CZ91398A3

CZ91398A3 - Použití dipeptidu R´-Glu-Trp-R´´ pro výrobu farmaceutického prostředku a farmaceutický prostředek pro léčení patologického stavu zahrnujícího neovaskularizaci

Info

Publication number: CZ91398A3
Application number: CZ98913A
Authority: CZ
Inventors: Lawrence R. Green; John W. Blasecki
Original assignee: Cytran, Ltd.
Priority date: 1995-10-03
Filing date: 1996-10-02
Publication date: 1998-11-11
Also published as: DE69636343T2; PL326149A1; EP0869808B1; CA2233457C; US6911431B1; ES2268710T3; EA199800357A1; SK42398A3; US5902790A; US6096713A; PL186123B1; ATE332702T1; HUP9902105A2; KR19990063958A; HUP9902105A3; DE69636343D1; JP3679129B2; US20060094665A1; NO981436L; NO981436D0

Description

ObIast techniky

Předk1ádaný vynález obecně pojednává o farmaceutických sloučeninách obsahuj ící ch peptidy a majících angiostatické vlastnosti přesněj i řečeno pojednává o dipeptidech obsahuj ících tryptofan a o způsobech její ch použ i t í .

Neovaskularizace, tvorba nových krevních cév, se uvádí do pohybu v časné embryogenezi a též při hojení ran, přestavbě tkán í a pravděpodobně i během normálního udržování cévního systému.

Procesy, probíhající během neovaskularizace zahrnují přinejmenším aktivaci endoteliálnich buněk a pericytů; rozklad bazální membrány; migraci a proliferaci endoteliálnich buněk a pericytů; tvorbu nových cévních kapilár; výskyt pericytů v okolí nových cév; vývoj nové bazální membrány; tvorba kápi 1árních smyček;

překonán í znehodnocován í tkání diferenciací nových cév:

organizování kapilární sítě

Dosavadní stav techniky

Je známo, že určité cytokiny potlačují neovaskularizaci, interleukin-12 (IL-12), transformační růstový faktornapř.

(TGF-), interferon- (IFN-) a faktor z krevních destiček (PF-4).

Nicméně klinické zkušenosti s léčbou cytokiny se ukázaly problematické, kvůli toxicitě některých těchto sloučenin.

Existuje množství pato1og i ckých stavů u nichž tvorba nových cév (angiogeneze) jako jeden následků nemoci.

Jedná se napr.

o neovaskularizaci rakov i nných nádorů, tvorbu hemangiomů;

neovasku1ar i zac i spojenou s různým i chorobám i jater;

angiogenní dysfunkce maj ící vztah k přebytku hormonů;

neovaskulární následky cukrovky;

neovaskulárn í následky vysokého krevního tlaku;

neovaskularizace během zotavování po mozkových cévních příhodách;

neovaskularizace způsobená zraněním hlavy; neovaskularizace při chronické infekcí jater;

r r„ r r

opětné zužování cév po jejich operativní· rozšíření a neovaskularizace jako následek tepelného či chladového traumatu.

Zatímco tvorba nových cév (angiogeneze) je nepochybně zapotřebí pro udržování zdravého cévního systému, klinická medicína by ocenila dostupnost netoxickéko léčebného postupu pro přechodné potlačení neovaskularizace, tj. indukce dočasné angiostáze.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje použití dipeptidu R' -Glu-Trp-R' ’ pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení patologického stavu zahrnujícího neovaskularizaci v jedinci.

Dále je popsáno též použití, kde dipeptid R' -Glu-Trp-R’' je L-Glu-L-Trp dipeptid.

Farmaceutický prostředek pro léčení patologického stavu zahrnujícího neovaskularizaci, který obsahuje farmaceuticky vhodný nosič a dipeptid R’ -Glu-Trp-R'' nebo jeho analog v množství účiném pro inhibování neovaskularizace.. Podávání farmaceutického přípravku - dipeptidu R' -Glu-Trp-R* ' s vhodným nosičem, v množství schopném tuto neovaskularizaci inhibovat. Preparáty typu R’ -Glu-Trp-R' ' pro inhibování neovaskularizace, lze použít jak v léčebném tak i preventivním režimu.

Bylo zjištěno, že L-Glu-L-Trp podporují tvorbu imunních buněk a normalizují jejich číselné poměry při stavech imunitní nedostatečnosti. (Viz např. XO 89/06134, XO 92/17191). Nicméně zde bylo zjištěno, že dipeptid má též angiostatickou aktivitu bez ohledu na jeho působení za stavů imunitní nedostatečnosti. Výsledky testů in vitro ukázaly, že nízké hladiny dipeptidu L-Glu-L-Trp potlačují v průběhu embryogeneze neovaskularizaci kuřecích chořioalantoidních membrán. Při testech na zvířatech dipeptid L-Glu-L-Trp potlačoval neovaskularizaci Levisova plicního nádoru, pokud byl injikován intradermálně myším kmene C57BL/6 a potlačoval růst Sarkomu 180 u myší kmene Swiss-Webster.

V jednom své provedení vynález popisuje použití dipeptidu R' -Glu-Trp-R’ ’ pro přípravu léků k léčení osob v patologickém stavu, jehož součástí je neovaskularizace.

PředevSím tento vynález popisuje použití di peptIdu

R' -Glu-Trp-R' ' nebo jeho analogu v množství účiném pro inhibování neovaskularizace hemangiomy.

prokrvené maligní a benigní nádory, včetně nádorů mozkových plen, nádory uvnitř hlavy, sarkomy, osteosarkomy, nádory měkkých tkání, jako jsou j í cen průdušni ce:

různým i s1oučeni nami i ndukovaná neovaskularizace jater, včetně druhotně indukované požíváním drog, alkoholu nebo jiných zneužívaných látek;

ang i ogenní dysfunkce mající vztah k přebytku hormonu.

např. estrogenu;

neovaskulárn í následky cukrovky.

jako centráln í serózní chořioretinopatie; neovaskulární následky vysokého krevního tlaku; neovasku1 arizace během zotavování po mozkových cévní ch př í hodách;

neovasku1ar i zace způsobená zranění m hlavy;

chroni ckou infekci jater (např. chronická hepatitida);

opětné zužován í cév po j ej i ch operát i vn í m rozš í řen í a neovaskular izace traumatu, jako jsou j ako následek popálen i ny tepelného či chladového či omrzliny. Dipeptid vykazuje svoji aktivitu jak u osob se zdravým imunním systémem, tj.

těch, kteří nejsou imunitně ohroženi, tak u těch, jej ichž imunitní systém je ohrožen.

Tento vynález uvádí farmaceutické preparáty

Glu-Trp obsahující d i pept i d

R' -Glu-Trp-R’ ’ a farmaceuticky přijatelný nosič.

Označen í vztahuj e dipeptid R' -Glu-Trp-R' ' , jak na dipeptid L-Glu-L- Trp' je používáno zde, se j eho deriváty nebo ana1ogy.

Jako deriváty dipeptidu

R' -Glu-Trp-R' jsou zde označovány takové sloučeniny, ve kterých je dipeptid modifikován kovalentní vazbou nějakého zbytku na místě R’ anebo R' ' . Jedná se např. o farmako1ogicky použitelné soli dipeptidu, amidy, imidy, estery, anhydridy, étery, metyl- nebo etyl-alkyl estery, alky-, aryl- nebo smíšené alkyl/áryl-dériváty jejichž molekulová váha je menší než 5000 dal tonů nebo menší než 1000 daltonů, multimerní nebo cyklické formy dipeptidu a pept i du, obsahujících méně než 20 aminokysel nebo méně než 10 aminokyselin, které obsahují ve své sekvenci glu-trp. Jako reprezentativní příklady lze uvést

HEW, EWEW, GEW, EWKHG,

EWKKHG, EW-NH-NHGHK-NH2,

Ac-L-Glu-L-Trp-OH, Suc-EW, Cpr-EW, i

But-EW, RKEWY, RKEW, KEWY,

KEW a pEW.

t- * * * r f _r t * · · · « - · · « . , • · · · ♦

♦ « jaR5~~ňásledek tepelného ci ~čhtadového traumatu, jako jsou popáleniny či ipeptid vykazuje svoji aktivitu jak u osob se zdravým imunním systémem£tj. těch, kteří [sou imunitně ohroženi, tak u těch, jejichž imunitní systém je o ento vynález uvádí farmaceutické preparáty Glu-Tr

3£y

sáhující dipeptid R’-GluTrp-R” a aceuticky přijatelný nosič. Označenj/dipeptid R’-Glu-Trp-R”, jak je používáno zde, se^vztahuje na dipeptid L-Glu-L- p” a jeho deriváty nebo analogy.

R’-Glu-Trp-

Jako deriváty dipepti ve kterých je dipeptid modifiková anebo R”. Jedná se např. o farrpákologič estery, anhydridy, étery, m I- nebo etyl-alkyl alkyl/aryl-deriváty jejichž jríolekulová váha je menší než 5 jsou zde označovány takové sloučeniny, ptfálentní vazbou nějakého zbytku na místě R’ oužitelné soli dipeptidu, amidy, imidy, tery, alky-, aryl- nebo smíšené daltonů nebo menší než

1000 daltonů, multirpérní nebo cyklické formy dipeptidu a pepti . obsahujících méně než 20 aminoky in nebo méně než 10 aminokyselin, které obsahují vě-své sekvenci glu-trp. Jal$0^/reprezentativní příklady lze uvést HEW, EWEW, GEW, EVVKHG,

EWKK

, EW-NH-NH-GHK-NH₂, Ac-L-Glu-L-Trp-OH, SuCzEW_T-Xpri\AL^But.EW-, RKEW, KEWY, KEW a pEW.

Mezi analogy dipeptidu R’-Glu-Trp-R” jsou zde zahrnuty takové sloučeniny, ve

» e · · kterých jsou L-aminokyseliny nahrazeny D-aminokyselinami, jako např. L-Glu-D-Trp, DGlu-L-Trp nebo D-Glu-D-Trp, popřípadě jsou zde analogy tryptofanu, jako je 5-hydroxytryptamin, 5-hydroxy-indol-octová kyselina nebo analogy pyrolu v nichž je dusíkový atom v pyrolovém kruhu nahrazen atomem uhlíku.

L-Glu-L-Trp je nyní nejčastěji používaným dipeptidem R’-Glu-Trp-R”. L-Glu-LTrp je zde také střídavě označován jako „EW“ a „EW dipeptid“, což je použití jednopísmenkové konvence, v níž první jmenovaná aminokyselina je z aminového konce a poslední jmenovaná aminokyselina je z karboxylového konce řetězce.

Termín „neovaskularizace“ zde označuje tvorbu nových krevních cév. Způsob, jímž jsou nové cévy vytvářeny může zahrnovat způsoby aktivace endoteliálních buněk a pericytů; rozklad bazální membrány; migraci a proliferaci (tj. buněčné dělení) endoteliálních buněk a pericytů; tvorbu nových cévních kapilár; výskyt pericytů v okolí nových cév; vývoj nové bazální membrány; tvorba kapilárních smyček; překonání znehodnocování tkání, diferenciaci nových cév, organizování kapilární sítě a konečně organizování do větších mikroskopických cév. Způsob proliferace endoteliálních buněk, např. v cévním pupenu, je zde označován jako „angiogenese“ a jedná se vlastně o

r 4 součást neovaskularizace. Reprezentativní diagnostické klinické projevy nemocí byly klasifikovány a kodifikovány (viz např. Mezinárodní klasifikace nemocí, ICD-9-CM,

Washington, D.C. 1989). Reprezentativní laboratorní projevy neovaskularizace zahrnují mimo jiné údaje, např. shromážděné v angiogramech, CAT skenech a sonogramech a rovněž vizuálním vyšetřením endoskopickými anebo kapilaroskopickými způsoby.

Termíny „angiostáze“, „angiostatický“ a „inhibice neovaskularizace“ zde znamenají, že rychlost nebo rozsah neovaskularizace v tkáni je snížen z úrovně před léčením na úroveň po léčení. Angiostáze může být zjišťována za použití laboratorních a klinických příznaků nemoci, viz výše. Angiostáze může zahrnovat potlačování jednoho či více pochodů, účastnících se v neovaskularizaci, např. množení endoteliálních buněk či buněk hladkých svalů v cévních stěnách, nebo jejich migraci.

Termín „patologický stav zahrnující neovaskularizaci“ zde označuje patologický stav, jehož jednou složkou je neovaskularizace, popřípadě nebezpečí jejího výskytu. Jedná se mimo jiné o patologické stavy, kde je neovaskularizace primární patologická složka, jako jsou hemangiomy; patologické stavy, kde neovaskularizace není primární patologická složka, ale přispívá k němu, jako je např. neovaskularizace nádorů; a stavy, kde je neovaskularizace následkem prvotní nemoci, jako je centrál serózní retinopatie při cukrovce.

Termín „případ“ zde označuje savce, včetně člověka nebo primáta, domácí zvíře či dobytek, kožešinová zvířata a další, jako např. psy, kočky, hlodavce, ptáky, koně, krávy, vepře, ryby a podobně. Provedení vynálezu zahrnuje způsoby léčení a prevence, použitelné u těchto „případů“ v případě potřeby.

Termín „imunologicky ohrožený“ zde označuje osobu, která má snížené množství jednoho nebo více druhů imunních buněk, jako jsou NK buňky, T4 nebo T8 Tlymfocyty, B-lymfocyty nebo fagocyty, měřeno pomocí standardních klinických diagnostických znaků. Jsou sem také zahrnuti jedinci se sníženou funkcí imunních buněk, zjišťovanou standardními testy funkčnosti těchto buněk, např. tvorba imunoglobulinů, chemotaxe, reakce smíšených lymfocytů nebo test přecitlivělosti pozdního typu. Imunologicky ohrožený jedinec je často nositelem neobvyklých nebo neočekávaných příležitostných infekcí.

Termínem „polypeptid“ je míněno sériové uspořádání aminokyselin dlouhé od více než 16 až do mnoha set aminokyselin, např. bílkovina.

9-99 ·

r 9 r r»99f

9 9 9 9 t e * 9»r » r ♦9 » * ♦.9

Termín „abnormální“ zde označuje laboratorní znaky takové neovaskularizace, která se vymyká z oblasti hodnot známých u zdravých jedinců.

Termín „normalizovaný“ zde označuje změny v laboratorních nebo klinických znacích neovaskularizace, které jsou léčením vráceny do oblasti normálních hodnot známých u normálních zdravých jedinců. Jedinec bez cévních defektů a bez nedostatků v systému srážení krve, fibrinolytickém nebo cévním systému, je zde označován jako „normální jedinec“.

Termíny „modulátor“ a „modulace“ znamenají činidlo a zároveň způsob potlačení neovaskularizace nebo tvorby cév v nornálním nebo v ohroženém jedinci.

Léčení pomocí R’-Glu-Trp-R” znamená způsob podání farmaceutického preparátu R’-Glu-Trp-R” jedinci v případě potřeby, se záměrem navodit snížení rychlosti nebo rozsahu neovaskularizace nebo tvorby cév.

V jednom výhodném provedení je farmaceutický preparát R’-Glu-Trp-R” podáván pacientovi s rakovinou v množství a po dobu, které jsou postačující ke snížení jednoho nebo více klinických či laboratorních příznaků neovaskularizace nebo tvorby cév, což má za následek zlepšení klinického Stavu takto léčeného pacienta. Tento způsob potlačuje neovaskularizaci v nádoru, čímž je sníženo zásobování nádoru krví a tedy inhibován růst nádoru.

Ve výhodném provedení sestává léčebný režim z podávání dávky 0,5 pg na 1 kg tělesné váhy až 1 mg na 1 kg tělesné váhy jedince, denně po dobu 1 dne až 30 dní. Ve výhodném provedení je dávka podána jedinci buď jako jedna denní intramuskulámí dávka farmaceutického preparátu R’-Glu-Trp-R” (intramuskulárně), nebo jako jedna denní intranasální dávka farmaceutického preparátu R’-Glu-Trp-R” (intranasálně). Dávka je přednostně připravena jako sterilní, injikovatelná, inhalovatelná, nosní kapky nebo roztok aplikovaný na sliznice sprejem, obsahující 0,001% až 0,01% farmaceutický preparát R’-Glu-Trp-R”: Případně může být farmaceutický preparát R’-Glu-Trp-R” podáván v dávkovačích jednotkách jako jsou např. tablety, čípky, kapsle, oční film, pasta či mast, např. zubní pasta, kožní mast nebo vodou rozpustný krémový základ. Nejvhodnější dávková jednotka pro podávání je 0,01 mg farmaceutického preparátu R’Glu-Trp-R”.

Postupy uvedené ve vynálezu nalezly množství preventivních a léčebných použití při léčbě patofyziologických stavů u lidí a domácích zvířat. V určitém provedení byly postupy uvedené ve vynálezu použity při in vitro udržování kultur endoteliálních « · buněk a cévních tkání, které se mohou vyskytovat před autologní nebo allogenn transplantací. Postupy se týkají udržování kultur endoteliálních buněk a cévních tkán

in vitro pěstováním v mediu obsahujícím sloučeninu R’-Glu-Trp-R”. Uvedený udržovac postup má výhodu v tom, že udržuje cévní tkáně a snižuje zánětlivé změny, nastávajíc po tkáňovém traumatu, způsobeném během chirurgického odebrání a uchovávání v tkáňové kultuře.

Ve vzorovém preventivním léčebném režimu jsou směsi uvedené ve vynálezu aplikovány pacientovi, který je buď náchylný k neovaskularizaci, nebo je jinak ohrožen vývojem neovaskularizace, např. zabránit po chirurgických zákrocích neovaskularizaci recidivujícího primárního nádoru nebo jeho metastatických buněk. Termín “preventivně účinná dávka zde označuje množství postačující k vyvolání angiostatického účinku na určitém místě tkáně, přičemž toto množství bude záviset na pacientově zdravotním stavu a váze, ale bude obecně spadat do rozmezí, popsaného zde pro léčebné účely. Preventivní podávání může být obzvláště vhodné pro jedince, u kterých existuje riziko komplikací jako jsou neovaskularizace či angiogenese, jako následek jiné nemoci, např. diabetická retinopatie.

Provedení vynálezu zahrnují léčebné režimy, kde farmaceutický preparát R’-GluTrp-R” je podáván samotný, nebo v kombinaci s dalším farmaceutickým činidlem, tzv. „kombinovaná terapie“. Reprezentativní kombinované terapie zahrnují takové léčebné postupy, kdy je R’-Glu-Trp-R” preparát podáván spolu s jedním či více antibiotiky, protizánětlivými prostředky nebo chemoterapeutickými sloučeninami. Tyto látky mohou být podávány buď společně s druhou léčebnou složkou, nebo odděleně, např. v různých časech nebo v různých injekcích či tabletách. Často je R’-Glu-Trp-R” podáván při kombinované terapii s protizánětlivými prostředky, antihistaminy, chemoterapeutickými prostředky a podobné. Jako příklad lze uvést kombinované léčení pomocí R’-Glu-Trp-R” a protizánětlivých prostředků, dobře známých v oboru.

Jiný příklad kombinovaného léčení pomocí R’-Glu-Trp-R” může také jako druhé činidlo obsahovat léky ovlivňující cévy. Příklady takovýchto vazoaktivních léků zahrnují léky ze skupiny inhibitorů enzymu konvertujícího angiotenzin (ACE), látky otevírající kanál pro draslík (PCO) a podobně.

Příklady kombinovaných léčení rakoviny pomocí R’-Glu-Trp-R zahrnují jako druhou složku podávání chemoterapeutických prostředků. Léčení pomocí R’-Glu-TrpR” může být účinné při potlačení nežádoucích vedlejších vlivů, spojených s terapií » ♦ * kortikosteroidy, např. neovaskularizace. Příklady chemoterapeutických prostředků jsou v oboru dobře známy.

Zkušení lékaři upraví dávkování a časový rozvrh podávání tak, aby byly vhodné pro dané klinické příznaky pacientů. Takovéto znalosti byly shromažďovány po desetiletí a jsou uvedeny v lékařské literatuře a rovněž v lékařských učebnicích. Okamžik započetí léčby daným činidlem či jejich kombinací závisí na klinickém posouzeni lekarem.

Empirické léčení je léčení nejběžnějších nebo pravděpodobných příčin, které je založeno na historických, demografických a epidemiologických informacích. Empirické léčení může často obsahovat použití mnoha terapeutických činidel určených k pokrytí široké oblasti léčebných možností. Pokud jsou dostupné údaje z laboratorních testu, výběr léčebného postupu může být upraven pro specifičtější léčení určité nemoci. Proto je léčení klinických syndromů velmi často započato empiricky. Spíše však je nutno nové terapeutické postupy testovat pro jednotlivé klinické syndromy.

V oblasti vývoje farmaceutických léků se pomocí předběžných klinických studií hodnotí léčebné účinky nikoli pouze na jeden klinický stav, ale na řadu činitelů nebo klinických stavů, které jsou předmětem zájmu. Výsledky různých (někdy neprůkazných) studií jsou zvažovány co se týče přínosů a rizik pro určitou terapii za použití lékařských vědomostí o rizicích, spojených s každou určitou nemocí.

Je běžné, že ne všichni pacienti s určitým syndromem jsou vyléčeni jednou terapií, naopak může existovat část pacientů, u nichž má terapie kladný a příznivý výsledek. Příklady klinických syndromů, kde části pacientů mohou pocítit příznivý výsledek po užití terapií uvedených v tomto vynálezu, jsou uvedeny v několika ^ř následujících odstavcích.

Farmaceutické směsi uvedené v tomto vynálezu jsou určeny pro parenterální, místní, subkutánní, intramuskulární, intratekální, orální, intranasální, intraperitoneální nebo lokální podávání (např. na kůži ve formě masti), nebo preventivní či léčebné působení. Směsi uvedené v tomto vynálezu jsou s výhodou podávány parenterálně, intramuskulárně nebo intranasálně. Zde uvedené R-Glu-Trp-R” směsi mají tu výhodu, že poskytují žádoucí účinky při velmi nízkých dávkových úrovních a bez toxických efektů. Tedy účelem terapie v akutním stavu může být rychlé zvýšení koncentrace R'Glu-Trp-R” v tkáni, např. intravenózní injekcí nebo infuzí. Alternativně může být v jiných případech žádoucí podávat R’-Glu-Trp-R” v průběhu delšího časového úseku.

» * 9 * » * •♦

Uvedené směsi obsahující R’-Glu-Trp-R” lze připravit způsobem, který umožňuje absorpci do krevního oběhu. Předvedené směsi jsou cévní modulátory, indukující takové změny na buněčné úrovni, které následně ovlivní změny v buněčných pochodech, které již dále nejsou závislé na přítomnosti směsí. Bylo pozorováno, že vlivy peptidu mohou být dlouhodobé tj. po týdny až měsíce, navzdory dosti rychlé degradaci peptidu, např. během 5 minut. Ačkoli uvedené sloučeniny R-Glu-Trp-R” jsou samy o sobě rozpustné ve vodě při nízkých koncentracích, v nichž se obvykle užívají, přednostně se používají ve formě jejich kyselých nebo zásaditých solí, vytvořených s farmakologicky přijatelnými činidly, např. kyselina octová, citrónová, maleinová nebo jantarová, sodík, draslík, čpavek nebo zinek. Volně rozpustné soli uvedených R’-GluTrp-R” směsí mohou být také převedeny na soli o nízké rozpustnosti v tělních tekutinách, např. modifikováním farmaceuticky přijatelnou, ve vodě slabě rozpustnou . solí, jako je tanin nebo kyselina palmitová, nebo převedením do formy s postupným , uvolňováním v čase pomocí kovalentní vazby k většímu nosiči, nebo uzavřením do < kapslí odkud se látka postupně v průběhu času uvolňuje, či jinými podobnými způsoby.

Uvedené farmaceutické preparáty R’-Glu-Trp-R” lze použít jako volné peptidy nebo ve formě vodou rozpustných, farmaceuticky vhodných solí, jako jsou sodné, draselné, amonné nebo zinečnaté soli. Rozumí se, že uvedené dipeptidy se mohou

-z^;..' r í podávat spolu s jinými aktivními přísadami, které nezávisle ovlivňují směsi aktivitu. Farmaceuticky vhodné soli mohou být připraveny z dipeptidu R’-Glu-Trp-R” (nebo jeho agonisty) pomocí vhodných metod. Takové soli mohou např. být připraveny působením na dipeptid R’-Glu-Trp-R” pomocí vodného roztoku požadovaného, farmaceuticky vhodného hydroxidu kovu, nebo jiné zásadité sloučeniny kovu a odpařením výsledného roztoku do sucha, přednostně za použití sníženého tlaku v dusíkové atmosféře. Jinou možností je smísit roztok R’-Glu-Trp-R” s alkoholátem požadovaného kovu a roztok \ i „ . _ potom do sucha odpařit. Farmaceuticky použitelné hydroxidy, zásady a alkoholáty jsou ř'- / takové, které mají kationty vhodné pro tento účel, mimo jiné se jedná o draslík, sodík, čpavek, vápník a hořčík. Příkladem jiných farmaceuticky vhodných solí jsou hydrochloridy, hydrobromidy, sírany, dvojsírany, octany, šťavelany, soli kyseliny valerové, olejové, laurové, borité, benzoové, mléčné, fosforečné, tosulové, citrónové, maleinové, fumarové, jantarové, vinné a podobně.

Pro parenterální podávání tento vynález poskytuje farmaceutické preparáty, které obsahují roztok dipeptidu R’-Glu-Trp-R”, nebo jeho polymerní, multimerní či

P P r r cyklické formy nebo jejich deriváty, rozpuštěné ve farmakologicky použitelném nosiči,

přednostně ve vodném nosiči. Lze použít řadu vodných nosičů, např. voda, pufrovaná voda, 0,4% roztok soli, 0,3% glycin a podobně, včetně bílkovin nebo glykoproteinů pro zvýšení stability, jako jsou albumin, lipoprotein, globulin apod. Takovéto směsi mohou být sterilizovány vhodnými, dobře známými sterilizačními technikami. Výsledné vodné roztoky mohou být baleny pro použití nebo filtrovány za sterilních podmínek a lyofilizovány, přičemž tyto lyofilizované preparáty jsou pak rozpouštěny před podáváním ve sterilní vodě. Směsi mohou obsahovat farmakologicky přijatelné pomocné sloučeniny nutné pro přiblížení fyziologickým podmínkám, jako jsou pH upravující a pufrující činidla, činidla upravující tonicitu a podobně, např. octan sodný, mléčnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý a jiné. Může být . žádoucí stabilizovat dipeptidy R’-Glu-Trp-R”, analogy, deriváty, agonisty a jiné, aby se . “ /zvýšila jejich skladovatelnost a farmakokinetický poločas. Stabilita preparátů při - /fefeskladování je zvyšována přidáním doplňkových látek jako jsou: a) hydrofobní činidla ' (např. glycerol); b) cukrů (např. sacharóza, manóza, sorbitol, rhamnóza, xylóza); c) složité sacharidy (např. laktóza); anebo d) bakteriostatická činidla. Farmakokinetický poločas peptidů lze modifikovat vazbou k peptidovým nosičům, polypeptidům a sacharidům chemickým pozměněním (např. vazbou postranního řetězce nebo N- či CJ

.. _kkoncových zbytků), nebo chemickým pozměněním aminokyseliny na jinou ’ . ' aminokyselinu (jak uvedeno výše). Farmakokinetický poločas a farmakodynamika mohou být také modifikovány: a) opouzdřením (např. v lipozómech); b) kontrolou stupně hydratace (např. kontrolou rozsahu a typu glykosylace peptidu); a c) kontrolou elektrostatického náboje a hydrofobicity peptidu.

Směsi obsahující dipeptid R’-Glu-Trp-R” uvedené v tomto vynálezu mohou být podávány v léčivech vhodných pro parenterální podávání (např. intravenózní, =, subkutánní, intramuskulámí). Preparáty mohou být podrobeny běžným farmaceutickým operacím, jako je sterilizace, mohou obsahovat pomocné látky, jako jsou konzervační činidla, stabilizátory, smáčecí činidla a podobně.

Směsi obsahující dipeptid R’-Glu-Trp-R” jsou typicky biologicky aktivní v dávce od 0,5 pg/kg do 1 mg/kg, převážně však od 1 pg/kg do 50 pg/kg. Koncentrace dipeptidu R’-Glu-Trp-R” ve farmaceutických směsích se může měnit, tj. od 0,001 % až do 15 či 20 váhových procent a bude primárně určena objemy tekutiny, viskozitami atd., podle zvláštních potřeb léčení a podle způsobu podávání léku pacientovi. Když je použit

9

intramuskulámě jako injekční roztok s aktivní složkou v množství schopném inhibovat neovaskularizaci, jedná se např. o 0,001 až 0,01 váhového procenta R’-Glu-Trp-R”. Když je připraven ve formě tablet, tobolek nebo čípků, aktivní složka se používá přednostně v množství 0,1 mg R’-Glu-Trp-R” na tabletu, tobolku nebo čípek. Farmakologicky aktivní vehikulum pro injekční formu může být jakýkoli farmakologicky přijatelný roztok jako je 0,9% vodný roztok chloridu sodného, destilovaná voda, roztok novokainu, Ringerův roztok, roztok glukózy a podobně. V této formě mohou tobolky, čípky nebo tablety obsahovat také jiné běžné základy a vehikula, jako jsou plnidla, škrob, glukóza a podobně. U lokálně aplikovatelných preparátů jsou dipeptidy R’-GluTrp-R” obyčejně obsaženy ve změkčujících přípravcích na bázi močoviny, vazelínových mastích a podobně, v koncentracích 0,1 až 10 000 dílů na milion, převážně v koncentraci 1 až 1000 dílů na milion a přednostně v koncentraci 10 až 100 dílů na ^/'milion. Konkrétní způsoby přípravy parenterálně, orálně nebo místně podávaných |j^sloučenin budou známé nebo zřejmé pracovníkům se zkušenostmi v oboru a jsou

M „podrobně popsány například v 17. vydání Remingtonů Pharmaceutical Science, Mack ’ ‘ Publishing Company, Easton, PA (1985), které je zde uvedeno mezi odkazy.

Je dávána přednost Intramuskulárnímu a intranasálnímu způsobu podávání R’_řGlu-Trp-R”. U dospělé osoby se dává přednost 50 až 100 pg R’-Glu-Trp-R” v jedné .y^dávce při intramuskulárním podávání (300 až 1000 pg na celou dobu terapie); u dětí do ^j^l roku 10 pg na dávku; u dětí mezi 1 a 3 roky věku 10 až 20 pg na dávku; u dětí mezi 4 á 6 roky věku 20 až 30 pg na dávku; u dětí mezi 7 a 14 roky věku 50 pg na dávku. Všechny výše uvedené dávky jsou vhodné pro léčení trvající 3 až 10 dní, v závislosti na potřebách pacienta. Léčba může být podle potřeby opakována, obyčejně během 1 až 6 / měsíců. V jiném výhodném provedení je léčebná dávka 10 pg/kg až 1 mg/kg .... 'farmaceutického preparátu R’-Glu-Trp-R” podáváno pacientovi denně po dobu 6 až 10 - ý;· ;.·dní,-ale případně podle úsudku ošetřujícího lékaře až po dobu 30 dní. V průběhu ; .jednoho preferovaného postupu terapie je R’-Glu-Trp-R” podáván denně í intramuskulámě v dávce 1 až 100 pg/kg po dobu 5 až 7 dní, po níž následuje 1 až 6 měsíční dočasný ústup nemoci a poté je opakován tentýž injekční režim.

R’-Glu-Trp-R” může být podáván samostatně, nebo připraven s farmaceuticky použitelnými nosiči, v jedné nebo v opakovaných dávkách. Vhodné farmaceutické nosiče zahrnují inertní pevné ředící materiály nebo plnidla, sterilní vodné roztoky a různá netoxická organická rozpouštědla. Farmaceutické směsi vytvořené spojením * r * dipeptidu R’-Glu-Trp-R” s farmaceuticky použitelným nosičem a vybraným antibiotikem. Takovéto směsi terapeutických činidel lze pak snadno podávat jako různé dávkové formy, jako jsou tablety, pastilky, sirupy, injekčních roztoky a podobně. Kombinace terapeutických činidel mohou také obsahovat dipeptid R’-Glu-Trp-R”, např. L-Glu-LTrp, v téže dávkové formě. Farmaceutické nosiče mohou, pokud je to vhodné, obsahovat další příměsi jako jsou příchutě, pojivá, masťové základy a podobné.

Pro účely orálního podávání se mohou použít tablety obsahující různé základy, jako je citrát sodný, uhličitan draselný a fosforečnan vápenatý, spolu s různými rozvolňovadly, jako se škrob, přednostně bramborový nebo tapiokový, alginová kyselina a některé složité křemičitany, spolu s pojivovými činidly, jako polyvinylpyrrolidon, sacharóza, želatina a klovatina. Dále jsou pro přípravu tablet užitečná různá maziva, jako stearan hořečnatý, laurylsulfát sodný a klouzek. Pevné směsi podobného typu mohou být použity jako plnidla v želatinových tobolkách. Pro tento účel se dává přednost materiálům jako je laktóza neboli mléčný cukr a vysokomolekulární polyetylenglykoly. Pokud jsou pro orální podávání ve formě léčebných nápojů požadovány vodné suspense, podstatné aktivní R’-Glu-Trp-R” dipeptidové složky zde mohou být spojovány s různými sladidly a příchutěmi, barvivý a pokud je to vhodné, s emulgátory a činidly vytvářejícími suspenze, spolu s rozpustidly, jako je voda, etanol, propylenglykol, glycerin a jejich kombinace.

Pro parenterální podávání lze použít roztoky R’-Glu-Trp-R” v sezamovém nebo arašídovém oleji nebo ve vodných roztocích polypropylenglykolu, rovněž ve sterilních solných roztocích, kdy jsou použity odpovídající, ve vodě rozpustné, farmaceuticky použitelné, dříve popsané soli kovů. Takové solné roztoky by měly být, pokud je to nutné, vhodně pufrovány a ředící vodný roztok by se měl nejprve upravit tak, aby byl izotonický, pomocí dostatečného množství soli nebo glukózy. Takové určité vodné roztoky jsou zvláště vhodné pro intravenózní, intramuskulární, podkožní a intraperitroneální injekce. Všechna používaná sterilní vodná média jsou snadno připravitelná pomocí standardních technik, dobře známých zkušeným pracovníkům v oboru. Navíc je možno podávat uvedené sloučeniny místně (např. pomocí katétru), za pomoci roztoku vhodného pro tento účel.

Množství, které ovlivní terapeutické výsledky u více než 50 % takto léčených jedinců je definováno jako „terapeuticky účinná dávka“. Léčení akutních stavů obyčejně probíhá 3 až 10 dní. Léčení chronických stavů nebo preventivní léčba mají ♦ ř ? · stejný průběh, ale mohou být opakovány po 1 až 6 měsících nebo déle. V některých případech může být žádoucí podávat sloučeniny přerušovaně denně po dobu 2 až 20 dní, výhodněji 3 až 14 dní, ještě výhodněji 4 až 10 dní, přičemž toto je opakováno přinejmenším po 1.5 dnech, výhodněji po 20 dnech nebo až po 1 až 6 měsících či více.

Způsob podávání směsí R’-Glu-Trp-R” závisí na druhu nemoci a místě, na kterém se léčba provádí. Při místní aplikaci může být vhodné podávat R’-Glu-Trp-R” na určité místo (např. umístěním jehly do tkáně na takovém místě) nebo umístěním napuštěného obvazu např. na místo nádoru po jeho chirurgickém odstranění; zatímco u jiných nemocí může být vhodné podávat R’-Glu-Trp-R” směsi systémově. Při jiných indikacích mohou být R’-Glu-Trp-R” směsi a jim podobné, podávány intravenózními, intraperitoneálními, intramuskulárními, subkutánními, intranasálními a intradermálními injekcemi a rovněž intrabronchiální instilací (např. pomocí rozprašovače), podáním přes kůži (např. pomocí nosiče rozpustného v tucích umístěného v náplasti), nebo gastrointestinálním podáním (např. pomocí tobolek či tablet).

Obecně platí, že soli uvedených R’-Glu-Trp-R” sloučenin (např. L-Glu-L-Lys) s farmaceuticky použitelnými kyselinami budou biologicky rovnocenné samotným těmto sloučeninám R'-Glu-Trp-R”.

Vhodné léčebné sloučeniny, inokula, způsoby podání a dávky se budou ovšem měnit podle klinické indikace. Pro intramuskulární injekci je inokulum připravováno obyčejně ze sušeného peptidu (nebo peptidového konjugátu) suspendováním peptidu ve fyziologicky vhodném ředidle, jako je voda, fyziologický roztok, nebo fyziologický roztok tlumený fosfátem. Určitě nastanou nějaké variace v dávkování v závislosti na stavu léčeného pacienta, lékař v každém případě určí vhodnou dávku pro určitého pacienta. Účinné množství peptidu na jednotlivou dávku závisí, mezi jiným, na tělesné váze, fyziologii a vybraném inokulačním režimu. Jednotková dávka peptidu udává váhu peptidu v dávce, tj. bez váhy nosiče (pokud je nosič použit). Účinného léčení bude dosaženo když koncentrace dipeptidu R’-Glu-Trp-R”, např. L-Glu-L-Trp, v určitém místě tkáně, v nejbližším okolí buněk dosahuje koncentrace 10’⁵ M až 10® M. Zkušení pracovníci jsou schopni použít klinické a laboratorní příznaky (viz výše) k určování pacientovy odezvy na použitou terapii a přizpůsobit podle toho dávkování. Protože farmakokinetika a farmakodynamika dipeptidů R’-Glu-Trp-R”, jejich agonistů, antagonistů a podobně, se budou u různých pacientů měnit, nejvýhodnější způsob pro dosažení léčebné koncentrace ve tkáni, je postupně zvyšovat dávku a sledovat klinické

a laboratorní příznaky (viz výše). Počáteční dávka pro takovéto léčení s režimem postupného zvyšování dávek, závisí na způsobu podávání. Při intravenózním podávání dipeptidu R’-Glu-Trp-R” s přibližnou molekulovou vahou 200 až 400 daltonů je podána počáteční dávka asi 0,5 pg/kg tělesné váhy, tato je v průběhu tohoto zvyšujícího se dávkového režimu desetinásobně zvyšována pro každý interval.

Pokud je podáván ve formě tablet, tobolek nebo čípků, je dávána přednost tomu, aby aktivní složka byla přítomna v množství 0,1 mg na tabletu, čípek nebo tobolku. Pokud je podávána touto formou, tobolka, čípek nebo tableta mohou obsahovat jiná běžná vehikula, jako jsou plnidla, škrob, glukóza atd.

Je vhodné, když je uváděný dipeptid R’-Glu-Trp-R” syntetizován některou z řady automatizovaných technik, které jsou v současnosti běžně dostupné. Obecně řečeno, tyto techniky znamenají stupňovitou syntézu a postupným přidáváním aminokyselin dávají vznik postupně větším molekulám. Aminokyseliny jsou spolu vázány kondenzací mezi karbonylovou skupinou jedné aminokyseliny a aminoskupinou další aminokyseliny, čímž se vytvoří peptidická vazba. Pro ovládání těchto reakcí je nezbytné blokovat aminoskupinu jedné aminokyseliny a karbonylovou skupinu druhé. Blokující skupiny musejí být vybrat tak, aby je bylo možno snadno odstranit bez nepříznivého ovlivnění peptidů, tj. racemizace nebo hydrolýzy vytvořených peptidických vazeb. Aminokyseliny s karboxylovými skupinami (např. Asp, Glu) nebo hydroxylovými skupinami (např. Ser, homoserin a tyrozin) také vyžadují před kondenzací blokování.

Pro syntézu peptidů existuje velká rozmanitost postupů, přičemž je obvykle dávána přednost syntéze na pevné fázi. Při tomto postupu je aminokyselina vázána na částice pryskyřice a peptid je vytvářen stupňovitým postupem, postupnými přidáváními chráněných aminokyselin k rostoucímu řetězci. Běžně se užívají modifikace tohoto postupu, popsaného Merrifieidem. V typické, automatizované metodě pevné fáze jsou peptidy syntetizovány připojením aminokyseliny, která bude na karboxylovám konci peptidů, na organický linker (např. PAM, 4-oxymetyl fenylacetamidometyl) kovalentně připojený k nerozpustné styrenové pryskyřici, která je příčně vázána divinylbenzenem. K blokování koncového aminu se používá t-Boc, hydroxylové a karboxylové skupiny jsou obyčejně blokovány O-benzylovými skupinami. Syntéza probíhá v automatickém syntetizátoru peptidů (Applied Biosystems, Foster City, CA, např. Model 430-A). Po syntéze může být produkt uvolněn z pryskyřice a blokující skupiny odstraněny pomocí fluorovodíkové nebo trifluorometylsulfonové kyseliny, podle zavedených metod (bergot, * f *

B.J. a S.N. McCurdy, Applied Biosystems Bulletin, 1987). Obvyklá syntéza může poskytnout 0,5 mmolu peptidů vázaného k pryskyřici. Výtěžek po odštěpení a čistění je přibližně 60 až 70 %. Například aktivovaný derivát esteru Glx s chráněnou aminoskupinou a postranním řetězcem reaguje sTrp, který má chráněn postranní řetězec a je přichycen svým C-koncem k pevné fázi. Po odstranění skupiny chránící alfa-aminoskupinu, může být peptid odštěpen z pevné fáze, nebo může být přidána podobným způsobem jiná aminokyselina. Postupně se přidávají další aminokyseliny. Peptidy se odštěpují za vysoce kyselých podmínek, které současně odstraní chránící skupiny.

Peptidy lze pak izolovat, lyofilizovat a uchovávat pro použití v budoucnu. Vhodné postupy syntézy proteinů jsou podrobně popsány v Steward a Young: Solid Phase Peptide Synthesis, 2. vydání, Pierce Chemical Company, 1984; a Tam a kol.: J. Am. Chem. Soc., 105:6442 (1983).

Purifikace vytvořených peptidů se provádí např. krystalizací peptidů z organických rozpustidel jako je metyl-butyl eter, následovanou rozpuštěním v destilované vodě a dialýzou (když je molekulová váha větší než 500), tenkovrstevnou chromatografií, gelovou chromatografií, lyofilizací nebo reverzní HPLC (např. za pomoci C18 sloupce s 0,1% trifluoroctovou kyselinou a acetonitrilem jako rozpouštědly), když je molekulová váha menší než 500 Vyčištěný peptid je lyofilizován a uložen v suchém stavu do použití. Typický farmaceutický preparát R’-Glu-Trp-R” je čištěný dipeptid L-Glu-L-Trp, který je tvořen bílým práškem (pokud je lyofilizovaný; jinak je krystalický), rozpustný ve vodě, DMF; nerozpustný v chloroformu a éteru. [alfa22₀ = +12,6; C = 0,5 H₂O. R_f = 0,65 (butanol: kyselina octová: voda = 3:1:1). UV (275 ± 5 nm, max). NMR (500Mhz): 0,001 mol/l peptidový roztok, Trp (3,17; 3,37; 4,57; 7,16; 7,24; 7,71; 7,49); Glu (1,90; 1,96; 2,21; 3,72).

V typickém případě aktivovaný derivát esteru kyseliny glutamové s chráněnou aminoskupinou a postranním řetězcem reaguje schráněným L-tryptofanem. Po odstranění chránících skupin a běžném čištění, jako je tenkovrstevná nebo GL chromatografie, může být peptid přečištěn lyofilizací, gelovou purifikací a podobně.

Má se za to, že uvedené peptidy obsahující tryptofan se mohou reverzibilně spojovat se specifickými buněčnými EW receptory na endoteliálních buňkách, jeden z takových receptorů byl definován jako všudypřítomná „CD2“ determinanta buněčného povrchu, která je přítomna také na lymfocytech, endoteliálních buňkách a některých τ ρ * f * * · r · r i r • · · » A » · >t

J · · · ♦ .· · ♦ » · ♦ Λ♦ • ♦ * ·. · *· ♦ * » «·· • £ » * « · · ·· f r - - * · · » »» epiteliálních buňkách. Je možné, že vazba EW dipeptidu na CD2 (a jiné EW receptory) způsobí v receptorů konformační změnu, která může podnítit zvýšení aktivity adenylátcyklázy a zvýšení vnitrobuněčného cAMP. V současnosti se věří, že L-Glu-LTrp projevuje svůj vliv potlačením buněčných mechanizmů, jimiž zánětlivé mediátory, jako jsou TNF-α a IL-1, spouštějí aktivaci a bujení endoteliálních buněk a pericytú. Aktivace vede ke změnám exprese adhezinů na buněčném povrchu, adheziny se účastní vazby zánětlivých buněk v místě zánětu cévy, zatímco buněčné bujení je zapojeno do neovaskularizace. Potlačení endoteliálních změn indukovaných zánětlivými mediátory pomocí L-Glu-L-Trp může zahrnovat defosforylaci jedné či více buněčných tyrozin kináz. Považuje se za pravděpodobné, že takové potlačení může mít za následek změny v syntéze nebo v expresi endoteliálních adhezinů, selektinů anebo integrinů, např. El_AM, VCAM a podobných, na buněčném povrchu. Posledně uvedené buněčné změny vyvolané dipeptidy obsahujícími tryptofan mohou mít za následek snížení schopnosti zánětlivých buněk (např. lymfocytů, neutrofilů anebo monocytů) uchytit se na místech zánětu cévy.

Zde použité symboly pro aminokyseliny jsou podle doporučení IUPAC-IUB, publikovaných v Arch. Biochem. Biophys. 115: 1-12, 1966 s následujícími jednopísmenkovými symboly pro aminokyseliny: L, Leu, Leucin; V, Val, Valin; Y, Tyr, Tyrozin; D, Asp, Asparagová kyselina; W, Trp, Tryptofan; P, Pro, Prolin; I, lleu, Izoleucin; G, Gly, Glycin; M, Met, Metionin; E, Glu, Glutamová kyselina; T, Thr, Threonin; K, Lys, Lyzin; N, Asn, Asparagin; R, Arg, Arginin; Q, Gin, Glutamin; A, Ala, Alanin; C, Cys, Cystein; S, Ser, Serin; F, Phe, Fenylalanin; H, His, Histidin; C, Cys, Cystein; S, Ser, Serin.

Dále uvedené příklady jsou poskytnuty pro další osvětlení vynálezu, nejsou však žádným způsobem míněny jako omezení oblasti působnosti nebo smyslu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Nepřítomnost mutagenní aktivity a toxicity u L-Glu-L-Trp: farmakokinetika a biodistribuce.

♦ ♦ *

Protokol A: Studium akutní toxicity

Souhrn: Když byl L-Glu-L-Trp injikován intramuskulámě v dávkách 10 OOOkrát převyšujících léčebné dávky, nebyl toxický pro myši, morčata, kuřata a psy, jak bylo zjištěno pozorováním celkového stavu, chování, pohybů, fyziologie srdce a dýchání a celkové patologie.

Protokol B: Studium chronické toxicity

Souhrn: Když byl L-Glu-L-Trp injikován denně 1krát intramuskulámě nebo intravenózně po dobu 28 dní, byl bez nepříznivých vlivů, jak bylo zjištěno pozorováním chování, přijímání potravy, tělesné váhy, stavu srsti, mukózních membrán, počtů červených a bílých krvinek, fyziologie srdce a dýchání, funkce jater a ledvin a celkové patologie. Funkce ledvin byla určována hodnocením vylučování moči po podání vody; pro některé další pokusy byli psi a krysy obětovány a zkoumány po 10, 20, 30 a 60 dnů.

Protokol C: Farmakokinetika a biodistríbuce: GLP studie.

L-Glu-L-Trp (110 gg/kg) radioaktivně značený ¹⁴C byl podáván intranasálně krysám kmene Sprague-Dawley. Krev a tkáňové vzorky byly odebírány v 0,5, 2, 8 nebo 24 hodinách a množství intaktního L-Glu-L-Trp bylo zjištěno pomocí HPLC. Tkáňové vzorky zahrnovaly zahuštěné červené krvinky, bílé krvinky, játra, ledviny, srdce, plíce, slezinu, thymus, mozek, sval, kůži, tuk, oko, vaječníky, varlata, podčelistní lymfatické uzliny a trávicí trakt s obsahem. Intranasálně podávaný ¹⁴C-L-Glu-L-Trp byl rychle absorbován do plazmy, C_max = 0,349 pg*eq.*hr/g ¹⁴C. Žádná intaktní sloučenina nebyla detekována v krvi ve 30 minutách při citlivosti v oblasti 5 až 101 ng/ml, což ukazuje na poločas kratší než 30 minut. Poločas eliminace v tkáních byl určen na 18,7 hod.

Příklad 2: Inhibiční vliv L-Glu-L-Trp na angiogenezi v chorioallantoidní membráně (CAM).

Krátce řečeno, 8-denní kuřecí embrya byla vyjmuta z vajec a umístěna do sterilních Petriho misek. Jednotlivé kotoučky filtračního papíru byly nasyceny vždy 7,5 μΙ různých zásobních roztoků L-Glu-L-Trp, rozpuštěného ve sterilním 0,14 M NaCI tak, aby byly dosaženy konečné testovací koncentrace 0,001; 0,01; 0,1; 1,0; 10; 100; 500 a 1000 pg na kotouček. Kotoučky byly na vzduchu vysušeny a potom umístěny na povrch jednotlivých embryí. Vaskularizace embryí byla hodnocena po 48 hodinách inkubace pomocí odstupňované škály v tabulce č.1 uvedené dole. ,

Tabulka č.1: Hodnocení vaskularity kuřecích embryí - CAM pokus.

Stupeň inhibice	Popis	Procento inhibice
0	Nejsou vidět odchylky od negativních kontrol	0
1	Slabá inhibice tvorby cév	25
2	Mírná inhibice tvorby cév	⁵⁰
3	Téměř kompletní inhibice tvorby cév	75
4	Kompletní inhibice tvorby cév	100

V tomto pokuse sloužil fyziologický roztok jako negativní kontrola a 10 gg heparinu na kotouček sloužilo jako pozitivní kontrola. Pentapeptid Tyr-Ala-Glu-Glu-Lys (TAGGL) byl použit pro kontrolu specificity (tj. pro možné nespecifické vlivy peptidů na neovaskularizaci při testovaných koncentracích). 9 až 12 testovacích kotoučků a odpovídající množství různých embryí bylo použito pro každou testovanou koncentraci spolu s 82 pozitivními a 82 negativními kontrolními embryi. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce č.2

Tabulka č.2: Výsledky CAM pokusu na kuřecích embryích.

Testovaný předmět	Počet embryí	Koncentrace (gg/kotouček)	Inhibice neovaskularizace Rozsah Průměr ±SD* Průměr %
Fyz. roztok	82	0	0-0	0±0	010
Heparin	82	10	1 -4	3,26 i 0,73	81 118
L-Glu-L-Trp	10	1000	2-4	3,3 ± 0,82	83120
10	500	1 -4	2,4 ± 0,84	60120
9	100	3-4	3,44 1 0,73	85118
11	10	1 -4	3,0911,14	78128
12	1	1 -4	2,3310,89	58 + 23
10	0,1	0-3	1,910,88	48 ± 23
¹⁰	0,01	1-2	1,510,53	38113
10	0,001	0-2	1,3 + 0,82	33 + 20
TAEEK	10	1000	0-2	0,7 i 0,82	18 + 20
10	500	0-1	0,3 10,48	9113
9	100	0-2	0,67 10,87	18 + 23
11	10	0-1	0,18 + 0,40	5 + 10
12	1	0-1	0,33 ± 0,49	8 + 10
10	0,1	0-0	010	0
10	0,01	0-0	010	0
10	0,001	0-0	010	0

* Průměr 1 SD = průměr ± standardní odchylka, n = 10 pro testované sloučeniny a n = 80 pro fyziologický roztok a heparin.

Výsledky ukazují 30 až 88% snížení vaskularity u embryí, na která bylo působeno 10 ng až 1000 gg L-Glu-L-Trp ve fyziologickém roztoku. Úroveň inhibice dosažená při 10 až 1000 gg se přibližně shodovala s heparinem (10 gg). Ačkoli byly zaznamenány při vyšších dávkách ( např. 100 až 1000 gg) jakési předpokládané nespecifické vlivy kontrolního pentapeptidu TAEEK na vaskularitu embryí, efekt nebyl tak výrazný, jako bylo dosaženo u L-Glu-L-Trp a tento pravděpodobně nespecifický vliv nebyl pozorován při nižších dávkách. Společně tyto výsledky naznačují vliv L-Glu-L-Trp na průběh tvorby cév v embryonálních tkáních kuřat.

Příklad 3: Inhibice neovaskularizace Lewisova karcinomu.

Když jsou buňky Lewisova karcinomu plic (5x10⁷) injikovány intradermálně (v 0,1 ml) do slabin obou zadních končetin myší C57BL/6 (stáří 0 dní), dávají během 7 dnů vznik viditelným, vysoce vaskularizovaným nádorovým uzlíkům. Po vyříznutí nádoru lze určit stupeň vaskularity mikroskopicky spočtením velkých cév, paprskovitě vycházejících z hmoty nádoru. Bylo provedeno nezávislé studium (jak popsáno dále) smluvní výzkumnou organizací, pověřenou GLP.

Jako negativní kontrola byl použit fyziologický roztok a jako pozitivní kontrola byl použit Cytoxan. Cytoxan (200 mg/kg) byl podáván pouze ve druhém dni. Pokusné léčení s L-Glu-L-Trp bylo prováděno intramuskulárné denně počínaje prvním dnem po injekci tumoru a pokračovalo po dobu 5 dní (tj. do 6. dne). L-Glu-L-Trp byl podáván v dávkách 125, 250, 500, 1000 a 2000 pg/kg/dávku. Negativní kontrola, fyziologický roztok, byl podáván intraperitoneálně podle stejného pětidenního plánu. Deset myší (20 nádorů) bylo zhodnoceno pro každou dávku, jak u testované látky, tak u kontrol. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce č.3.

Tabulka č.3: Inhibice neovaskularizace Lewisova nádoru plic.

Skupina	Léčení	Dávka (pg/kg/dávku)	Počet cév (průměr ± S.D.)*
1	žádné	0	19 ± 6
2	Cytoxan	200	9 ± 5*
3	L-Glu-L-Trp	2000	17±7
4	1000	12 ±5*
5	500	9± 4*
6	250	7 + 2
7	125	6 ±3*

* mnohonásobné párové porovnání podle Studenta-Newmana-Keulse; skupiny statisticky odlišné od skupiny 1 na hladině významnosti p<0,05.

Výsledky ukazují jasnou, statisticky významnou inhibici neovaskularizace, která je výsledkem působení buď Cytoxanu nebo L-Glu-L-Trp. Nízké dávky L-Glu-L-Trp byly efektivnější při inhibici angiogeneze (skupiny 4 až 7) než dávky vyšší (skupina 3). Nepřímo úměrný průběh závislosti dávka-odpověď, tj. nižší aktivita při vyšších dávkách, je ve shodě s dříve pozorovaným působením jiných látek, modifikujících biologickou odpověď v tomto pokusu (např. IFN-α nebo IL-12).

Všechny léčebné procedury byly dobře snášeny a nebyl pozorován ani úbytek na váze, ani úmrtí.

Příklad 4: Protinádorová aktivita L-Glu-L-Trp: Sarkom 180.

Neovaskularizace je vyžadována pro růst nádoru. Protinádorová aktivita L-GluL-Trp byla zjišťována nezávislou smluvní výzkumnou organizací. Nádory Sarkomu 180 (ATCC CCL-8 CCFR S-180 II) byly indukovány intramuskulární injekcí 2 x 10⁶buněk/0,1 ml do slabin obou zadních končetin myší kmene Swiss-Webster. Skupiny sestávaly z 10 zvířat (20 nádorů). L-Glu-L-Trp byl podán v jedné 0,1 ml dávce v množstvích buď 10 gg/kg, 75 gg/kg, 250 gg/kg nebo 1000 gg/kg. Velikost nádoru byla hodnocena po chirurgickém odstranění a zvážení ovlivněné končetiny, váha byla porovnána s váhou normální kontrolní (bez nádoru) končetiny. První preventivní léčebný režim (PLR-1) sestával z 5 intraperitoneálních injekcí, následujících po sobě v jednodenních intervalech, začínajících v den -5 a končících v den -1. Druhý preventivní léčebný režim (PLR-2) sestával z 5 intramuskulárních injekcí do levé zadní končetiny (místo nádoru), následujících po sobě v jednodenních intervalech, začínajících v den -5 a končících v den -1. Buňky Sarkomu 180 byly podány intramuskulárně v deri 0,. Jako negativní kontrola byl použit fyziologický roztok.

Tabulka č.4: Vliv léčení pomocí L-Glu-L-Trp na velikost nádoru Sarkomu 180.

Skupina	Režim léčení	Dávka (pg/kg)	Váha končetiny	Průměrná váha nádoru^a	Procent váhy kontrolního nádoru ^b
Levá	Pravá
Levá	Pravá
1A (normální)	žádný	0	1,2±0,1	1,2±0,2	0	0	-	-
1B (nádor)	žádný	0	3,7±0,6	3,5±0,7	2,5	2,3	0	0
2	PLR-1	10	4,2±0,9	4,1±0,7	3,0	2,9	120	126
3	PLR-1	75	4,2±0,8	4,2±0,8	3,0	3,0	120	130
4	PLR-1	250	3,5±1,0	3,1 ±0,6	• 2,3	1.9	92	83
5	PLR-1	1000	2,5±0,7	2,2±0,5	1,3	1,0	52	43
6	PLR-2	10	3,6±0,7	3,8±0,7	2,4	2,6	96	113
1	PLR-2	75	3,6±0,7	3,5±0,3	2,4	3,3	96	143
8	PLR-2	250	3,0±0,1	2,3±0,5	1.8	1.1	72	48
9	PLR-2	1000	2,4±0,5	2,5±0,5	1,2	1,3	48	57

(a) Průměrná váha nádoru = (průměrná váha ošetřované nohy - průměrná váha normální kontroly);

(b) Inhibice = (váha ošetřovaného nádoru/váha kontrolního nádoru) x 100%

Výsledky v Tabulce č.4 ukazují, že preventivní podávání L-Glu-L-Trp intraperitoneálně nebo intramuskulárně v dávkách 250 pg/kg a 1000 pg/kg inhibují následný intramuskulární růst nádoru. Je zajímavé, že se zdá možné vyvolat systémové inhibiční vlivy pomocí podávání látky lokálně intramuskulárně, protože intramuskulární podání do levé končetiny inhibovalo následný růst nádoru v pravé končetině (např. skupiny 8 a 9). Výsledky jsou ve shodě s inhibicí neovaskularizace pozorovanou v Příkladech 2 a 3 (viz výše).

Předložený vynález poskytuje v podstatě nový způsob inhibice neovaskularizace. I když zde byly předvedeny určité příklady, tento popis je ilustrativní, nikoli omezující. Řada variant vynálezu se stane zřejmá pracovníkům se zkušenostmi v oboru po přečtení tohoto pojednání. Pole působnosti by proto mělo být určeno ne s odvoláním na výše uvedený popis, ale s odvoláním na připojené patentové nároky spolu s plným rozsahem jejich ekvivalentů.

Průmyslová využitelnost

Vynález popisuje použití farmaceutických preparátů typu R'-Glu-Trp-R pro inhibování neovaskularizace, jak v léčebném tak i preventivním režimu.

r r

Claims

r r * r *

TOVÉ NÁROKY

1. Použití dipeptidu

R’ -Glu-Trp-R’ ’ pro výrobu farmaceutického prostředku pro neovašku1ar i zac i léčení v jedinci pato1ogi ckého stavu zahrnuj ícího
2. Použ i t í pod1e nároku kde dipeptid

R’ -Glu-Trp-R' ’ je

L-Glu-L-Trp dipeptid.
3.

Použ i t i podl e nároku

2, kde patologickým stavem je hemang i om.
4.

Použ i t í podle nároku

2, patologickým stavem je maligní nádor nebo vasku1ar i zováný benigní nádor.
5. Použ i t í podle nároku

2, kde patologickým stavem je neovaskularizace v období zotavování po cerebrovaskulárn í m úrazu, neovaskularizace po poranění hlavy;¹ opětné zužování cévy po jejím operativním způsobená poškozením vysokými rozší řen í nebo neovaskularizace či nízkými teplotami.
6. Použití podle nároku kde patologickým stavem je neovašku1ar i zace spojená chemickými látkami i ndukovanou neovaskularizaci jater.

angiogenní dysfunkce způsobená přebytkem hormonů;

neovaskulárn í důsledky diabetů;

neovaskulární důsledky hypertenze nebo chronické infekce jater.

7. Použ i t í podle nároku 2, kde prostředek je vhodný pro podán í jedinci v dávkách od.0,5 g na 1 kg tělesné váhy až po 1 mg na 1 kg tělesné váhy. 8 . Použ i t í podle nároku 7, kde dávka jev množství asi 1 9/ kg až 50 g/kg tělesné váhy. 9. Použ i ti podle nároku 7, kde prostředek je vhodný pro i denní podán í po dobu 1 až as i 30 dnů.
10. Použití podle nároku 7, kde farmaceutický prostředek je vhodný pro podání intramuskulárně nebo intranasálně.

r

A
11. Použ i t í podle nároku 2, kde farmaceutický prostředek r re e r r re je vhodný pro podán í ve formě injekčního roztoku, obsahujícího

0,001 % až 0,01 %

L-Glu-L-Trp.
12. Použ i t í pod1e nároku 2, kde prostředek je vhodný pro podán í v jednotkových dávkových formách jako jsou tablety, čípky, tobolky, oční film.

inhalační prostředek, slizniční sprej, nosní kapky, oční kapky, zubní pasta, mast nebo ve vodě rozpustný krém.
13. Použití podle nároku 12, kde uvedená jednotková dávková forma obsahuje v podstatě 0,01 mg uvedeného R' -Glu-Trp-R' ' .
14. Použití podle nároku 2, kde prostředek je vhodný pro podání jedinci v kombinaci s vasoaktivním lékem.
15. Použití podle nároku 14, kde vasoaktivní lék je inhibitor enzymu konvertuj icího angiotensin (ACE) nebo otvírač draselného kanálu (PCO).
16. Použití podle nároku 2, kde jedinec trpí nádorem a kde prostředek je vhodný pro podání jedinci v kombinaci s chemoterapeutickým činidlem.
17. Použití podle nároku 2, kde jedinec není imunitně ohrožen.
18. Použití .dipeptidu R’ -Glu-Trp-R’ ’ v podstatě jak je popsán zde pokud jde o jakýkoliv příklad.
19. Použití podle nároku 4, kde nádorem je kapsisův sarkom.
20. Použití podle nároku 4, kde nádorem je meningní sarkom, intracerebrální tumor, sarkom, osteosarkom, rakovina jícnu nebo rakov i na průdušni ce.
21. Použití podle nároku 4, kde nádorem je lev i sův rakovinný nádor.

r f r (.

- - < ^! ^r
22. Použití analogu dipeptidů farmaceutického prostředku pro

R' -Glu-Trp-R’ ' pro výrobu patologického stavu zahrnujícího neovaskularizaci jedinci,
23. Použití dipeptidu R’ -Glu-Trp-R’’ podle nároku 1, kde uvedený dipeptid je cyklizovaný L-Glu-L-Trp dipeptid.
24. Použití dipeptidu R' -Glu-Trp-R' ' podle nároku 1, kde uvedený dipeptid je multimer L-Glu-L-Trp dipeptidu, který neobsahuje více než 10 aminokyselin.
25. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení patologického stavu zahrnujícího neovaskularizaci, kde uvedený prostředek obsahuje f armaceut i cky vhodný nosič dipeptid

R' -Glu-Trp-R' ’ v množstv í úč i ném pro inhibování neovasku1ar i zace.
26. Farmaceutický prostředek podle nároku 28, kde dipeptid

R' -Glu-Trp-R’ ' je

L-Glu-L-Trp dipeptid.
27. Farmaceutický prostředek podle nároku 28, kde dipeptid

R' -Glu-Trp-R' ' je cyklizovaný

L-Glu-L-Trp dipeptid.
28. Farmaceutický prostředek podle nároku 28, kde di pept i d

R' -Glu-Trp-R’ ' je multimerní L-Glu-L-Trp dipeptid, který neobsahuje více než 1O aminokyse1 in.
29. Farmaceutický prostředek vhodný pro léčení patologického stavu zahrnujícího neovaskularizaci, kde uvedený prostředek obsahuje farmaceuticky vhodný nosič a analog dipeptidu R' -Glu-Trp-R' ’ v množství účiném pro inhibování neovaskular izace, kde v uvedeném analogu je dusík pyrolového kruhu tryptofanu nahrazen uhlíkem.