【発明の詳細な説明】
吸着性が減少して加水分解性が増加したズブチリシンＢＰＮ′変異体
技術分野
本発明は、様々なクリーニング組成物で有用な新規酵素変異体と、このような
酵素変異体についてコードする遺伝子に関する。
背景
酵素は最大類の天然タンパク質を構成している。各類の酵素は通常異なる種類
の化学反応を触媒する（消費されずに反応を促進する）。プロテアーゼとして知
られる酵素の１種は、他のタンパク質を加水分解する（開裂される化学結合のい
ずれかの側における水分子のＨ及びＯＨ部分の取込みで化合物を２以上のより簡
単な化合物に分解する）それらの能力について知られている。タンパク質を加水
分解するこの能力は、洗濯洗剤製品への添加剤として天然タンパク質エンジニア
リング処理プロテアーゼを配合することにより利用されてきた。衣類上の多くの
汚れはタンパク質性であり、広域特異性プロテアーゼはこのような汚れの除去性
を実質上改善することができる。
残念ながら、天然細菌環境下におけるこれらタンパク質の効力レベルは相対的
に非天然の洗浄環境中にしばしば移行していない。特に、熱安定性、ｐＨ安定性
、酸化安定性及び基質特異性のようなプロテアーゼ特徴は、酵素の天然環境外で
の利用上必ずしも最適化されていない。
プロテアーゼのアミノ酸配列がプロテアーゼの特徴を決定する。プロテアーゼ
のアミノ酸配列の変化は、酵素の性質を様々な程度に変えるかもしれないし、あ
るいはアミノ酸配列における変化の位置、性質及び／又は大きさに応じて酵素を
不活化させることさえある。洗浄環境下でプロテアーゼの効力を増加させること
を目標として、それらの性質を改善する試みに際し、プロテアーゼの野生型アミ
ノ酸配列を変えるいくつかのアプローチが行われてきた。これらのアプローチで
は、全く多様な条件下で熱安定性を高めて酸化安定性を改善するために、アミノ
酸配列を変えることがある。
当業界で記載された様々なアプローチにもかかわらず、様々な表面をクリーニ
ングする上で有用なプロテアーゼの新たに有効な変異体に関する必要性が継続し
ている。
本発明の目的
本発明の目的は、野生型の酵素と比較して改善された加水分解性を有するズブ
チリシン酵素変異体を提供することである。
これらのズブチリシン酵素変異体を含んでなるクリーニング組成物を提供する
ことも本発明の目的である。
要旨
本発明は、具体的な特定の位置で野生型ズブチリシンＢＰＮ′に存在する場合
とは異なるアミノ酸（即ち、置換）を有した少くとも１、２又は３つのアミノ酸
位置を含んでなるズブチリシンＢＰＮ′変異体に関し、それによりＢＰＮ′変異
体は野生型ズブチリシンＢＰＮ′と比較して不溶性基質に対する低い吸着性と高
い加水分解性を有している。本発明はこのようなズブチリシンＢＰＮ′変異体に
ついてコードする遺伝子にも関する。本発明は様々な表面をクリーニングする上
でこのようなズブチリシンＢＰＮ′変異体を含んでなる組成物にも関する。
説明
Ｉ．ズブチリシン変異体
本発明は、酵素についてコードする様々なヌクレオチド配列を変異させること
で酵素のアミノ酸配列を修正することにより修正されたズブチリシン酵素、特に
ＢＰＮ′に関する。本発明の修正ズブチリシン酵素(以下、“ＢＰＮ′変異体”)
は、野生型ズブチリシンと比較して、不溶性基質に対する低い吸着性と高い加水
分解性を有している。本発明はこのようなＢＰＮ′変異体についてコードする変
異遺伝子にも関する。
本発明のズブチリシン酵素は、プロテアーゼとして知られる酵素の１種に属す
る。プロテアーゼはペプチド結合の開裂用の触媒である。１タイプのプロテアー
ゼはセリンプロテアーゼである。セリンプロテアーゼは、活性部位に必須セリン
残基があるという事実により識別される。
可溶性基質の酵素加水分解速度が酵素濃度に応じて増加するという観察は、詳
しく文献に記載されている。したがって、多くのクリーニング適用例で遭遇する
ような表面結合基質にとり、加水分解の速度は表面濃度の増加に従い増加するこ
とはもっともらしい。これは事例として示された（Brode,P.F.III 及びD.S.Rauc
h,LANGMUIR,″Subtilisin BPN′: Activity on an Immobilized Substrate″（
ズブチリシンＢＰＮ′：固定基質上の活性）,Vol.8,pp.1325-1329(1992)）。実
際に、表面濃度に対する速度の直線的依存性は、酵素の表面濃度が変えられたと
きに不溶性基質でみられた（Rubingh,D.N.及びM.D.Bauer,″Catalysis of Hydro
lysis by Proteases at the Protein-Solution Interface″（タンパク質-溶液
界面でプロテアーゼによる加水分解の触媒作用）,in POLYMER SOLUTIONS,BLENDS
AND INTERFACES,Ed.by I.Noda及びD.N.Rubingh,Elsevier,p.464(1992)）。意外
にも、より良いクリーニング性能を与える変異プロテアーゼに関するサーチでこ
の原理を適用しようとしたとき、我々は多く吸着する酵素ほど良い性能を与える
ということを見い出せなかった。実際に、我々は意外にも、基質への酵素による
吸着性が減少すると基質の加水分解性が増加する（クリーニング性能が良くなる
）という、それとは反対の事例であることを決定した。
理論に拘束されないと、ある変異体を他と比較したときに改善された性能は、
少なく吸着する酵素ほど強く結合されず、したがって不溶性タンパク質基質が除
去されるべき表面上においてより高度に移動性であるという事実の結果であると
考えられる。匹敵する酵素溶液濃度のとき、この増加した移動性はより高濃度の
酵素を表面にデリバリーすることで付与されるいかなる利点をも越える上で十分
である。
本明細書で記載された変異は、表面結合汚れへの酵素の吸着性を変える（即ち
、減少させる）ようにデザインされている。ＢＰＮ′において、２００〜２２０
位のアミノ酸は酵素分子上で大きな外部ループを形成している。このループは表
面結合ペプチドへの酵素分子の吸着上有意な役割を果たして、このループにおけ
る特異的変異はこの吸着上有意の効果を有することが発見された。理論に拘束さ
れないと、このループは少くとも２つの理由からＢＰＮ′分子の吸着にとり重要
であると考えられる。第一に、この外部ループを含んだアミノ酸は分子が暴露さ
れるいかなる表面とも密に接触することができる。第二に、ＢＰＮ′分子の活性
部位及び結合ポケットに対してこのループの近位部分は、表面結合基質（ペプチ
ド／タンパク質汚れ）への酵素の触媒生産性吸着に際して役割を有する。
本明細書で用いられる“変異体”とは、野生型の場合とは異なるアミノ酸配列
を有した酵素を意味する。
本明細書で用いられる“変異ＢＰＮ′遺伝子”とは、ＢＰＮ′変異体について
コードする遺伝子を意味する。
本明細書で用いられる“野生型ズブチリシンＢＰＮ′”とは、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１で表されるズブチリシン酵素に関する。ズブチリシンＢＰＮ′のアミノ
酸配列はWells,J.A.,E.Ferrari,D.J.Henner,D.A.Estell及びE.Y.Chen,NUCLEIC
ACIDS RESEARCH,Vol.11,7911-7925(1983)で更に記載されており、これは参考の
ため本明細書に組み込まれる。
本明細書で用いられる“野生型アミノ酸配列”という用語は、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１と、１９９〜２２０位以外のアミノ酸配列に修正を有するＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１とを包含している。
本明細書で用いられる“より親水性のアミノ酸”とは、下記の親水性の表に関
して対象アミノ酸よりも大きな親水性を有するあらゆる他のアミノ酸に関する。
下記の親水性の表（表１）は親水性増加順として下位の方からアミノ酸を掲載し
ている（Hopp,T.P．及びWoods,K.R.,″Prediction of Protein Antigenic Deter
minants from Amino Acid Sequences″（アミノ酸配列からのタンパク質抗原決
定基の予想），PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE USA,Vol.78,
pp.3824-3828，1981 参照;参考のため本明細書に組み込まれる）。
表１はどのアミノ酸が電荷を有するかについても示している（この特徴は約８
〜９のｐＨに基づいている）。正荷電アミノ酸はＡｒｇ及びＬｙｓであり、負荷
電アミノ酸はＧｌｕ及びＡｓｐであり、残りのアミノ酸は中性である。本発明の
好ましい態様において、置換アミノ酸は中性又は負荷電であり、更に好ましくは
負荷電（即ち、Ｇｌｕ又はＡｓｐ）である。
したがって、例えば、“中性であるか又は負電荷を有する同等又はより親水性
のアミノ酸でＧｌｎを置換する”という表現は、ＧｌｎがＡｓｎ（Ｇｌｎと同親
水性である）あるいはＳｅｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐ（Ｇｌｎより親水性である）で
置換されることを意味する；それら各々は中性であるか又は負電荷を有して、Ｇ
ｌｎと比較して大きな親水価を有している。同様に、“中性であるか又は負電荷
を有するより親水性のアミノ酸でＰｒｏを置換する”という表現は、ＰｒｏがＧ
ｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ又はＡｓｐで置換されることを意味する。
Ａ．少くとも１つのアミノ酸置換を含んだ変異体
本発明の１つの態様において、ＢＰＮ′変異体は、野生型アミノ酸配列が１９
９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０
８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１
８、２１９又は２２０位のうち１以上で置換された野生型アミノ酸配列を含んで
なる；それによりＢＰＮ′変異体は、野生型ズブチリシンＢＰＮ′と比較して、
不溶性基質に対する低い吸着性と高い加水分解性を有している。好ましくは、置
換アミノ酸を有する位置は１９９、２００、２０１、２０２、２０５、２０７、
２０８、２０９、２１０、２１１、２１２又は２１５、更に好ましくは２００、
２０１、２０２、２０５又は２０７である。
好ましくは、１９９位用の置換アミノ酸はＣｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２００位用の置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０１位用の置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０２位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０３位用の置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、
Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０４位用の置換アミノ酸はＧｌｕである。
好ましくは、２０５位用の置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、
Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ
である。
好ましくは、２０６位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ａｓｎ又はＳｅｒである。
好ましくは、２０７位用の置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０８位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０９位用の置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、
Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２１０位用の置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１１位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ，Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１２位用の置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ
である。
好ましくは、２１３位用の置換アミノ酸はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、
Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、
Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１４位用の置換アミノ酸はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２１５位用の置換アミノ酸はＴｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１６位用の置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１８位用の置換アミノ酸はＧｌｕである。
好ましくは、２１９位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２２０位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
更に好ましくは、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０７
、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６
、２１９及び２２０位のいずれに関する置換アミノ酸も表１が参照され、中性又
は負荷電であり、野生型ズブチリシンＢＰＮ′の対象位置にあるアミノ酸と等し
いか又はそれより親水性、好ましくはより親水性である。
更に一層好ましくは、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２
０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２
１６、２１９及び２２０位のいずれに関する置換アミノ酸もＡｓｐ又はＧｌｕで
あり、２０４又は２１８用の置換アミノ酸はＧｌｕである。
Ｂ．少くとも２つのアミノ酸置換を含んだ変異体
本発明のもう１つの態様において、ＢＰＮ′変異体は、野生型アミノ酸配列が
１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、
２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、
２１７、２１８、２１９又は２２０位のうち２以上で置換された野生型アミノ酸
配列を含んでなる；それによりＢＰＮ′変異体は、野生型ズブチリシンＢＰＮ′
と比較して、不溶性基質に対する低い吸着性と高い加水分解性を有している。好
ましくは、置換アミノ酸を有する位置は１９９、２００、２０１、２０２、２０
５、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２又は２１５、更に好まし
くは２００、２０１、２０２、２０５又は２０７である。
好ましくは、１９９位用の置換アミノ酸はＣｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２００位用の置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０１位用の置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０２位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０３位用の置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、
Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０４位用の置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０５位用の置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、
Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２０６位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２０７位用の置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０８位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０９位用の置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、
Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２１０位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１１位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１２位用の置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ
である。
好ましくは、２１３位用の置換アミノ酸はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、
Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１４位用の置換アミノ酸はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１５位用の置換アミノ酸はＴｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１６位用の置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１７位用の置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、
Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１８位用の置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ
である。
好ましくは、２１９位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２２０位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
更に好ましくは、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５
、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４
、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９又は２２０位のいずれに関する置換
アミノ酸も表１が参照され、中性又は負荷電であり、野生型ズブチリシンＢＰＮ
′の対象位置にあるアミノ酸と等しいか又はそれより親水性、好ましくはより親
水性である。
更に一層好ましくは、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２
０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２
１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９又は２２０位のいずれに関する
置換アミノ酸もＡｓｐ及びＧｌｕである。
Ｃ．少くとも３つのアミノ酸置換を含んだ変異体
本発明のもう１つの態様において、ＢＰＮ′変異体は、野生型アミノ酸配列が
１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、
２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、
２１７、２１８、２１９及び２２０位のうち３以上で置換された野生型アミノ酸
配列を含んでなる；それによりＢＰＮ′変異体は、野生型ズブチリシンＢＰＮ′
と比較して、不溶性基質に対する低い吸着性と高い加水分解性を有している。好
ましくは、置換アミノ酸を有する位置は１９９、２００、２０１、２０２、２０
５、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２又は２１５、更に好まし
くは２００、２０１、２０２、２０５又は２０７である。
好ましくは、１９９位用の置換アミノ酸はＣｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、
Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２００位用の置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０１位用の置換アミノ酸はＧｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０２位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０３位用の置換アミノ酸はＭｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、
Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０４位用の置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕからなる群より選
択される。
好ましくは、２０５位用の置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、
Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２０６位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２０７位用の置換アミノ酸はＡｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０８位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２０９位用の置換アミノ酸はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、
Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又
はＧｌｕである。
好ましくは、２１０位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１１位用の置換アミノ酸はＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１２位用の置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ
である。
好ましくは、２１３位用の置換アミノ酸はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、
Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１４位用の置換アミノ酸はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、
Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１５位用の置換アミノ酸はＴｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１６位用の置換アミノ酸はＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１７位用の置換アミノ酸はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、
Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２１８位用の置換アミノ酸はＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕ
である。
好ましくは、２１９位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、
Ａｓｐ又はＧｌｕである。
好ましくは、２２０位用の置換アミノ酸はＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、
Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＧｌｕである。
更に好ましくは、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６
、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５
、２１６、２１７、２１８、２１９又は２２０位のいずれに関する置換アミノ酸
も表１が参照され、中性又は負荷電であり、野生型ズブチリシンＢＰＮ′の対象
位
置にあるアミノ酸と等しいか又はそれより親水性、好ましくはより親水性である
。
更に一層好ましくは、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２
０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２
１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９又は２２０位のいずれに関する
置換アミノ酸もＡｓｐ又はＧｌｕである。
Ｄ．酵素変異体の製造
例１
変異ＢＰＮ′遺伝子
野生型ズブチリシンＢＰＮ′遺伝子を含んだファージミド（ｐＳＳ‐５）（Mi
tchinson,C．及びJ.A.Wells,(1989),″Protein Engineering of Disulfide Bond
s in Subtilisin BPN′″(ズブチリシンＢＰＮ′におけるジスルフィド結合のタ
ンパク質エンジニアリング),BIOCHEMISTRY,Vol.28,pp.4807-4815）を大腸菌ｕｎ
ｇ株ＣＪ２３６中に組み込んで形質転換させ、一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ鋳型は
ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Kunkel,T.A.,J.D.Roberts 及びR.A.Zakour,″R
apid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selectio
n″(表現型選択のない迅速で効率的な部位特異性変異誘発),METHODS IN ENZYMOL
OGY,Vol.154,pp.367-382(1987)；Yuckenberg,P.D.,F.Witney,J.Geisselsoder
及びJ.McClary,″Site-directed in vitro mutagenesis using uracil-containi
ng DNA and phagemid vectors″(ウラシル含有ＤＮＡ及びファージミドベクター
を用いた部位特異性インビトロ変異誘発),DIRECTED MUTAGENESIS - A PRACTICAL
APPROACH,ed.M.J.McPherson,pp.27-48(1991)により修正された；双方とも参考
のため本明細書に組み込まれる）を用いて作製する。Zoller及びSmith の方法（
Zoller,M.J．及びM.Smith,″Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13
-derived vectors: an efficient and general procedure for the production
of point mutations in any fragment
of DNA″(Ｍ１３由来ベクターを用いたオリゴヌクレオチド特異性変異誘発：Ｄ
ＮＡの断片における点変異の作成に関して効率的で一般的な操作),NUCLEIC ACID
S RESEARCH,Vol.10,pp.6487-6500(1982)；参考のため本明細書に組み込まれる）
の単一プライマー部位特定変異誘発修正法を用いて、すべての変異体を作製する
（基本的に、前掲のYuckenbergら,1991 で表されたとおり）。オリゴヌクレオチ
ドはアプライド・バイオシステム社（Applied Biosystem Inc.）３８０Ｂ ＤＮ
Ａシンセサイザーを用いて作る。変異誘発反応産物を大腸菌株ＭＭ２９４〔アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collecti
on）大腸菌３３６２５〕に組み込んで形質転換させる。すべての変異体をＤＮＡ
配列決定により確認し、単離されたＤＮＡを枯草菌発現株ＢＧ２０３６（Yang,M
.Y.,E.Ferrari 及びD.J.Henner，(1984),″Cloning of the Neutral Protease G
ene of Bacillus subtillis and the Use of the Cloned Gene to Create an In
Vitro-derived Deletion Mutation″(枯草菌の中性プロテアーゼ遺伝子のクロ
ーニングと、インビトロ由来欠失変異を作る上でクローン化遺伝子の使用),JOUR
NAL OF BACTERIOLOGY,Vol.160,pp.15-21)に組み込んで形質転換させる。一部の
変異体では、２１７位アミノ酸にフレームシフト停止コドン変異がある修正ｐＳ
Ｓ‐５を用いて、ウラシル鋳型を作製する。オリゴヌクレオチドは２１７位で適
正なリーディングフレームを復元するようにデザインし、１９９、２００、２０
１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１
０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１
９及び２２０位のランダム置換についてもコードさせる（これらのコドンにおい
て３つすべての塩基に関する全部で４つのヌクレオチドの等モル及び／又は可変
混合物）。フレームシフト停止を訂正して機能性酵素を産生する変異は、カゼイ
ンを消化するそれらの能力により同定する。ランダム置換はＤＮＡ配列決定より
調べる。
例２
発酵
関心あるズブチリシン変異体を含んだ枯草菌細胞（ＢＥ２０３６）をＬＢ‐グ
ルコースブロスの１ｌ培養物中で中間対数期まで増殖させ、全容量１０ｌのバイ
オスタット(Biostat)ＥＤ醗酵槽〔Ｂ．ブラウン・バイオテック社(B.Braun Biot
ech,Inc.),Allentown,Pennsylvania 〕中に接種する。発酵培地は酵母エキス、
デンプン、消泡剤、緩衝剤及び微量ミネラルを含有している（FERMENTATION：A
PRACTICAL APPROACH,Ed.B.McNeil及びL.M.Harvey,1990 参照）。ブロスを発酵ラ
ン中に７．０の一定ｐＨに保つ。クロラムフェニコールを変異誘発プラスミドの
抗生物質選択用に加える。細胞をＡ600約６０まで３７℃で一夜増殖させて、回
収する。
例３
精製
発酵ブロスは純粋酵素を得るために下記ステップで用いる。ブロスから遠心に
より枯草菌細胞を除き、１００Ｋカットオフ膜で細かな粒子を除去することによ
り清澄化する。この後１０Ｋカットオフ膜で遠心し、フロー透析してイオン強度
を減少させ、０．０２５Ｍ ＭＥＳ緩衝剤（２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスル
ホン酸）を用いてＰＨを５．５に調整する。酵素はそれを陽イオン交換クロマト
グラフィーカラム又はアフィニティ吸着クロマトグラフィーカラムにいれて、そ
れをＮａＣｌ又はプロピレングリコール勾配でカラムから溶出させることにより
更に精製する（Scopes,R.K.,PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE,S
pringer-Verlag,New York(1984)参照；参考のため本明細書に組み込まれる）。
ｐＮＡアッセイ（DelMar,E.G.,C.Largman,J.W.Brodrick及びM.C.Geokas,ANAL.
BIOCHEM.,Vol.99,pp.316-320(1979)；参考のため本明細書に組み込まれる）を用
いて、勾配溶出中に集められた分画について活性酵素濃度を調べる。このアッセ
では、酵素が可溶性合成基質サクシニル‐アラニン‐アラニン‐プロリン‐フェ
ニルアラニン‐ｐ‐ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ）を加水分解するにつ
れてｐ‐ニトロアニリンが放出される速度を測定する。加水分解反応による黄色
の発生速度を分光光度計において４１０ｎｍで測定するが、これは活性酵素濃度
と比例している。加えて、２８０ｎｍの吸光度測定も全タンパク質濃度を調べる
ために行う。活性酵素／全タンパク質比は酵素純度を示し、ストック溶液として
プールされる分画を確認するために用いる。
貯蔵中に酵素の自己分解を避けるため、等重量のプロピレングリコールをクロ
マトグラフィーカラムから得られたプールされる分画に加える。精製操作の終了
後、ストック酵素溶液の純度をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリ
アクリルアミドゲル電気泳動）でチェックし、絶対酵素濃度をトリプシンインヒ
ビタータイプII‐Ｔ：シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Company)（St.Louis
,Missouri）から購入した七面鳥卵白を用いて活性部位滴定法により調べる。測
定された変換ファクターは、酵素分子の様々な位置で起きるどの変化が可溶性基
質ｐＮＡに対して野生型よりも増加した活性を有する酵素変異体を生じるのかに
ついて示す。
使用向け製造に際して、酵素ストック溶液は、プロピレングリコールを除去し
て緩衝剤を交換するために、セファデックス‐Ｇ２５〔ファルマシア(Pharmacia
)，Piscataway,New Jersey〕サイズ排除カラムで溶出させる。酵素ストック溶液
中のＭＥＳ緩衝剤は、０．０１Ｍ ＣａＣｌ2を含有してＨＣｌで８．６にｐＨ
調整された０．１Ｍトリス緩衝剤（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））
と交換する。すべての実験は２５℃に恒温されたトリス緩衝液中ｐＨ８．６で行
う。
Ｅ．酵素変異体の特徴付け
例４
モデル表面作製
ＣＰＧ社（Fairfield,New Jersey）から購入したアミノプロピル制御多孔質ガ
ラス（ＣＰＧ）を、ビーチャム社（Bachem,Inc.）（Torrence,California）から
購入したｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ基質を共有結合させるための支持体として用いる。
反応はジメチルスルホキシド中で行い、１‐エチル‐３‐〔３‐（ジメチルアミ
ノ）プロピル〕カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）をカップリング剤として用いる
。終了時（ｐＮＡアッセイでモニターする）、過剰溶媒を除去し、ＣＰＧ：ｓＡ
ＡＰＦ‐ｐＮＡをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び二重蒸留水ですすぐ。
この後、約７０℃でＮ2パージしながらオーブン乾燥させる。固定基質の反応ス
キーム及び製造はBrode,P.F.III 及びD.S.Rauch,″Subtilisin BPN′：Activity
on an Immobilized Substrate″,LANGMUIR,Vol.8,p.1325-1329(1992)で記載さ
れたように行うが、その開示は参考のため本明細書に組み込まれる。
ＣＰＧ表面は６２，０００±７０００ｐＮＡ分子／μｍ2を有する。表面積は
受け取ったＣＰＧに関してＣＰＧ社により報告された５０．０ｍ2／ｇの値から
変わっていない。これはｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡをＣＰＧに加えるために用いた操作
が多孔質構造にダメージを与えないことを示唆している（平均径Åである）。
例５
表面加水分解アッセイ
ＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡを用いると、酵素変異体の吸着とＣＰＧ結合ペプ
チドの加水分解が単一実験で測定できる。少量の酵素変異体ストック溶液を脱気
されたトリス緩衝液及びＣＰＧ：ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡ含有のフラスコに加える。
フラスコを９０分間にわたりリスト式シェーカー上で振盪させ、その間にシェー
カーを様々な時間間隔で停止させる（例えば、吸着加水分解の初期段階では２分
毎に‐例えば最初の２０分間‐実験の最後では１０分毎に）。ＣＰＧ：ｓＡＡＰ
Ｆ‐ｐＮＡを静置して、溶液をサンプリングする。実験操作と吸着及び加水分解
の計算はいずれも前掲のBrode ら,1992 で記載されたようにして行う。
すべての酵素は自己分解に対する安定性についてモニターされ、この実験の経
過中に明らかな自己分解喪失を示さない。したがって、酵素吸着は溶液からの減
少分を測定することにより調べることができる。初期酵素変異体濃度と個々の各
時点に測定された濃度との差異が、吸着された酵素変異体の量を表す。表面から
加水分解されたｐＮＡの量は、４１０ｎｍでサンプルの一部について吸光度読取
りを行うことにより測定する。加水分解されたｐＮＡの全量は、サンプリングさ
れた量及びフラスコに残存する量を加えることにより計算する。この値は、酵素
が存在しないときｐＨ８．６でトリス緩衝液により加水分解されたｐＮＡの量を
差引くことにより補正する。この塩基加水分解は、酵素の効力に応じて、全加水
分解の７〜２９％である。
例６
可溶性基質速度論的分析
可溶性基質ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡの加水分解速度は、ＤＵ‐７０分光光度計にお
いて４１０ｎｍで時間の関数として吸光度増加を測定することによりモニターす
る。酵素濃度は一定に保ち、６〜１０ナノモルの範囲内にあるように調整するが
、基質濃度は速度論的測定毎に９０〜７００μＭ ｓＡＡＰＦ‐ｐＮＡと様々で
ある。吸光度データポイントは９００秒間にわたり毎秒測り、データをロータス
(LOTUSTM)スプレッドシート〔ロータス・デベロップメント社(Lotus Developmen
t Corporation),Cambridge,Massachusetts〕に移す。速度論的パラメーターの分
析は標準ラインウィーバー・バーク(Lineweaver Burk)分析により行い、その場
合にランの初期部分（通常、最初の１分間）のデータを直線
的回帰曲線に合わせて、ｖOを求める。ｖO及びｓOデータを標準逆関数式にプロ
ットして、ＫM及びｋcatを求める。
Ｆ．例ＢＰＮ′変異体
表面結合基質に対して減少した吸着性と増加した加水分解性を有する本発明の
ＢＰＮ′変異体は、下記表２で例示されている。特異的変異を表す上で、野生型
に存在する本来のアミノ酸が最初に、位置番号が第二に、置換アミノ酸が第三に
示されている。
II．クリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、本発明の１種以上の酵素変異体の有効量が
タンパク質汚れ除去の必要な様々な表面をクリーニングする上で有用な組成物中
に含有される。このようなクリーニング組成物には、形態上制限されない（例え
ば、液体及び顆粒）、硬質表面をクリーニングするための洗剤組成物；形態上制
限されない（例えば、顆粒、液体及び固形処方）、布帛をクリーニングするため
の洗剤組成物；皿洗い組成物（形態上制限されない）；形態上制限されない（例
えば、歯磨剤、練歯磨剤及び洗口液処方）オーラルクリーニング組成物；形態上
制限されない（例えば、液体、錠剤）義歯クリーニング組成物；形態上制限され
ない（例えば、液体、錠剤）コンタクトレンズクリーニング組成物がある。本明
細書で記載される“酵素変異体の有効量”とは、特定のクリーニング組成物で必
要な酵素活性を出すために必要な酵素変異体の量に関する。このような有効量は
当業者により容易に確認でき、用いられる具体的酵素変異体、クリーニング適用
例、クリーニング組成物の具体的組成と、液体又は乾燥（例えば、顆粒、固形）
組成物が必要かどうか等のような多くのファクターに基づいている。好ましくは
、本発明のクリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を約０．０００
１〜約１０％、更に好ましくは約０．００１〜約１％、更に一層好ましくは約０
．０１〜約０．１％含有する。本発明の酵素変異体が用いられた様々なクリーニ
ング組成物のいくつかの例が、以下で更に詳細に記載されている。そこで用いら
れるすべての部、パーセンテージ及び比率は、他で指摘されないかぎり、重量に
よる。
本明細書で用いられる“非布帛クリーニング組成物”には、硬質表面クリーニ
ング組成物、皿洗い組成物、オーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組
成物及びコンタクトレンズクリーニング組成物がある。
Ａ．硬質表面、皿及び布帛用のクリーニング組成物
本発明の酵素は、高い起泡性及び良好な不溶性基質除去性が望まれるあらゆる
洗剤組成物で用いることができる。このため、本発明の酵素変異体は、完全に処
方された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、布帛洗濯組成物等を提供するため
に、様々な慣用成分と共に用いることができる。このような組成物は液体、顆粒
、固形物等の形をとることができる。このような組成物は３０〜６０重量％もの
界面活性剤を含有した最新の“濃縮”洗剤として処方してもよい。
本発明のクリーニング組成物は、場合により、好ましくは、様々なアニオン系
、ノニオン系、双極性等の界面活性剤を含有することができる。このような界面
活性剤は、典型的には組成物の約５〜約３５％のレベルで存在する。
本発明で有用な界面活性剤の非制限例には、慣用的なＣ11‐Ｃ18アルキルベン
ゼンスルホネートと一級及びランダムアルキルサルフェート、式ＣＨ3（ＣＨ2）x
（ＣＨＯＳＯ3-Ｍ+）ＣＨ3及びＣＨ3（ＣＨ2）y(ＣＨＯＳＯ3 -Ｍ+)ＣＨ2ＣＨ3
のＣ10‐Ｃ18二級（２，３）アルキルサルフェート（式中ｘ及び（ｙ＋１）は少
くとも約７、好ましくは少くとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特に
ナトリウムである）、Ｃ10‐Ｃ18アルキルアルコキシサルフェート（特に、ＥＯ
１〜５エトキシサルフェート）、Ｃ10‐Ｃ18アルキルアルコキシカルボキシレー
ト（特に、ＥＯ１〜５エトキシカルボキシレート）、Ｃ10‐Ｃ18アルキルポリグ
リコシド及びそれらの対応サルフェート化ポリグリコシド、Ｃ12‐Ｃ18α‐スル
ホネート化脂肪酸エステル、Ｃ12‐Ｃ18アルキル及びアルキルフェノールアルコ
キシレート（特に、エトキシレート及び混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ12‐Ｃ18
ベタイン及びスルホベタイン（“スルタイン”）、Ｃ10‐Ｃ18アミンオキシド
等がある。アルキルアルコキシサルフェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシ
カルボキシレート（ＡＥＣ）が本発明では好ましい（前記アミンオキシド及び／
又はベタイン又はスルタイン界面活性剤
とこのような界面活性剤との併用も、処方者の希望に応じて好ましい）。他の慣
用的で有用な界面活性剤は標準テキストに掲載されている。特に有用な界面活性
剤には１９９３年３月１６日付で発行されたConnorらの米国特許第５，１９４，
６３９号明細書で開示されたＣ10‐Ｃ18Ｎ‐メチルグルカミドがあり、その開示
は参考のため本明細書に組み込まれる。
他の活性成分、キャリヤ、ヒドロトロピー剤、加工助剤、色素又は顔料、液体
処方用溶媒等を含めて、洗剤クリーニング組成物で有用な様々な他の成分を本発
明の組成物に含有させることができる。起泡性の一層の増加が望まれるならば、
Ｃ10‐Ｃ16アルコールアミドのような起泡増進剤が典型的には約１〜約１０％レ
ベルで組成物中に配合できる。Ｃ10‐Ｃ14モノエタノール及びジエタノールアミ
ドがこのような起泡増進剤の典型的種類である。このような起泡増進剤と前記の
アミンオキシド、ベタイン及びスルタインのような高起泡性補助界面活性剤との
併用も有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4等のような可溶性マグ
ネシウム塩が、起泡性を追加するために、典型的には約０．１〜約２％のレベル
で添加できる。
本発明の液体洗剤組成物は、キャリヤとして水及び他の溶媒を含有することが
できる。メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールで例示さ
れる低分子量一級又は二級アルコールが適切である。一価アルコールが界面活性
剤を溶解させる上で好ましいが、約２〜約６の炭素原子と約２〜約６のヒドロキ
シ基を含んだもののようなポリオール（例えば、１，３‐プロパンジオール、エ
チレングリコール、グリセリン及び１，２‐プロパンジオール）も使用できる。
組成物はこのようなキャリヤを約５〜約９０％、典型的には約１０〜約５０％含
有する。
本発明の洗剤組成物は、水性クリーニング操作で使用中に、洗浄水が約６．８
〜約１１．０のｐＨを有するように処方されることが好ましい。このため、最終
製品は典型的にはこの範囲で処方される。推奨される使用量レベルでｐＨをコン
トロールするための技術には緩衝剤、アルカリ、酸等の使用があり、これは当業
者に周知である。
本発明の硬質表面クリーニング組成物及び布帛クリーニング組成物を処方する
場合、処方者は約５〜約５０重量％のレベルで様々なビルダーを用いたいと思う
かもしれない。典型的ビルダーには１〜１０ミクロンゼオライト、ポリカルボキ
シレート、例えばシトレート及びオキシジサクシネート、積層シリケート、ホス
フェート等がある。他の慣用的ビルダーは標準処方集に掲載されている。
同様に、処方者はこのような組成物中にセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及
びプロテアーゼのような様々な追加酵素を、典型的には約０．００１〜約１重量
％のレベルで用いたいと思うかもしれない。様々な洗浄及び布帛ケア酵素が洗濯
洗剤業界で周知である。
ペルカーボネート、ペルボレート等のような様々な漂白化合物が、典型的には
約１〜約１５重量％のレベルでこのような組成物中で使用できる。所望であれば
、このような組成物はテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベン
ゼンスルホネート等のようなブリーチ活性剤も含有することができ、これらも当
業界で知られている。使用量レベルは、典型的には約１〜約１０重量％の範囲で
ある。
様々な汚れ放出剤、特にアニオン系オリゴエステルタイプ、様々なキレート化
剤、特にアミノホスホネート及びエチレンジアミンジサクシネート、様々な土汚
れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、様々な分散剤、特にポ
リアクリレート及びポリアルパラテート、様々な増白剤、特にアニオン系増白剤
、様々な起泡抑制剤、特にシリコーン及び二級アルコール、様々な布帛柔軟剤、
特にスメクタイトクレー等はすべて約１〜約３５重量％範囲のレベルでこのよう
な組成物に使用できる。標準処方集と公開された特許明細書では、このような慣
用
物質の多数の詳細な記載を含んでいる。
酵素安定剤も本発明のクリーニング組成物で用いてよい。このような酵素安定
剤にはプロピレングリコール（好ましくは、約１〜約１０％）、ギ酸ナトリウム
（好ましくは、約０．１〜約１％）及びギ酸カルシウム（好ましくは、約０．１
〜約１％）がある。
１．硬質表面クリーニング組成物
本明細書で用いられる“硬質表面クリーニング組成物”とは、床、壁、浴室タ
イル等のような硬質表面をクリーニングための液体及び顆粒洗剤組成物に関する
。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有
効量で、好ましくは組成物の活性酵素の約０．００１〜約１０重量％、更に好ま
しくは約０．０１〜約５％、更に一層好ましくは約０．０５〜約１％で含有する
。本発明の１種以上の酵素変異体を含有することに加えて、このような硬質表面
クリーニング組成物は典型的には界面活性剤と水溶性金属イオン封鎖ビルダーを
含有する。しかしながら、スプレーウィンドークリーナーのようなある特殊製品
では界面活性剤が時々用いられないが、その理由はそれらがガラス表面で薄膜状
／すじ状残留物を形成することがあるためである。
界面活性剤成分は存在するとき本組成物の０．１％程の少量でもよいが、典型
的には組成物は約０．２５〜約１０％、更に好ましくは約１〜約５％の界面活性
剤を含有する。
典型的には、組成物は約０．５〜約５０％、好ましくは約１〜約１０％の洗浄
ビルダーを含有する。
好ましくは、ｐＨは約８〜１２の範囲にあるべきである。水酸化ナトリウム、
炭酸ナトリウム又は塩酸のような慣用的ｐＨ調整剤が、調整が必要ならば使用で
きる。
溶媒も組成物に含有させてよい。有用な溶媒にはグリコールエーテル、例えば
ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチル
エーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘ
キシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリ
コールモノブチルエーテルと、ジオール、例えば２，２，４‐トリメチル‐１，
３‐ペンタンジオール及び２‐エチル‐１，３‐ヘキサンジオールがあるが、そ
れらに限定されない。用いられる場合、このような溶媒は典型的には約０．５〜
約１５％、好ましくは約３〜約１１％のレベルで存在する。
加えて、イソプロパノール又はエタノールのような高揮発性溶媒は、表面への
組成物の“フルストレンクス”適用後に表面が洗い流されるとき、表面から組成
物の速い蒸発を促進するために、本組成物で用いることができる。用いられる場
合、揮発性溶媒は典型的には組成物中に約２〜約１２％のレベルで存在する。
本発明の硬質表面クリーニング組成物態様は、下記例で説明される。
例７〜１２
例７〜１０において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＬｙｓ２１３Ｇ
ｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例１１〜１２において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＬｙｓ２１３Ｇｌｕ及びＩｌｅ２０５Ｌｅｕ＋Ａｌａ２１６Ａｓｐの代わり
に用いられても、実質上同様の結果である。
例１３〜１８
例１３〜１６において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＬｙｓ２１３
Ｇｌｕ＋Ｔｙｒ２１７Ｌｅｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
例１７〜１８において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＬｙｓ２１３Ｇｌｕ＋Ｔｙｒ２１７Ｌｅｕ及びＡｌａ２１６Ｇｌｕの代わり
に用いられても、実質上同様の結果である。
２．皿洗い組成物
本発明のもう１つの態様において、皿洗い組成物は本発明の１種以上の酵素変
異体を含有している。本明細書で用いられる“皿洗い組成物”とは、限定されな
いが顆粒及び液体形を含めて、皿をクリーニングするためのすべての形態の組成
物に関する。本発明の皿洗い組成物態様は下記例で説明される。
例１９〜２４
例１９〜２２において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＧｌｎ２０６
Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ２１１Ａｌａ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕの代わりに用いられても、実
質上同様の結果である。
例２３〜２４において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＧｌｎ２０６Ｐｒｏ＋Ｇｌｙ２１１Ａｌａ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕ及びＩｌｅ
２０５Ｌｅｕ＋Ａｌａ２１６Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果
である。
３．布帛クリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、布帛クリーニング組成物は本発明の１種以
上の酵素変異体を含有している。本明細書で用いられる“布帛クリーニング組成
物”とは、限定されないが顆粒、液体及び固形を含めて、布帛をクリーニングす
るためのすべての形態の洗剤組成物に関する。
ａ．顆粒布帛クリーニング組成物
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有
効量で、好ましくは組成物の活性酵素の約０．００１〜約１０重量％、更に好ま
しくは約０．００５〜約５％、更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。
１種以上の酵素変異体に加えて、顆粒布帛クリーニング組成物は典型的には少く
とも１種の界面活性剤、１種以上のビルダーと、一部の場合には漂白剤を含有す
る。
本発明の顆粒布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
例２５〜２８
例２５〜２６において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＡｌａ２１６
Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例２７〜２８において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＡｌａ２１６Ａｓｐ及びＡｌａ２１６Ｇｌｙの代わりに用いられても、実質
上同様の結果である。
例２９〜３２
例２９〜３０において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＬｙｓ２１３
Ｇｌｕ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕ＋Ｔｙｒ２１７Ｌｅｕの代わりに用いられても、実
質上同様の結果である。
例３１〜３２において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＬｙｓ２１３Ｇｌｕ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕ＋Ｔｙｒ２１７Ｌｅｕ及びＩｌｅ
２０５Ｖａｌ＋Ｐｒｏ２１０Ａｌａ＋Ｌｙｓ２１３Ｇｌｕの代わりに用いられて
も、実質上同様の結果である。
ｂ．液体布帛クリーニング組成物
本発明の液体布帛クリーニング組成物は、本発明の１種以上の酵素変異体を有
効量で、好ましくは組成物の活性酵素の約０．００５〜約５重量％、更に好まし
くは約０．０１〜約１％で含有する。このような液体布帛クリーニング組成物は
、
典型的にはアニオン系界面活性剤、脂肪酸、水溶性洗浄ビルダーと水を更に含有
する。
本発明の液体布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
例３３〜３７
例３３〜３５において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＰｒｏ２１０
Ａｌａ＋Ｇｌｙ２１５Ｔｈrの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
例３６〜３７において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＰｒｏ２１０Ａｌａ＋Ｇｌｙ２１５Ｔｈｒ及びＰｒｏ２１０Ａｌａ＋Ｌｙｓ
２１３Ｇｌｕ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕ＋Ｔｙｒ２１７Ｌｅｕの代わりに用いられて
も、実質上同様の結果である。
ｃ．固形布帛クリーニング組成物
手洗い汚れ布帛用に適した本発明の固形布帛クリーニング組成物は、本発明の
１種以上の酵素変異体を有効量で、好ましくは組成物の約０．００１〜約１０重
量％、更に好ましくは約０．０１〜約１％で含有する。
本発明の固形布帛クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
例３８〜４１
例３８〜３９において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＬｙｓ２１３
Ｇｌｕ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
例４０〜４１において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体のいずれの組合
せがＬｙｓ２１３Ｇｌｕ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕ及びＴｙｒ２１４Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ
２１７Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
Ｂ．追加クリーニング組成物
前記の硬質表面クリーニング、皿洗い及び布帛クリーニング組成物に加えて、
本発明の１種以上の酵素変異体は不溶性基質の加水分解が望まれる様々な他のク
リーニング組成物中に配合してもよい。このような追加クリーニング組成物には
オーラルクリーニング組成物、義歯クリーニング組成物及びコンタクトレンズク
リーニング組成物があるが、それらに限定されない。
１．オーラルクリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、製薬上許容される量の本発明の１種以上の
酵素変異体が歯又は義歯からタンパク質汚れを除去する上で有用な組成物に含有
される。本明細書で用いられる“オーラルクリーニング組成物”とは、歯磨剤、
練歯磨剤、歯磨ゲル、歯磨粉、洗口液、マウススプレー、マウスゲル、チューイ
ンガム、ロゼンジ、小袋、錠剤、バイオゲル、予防ペースト、歯処理溶液等に関
する。好ましくは、本発明のオーラルクリーニング組成物は組成物の約０．００
０１〜約２０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約１０％、更に一層好まし
くは約０．０１〜約５％の本発明の１種以上の酵素変異体と、製薬上許容される
キャリヤを含む。本明細書で用いられる“製薬上許容される”とは、その用語が
表す薬物、薬剤又は不活性成分が妥当な利益／危険比で釣り合って過度の毒性、
不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応等なくヒト及びそれより下等の動物
の組織と接触する使用に適していることを意味する。
典型的には、オーラルクリーニング組成物のオーラルクリーニング成分の製薬
上許容されるオーラルクリーニングキャリヤ成分は、通常組成物の約５０〜約９
９．９９重量％、好ましくは約６５〜約９９．９９％、更に好ましくは約６５〜
約９９％である。
本発明のオーラルクリーニング組成物に含有させてもよい製薬上許容されるキ
ャリヤ成分と任意成分は当業者に周知である。オーラルクリーニング組成物で有
用な様々な組成タイプ、キャリヤ成分と任意成分は、１９９２年３月１７日付で
発行されたSeibelの米国特許第５，０９６，７００号；１９９１年７月２日付で
発行されたSampathkumarの米国特許第５，０２８，４１４号；１９９１年７月２
日付で発行されたBenedict,Bush 及びSunberg の米国特許第５，０２８，４１５
号明細書で開示されており、それらはすべて参考のため本明細書に組み込まれる
。
本発明のオーラルクリーニング組成物態様は下記例で説明される。
例４２〜４５
例４２〜４５において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＩｌｅ２０５
Ｌｅｕ＋Ｐｒｏ２１０Ａｌａ＋Ｌｙｓ２１３Ｇｌｕ＋Ａｌａ２１６Ｇｌｕ＋Ｔｙ
ｒ２１７Ｌｅｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例４６〜４９
例４６〜４９において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＡｌａ２１６
Ｇｌｙの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
例５０〜５３
例５０〜５３において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＴｙｒ２１４
Ｐｈｅ＋Ｔｙｒ２１７Ａｓｎの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
例５４〜５７
例５４〜５７において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＩｌｅ２０５
Ｖａｌ＋Ｐｒｏ２１０Ａｌａ＋Ｌｙｓ２１３Ｇｌｕの代わりに用いられても、実
質上同様の結果である。
２．義歯クリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、口腔外で義歯をクリーニングするための義
歯クリーニング組成物は本発明の１種以上の酵素変異体を含有する。このような
義歯クリーニング組成物は、有効量の、好ましくは組成物の約０．０００１〜約
５０重量％、更に好ましくは約０．００１〜約３５％、更に一層好ましくは約０
．０１〜約２０％の本発明の１種以上の酵素変異体と、義歯クリーニングキャリ
ヤを含有する。発泡錠等のような様々な義歯クリーニング組成物フォーマットが
当業界で周知であり（例えば、Young の米国特許第５，０５５，３０５号明細書
参照；参考のため本明細書に組み込まれる）、義歯からタンパク質汚れを除去す
る上で本発明の１種以上の酵素変異体の配合用に通常適している。
本発明の義歯クリーニング組成物態様は下記例で説明される。
例５８〜６１
例５８〜６１において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＡｌａ２１６
Ｇｌｕの代わりに用いられても、実質上同様の結果である。
３．コンタクトレンズクリーニング組成物
本発明のもう１つの態様において、コンタクトレンズクリーニング組成物は本
発明の１種以上の酵素変異体を含有する。このようなコンタクトレンズクリーニ
ング組成物は、有効量の、好ましくは組成物の約０．０１〜約５０重量％、更に
好ましくは約０．０１〜約２０％、更に一層好ましくは約１〜約５％の本発明の
１種以上の酵素変異体と、コンタクトレンズクリーニングキャリヤを含有する。
錠剤、液体等のような様々なコンタクトレンズクリーニング組成物フォーマット
が当業界で周知であり（例えば、１９８９年９月５日付で発行されたDavies，Me
aken 及びReesの米国特許第４，８６３，６２７号；１９８８年５月２４日付で
再発行されたHuth,Lam及びKirai の米国特許Ｒｅ第３２，６７２号；１９８６年
９月２日付で発行されたSchafer の米国特許第４，６０９，４９３号；１９８７
年９月１日付で発行されたOgunbiyi及びSmith の米国特許第４，６９０，７９３
号；１９８６年９月３０日付で発行されたOgunbiyi,Riedhammer 及びSmith の米
国特許第４，６１４，５４９号；１９８１年８月２５日付で発行されたOgata の
米国特許第４，２８５，７３８号明細書参照；これら各々が参考のため本明細書
に組み込まれる）、コンタクトレンズからタンパク質汚れを除去する上で本発明
の１種以上の酵素変異体の配合用に通常適している。
本発明のコンタクトレンズクリーニング組成物態様は下記例で説明される。
例６２〜６５
例６２〜６５において、特に表２で列挙されたＢＰＮ′変異体がＩｌｅ２０５
Ｌｅｕ＋Ａｌａ２１６Ａｓｐの代わりに用いられても、実質上同様の結果である
。
本発明の具体的態様が記載されてきたが、本発明の様々な変更及び修正が本発
明の精神及び範囲から逸脱せずに行えることは当業者にとり明らかであろう。本
発明の範囲内に属するすべてのこのような修正を添付された請求の範囲ではカバ
ーしていると考えられる。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 9/56 9152−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 9/56
// Ｃ０７Ｋ 14/32 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/32
(Ｃ１２Ｎ 9/56
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ)，ＡＭ，ＡＵ，
ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＺ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，
ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 ラビング，ドン ネルトン
アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、
シード、ロード、8224