composición limpiadora comprende la
variante BPN' de la reivindicación 1 y un vehículo limpiador para
superficies duras.
3. Una composición limpiadora para superficies
duras que comprende la variante BPN' de la reivindicación 1 y un
vehículo limpiador para superficies duras.
4. Una composición limpiadora para tejidos que
comprende una variante BPN' de la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US12143793A | 1993-09-15 | 1993-09-15 | |
| US121437 | 1993-09-15 | ||
| US28746194A | 1994-08-11 | 1994-08-11 | |
| US287461 | 1994-08-11 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2275265T3 true ES2275265T3 (es) | 2007-06-01 |
Family
ID=26819467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES94929758T Expired - Lifetime ES2275265T3 (es) | 1993-09-15 | 1994-08-31 | Variantes de subtilisina bpn con adsorcion reducida e hidrolisis mejorada. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0719339B1 (es) |
| JP (1) | JPH09502610A (es) |
| CN (1) | CN1057123C (es) |
| AT (1) | ATE343636T1 (es) |
| AU (1) | AU7870394A (es) |
| BR (1) | BR9407502A (es) |
| CA (1) | CA2170491C (es) |
| CZ (1) | CZ79196A3 (es) |
| DE (1) | DE69434873T2 (es) |
| ES (1) | ES2275265T3 (es) |
| HU (1) | HUT74222A (es) |
| MA (1) | MA23330A1 (es) |
| NO (1) | NO961067L (es) |
| WO (1) | WO1995007991A2 (es) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6436690B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-20 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6440717B1 (en) | 1993-09-15 | 2002-08-27 | The Procter & Gamble Company | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6599730B1 (en) * | 1994-05-02 | 2003-07-29 | Procter & Gamble Company | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| ZA952220B (en) * | 1994-05-02 | 1995-12-14 | Procter & Gamble | Bpn' variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted |
| US6455295B1 (en) | 1995-03-08 | 2002-09-24 | The Procter & Gamble Company | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117350A0 (en) | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Proteinase k variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US6475765B1 (en) | 1995-03-09 | 2002-11-05 | Procter & Gamble Company | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| IL117352A0 (en) * | 1995-03-09 | 1996-07-23 | Procter & Gamble | Thermitase variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |
| US5718895A (en) * | 1995-11-16 | 1998-02-17 | Alcon Laboratories, Inc. | Enzymes with low isoelectric points for use in contact lens cleaning |
| DE19617229A1 (de) * | 1996-04-30 | 1997-11-06 | Basf Ag | Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Ethylenpolymerisaten im Hochdruck |
| US6908757B1 (en) | 1998-03-26 | 2005-06-21 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions |
| US6569663B1 (en) | 1998-03-26 | 2003-05-27 | The Procter & Gamble Company | Serine protease variants having amino acid substitutions |
| US6946128B1 (en) | 1999-07-22 | 2005-09-20 | The Procter & Gamble Company | Protease conjugates having sterically protected epitope regions |
| BR0012660A (pt) | 1999-07-22 | 2002-04-09 | Procter & Gamble | Variante de protease tipo subtilisina; composição de limpeza; e composição de cuidado pessoal |
| MXPA02000842A (es) | 1999-07-22 | 2002-07-30 | Procter & Gamble | Conjugados de proteasa que tienen sitios de corte protegidos estericamente. |
| CN1373802A (zh) | 1999-07-22 | 2002-10-09 | 宝洁公司 | 在特定表位区域具有氨基酸缺失和取代的枯草杆菌蛋白酶变体 |
| BR9917481A (pt) * | 1999-09-09 | 2002-05-21 | Procter & Gamble | Composição detergente contendo uma protease |
| US20050101012A1 (en) | 2001-03-12 | 2005-05-12 | Gerold Schuler | CD4+CD25+ regulatory T cells from human blood |
| DE10153792A1 (de) * | 2001-10-31 | 2003-05-22 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease-Varianten und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neuen Alkalischen Protease-Varianten |
| DE10162727A1 (de) | 2001-12-20 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14391) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| DE10162728A1 (de) | 2001-12-20 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus gibsonii (DSM 14393) und Wasch-und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| EP1321513A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-06-25 | Direvo Biotech AG | Subtilisin variants with improved characteristics |
| DE10163884A1 (de) | 2001-12-22 | 2003-07-10 | Henkel Kgaa | Neue Alkalische Protease aus Bacillus sp. (DSM 14392) und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese neue Alkalische Protease |
| US8222033B2 (en) | 2002-08-12 | 2012-07-17 | Argos Therapeutics, Inc. | CD4+CD25− T cells and Tr1-like regulatory T cells |
| CA2534629C (en) * | 2003-08-06 | 2016-01-19 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Engineered proteases for affinity purification and processing of fusion proteins |
| CA2690055A1 (en) | 2007-06-06 | 2008-12-18 | Danisco Us Inc. | Methods for improving protein performance |
| DE102007044415A1 (de) | 2007-09-17 | 2009-03-19 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Leistungsverbesserte Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel enthaltend diese Proteasen |
| CN102046783A (zh) * | 2008-06-06 | 2011-05-04 | 丹尼斯科美国公司 | 包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法 |
| EP2166076A1 (en) | 2008-09-23 | 2010-03-24 | The Procter & Gamble Company | Cleaning composition |
| RU2560978C2 (ru) * | 2008-11-11 | 2015-08-20 | ДАНИСКО ЮЭс ИНК. | Протеазы, содержащие одну или несколько комбинируемых мутаций |
| WO2013120948A1 (en) * | 2012-02-17 | 2013-08-22 | Novozymes A/S | Subtilisin variants and polynucleotides encoding same |
| EP4525615A2 (en) | 2022-05-14 | 2025-03-26 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4990452A (en) * | 1986-02-12 | 1991-02-05 | Genex Corporation | Combining mutations for stabilization of subtilisin |
| BR9006827A (pt) * | 1989-06-26 | 1991-08-06 | Unilever Nv | Composicoes detergentes enzimaticas |
| EP0563169B2 (en) * | 1990-12-21 | 2006-04-12 | Novozymes A/S | ENZYME MUTANTS HAVING A LOW DEGREE OF VARIATION OF THE MOLECULAR CHARGE OVER A pH RANGE |
-
1994
- 1994-08-31 WO PCT/US1994/010020 patent/WO1995007991A2/en not_active Ceased
- 1994-08-31 CN CN94194071A patent/CN1057123C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-31 AU AU78703/94A patent/AU7870394A/en not_active Abandoned
- 1994-08-31 CZ CZ96791A patent/CZ79196A3/cs unknown
- 1994-08-31 ES ES94929758T patent/ES2275265T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-31 DE DE69434873T patent/DE69434873T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-31 BR BR9407502A patent/BR9407502A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-08-31 EP EP94929758A patent/EP0719339B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-31 HU HU9600667A patent/HUT74222A/hu unknown
- 1994-08-31 CA CA002170491A patent/CA2170491C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-31 AT AT94929758T patent/ATE343636T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-31 JP JP7509233A patent/JPH09502610A/ja active Pending
- 1994-09-15 MA MA23650A patent/MA23330A1/fr unknown
-
1996
- 1996-03-15 NO NO961067A patent/NO961067L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9407502A (pt) | 1997-01-07 |
| EP0719339A1 (en) | 1996-07-03 |
| MA23330A1 (fr) | 1995-04-01 |
| ATE343636T1 (de) | 2006-11-15 |
| WO1995007991A2 (en) | 1995-03-23 |
| DE69434873T2 (de) | 2007-09-06 |
| HU9600667D0 (en) | 1996-05-28 |
| NO961067D0 (no) | 1996-03-15 |
| DE69434873D1 (de) | 2006-12-07 |
| CZ79196A3 (en) | 1996-06-12 |
| WO1995007991A3 (en) | 1995-04-13 |
| CN1057123C (zh) | 2000-10-04 |
| CA2170491C (en) | 2001-10-30 |
| EP0719339B1 (en) | 2006-10-25 |
| HUT74222A (en) | 1996-11-28 |
| CA2170491A1 (en) | 1995-03-23 |
| JPH09502610A (ja) | 1997-03-18 |
| AU7870394A (en) | 1995-04-03 |
| NO961067L (no) | 1996-05-15 |
| CN1134728A (zh) | 1996-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2275265T3 (es) | Variantes de subtilisina bpn con adsorcion reducida e hidrolisis mejorada. | |
| US6599730B1 (en) | Subtilisin 309 variants having decreased adsorption and increased hydrolysis | |
| US6436690B1 (en) | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis wherein one or more loop regions are substituted | |
| US6455295B1 (en) | Subtilisin Carlsberg variants having decreased adsorption and increased hydrolysis | |
| US6451574B1 (en) | Proteinase K variants having decreased adsorption and increased hydrolysis | |
| ES2287931T3 (es) | Composiciones limpiadoras que contienen proteasa. | |
| JPH09512433A (ja) | ズブチリシンｂｐｎ′変異体を含む布帛クリーニング組成物 | |
| US6475765B1 (en) | Subtilisin DY variants having decreased adsorption and increased hydrolysis | |
| WO1996028558A1 (en) | Thermitase variants having decreased adsorption and increased hydrolysis | |
| WO1996028558A9 (en) | Thermitase variants having decreased adsorption and increased hydrolysis | |
| US6440717B1 (en) | BPN′ variants having decreased adsorption and increased hydrolysis |