CZ99197A3 - Anti-neoplastic extracts of cocoa, process of their preparation and their use - Google Patents

Description

Vynález se týká výtažků kakaa, například polyfenolů, výhodně polyfenolů obohacených prokyanidiny. Vynález se rovněž týká způsobu přípravy těchto extraktů a jejich použití například jako antineoplastických činidel a antioxidů.

Dosavadní stav techniky

Polyfenoly představují velmi pestrou skupinu sloučenin (Ferreira, D., Steynberg, J.P., Roux, D.D. a Brandt, E.V., Diversity of Structure and Function in Olygomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803, (1992)), které se v širokém měřítku objevují v různých rostlinách, z nichž některé vstupují do potravinového řetězce. V některých případech reprezentují důležitou třídu sloučenin pro lidskou dietní stravu. I když lze některé polyfenoly považovat za nevýživné, přesto vzrůstá zájem o tyto sloučeniny, vzhledem k jejich možným příznivým účinkům na zdraví. Ukázalo se, že například kvercitin (flavonoid) vykazuje protirakovinové účinky při experimentálních studiích na zvířatech (Deschner, E.E., Ruperto, J. , Wong,

G. a Newmark, H.L., Quercitin and Rutin as Inhibitors of Asoxymethanol-Induced Colonic Neoplasia, Carcinogenesis, 7, 1193-1196 (1991) a Kato, R., Nakadate, T., Yamamoto, S. a

Sugimura, T., Inhibition of 12-0-Tetradecanoylphorbol-13Acetate Induced Tumor Promotion and Omithyne Decerboxylase Activity by Quercitin: Possible Involvement of Lipoxygenase Inhibition, Carcinogenesis, 4, 1301-1305 (1983)). Ukázalo se, že (+)-katechin a (-)-epikatechin (3—flavanoly) inhibují reverzní transkriptázovou aktivitu viru leukémie (Chu, S.C., Hsieh, Y.S. a Lim, J.Y., Inhibitory Effects of Flavonoids on Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity J. of Natural Products, 55:2, 179-83 (1992)). Rovněž se zjistilo, že novotanin (polygomerní hydrolyzovatelný tannin) vykazuje protinádorové účinky (Okuda, T., Yoshida, T., a Hatano, T., Molecular Structures and Pharmacological Activities of Polyphenols-Olygomeric Hydrolyzable Tannins and Others - presentované na 16. mezinárodní konferenci skupiny Groupe Polyphenols v Lisabonu (Portugalsko) 13.-16. července 1992). Statistické zprávy rovněž ukazují, že úmrtnost na rakovinu žaludku je podstatně nižší v oblastech Japonska, které produkují čaj. Epigallokatechingallát byl označen za farmakologicky účinný materiál obsažený v zeleném čaji, který inhibuje kožní nádory u myší (Okuda, T., Yoshida, T., a Hatano, T., Molecular Structures and Pharmacological Activities of Polyphenols-Olygomeric Hydrolyzable Tannins and Others presentované na 16. mezinárodní konferenci skupiny Groupe Polyphenols v Lisabonu (Portugalsko) 13.-16. července 1992) . Rovněž se ukázalo, že kyselina ellagová vykazuje protirakovinové aktivity na různých modelech nádorů u zvířat (Boukharta, M., Jalbert, G. a Castonguay, A., Efficacy of Ellagitannins and Ellagis Acid as Cancer Chemopreventive Agents - presentované na 16. mezinárodní konferenci skupiny Groupe Polyphenols v Lisabonu 13.-16. července 1992). V nedávné době si Corporation nechala patentovat proanthokyanidových polygomerů.

(Portugalsko) společnost Kikkoman antimutagenní použití

Nedávno byla na 202. národním setkání Amerických chemických věd presentována oblast fenolových sloučenin, nacházejících se v potravinách a jejich schopnost modulovat nádorový vývoj v experimentálních modelech zvířat (Ho a kol., Huang a kol., (1992)) .

Nicméně žádná z těchto zpráv se netýká výtažků kakaa, způsobu přípravy těchto výtažků ani použití těchto výtažků jako antineoplastických činidel.

Protože nefermentované kakaové boby mají vysoký obsah polyfenolu, je možné se domnívat, že extrakce těchto sloučenin z kakaa a mapování aktivity těchto extraktů odhalí podobné účinky kakaových extraktů. Národní institut, zabývající se výzkumem rakoviny, zjišťoval v rámci programu týkajícího se selekcí přírodních produktů protirakovinové účinky různých druhů Theobroma a Herranía. Tyto testy zaznamenaly pouze nízkou protirakovinnou aktivitu některých extraktů z kakaových tkání, takže odborníci v oblasti výzkumu antineoplastických a protikarcinogenních účinků nedoporučili používání kakaa a jeho extraktů pro léčebné terapie při léčbě rakoviny. Protože byla vyvinuta celá řada analytických postupů, jejichž účelem bylo určit, jakou měrou přispívají kakaové polyfenoly k vývoji chuti (Clapperton, J., Hammerstone, J.F. Jr., Romanczyk, L. J. Jr., Chán, J., Yow, S., Lim, D. a Lockwood, R., Polyphenols and Cocoa Flavor - presentované na 16. mezinárodní konferenci skupiny Groupe Polyphenols v Lisabonu (Portugalsko) 13.-16. července 1992), rozhodli se vynálezci aplikovat analogické metody na připravené vzorky s cílem stanovit jejich protirakovinové účinky navzdory již známým skutečnostem. Překvapivě se zjistilo, že kakaové polyfenolové výtažky, které obsahují prokyanidy, mají významnou použitelnost jako protirakovinové nebo antineoplastická činidla. Kromě toho vynálezci demonstrují, že kakaové extrakty, obsahující prokyanidy lze požít jako antioxidanty.

Podstata vynálezu

Jak již bylo uvedeno, cílem vynálezu je poskytnout způsob výroby kakaového výtažku.

Cílem vynálezu je rovněž poskytnout kakaový výtažek.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout antioxidační kompozici.

Cílem vynálezu je rovněž demonstrovat inhibici aktivity DNA topoisomerasového II enzymu.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout způsob léčení nádoru nebo rakoviny.

Cílem vynálezu je rovněž poskytnout protirakovinovou, protinádorovou nebo protinovotvarovou kompozici.

Cílem vynálezu je také poskytnout způsob výroby protirakovinové, protinádorové nebo protinovotvarové kompozice.

Cílem vynálezu je konečně poskytnout sadu použitelnou při léčení nádorů nebo rakoviny.

Překvapivě bylo zjištěno, že kakaový výtažek má protinádorové, protirakovinové nebo protinovotvarové účinky, nebo že představuje antioxidační kompozici, nebo že inhibuje účinky DNA topoisomerasového II enzymu. Vynález poskytuje v podstatě čistý kakaový výtažek. Tento výtažek výhodně obsahuje polyfenoly, např. polyfenoly obohacené kakaovými prokyanidy, zejména polyfenyly s alespoň jedním kakaovým prokyanidem, zvoleným ze skupiny zahrnující (-)epikatechin, prokyanidin B-2, prokyanidinové oligomery 2 až 12, výhodně 2 až 5 nebo 4 až 12, prokyanidin B-5, prokyanidin A-2 a prokyanidin C-l. Vynález rovněž poskytuje protinádorovou, protirakovinovou nebo protinovotvarovoou kompozici, nebo antioxidační kompozici nebo inhibiční kompozici DNA topoisomerásy II, které obsahuje v podstatě čistý kakaový extrakt nebo syntetické kakaové polyfenoly, např. polyfenoly obohacené prokyanidiny, a vhodný nosič. Tento extrakt výhodně obsahuje kakaové prokyanidiny. Kakaový výtěžek lze výhodně získat způsobem zahrnujícího redukování kakaových bobů na prášek, zbavení tohoto prášku tuků a extrahování účinných složek z tohoto prášku.

Kromě toho vynález poskytuje sadu pro léčení pacientů, kteří vyžadují léčbu pomocí protinádorového, protirakovinového nebo protinovotvarového činidla, pomocí antioxidantu nebo pomocí DNA topoisomerásového II inhibitoru, přičemž tato sada obsahuje kakaový výtažek nebo syntetický kakaový polyfenol nebo polyfenoly nebo prokyanidin(y) a nosič vhodný pro smísení s tímto výtažkem nebo syntetickými polyfenoly nebo prokyanidy.

Tyto a další cíle provedení vynálezu se stanou zřejmějšími po prostudování následující popisné části.

Stručný popis obrázků

Pro názornost je popisná část doplněna odkazy na doprovodné výkresy, na kterých:

Obr. 1 znázorňuje reprezentativní gelový permeační chromatogram z frakce surových kakaových prokyanidinů;

obr. 2A znázorňuje reprezentativní chromatogram vysokovýkonnostní kapalinové chromatografie (dále jen HPLC) s převrácenými fázemi, který ukazuje separaci (eluční profil) kakaových prokyanidinů extrahovaných z nefermentovaného kakaa;

obr. 2B znázorňuje reprezentativní HPLC chromatogram s normálními fázemi, který ukazuje separaci kakaových prokyanidinů extrahovaných z nefermentovaného kakaa;

obr. 3 znázorňuje šest reprezentativních prokyanidinových struktur;

obr. 4A až 4E znázorňují reprezentativní HPLC chromatogramy pěti frakcí použitých při testování protirakovinových nebo protinovotvarových účinků;

obr. 5 a obr. 6A až 6D znázorňují závislost dávky a odezvy mezi kakaovými extrakty a rakovinnými buňkami ACHN (obr. 5) a PC-3 (obr. 6A až 6D) (frakční přežití vs. dávka, μς/ιηΐ) ; M&M2 F4/92, M&MA+E U12P1, M&MB+E Z192P1, M&MC+E U12P2, M&MD+E U12P2 obr. 7A až 7H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, A+B, A+E a A+D a PC-3 buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, μς/ιηΐ) ; MM-1A 0212P3, MM-1 B 0162P1, MM-1 C 0122P3, MM-1 D 0122P3, MM-1 E 0292P8, MM-1 A/B 0292P6, MM-1 A/E 0292P6, MM-1 A/D 0292P6;

obr. 8A až 8H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, A+B, B+E a D+E a KB Nazofaryngální/HeLa buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, gg/ml); MM-1 A 092K3, MM-1 B

0212K5, MM-1 C 0162K3, MM-1 D 0212K5, MM-1 E 0292K5, MM-1 A/B 0292K3, MM-1 B/E 0292K4, MM-1 D/E 0292K5;

obr. 9A až 9H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, B+D, A+E a D+E a HCT-116 buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, pg/ml); MM-1 C 0192H5, MM-1 D 0192H5, MM-1 E 0192H5, MM-1 B&D 0262H2, MM-1 A/E 0262H3, MM-1 D&E 0262H1;

obr. 10A až 10H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, B+D, C+D a A+E ledvinovou buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, pg/ml); MM-1 A 092A5, MM-1 B 092A5, MM-1 C 0192A7, MM-1 D 0192A7, M&M-l E 0192A7, MM-1 B&D 0302A6, MM-1 C&D 0302A6, MM/1 A&E 0262A6;

obr. 11A až 11H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, A+E, B+E a C+E A/549 plicní buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, pg/ml); MM-1 A 019258, MM-1 B 09256, MM1 C 019259, MM-1 D 019258, MM-1 E 019258, MM-1 A/E 026254, MM-1 B&E 030255, MM-1 C&E N6255;

obr. 12A až 12H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, A+C, C+D a D+E a SK-5 melanomovou buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, pg/ml); MM-1 A 0212S4, MM-1 B 0212S4, MM-1 C 0212S4, MM-1 D 0212S4, MM-1 E N32S1, MM-1 B&C N32S2, MM-1 C&D N32S3, MM/1 D&E N32S3;

obr. 13A až 13H znázorňují typickou závislost dávka odezva mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi A, B, C, D, E, B+C, C+E a D+E a MCF-7 prsní buněčnou linií (frakční přežití vs. dávka, pg/ml); MM-1 A N22M4, MM-1 B N22M4, MM-1

C N22M4, MM-1 D N22M3, MM-1 E 0302M2, MM-1 B&C 0302M4, MM-1 C&E N22M3, MM/1 D&E N22M3;

obr. 14 znázorňuje typický stav dávka - odezva prokyanidin (zejména frakci D) a buněčné linie CCRF-CEM Tbuněčné leukémie (buňky/ml vs. dny růstu; prázdná kolečka znamenají kontrolní frakci, plná kolečka znamenají 125 gg frakce D, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 250 gg frakce D, plné obrácené trojúhelníky znamenají 500 gg frakce D);

obr. 15A znázorňuje srovnání testů XTT a krystalického violeťového testu na MCF-7 pl$8 prsních rakovinových buňkách ošetřených frakcí D+E (prázdná kolečka znamenají XTT a plná kolečka znamenají krystalickou violeť);

obr. 15B znázorňuje typickou křivku dávka - odezva získanou z MDA MB231 prsní buněčné linie ošetřené různými koncentracemi surových polyfenolu získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají kontrolní vzorek, plná kolečka znamenají vehikulum, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 250 gg/ml, plné obrácené trojúhelníky znamenají 100 gg/ml, prázdné čtverečky znamenají 10 gg/ml; absorbance 2,0 je maximální hodnotou deskového čítače a nemusí nezbytně reprezentovat buněčný počet);

obr. 15C znázorňuje typickou křivku dávka - odezva získanou z buněčné linie PC-3 buněk rakoviny prostaty ošetřené různými koncentracemi surových polyfenolů získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají kontrolní vzorek, plná kolečka znamenají vehikulum, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 250 μς/ml, plné obrácené trojúhelníky znamenají 100 μρ/ml, prázdné čtverečky znamenají 10 μς/ιηΐ) ;

obr. 15D znázorňuje typickou křivku dávka - odezva získanou z buněčné linie MCF-7 pl68 prsních rakovinových buněk ošetřené různými koncentracemi surových polyfenolů získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají kontrolní vzorek, plná kolečka znamenají vehikulum, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 250 gg/ml, plné obrácené trojúhelníky znamenají 100 μg/ml, prázdné čtverečky znamenají 10 μς/πιΐ, plné čtverečky znamenají 1 μρ/ιηΐ; absorbance 2,0 je maximální hodnotou deskového čítače a nemusí nezbytně reprezentovat buněčný počet);

obr. 15E znázorňuje typickou křivku dávka - odezva získanou z Hela cervikální rakovinné buněčné linie ošetřené různými koncentracemi surových polyfenolů získaných z kakaového genotypu UTT-1 (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají kontrolní vzorek, plná kolečka znamenají vehikulum, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 250 μυ/ml, plné obrácené trojúhelníky znamenají 100 μg/ml, prázdné čtverečky znamenají 10 μg/ml; absorbance 2,0 je maximální hodnotou deskového čítače a nemusí nezbytně reprezentovat buněčný počet);

obr. 15F znázorňuje cytotoxické účinky proti Hela cervikální rakovinné buněčné linii ošetřené různými frakcemi kakaového polyfenylu (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají 100 μρ/ιηΐ frakcí A-E, plná kolečka znamenají 100 μς/πιΐ frakcí A-C, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 100 μρ/ιηΐ frakcí D&E; absorbance 2,0 je maximální hodnotou deskového čítače a nemusí nezbytně reprezentovat buněčný počet);

obr. 15G znázorňuje cytotoxické účinky při 100 μΐ/ml proti SKBE-3 plicní rakovinné buněčné linii ošetřené různými frakcemi kakaového polyfenylu (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají frakcí A-E, plná kolečka znamenají frakcí A-C, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají frakcí D&E);

obr. 15H znázorňuje typický vztah dávka - odezva mezi kakaovou prokyanidinovou frakcí D+E na Hela buňkách (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají kontrolní vzorek, plná kolečka znamenají 100 μg/ml, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 75 μς/πιΐ, plné obrácené trojúhelníky znamenají 50 μς/πιΐ, prázdné čtverečky znamenají 25 μ9/ιη1, plné čtverečky znamenají 10 μς/πιΐ; absorbance 2,0 je maximální hodnotou deskového čítače a nemusí nezbytně reprezentovat buněčný počet);

ý obr. 151 znázorňuje typický vztah dávka - odezva mezi kakaovou prokyanidinovou frakcí D+E na SKBR-3 buňkách (absorbance (540 nm) vs. dny; prázdná kolečka znamenají kontrolní vzorek, plná kolečka znamenají 100 μς/πιΐ, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají 75 μς/ιηΐ, plné obrácené trojúhelníky znamenají 50 pg/ml, prázdné čtverečky znamenají 25 μς/ιηΐ, plné čtverečky znamenají 10 μρ/πιΐ) ;

obr. 15J znázorňuje typický vztah dávka - odezva mezi kakaovou prokyanidinovou frakcí D+E na Hela buňkách získaných za použití testu klonování měkkého agaru (sloupcový graf; počet kolonií vs. kontrolní vzorek, 1, 10, 50 a 100 pg/ml);

obr. 15K znázorňuje růstovou inhibici Hela buněk při jejich ošetření surovými výtažky získanými z osmi různých kakaových genotypů (procenta kontrolního vzorku vs. koncentrace, pg/ml; prázdná kolečka znamenají C-l, plná kolečka znamenají C-2, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají C-3, plné obrácené trojúhelníky znamenají C-4, prázdné čtverečky znamenají C-5, plné čtverečky znamenají C-6, prázdné trojúhelníky znamenají C-7, plné trojúhelníky znamenají C-8; C-1=UF-12, zemědělská odrůda Criollo, surové výtažky UF-12 (Brazílie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-2=NA-33, zemědělská odrůda Forastero, surové výtažky NA-33 (Brazílie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C3=EEG-48, zemědělská odrůda Forastero, surové výtažky EEG12 (Brazílie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-4=neznámý, zemědělská odrůda Forastero, surové výtažky neznámé (západní Afrika) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-5=UF-613, zemědělská odrůda Trinitario, surové výtažky UF-613 (Brazílie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-6=ICS-100, zemědělská odrůda Trinitario, surové výtažky ICS-100 (Brazílie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-7=ICS-139, zemědělská odrůda Trinitario, surové výtažky ICS-139 (Brazílie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných); C-8=UIT-1, zemědělská odrůda Trinitario, surové výtažky UIT-1 (Malajsie) kakaových polyfenolů dekofeinovaných/deteobrominovaných) ;

obr. 15L znázorňuje růstovou inhibici Hela buněk při jejich ošetření surovými výtažky získanými z fermentovaných kakaových bobů a sušených kakaových bobů (stadia úplné fermentace a slunečního sušení; procenta kontrolního vzorku v závislosti na koncentraci, μς/ιηΐ; prázdná kolečka znamenají frakci v den 0, plná kolečka znamenají frakci v den 1, prázdné obrácené trojúhelníky znamenají frakci v den 2, plné obrácené trojúhelníky znamenají frakci v den 3, prázdné čtverečky znamenají frakci v den 4, plné čtverečky znamenají frakci v den 9);

obr. 15M znázorňuje účinky enzymaticky zoxidovaných kakaových prokyanidinů proti Hela buňkám (křivka - dávka odezva pro surový kakaový polyfenol ošetřený polyfenoloxidázou; procenta kontrolního vzorku vs. koncentrace, μς/ιηΐ; plné čtverečky znamenají surový UIT-1 (s kofeinem a teobrominem), prázdná kolečka znamenají UIT-1 (bez kofeinu a teobrominu) a plná kolečka znamenají surový UIT-1 (katalyzovaný polyfenoloxidázou));

obr. 15N znázorňuje reprezentativní polopreparativní HPLC separaci s obrácenými fázemi pro kombinované frakce kakaového prokyanidinů D a E;

obr. 150 znázorňuje reprezentativní polopreparativní HPLC separaci s normální fází surového kakaového polyfenolového výtažku;

obr. 16 znázorňuje typické rancimátové oxidační křivky pro kakaový prokyanidinový výtažek a frakce v porovnání se syntetickými antioxidanty BHA a BHT (zvolené jednotky vs. čas; tečkovaná čára a křížek ( + ) znamená BHA a BHT; * znamená D-E; x znamená surový výtažek; prázdné čtverečky znamenají A-C, prázdné kosočtverce znamenají kontrolní vzorek) ;

obr. 17 znázorňuje typickou indikaci agarozovým gelem inhibice topoisomerásou II katalyzovaného štěpení řetězce kinetoplastové DNA kakaovými prokyanídinovými frakcemi (průchod 1 obsahuje 0,5 μς značkovacích (N) kinetoplastových DNA cyklů s monomerní délkou; průchody 2 a 20 obsahují kinetoplastickou DNA, která byla inkubována topoisomerázou II v přítomnosti 4 % DMSO, ale v nepřítomnosti kakaových prokyanidinů. (Kontrolní -C) ; průchody 3 a 4 obsahují kinetoplastickou DNA, která se inkubovala topoisomerásou II v přítomnosti 0,5 a 5,0 pg/ml kakaové prokyanidinové frakce A; průchody 5 a 6 obsahují kinetoplastovou DNA, která se inkubovala topoisomerásou II v přítomnosti 0,5 a 5,0 μς/πιΐ kakaové prokyanidinové frakce B; průchody 7, 8, 9, 13, 14 a 15 jsou replikami kinetoplastové DNA, která se inkubovala topoisomerásou II v přítomnosti 0,05, 0,5 a 5,0 μς/πιΐ kakaové prokyanidinové frakce D; průchody 10, 11, 12, 16, 17 a 18 jsou replikami kinetoplastové DNA, která se inkubovala topoisomerásou II v přítomnosti 0,05, 0,5 a 5,0 μς/ιηΐ kakaové prokyanidinové frakce E; průchod 19 je replikou kinetoplastové DNA, která se inkubovala topoisomerásou II v přítomnosti 5,0 pg/ml kakaové prokyanidinové frakce E);

obr. 18 znázorňuje dvě závislosti dávka - odezva kakaové prokyanidinové frakce D proti DNA dostatečně a nedostatečně opravených buněčných linií (frakční přežití vs. μς/πιΐ; levá strana xrs-β DNA nedostatečně opravená buněčná linie, MM-1 D D282X1; pravá strana BR1 dostatečně opravená DNA buněčná linie, MM-1 D D282B1);

obr. 19 znázorňuje křivky závislosti dávka - odezva pro MCF-7 buňky rezistentní proti adriamycinu a pro MCF-7 pl68 parentální buněčnou linii, která byla ošetřena kakaovou frakcí D+E (procenta kontrolního vzorku vs.

koncentrace, gg/ml; prázdná kolečka znamenají MCF-7 pl68; plná kolečka znamenají MCF-7 ADR); a obr. 20 znázorňuje účinky dávky - odezvy na Hela buňky, které byly ošetřeny 12 frakcemi, připravenými pomocí polopreparativní HPLC s normální fází při koncentracích 100 μς/ιηΐ a 25 μς/ιηΐ (sloupcový graf, procenta kontrolní v závislosti na kontrolním vzorku a frakcích 1 až 12).

Jak již bylo uvedeno, nyní se překvapivě zjistilo, že kakaové výtažky vykazují protirakovinové, protinádorové nebo protinovotvarové účinky, antioxidační účinky a inhibují DNA topoisomerásový II enzym. Výtažky se zpravidla připravují redukcí kakaových bobů na prášek, odtučněním tohoto prášku a extrahováním účinné sloučeniny nebo sloučenin z takto odtučněného prášku. Prášek lze připravit vymrazením kakaových bobů a dužiny, vylupováním kakaových bobů a dužiny, zbavením vymražených kakaových bobů slupek a rozemletí slupek zbavených bobů. Extrakci účinné sloučeniny nebo sloučenin lze provést jako rozpouštědlovou extrakci. Takto získané výtažky lze čistit např. gelovou permeační chromatografii nebo preparativní vysokovýkonnou kapalnou chromatografii (HPLC) nebo kombinací těchto technik. Bez toho, že bychom se opírali o určitou teorii, identifikovaly se výtažky, které mají účinnost jako kakaové polyfenoly např. prokyanidiny. Tyto kakaové prokyanidiny mají vysokou protirakovinovou, protinádorovou nebo protinovotvarovou účinnost, antioxidační účinnost a inhibují DNA topoisomerásový II enzym.

Protirakovinové, protinádorové nebo protinovotvarové, antioxidační a DNA topoisomerásový II enzym inhibující kompozice, které obsahují kakaové polyfenoly nebo prokyanidiny podle vynálezu, lze připravit za použití standardních ve farmaceutickém průmyslu dobře známých technik. Tyto kompozice mohou být pacientovi v případě potřeby takového podání podávány v dávkách a způsoby v lékařství dobře známými, přičemž při volbě dávek a způsobů podání je třeba vzít v úvahu takové faktory, jakými jsou věk, pohlaví, hmotnost a celkový stav příslušného pacienta. Kompozice mohou být podávány současně s dalšími antineoplastickými, protirakovinovými nebo protinádorovými činidly nebo antioxidanty nebo DNA topoisomerásový II enzym inhibujícími činidly a/nebo s činidly, která zmírňují nežádoucí účinky antineoplastických protirakovinových, protinádorových, antioxidačních nebo DNA topoisomerásový II enzym inhibujících činidel, popř. následně po podání těchto činidel, přičemž je opět třeba vzít v úvahu takové faktory, jakými jsou věk, pohlaví, hmotnost a celkový stav příslušného pacienta a způsob podání.

Mezi příklady kompozic podle vynálezu lze zahrnout pevné kompozice pro orální podání, např. kapsle, tablety, pilule a pod., stejně jako žvýkatelné pevné kompozice, které jsou pro vynález zvláště vhodné, protože pochází z poživatelných zdrojů (např. pevné kompozice s kakaovou, příp. čokoládovou příchutí); kapalné preparáty, např. pro orální, nazální, anální a vaginální podání, např. suspenze, sirupy nebo elixíry; a přípravky pro parentální, subkutální, intradermální, intramuskulární nebo intravenózní podání (např. injektovatelné podání), zejména sterilní suspenze nebo emulze. Avšak účinná složka v kompozicích může tvořit komplex s proteiny, např. tehdy, pokud se aplikuje do krevního proudu, přičemž v tomto případě může dojít ke srážení v důsledku vysrážení krevních proteinů, což by měl odborný lékař vzít v úvahu. V těchto kompozicích může být účinný kakaový extrakt v předsměsi s vhodným nosičem, ředidlem nebo masťovým základem, např. sterilní vodou, fyziologickým roztokem nebo glukózou. Účinný kakaový výtažek podle vynálezu může být poskytnut v lyofilizované formě, např. v isotonickém vodném, solném pufru.

Vynález rovněž zahrnuje sadu poskytující účinný kakaový výtažek. Tato sada může zahrnovat samostatný zásobník obsahující vhodný nosič, ředidlo nebo masťový základ. Tato sada může rovněž zahrnovat další protirakovinové, protinádorové činidlo nebo antioxidant nebo topoisomerásový II enzym a/nebo činidlo, které zmírňuje nežádoucí účinky antineoplastických protirakovinových, protinádorových, antioxidačních nebo DNA topoisomerásový II enzym inhibujících činidel pro souběžné nebo následné podání. Toto další činidlo nebo činidla mohou být poskytována v samostatném zásobníku nebo zásobnících nebo ve směsi s účinným kakaovým výtažkem. Kromě toho může tato sada zahrnovat instrukce pro směšování nebo kombinování jednotlivých složek a/nebo pro podání.

nebo protinovotvarové činidlo inhibující DNA

Vynález se tedy týká syntetických kakaových polyfenolů nebo prokyanidinů nebo jejich derivátů, které zahrnují např. glykosidy, galláty, estery, atd..

Následující neomezující příklady mají prezentovat některé varianty provedení vynálezu bez toho, že by omezovaly rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1: Zdroj kakaa a způsob přípravy

Z tří hlavních světových oblastí produkujících kakao se získalo několik genotypů Theobroma cacao, které reprezentují tři zemědělské odrůdy kakaa (Enriquez, G. A. a Soria, J. V., Cocoa Cultivars Register IICA, Turrialba, Costa Rica (1967); Engels, J. Μ. M., Genetic Resources of Cacao: katalog CATIE Collection, technický buletin 7, Turrialba, Costa Rica (1981)). Seznam genotypů použitých v této studii je uvedeno v tabulce 1. Sklizené kakaové tobolky se otevřely a boby s dužinou se separovaly vymrazenim. Dužina se ručně vyjmula s vymrazené hmoty a boby se vystavily následné analýze. Nefermentované, vymrazené kakaové boby se nejprve ručně zbavily slupek a pomocí mlýnu TEKMAR namlely na jemnou práškovitou hmotu. Výsledná hmota se následně přes noc odtučňovala za použití Soxhletovy extrakce, při které se jako rozpouštědlo použil předestilovaný hexan. Zbytek rozpouštědla se z odmaštěné hmoty odstranil za pomoci vakua při pokojové teplotě.

Tabulka 1

Popis materiálového zdroje Theobroma. cacao
Genotyp	Původ	Zahradnická odrůda
UIT-1	Mala j sie	Trinitario
Neznámý	Západní Afrika	Forastero
ICS-100	Brazílie	Trinitario
ICS-39	Brazílie	Trinitario
UF-613	Brazílie	Trinitario
EEG-48	Brazílie	Forastero
UF-12	Brazílie	Criollo
NA-3 3	Brazílie	Forastero

Příklad 2: prokyanidinové extrakční postupy

A. metoda 1

Prokyanidiny se extrahovaly z odtučněných nefermentovaných vymrazených kakaových bobů z příkladu 1 za použití modifikace metody popsané Jalalem, M.A.F. a Collinem, H.A. v článku „Polyphenols of Mature Plant, Tissue Cultures of

6, 1377-1380 (1978) g dávek odtučněné kakaové hmoty dvakrát roztoku acetonu v deionizované vodě a následně 400 ml 70 % methanolu v deionizované vodě. Po shromáždění se rozpouštědla odpařila při teplocě 45°C pomocí rotační

Seedling and Phytochemistry, extrahovaly z 400 ml 70

Theobroma cacoa Prokyanidiny se odparky udržované v parciálním podtlaku. Výsledná vodná fáze se doředila do jednoho litru deionizovanou vodou a extrahovala dvakrát 400 ml CHCI3. Rozpouštědlová fáze se zlikvidovala. Vodná fáze se následně extrahovala čtyřikrát 500 ml acetátu. Výsledné emulze se odstřeďovaly na odsředivce Sorvall RC 28S, pracující při 2 000 xg za 30 minut při 10°C. Ke sloučených ethylacetátovým extraktům se přidalo 100 až 200 ml deionizované vody. Rozpouštědlo se opět odpařilo při 45°C pomocí rotační odparky udržované pod parciálním podtlakem. Výsledná vodná fáze se vymrazila v kapalném dusíku a následně na vymrazovacím systému LABCONCO. Výtěžky surových prokyanidinů, které byly získány z různých kakaových genotypů jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

Výtěžky surových prokyanidinů

Genotyp Původ Výtěžky (g)

UIT-1	Malaj sie	3,81
Neznámý	Západní Afrika	2,55
ICS-100	Brazílie	3, 42
ICS-39	Brazílie	3,45
UF-613	Brazílie	2, 98
EEG-43	Brazílie	3,15
UF-12	Brazílie	1,21
NA-3 3	Brazílie	2,23

B.

metoda 2

Alternativně lze prokyanidiny extrahovat z odtučněných nefermetovaných vymrazených kakaových bobů z příkladu 1 70 % vodným roztokem acetonu. 10 g odtučněnéno materiálu se 5 až 10 min suspenzovalo ve 100 ml rozpouštědla. Tato suspenze se odstřeďovala 15 min při 4°C při 3 000 xg a supernatant se nechal projít skelnou vatou. Získaný filtrát se podrobil destilaci v parciálním podtlaku a výsledná vodná fáze se vymrazila v kapalném dusíku a následně ve vymrazovacím systému LABCONCO. Výtěžky surových prokyanidinů se pohybovaly v rozmezí od 15 do 20 %. Aniž bychom se vázali na určitou teorii, je zřejmé, že rozdíly v surových výtěžcích odrážejí variace , kterých se dosáhlo za použití různých genotypů, geografických původů, zemědělských odrůd a způsobu přípravy.

Příklad 3: částečné čištění kakaových prokyanidinů

A. gelová permeační chromatografie

Prokyanidiny získané z příkladu 2 se částečně vyčistily kapalinovou chromatografii v koloně SEPHADEX LH20 (28 x 2,5 cm). K separování se použije krokový gradient do deionizované vody. Separace se zahájila s gradienčním složením 15 % methanolu v deionizované vodě, přičemž dále krokově každých 30 min následovala postupně separace pomocí 25 % methanolu v deionizované vodě, 35 % methanolu v deionizované vodě, 75 % methanolu v deionizované vodě a konečně 100 % methanolu. Plynule eluované xanthinové alkaloidy (kofein a teobromin) se shromáždily jako jediná frakce. Frakce poskytující podfrakci prostou xanthinových alkaloidů byla podrobena další separaci, která poskytla 5 podfrakci, označených MM2A až MM2E. Rozpouštědlo se z jednotlivých podfrakcí odstranilo odpařením při 45°C pomocí rotační odparky udržované pod částečným podtlakem. Výsledná vodná fáze se zmrazila v kapalném dusíku a přes noc vymrazovala na vymrazovacím systému LABCONCO. Reprezentativní chromatogram gelové permeace znázorňující tuto frakci je zobrazen na obrázku 1. Tímto způsobem se frakcionovalo přibližně 100 mg materiálu.

Obrázek 1 znázorňuje gelový permeační chromatogram surových prokyanidinů získaný na Sephadexu LH-20.

Chromatografické podmínky: kolona Sephadex LH-20, x 2,5 cm, mobilní fáze: krokový gradient methanoiu a vody 15:85, 25:75, 35:65, 70:30 a 100:0, krokován v půlhodinových intervalech, průtok: 1,5 ml/min, detektor UV@ λχ = 254 nm a λ₂ = 365 nm, rychlost posunu papíru zapisovače: 0,5 mm/min, hmotnost pevné fáze: 120 mg.

B. polopreparativní vysokovýkonnostní kapalná chromatografie (HPLC) metoda 1: separace s reverzními fázemi

Prokyanidiny získané z příkladu 2 a/nebo 3A se částečně vyčistily polopreparativní HPLC. HPLC systém Hewlett Packard 1050, vybavený detektorem s proměnnou vlnovou délkou, vstřikovacím ventilem Rheodyne 7010 s 1 ml injektážní smyčkou se zkompletoval s frakčním kolektorem Pharmacia FRAC-100. Separace se prováděly na koloně Phenomenex Ultracarb 10μ ODS ochrannou kolonou (250 x 22,5 mm) spojené s Phenomenex Ultracarb 10μ ODS (60 x 10 mm). Mobilní fázi tvořila A=voda; B=methanol, použité za následujících lineárních gradienčních podmínek:

.oas,

A); (0,85), (60, 50) (90, 0) (110, 0) při průtoku 5 ml/min. Reprezentativní záznam polopreparativní

HPLC je znázorněn na obrázku 15n a ukazuje separaci prokyanidinů přítomných ve frakci D+E. Jednotlivé píky nebo selektivní chromatografické oblasti se shromáždily v určitých časových intervalech. Hmotnost pevné fáze se pohybovala v rozmezí od 25 do 100 mg materiálu.

metoda 2: normální fázová separace

Prokyanidinové výtažky získané z příkladů 2 a/nebo 3A se částečně vyčistily polopreparativní HPLC. HPLC systém Hewlett Packard 1050 a detektor Millipore-Waters model 480 LC nastavený na 254 nm se zkompletovaly s frakčním kolektorem Pharmacia FRAC-100 nastaveným v pákovém kódu. Separace se Supelco 5u Supelcosil LC-Si ochrannou kolonou prováděly v koloně (250 x 100 mm) spojené

Supelco 5μ Supelguard LC-Si (20 x 4,6 mm). Prokyanidy se eluovaly lineárním gradientem za následujících podmínek: (čas, % A, % B) ; (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), načež následovalo 10 minutové ustálení. Mobilní fázi tvořily A=dichloromethan; B=methanol; C=směs kyseliny octové a vody (1:1). Použitým průtokem byl průtok 3 ml/min. Složky se detekovaly pomocí UV záření při 254 nm a zaznamenaly na záznamník Kipp & Zonan VD41. Vstřikované objemy se pohybovaly v rozmezí od 100 do 250 μΐ 10 mg prokyanidinovýcn výtažků rozpuštěných v 0,25 ml 70 % vodného roztoku acetonu. Reprezentativní záznam polopreparativní HLPC znázorňuje obrázek 15o. Jednotlivé píky nebo selektivní chromatografické oblasti se shromáždily v časových intervalech nebo ručně shromážděním frakcí pro další čištění a následné vyhodnocení.

Podmínky HPLC:

Supelco 5u Supelcosil LC-Si polopreparativní (250 x 100 mm) kolona spoj ené ochrannou kolonou Supelco 5μ Supelguard LC-Si (20 x 4,6 mm) a detektor Millipore-Waters model 480 LC nastavený na 254 nm, průtok: 3 ml/min, teplota kolony: okolní teplota, vstřikování: 250 μΐ 70 % vodného acetonového výtažku.

Gradient:	Kyselina octová/H20 (1:1)
Čas (min)	ch2ci2	Methanol
0	82	14	4
30	67,6	28,4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

Tímto způsobem se získaly následující frakce:

FRAKCE	TYP
1	dimery
2	trimery
3	tetramery
4	pentamery
5	hexamery
6	heptamery
7	oktamery
8	nonamery
9	dekamery
10	undekamery
11	dodekamery
12	vyšší oligomery

Příklad 4: analytická HPLC analýza prokyanidinových výtažků metoda 1: separace s reverzními fázemi

Prokyanidoné extrakty získané z příkladu 3 se přefiltrovaly přes 0,45 μ filtr a analyzovaly pomocí HPLC ternárního systému Hewlett Packard 1090 opatřeným diodovým detektorem a programovatelným fluorescenčním detektorem HP model 1046A. Separace se prováděly při 45°C na koloně Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS (200 x 2,1 mm). Flavanoly a prokyanidiny se eluovaly lineárním gradientem 60 % B v , načež se kolona promyla eluční složkou B, jejíž průtok byl 0,3 ml/min. Mobilní fáze byla tvořena (B) 0,5 % kyselinou octovou v methanolu a (A) 0,5 % kyselinou octovou ve vodě. Koncentrace kyseliny octové v mobilních fázích A a B se mohla zvýšit až na 2 %. Složky byly detekovány fluorescenční metodou, přičemž λ_εχ=276 nm a X_em=316 nm. Koncentrace (+)-katechinonu a (-)-epikatechinu se určily vzhledem k referenčním standardním roztokům. Koncentrace prokyanidinu se určily pomocí odezvového faktoru, určeného pro (-)epikatechin. Reprezentativní HPLC chromatogram ukazující separaci různých složek je znázorněn na obrázku 2A pro jeden kakaový genotyp. Podobné HPLC profily lze získat i z dalších kakaových genotypů.

HPLC podmínky: kolona: Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS (200 x 2,1 mm) spojené ochrannou kolonou Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS (200 x 2,1 mm) opatřeným diodovým detektorem nastaveným na 289 nm a programovatelnými fluorescenčním detekrorem, kde λ_ΘΧ=276 nm a X_em=316 nm. Průtok: 3 ml/min. Teplota kolony: 45°C.

Gradient: Čas (min)	0,5 % kyseliny octové v deionizované H2O	0,5 % kyseliny octové v methanolu
0	100	0
50	40	60
60	0	100

metoda 2: normální fázová separace

Prokyanidoné extrakty získané z příkladu 3 se přefiltrovaly přes 0,45 μ filtr a analyzovaly pomocí HPLC ternárního systému Hewlett Packard 1090 opatřeným diodovým detektorem a programovatelným fluorescenčním detektorem HP model 1046A. Separace se prováděly při 37 °C na koloně 5μ Phenomenex Lichrosphere Silica 100 (250 x 3,2 mm) spojené s ochrannou kolonou Supelco Supelguard LC-Si 5μ (20 x 4,6 mm). Prokyanidiny se eluovaly lineárním gradientem za následujících podmínek (čas, % A, % B); (0,

62, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), načež následovalo 8 minut pro dosažení rovnováhy. Mobilní fázi tvořily A=dichloromethan, B=methanol a C=směs kyseliny octové a vody (objemový poměr 1:1). Použil se průtok 0,5 ml/min. Složky se stanovily fluorescenční metodou, při které λ_εχ=27 6 nm a k_etn=316 nm nebo UV metodou při 280 nm. Reprezentativní HPLC chromatogram, který ukazuje separaci různých prokianidinů, je pro jeden genotyp znázorněn na obrázku 2B. Podobné HPLC profily lze získat i z dalších kakaových genotypů.

HPLC podmínky: kolona 5μ Phenomenex Lichrosphere Silica 100 (250 x 3,2 mm) spojená s ochrannou kolonou Supelco Supelguard LC-Si 5μ (20 x 4,6 mm), detektory: fotodiodové seskupení nastavené na 280 nm, fluorescenční X_ex=276 nm a X_em=316 nm, průtok: 0,5 ml/min, teplota kolony: 37°C.

Gradient: Čas (min)	ch2-ci2	(1:1)	Kyselina octová/H20
0	82	14	4
30	67,6	28,4	4
60	46	50	4
65	10	86	4
70	10	86	4

Příklad 5: identifikace prokyanidinu

Prokyanidiny se čistily kapalinovou chromatografii na kolonách Sephadex LH-20 (28 x 2,5 cm) a následně polopreparativní HPLC za použití kolony 10μ μBundapak C18 (100 x 8 mm) nebo polopreparativní HPLC za použití kolony 5μ Supercosil LC-Si (250 x 10 mm).

Částečně vyčištěné isoláty se analyzovaly bombardováním rychlenými atomy - hmotnostní spektrometrií (FAB-MS) na VG ZAB-T MS systému s vysokým rozlišením za použití kapalinové sekundární iontové hmotnostní spektrometrické (LSIMS) techniky v pozitivním a negativním iontovém modelu. Jako zdroj ionizace se použila césiova iontová pistole při 30 kV a „Magická střelová matrice (1:1 dithiotreitol/dithioerythritol) se použila jako protonový donor.

Analytické testování těchto frakcí pomocí LSIMS odhalilo přítomnost celé řady flavan-3-olových oligomerů, které jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

LSIMS (pozitivní iont) údaje získané z frakcí kakaových prokianidinů

Oligomer	(N+l)+ m/ z	(M+Na) + m/z	Molární hmotnost
Monomery (katechiny)	291	313	290
Dimer(y)	577/579	599/601	576/578
Trimer(y)	865/867	887/889	884/866
Tetramer(y)	1 155	1177	1154
Pentamer(y)	1 143	1 465	1442
Hexamer(y)	1 731	1 753	1730
Heptamer(y)	-	2 041	2018
Oktamer(y)	-	2 329	2306
Nonamer(y)	-	2 617	2594
Dekamer(y)	-	2 905	2882
Undekamer(y)	-	3 170
Dodekamer(y)	-	-	3458
Hlavní hn	lotnostní fragmentové ionty se	shodovaly s
již dříve vypr	acovanými pracemi,	týkajícími se	pozitivních

a negativních iontových FAB-MS analýz prokyanidinů (Šelf R. , Eagles J., Galletti G.C., Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Lee A.G.H., Magnolato D., Richli U., Gujur R.

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry of Syn Vegetable Tannins), Biomed Environ. Mass a Haslam E Polyphenols

Spec. 13, 449-468 (1986) Porter L.J., Ma Z., Chán B.G.,

Cocoa Procyanidins: Major Flavanoids and Identification of

Minor Metabolites, (1991)). Iont, odpovídající m/z 577 (M+H.

adukt při m/z 599 (M+Ma)⁺ předpokládá přítomnost prokyanidinových dimerů s dvojnou vazbou. Prokyanidinové isomery B-2, B-5 a C-l se předběžně stanovily na základě v závorce uvedených prací (Revilla E., Bourzeix M. a Alonso E., Analysis of Catechins and Procianidins in Grape Seeds by HPLC with Photodiode Array Detection, Chromatographia 31, 465-468 (1991) Šelf R.,

Eagles J., Galletti G.C., Mueller-Harvey I., Hartley R.D., Lee A.G.H., Magnolato D., Richli U., Gujur R. a Haslam E., Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry of Polyphenols (Syn Vegetable Tannins), Biomed Environ. Mass Spec. 13, 449-468 (1986) Porter L.J., Ma Z., Chán B.G., Cocoa Procyanidins:

and Identification of Some Minor Hytochemistry, 30, 1657-1663 (1991)).

v částečně vyčištěných frakcích konče

Some

Hytochemistry,

30, 1657-1663 ⁺ a jeho sodný v isolátech

Major Flavanoids Metabolites, Prokyanidiny oktamerem a dekamerem se ověřily pomocí FAB - hmotnostní spektrometrie, kromě toho přítomnost prokyanidinů, konče dodekamerem se zjistila rovněž normální fázovou HPLC analýzou (viz obr. 2B) . Aniž bychom se chtěli vázat na určitou teorii, dá se předpokládat, dodekameru v rozpouštědlech použitých čištění je poněkud omezená. Tabulka 4 uvádí relativní koncentrace prokyanidinů nalezených v izolátech prostých že rozpustnost při extrakci a xanthinových alkaloidů na základě reverzní fázové HPLC analýzy. Tabulka 5 uvádí relativní koncentrace prokyanidinů určené pomocí normální fázové HPLC analýzy.

Tabulka 4

Relativní koncentrace prokyanidinů v isolátech prostých xanthinových alkaloidů

Složka	Molekulová hmotnost	Množství
(+)-katechin	290	1,6
(-)-epikatechin	290	38,2
B-2 dimer	578	11,0
B-5 dimer	578	5,3
C-l trimer	866	9,3
Dimery s dvojnou vazbou	576	3,0
Tetramer(y)	1 154	4,5
Pentymer-oktamer	1 442-2 306	24,5
Neznámé a vyšší	-	2, 6

oligomery

Tabulka 5

Relativní koncentrace prokyanidinů ve vodných acetonových výtažcích

Složka	Molekulová hmotnost	Množství
(+)-katechin a (-)-epikatechin	290 (stejná pro oba)	41,9
B-2 dimer a B-5 dimer	578	13,9
Trimery	884/866	11,3
Tetramery	1 154	9, 9
Pentamery	1 442	3,8
Hexamery	1 730	5,1
Heptamery	2 018	4,2
Oktamery	2 306	2,8
Nonamery	2 594	1,6
Dekamery	2 882	0,7
Undekamery	3 170	0,2
Dodekamery	3 458	<0,1

Obrázek 3 znázorňuje několik prokyanidinových struktur a obrázky 4A až 4B znázorňují reprezentativní HPLC chromatogramy pěti frakcí použitých při následujícím určováním protirakovinové nebo protinovotvarové účinnosti.

Podmínky pro vysokovýkonnostni kapalinové chromatografie pro obrázky 4A až 4E byly následující:

Podmínky HPLC: ternární HPLC systém Hewlett Packard 1090 vybavený programovatelným fluorescenčním detektorem HP model 1046A. Kolona: Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS (200x 2,1 mm) lineární gradient 60 % B v A při průtoku 0,3 ml/min. B=0,5 % kyseliny octové v methanu; A=0,5 % kyseliny octové v deionizované vodě. λ_θχ=280 nm; X_em=316 nm.

Obrázek 15 O znázorňuje reprezentativní chromatogram polopreparativní vysokovýkonnostní kapalinové chromatografie pro dalších 12 frakcí, použitých při zjišťování protirakovinové nebo protinovotvarové účinnosti (pro HPLC podmínky platí výše vymezené podmínky).

Příklad 6: protirakovinová, protinádorová nebo protinovotvarová účinnost kakaových výtažků (prokyanidinů)

Pro testování vzorků z příkladu 5 se použilo MTT (3[4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5difenyltetrzoliumbromid)mikrotitrové destičkové tetrazoliové cytotoxické seskupení původně vyvinuté Mosmannem T., a popsaném v „Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytoxicity Assays, J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983). Testované vzorky, standardy (cysplatin a chlorambucil) a MTT reagenční činidla se rozpustily ve 100 % DMSO (dimethylsufoxidu) při koncentraci 10 mg/ml. Ze zásobních roztoků se připravila celá řada naředěných vzorků. V případě testovaných vzorků se připravily naředěné vzorky obsahující 0,01 až 100 μς/πιΐ v 0,5 % DMSO.

_t - 97 V/;

A '/ 7

Všechny lidské nádorové buněčné linie se zťskalCýýlf americké sbírky typových kultur. Buňky se nechaly růst ve formě monovrstev v alfa-MEM obsahujícím 10 % plo“dověho bovinního séra 100 jednotek/ml penicilínu, 10 gg/ml streptomycinu a 240 jednotek/ml nystatinu. Buňky se udržovaly ve zvlhčené 5 % CO₂ atmosféře při teplotě 37 °C.

Po trypsinizaci se buňky sečetly a nastavily na koncentraci 50 x 10³ buněk/ml (lišících se v závislosti na příslušné rakovinové buněčné linii). 200 μΐ buněčné suspenze se umístilo do jamek čtyřřadé, 96 jamkové mikrotitrační plotny. Potom, co se buňky nechaly po dobu 4 hodin přichytit se vždy do kvadruplexových jamek přidaly μΐ

DMSO obsahujícího roztoky testovaného vzorku.

Počáteční experimenty, zjišťující závislost na dávce, vyuzivajíci řadu různě naředěných testovacích vzorků se použily ke stanovení rozmezí dávek, které mají být testovány. Absorbance jamek při 540 nm se posléze změřily na BIO RAD MP450 plotnovém čítači. Průměrná absorbance testovaného vzorku získaná zprůměrováním výsledků pro čtyři vzorky se porovnala s kontrolními výsledky pro standardy a výsledky se vyjádřily jako procento kontrolní absorbance + /- standardní odchylka. Redukce MTT na nachový formazanový produkt lineárně koreluje s počtem živých buněk v jamce. Takže měřením absorbance redukčního produktu lze získat kvantování procent buněčného přežití v dané dávce testovaného vzorku. Kontrolní jamky obsahují finální koncentraci 1

DMSř

Tímto postupem se nejprve testovaly 2 vzorky. Vzorek MM1 představoval zcela surový isolát kakaových prokyanidinů a obsahoval nezanedbatelné množství kofeinu a teobrominu. Vzorek MM2 reprezentoval kakaový prokyanidinový isolát částečně vyčištěný gelovou permeační chromatografií. Kofein a teobromin nebyly ve vzorku MM2 přítomny. U obou vzorků se pomocí již popsaných procedur určovala účinnost proti následujícím rakovinovým buněčným liniím:

HCT-116 rakovina tlustého střeva ACHN ledvinový adenokarcinom SK-5 melanom

A498 ledvinový adenokarcinom MCF-7 prsní rakovina PC-3 rakovina prostaty CAPA-2 rakovina slinivky.

Co se týče MM1, zjistilo se, že jeho účinnost na výše vyjmenované rakovinové buněčné linie je pouze malá nebo vůbec žádná. U MM2 se zjistila určitá účinnost proti HCT116, PC-3 a ACHN rakovinovým buněčným liniím. Nicméně se ukázalo, že jak MM1, tak MM2 interferují s MTT reakčním činidlem, takže přišívají ke snížení absorbance, které by mohlo odrážet snížení počtu buněk schopných existence. Tato interference rovněž přispívá k velkým sloupcům chyb, protože se zdá, že chemická reakce, probíhající v jamkách v obvodu plata, probíhá mnohem rychleji. Typický příklad těchto jevů je znázorněn na obrázku 5. Při vysokých koncentracích testovaného materiálu se dá očekávat, že dojde k velkému poklesu přežívajících buněk. Nicméně mikroskopická pozorování ukázala, že k cytotoxickým účinkům dochází navzdory MTT interferenčním vlivům. Tímto způsobem se získala např. pro účinnost MM2 na ACHN buněčné linii hodnota IC50 0,5 gg/ml. Tyto předběžné výsledky si z pohledu vynálezce vyžádaly úpravu testovacích postupů tak, aby se vyloučila interference s MTT. Toho se dosáhlo následujícím způsobem. Po inkubování ploten při 37°C ve zvlhčené 5 % CO: atmosféře, které trvalo 18 hodin se médium opatrně odsálo a nahradilo čistým alfa-MEM médiem. Toto médium se v třetí den provádění testu z jamek opět odsálo a nahradilo 100 μΐ čerstvě připraveného McCoyova média. Do jamek všech plat se následně přidalo 11μ1 5 mg/ml zásobního roztoku MTT v PBS (fosfátem pufrovaný solný roztok). Po 4 hodinové inkubaci ve zvlhčené 5 % CO₂ atmosféře při 37°C se do všech jamek plotny přidalo 100 μΐ 0,04N HC1 v isopropanolu a následně se směsi intenzívně míchaly s cílem rozpustit formazan produkovaný všemi životaschopnými buňkami. Navíc bylo rozhodnuto, stanovit specifické složky podfrakcí prokyanidinů zodpovědné za tyto účinky.

Separační postupy, které již byly popsány pro přípravu subfrakcí se použily pro přípravu vzorků pro další testování. Připravilo se pět frakcí, reprezentujících oblasti znázorňující na obrázku 1 a distribuci složky a složek znázorněnou na obrázku 4A až 4E. Vzorkům se přiřadily kódy MM2A až MM2E, které odrážejí jejich analytické vlastnosti a označují nepřítomnost kofeinu a teobrominu.

U každé frakce se jednotlivě zjišťovala účinnost proti HCT-116, PC-3 a ACHN rakovinovým buněčným liniím. Výsledky neprokázaly účinnost žádné ze specifických frakcí. Tento výsledek lze považovat za neobvyklý, protože složky v „aktivních přírodních produkčních isolátech se mohou chovat synergicky. V případě kakaového prokyanidinového isolátu (MM2) isolát obsahoval více než 20 detekovatelných složek. Předpokládalo se, že je možné, aby se účinnost týkala spíš, než jednotlivé složky nebo složek kombinace složek, přítomných v různých frakcích. Na základě těchto výsledků se rozhodlo o zkombinování frakcí a testy zaměřené na účinnost proti stejným rakovinovým buněčným liniím se zopakovaly. Několik frakčních kombinací produkovalo cytotoxické účinky proti PC-3 rakovinovým buněčným liniím, přesněji pro kombinaci MM2A a MM2E představovaly IC₅₀ hodnoty 40 μς/τηΐ a pro kombinace MM2C a MM2E se získala IC50 hodnota 20 μς/πιΐ. Rovněž byla zaznamenána účinnost proti HCT-116 a ACHN buněčným liniím, ale jako v předcházejícím případu interference s MTT indikátorem znemožnily přesná pozorování. Shodné experimenty se opakovaně provedly HCT-116 a ACHN buněčných liniích s cílem zlepšit výsledná data. Nicméně tyto výsledky byly neprůkazné, vzhledem k bakteriální kontaminaci a vyčerpání materiálu testovaného vzorku. Obrázky 4A až 6D ukazují závislost odezvy na dávce mezi kombinacemi kakaových výtažků a PC-3 rakovinnýmh buňkám. Nicméně z těchto údajů je zřejmé, že kakaové výtažky, zejména kakaové polyfenoly nebo prokyanidiny mají značnou protinádorovou, protirakovinovou nebo protinovotvarovou účinnost zejména co se týče lidských rakovinných buněčných linií PC-3 (prostaty), HCT-116 (tlustého střeva) a ACHN (ledvin). Kromě toho tyto výsledky naznačují, že za účinnost proti PC-3 buněčné linii mohou být zodpovědné specifické prokyanidinové frakce.

Příklad 7: protirakovinové, protinádorové nebo protinovotvarová účinnost kakaových výtažků (prokyanidinů)

Za účelem potvrzení výše uvedených zjištění a za účelem studií dalších kombinací frakcí se provedly další srovnávací testy. Všechny připravené materiály a postupy byly shodné s výše popsanými materiály a postupy s tou výjimkou, že se standardní 4 opakování testované dávky zvýšily na 8 nebo 12 opakování testované dávky. Při těchto studiích se posuzovala účinnost jednotlivých pěti kakaových prokyanidinových frakcí a jejich kombinací proti následujícím rakovinovým buněčným liniím:

HCT-116 rakovina tlustého střeva ACHN ledvinový adenokarcinom SK-5 melanom

KB Nasofaryngeální/HeLa MCF-7 prsní rakovina PC-3 rakovina prostaty A-549 plíce

CCRF-CEM T-buněčná leukemie.

Jednotlivé testy zjišťovaly účinnost různých koncentrací dávek (0,01 až 100 μς/πιΐ) frakcí A, B, C, D a E (viz obr. 4A až 4E a s nimi související popis) proti jednotlivým buněčným liniím. Kombinační testy zjišťovaly účinnost stejných dávkových koncentrací frakcí A+B, A+C, A+D, A+E, B+C, B+D, B+E, C+D, C+E a D+E proti jednotlivým buněčným liniím. Výsledky těchto testů jsou diskutovány jednotlivě a následně v celkovém souhrnu.

A. PC-3 buněčná linie prostaty

Obrázky 7A až 7H znázorňují typickou závislosr odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi a PC-3 buněčnou linií. Obr. 7D a 7E ukazují, že frakce D a E byly účinné při hodnotě IC₅₀ 75 pg/ml. Hodnoty IC₅₀ získané z křivek závislosti dávka - odezva dalších kombinací pokyanidinových frakcí se v případě, že tyto kombinace obsahovaly frakci D nebo E, pohybovaly v rozmezí od 60 do 80 ug/ml. Jednotlivé IC50 hodnoty jsou shrnuty v tabulce 6.

B. K3 nazofaryngeální/HeLa buněčná linie

Obrázky 8A až 8H znázorňují typickou závislost odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi a KB nazofaryngeální/HeLa buněčnou linií. Obr. 8D a 8E ukazují, že frakce D a E byly účinné při hodnotě IC₅₀ 75 μρ/ιηΐ. Obrázek 8F až 8H znázorňují reprezentativní výsledky získané ze studie kombinací frakcí. V tomto případě nemá kombinace prokyanidinových frakcí A+B žádný účinek, přičemž kombinace frakcí B+E a D+E byly účinné při IC50 hodnotě 60 μg/ml. IC50 hodnoty získané z křivek závislosti dávka odezva dalších kombinací prokyanidinových frakcí se v případě, že tyto kombinace obsahovaly frakci D nebo E, pohybovaly v rozmezí od 60 do 80 μρ/πιΐ. Jednotlivé ICs_C hodnoty jsou shrnuty v tabulce 6. Tyto výsledky jsou v podstatě shodné s výsledky získanými při určování účinnosti proti PC-3 buněčné linie.

C. HCT-116 buněčná linie tlustého střeva

Obrázky 9A až 9H znázorňují typickou závislost odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi a HCT-116 buněčnou linií tlustého střeva. Obr. 9D a 9E ukazují, že frakce D a E byly účinné při hodnotě IC₅₀ přibližně 400 μρ/πιΐ. Tato hodnota se získala extrapolací z existující křivky. Je třeba uvést, že sklon křivky dávka -odezva pro frakci D rovněž naznačuje účinnost. Nicméně pro tuto frakci se hodnota IC50 nestanovila, protože sklon této křivky byl příliš plochý pro získání věrohodných hodnot. Obrázek 9F až 9H znázorňují reprezentativní výsledky získané ze studie kombinací frakcí. V tomto případě nevykazuje kombinace prokyanidinových frakcí B+D podstatnější účinek, přičemž kombinace frakcí A+E a D+E byly účinné při IC₅₀ hodnotě 500 μg/ml, resp. 85 μς/ιηΐ. IC = _;. hodnoty získané z křivek závislosti dávka - odezva dalších kombinací prokyanidinových frakcí se v případě, že tyto kombinace obsahovaly frakci E, dosahovaly přibližně 250 μς/πιΐ. Extrapolované IC50 hodnoty jsou shrnuty v tabulce 6.

D. ACHN ledvinová buněčná linie

Obrázky 10A až 10H znázorňují typickou závislost odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanídinovými frakcemi a ACHN ledvinovou buněčnou linií. Obr. 10A a 10E ukazují, že žádná jednotlivá frakce nebyla proti této linii účinná. Obrázek 10F až 10H znázorňují reprezentativní výsledky získané ze studie kombinací frakcí. V tomto případě nemá kombinace prokyanidinových frakcí B+C žádný účinek, přičemž kombinace frakcí A+E byly účinné při IC50 hodnotě 500 μς/ιηΐ, přičemž tato hodnota se zjistila extrapolací z existující křivky. Křivky závislosti dávka - odezva podobné křivce kombinace C+D byly považovány za neúčinné, protože jejich sklon byl příliš plochý. Extrapolované IC₅₀ hodnoty pro další frakční kombinace jsou shrnuty v tabulce 6.

E. A-549 plicní buněčná linie

Obrázky 11A až 11H znázorňují typickou závislost odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanídinovými frakcemi a A-549 plicní buněčnou linií. V tomto testu nebylo při použitých dávkách jednotlivých frakcí ani kombinací frakcí dosaženo žádného účinku. Nicméně prokyanidinové frakce mohou mít v souvislosti s touto buněčnou linií určitý účinek.

F. SK-5 melanomová buněčná linie

Obrázky 12A až 12H znázorňují typickou závislost odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanídinovými frakcemi a SK-5 melanomovou buněčnou linií. V tomto testu nebylo při použitých dávkách jednotlivých frakcí ani kombinací frakcí dosaženo žádného účinku. Nicméně prokyanidinové frakce mohou mít v souvislosti s touto buněčnou linií určitý účinek.

G. MCF-7 prsní buněčná linie

Obrázky 13A až 13H znázorňují typickou závislost odezvy na dávce mezi kakaovými prokyanidinovými frakcemi a MCF-7 prsní buněčnou linií. V tomto testu nebylo při použitých dávkách jednotlivých frakcí ani kombinací frakcí dosaženo žádného účinku. Nicméně prokyanidinové frakce mohou mít v souvislosti s touto buněčnou linií určitý účinek.

H. CCRF-CEM T-buněčná linie leukemie

Při stanovování účinnosti proti CCRF-CEM T-buněčné linii leukemie se získaly atypické křivky závislosti odezvy na dávce. Avšak mikroskopické součty počtu buněk v závislosti na čase při různých koncentrací frakce ukázaly, že 500 μς frakce A, B a D způsobily 80 % redukci růstu v průběhu 4 denní časové prodlevy. Reprezentativní závislost odezvy na dávce je znázorněna na obrázku 14.

I. Souhrn

IC50 hodnoty získané v těchto testech jsou souhrnně uvedeny v tabulce 6. Pro všechny buněčné linie s výjimkou CCRF-CEM t-buněčné linie leukemie. Údaje, týkající se CCRFCEM t-buněčnou linií leukemie se z této tabulky záměrně vynechaly, protože pro jejich stanovení byl použit jiný testovací postup. Obecné shrnutí těchto výsledků ukazuje, že nejvíce účinnosti je spojeno s frakcemi D a E. Tyto frakce byly nejúčinnější proti buněčným liniím PC-3 (prostaty) a KB (nazofaryngeální/HeLa) . Tyto frakce rovněž vykazují účinnost proti buněčným liniím HCT-116 (tlustého střeva) a ACHN (ledvin), ale pouze při podstatně vyšších dávkách. Proti buněčným liniím MCF-7 (prsu), SK-5 (melanomu) a A-549 (plic) nebyla zjištěna žádná účinnost. Avšak prokyanidinové frakce mohou být v souvislosti s těmito buněčnými liniemi použity. Rovněž se prokázala účinnost proti buněčné linii CCRF-CEM (T-buněčné leukemie). Je třeba zmínit, že frakce D a E jsou kompozičně nejkomplexnější, nicméně z těchto výsledků je zřejmé, že kakaové výtažky, zejména kakaové prokyanidiny mají značnou protirakovbinovou, protinádorovou nebo protinovotvarovou účinnost.

Tabulka 6

IC₅o hodnoty pro frakce kakaových prokyanidinů proti různým buněčným liniím (IC_5Q hodnoty v μg/ml)

Frakce PC-3 KB HCT-116 ACHN MCF-7 SK-5 A-549

D	90	80
E	75	75
A+B
A+C	125	100
A+D	75	75

Tabulka 6 - pokračování

IC₅₀ hodnoty pro frakce kakaových prokyanidinů proti různým buněčným liniím (IC₅₀ hodnoty v pg/ml)

Frakce	PC-3	KB	HCT-116	ACHN MCF-7 SK-5	A-549
A+E	80	75	500	500
B+C
B + D	75	80
B+E	60	65	200
C + D	80	75		1 000
C+E	80	70	250
D+E	8	60	85
Hodnoty	vyšší	než	100 pg/ml	se extrapolovaly z	křivek

závislosti odezvy na dávce.

Příklad 8: protirakovinová, protinádorová nebo protinovotvarová účinnost kakaových výtažků (prokyanidinů)

Pro zkompletování a rozšíření výsledků získaných v příkladech 6 a 7 se použilo několik dalších in vitro zkušebních testovacích postupů.

Metoda A: Test krystalického fialového zabarvení

Všechny lidské nádorové buněčné linie se získaly z americké sbírky typových kultur. Buňky se nechaly růst ve formě monovrstev v IMEM obsahujícím 10 % plodového bovinního séra bez antibiotik. Buňky se udržovaly ve zvlhčené 5 % CO2 atmosféře při teplotě 37 °C.

Po trypsinizaci se buňky sečetly a nastavily na koncentraci 1 000 až 2 000 buněk/100 μΐ. Buněčné bujení se určilo očkováním buněk (1 000 až 2 000 buněk/jamka) na 96 jamkovou mikrotitračního plotnu. Po přidání 100 μΐ buněk se buňky nechaly 24 hodin přichytit. Na konci této 24 hodinové periody se do jamek přidaly různé kakaové frakce v různých koncentracích s cílem získat závislosti odezvy na dávce. Kakaové frakce se rozpustily v médiu při dvojnásobné koncentraci a vždy do tří jamek se přidalo 100 μΐ příslušného roztoku, obsahujícího shodnou frakci ve shodné koncentraci. V následujících dnech se plotny zabarvovaly 15 minut 50 μΐ krystalické violeti (2,5 g krystalické violeti, rozpuštěné ve 125 ml methanolu a 375 ml vody). Zabarvení se odstranilo a plotna se opatrně ponořila do studené vody z důvodu odstranění zabarvení. Promývání se zopakovalo ještě dvakrát a plotny se nechaly vyschnout. Zbývající zabarvení se rozpustilo přidáním 100 μΐ 0,1 M citrátu sodného a 50 % ethanolú do každé jamky. Po rozpuštění se počet buněk vypočetl na plotnovém čítači ELISA při 540 nm (referenční filtr při 410 nm) . Výsledky z čítače ELISA se vynesly do grafu tak, že na osu Y se vynesla absorbance a na osu X dny růstu.

Metoda B: Test klonování měkkého agaru

Buňky se klonovaly v měkkém agaru za použití metody, kterou popsal Nawata H., Chong M.T., Bronzert D. a Lippman M.E. v článku „Estadiol - Independent Growth of a Subline of MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Culture, J. Biol. Chem., 256:13, 6 895-6 902 (1981). Jednotlivé buněčné suspenze se připravily přidáním různých koncentrací kakaových frakcí do média, obsahujícího 0,8 % agaru. Suspenze se rozdělily rovným dílem do 35 mm nádobek potažených médiem obsahujícím 1,0 % agaru. Po deseti denní inkubaci se stanovil na zobrazovacím analytickém systému Ominicron 3 600 počet kolonií, jejichž průměr byl větší než 60 μπι. Výsledky byly vyneseny do grafu, přičemž na ose Y byl vynesen počet kolonií a na ose X koncentrace kakaových frakcí.

Metoda C: XTT mikrokulturní tetrazoliový test

K testování různých kakaových frakcí se použil XTT testovací postup, který popisuje Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Paull K.D., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens N.J., Seniff D. a Boyd M.R. v článku „Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines, Canur Research, 48, 4 822-4 833 (1988). XTT test se v podstatě shodoval s testem využívajícím MTT postup (příklad 6) s výjimkou následujících modifikací. XTT ((2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-solfofenyl)-5[(fenylamino)karbonyl]-2H-tetrazoliumhydroxid) se připravil v koncentraci 1 mg/ml média bez séra a předehřál se na 37°C. PMS se připravilo jako 5 mM PBS. XTT a PMS se smísily dohromady a do každé jamky se přidalo 10 μΐ PMS na ml XTT a 50 μΐ PMS-XTT. Po čtyřhodinové inkubaci při 37°C se plotny promíchávaly 30 minut na mechanické třepačce a následně se změřila absorbance při 450 až 600 nm. Výsledky se vynesly do grafu, přičemž absorbance se nanesla na osu Y a dny růstu nebo koncentrace na osu X.

Výsledky, získané za použití metody A a C se rovněž vynesly do grafu jako % kontrolního vzorku (na ose Y) v závislosti na dnech růstu nebo koncentraci (osa X).

K porovnání XTT testovacího postupu a krystalického violeťového postupu, které mělo určit, který test je citlivější, se použila kakaová frakce D&E (příklad 3B) proti prsní rakovinové buněčné linii MCE-7 pl68. Jak ukazuje obrázek 15A, oba testy vykazují při koncentracích vyšších, než 75 μg/ml stejné závislosti odezvy na dávce. Při koncentracích nižších než tato hodnota vykazuje krystalický violeťový test vyšší standardní odchylky, než výsledky testu XTT. Avšak protože je krystalický violeťový test snadnější pro použití, prováděly se všechny následující testy, není-li stanoveno jinak, touto metodou. Výsledky krystalického violeťového testu (obr. 15B až 15E) mají demonstrovat účinky surového polyfenolového výtažku (příklad 2) na prsní rakovinovou buněčnou linii MDA MB231, PC-3 rakovinovou buněčnou linii prostaty, MCF-7 pl63 prsní rakovinovou buněčnou linii a cervikální rakovinovou buněčnou linii Hela. Ve všech případech dávka 250 pg/ml zcela inhibovala veškerý rakovinový buněčný růst v průběhu 5 až 7 dní. Zdálo se, že Hela buněčná linie je na výtažek citlivější, protože buněčný růst již inhibovala dávka 100 pg/ml. Kakaové frakce z příkladu 3B se testovaly proti Hela buněčné linii a proti další SKBR-3 prsní rakovinové buněčné linii. Tyto výsledky (obr. 15F a 15G) ukazují, že frakce D & E má nejvyšší účinnost. Jak ukazuje obrázek 15H a 151, hodnoty IC₅₀ pro frakci D a A dosahovaly pro obě rakovinové buněčné linie přibližně 40 pg/ml.

Kakaová frakce D&E se rovněž testovala za použití testu klonování v měkkém agaru, který určil schopnost testované sloučeniny nebo sloučenin inhibovat ukotvený nezávislý růst. Jak ukazuje obrázek 15J, koncentrace 100 μς/ιπΐ této frakce zcela inhibuje tvorbu kolonie buněk Hela.

Proti linii Hela cell se rovněž testovaly surové polyfenolové výtažky získané z osmy různých kakaových genotypů reprezentujicích tři zahradnické odrůdy kakaa. Jak ukazuje obrázek 15K všech různých variant kakaa vykazovalo podobnou odezvou účinnost v závislosti na dávce. UIT-1 varianta vykazovala největší účinnost proti linii buněk Hela. Tyto výsledky ukazují, že všechny kakaové genotypy zahrnují polyfenolovou reakci, která vykazuje účinnost alespoň proti jedné linii lidské rakovinné buňky, která je nezávislá na geografickém původu, zemědělské odrůdě a genotypu.

Další série testů se provedly na surových polyfenolových extraktech připravených z jedné tuny tradičních brazilských kakaových bobů, pět dnů fermentovaných a následně 4 dny sušených na slunci. Výsledky zobrazené na obrázku 15L ukazují, že extrakty v těchto časně zpracovaných stadiích nevykazují žádné účinky, což svědčí o malé změně ve složení polyfenolů. Nicméně je známo, že (Lehrian, D.W., Patterson G.R., In Biotechnology; Reed G., Ed.; Verlag Chemie: Weinheim, 1983, svaz. 5, kap. 12.), že polyfenoloxidáza (PPO) oxiduje v průběhu fermentace polyfenoly. Za účelem zjištění vlivů, které by mohly mít vliv na účinnost enzymaticky zoxidovaných polyfenolů, se provedly další testy. Surová PPO se připravila extrahováním jemně namletých, nefermentovaných, vymražených, odtučněných brazilských kakaových bobů s acetonem v poměru 1 mg prášku na 10 ml acetonu. Získaná suspenze se odstřeďovala při 3000 ot/min po dobu 15 minut. To se opakovalo třikrát, přičemž se pokaždé odstranil supernatant a čtvrtá extrakce se prolila skrze Buchnerovu filtrační nálevku. Získaný acetonový prášek se nechal vysušit vzduchem a následně se podrobil testu popsanému McLordem J.D. a Kilarem A., v článku „Control of Enzymatic Browning in Processed Mushrooms {Agaricus Bisporus') J. Food Sci., 48:1 479 (1983).Do roztoku surových polyfenolů (100 mg/ml Citráto-fosfátového pufru, 0,02M, pH 5,5) 100 mg acetonového prášku (4000 μ/mg proteinu) se přidalo a nechalo 30 minut míchat proudem vzduchu probublávajícím skrze suspenzi. Vzorek se odstřeďoval při 5000 xg 15 minut a supernatant extrahoval 3x 20 ml ethylacetátu. Ethylacetátové výtažky se sloučily, vysušily destilací za částečného vakua a po přidání 5 ml vody se lyofilizovaly. Připravený materiál se testoval proti buňkám Hela a závislost odezvy na dávce se porovnal s toutéž závislostí surových polyfenolových výtažků, které nebyly enzymaticky ošetřeny. Výsledky (obr. 15M) ukazují značný posun na křivce odezva - dávka pro enzymaticky zoxidovaný výtažek, což ukazuje, že zoxidované produkty jsou účinnějšími inhibitory, než jejich přirozené formy.

Příklad 9: Antioxidační účinnost kakaových výtažků obsahujících prokyanidiny

Literatura uvádí vztah mezi spotřebou přirozeně se vyskytujících antioxidantů (vitamínů C, E a B-karotenu) a nižší výskytem nemocí zahrnujících rakovinu (Designing Foods, Manipulating Foods to Promote Health, Inform, 4:4, 344-369 (1993)).Obecně se uvažuje, že tyto antioxidanty ovlivňují určicé oxidační a volnoradikálové procesy včetně některých typů nádorové působení. Kromě toho některé rostlinné polyfenolové sloučeniny, které jsou známé jako antikarcinogenní, rovněž vykazují silné antioxidační účinky (Ho a kol. 1992, Huang a kol. 1992).

Pro stanovení toho, zda kakaové výtažky obsahující prokyanidiny vykazují antioxidační vlastnosti se použila standardní Rancimatová metoda. Postupy popsané v příkladech 1, 2 a 3 se použily pro přípravu kakaových výtažků, které byly dále zpracovány tak, že poskytly dvě frakce gelové permeační chromatografie. Tyto dvě frakce jsou aktuálně zkombinované frakce A až C a D a E (viz obr. 1), jejichž antioxidační vlastnosti se porovnávaly s antioxidačními vlastnostmi syntetických antioxidantů BHA a BHT.

Z nepražených arašídových ořechů se vylisoval po odstranění slupek arašídový olej. Každá testovaná sloučenina se naroubovala do oleje ve dvou koncentracích, t j . přibližně 100 ppm a 20 ppm, přičemž aktuální koncentrace jsou uvedeny v tabulce 7. Do každého vzorku se přidalo 50 μΐ methanolem solubiiizovaného antioxidantů s cílem napomoci dispergaci zmíněného antioxidantů. Kontrolní vzorek se připravil z 50 μΐ methanolu prostého antioxidantů.

U každého vzorku se testoval dvakrát se za použití Rancimatového stabilizačního testu hodnotila oxidační stabilita při 100°C a 20 cm³/min vzduchu. Testovací parametry se zvolily tak, aby odpovídaly parametrům použitým při Metodě aktivního kyslíku (AOM) nebo Swiftově testu stability (Van Oosten C.W., Poot C. a A.C. Hensen, The Precision of the Swift Stability Test, Fette, Seifen, Anstrichmittel, 83:4, 133-135 (1981)).

Typická Rancimátová stopa je znázorněna na obrázku 16.

Výsledky testů jsou uvedeny	v tabulce	8 jako hodiny
potřebné pro dosažení peroxidové	úrovně 10C	i meq.
Tabulka	7
Koncentrace antioxidantů
Koncentrace	1 Koncentrace 2
Vzorek		ppm
Butyrovaný hydroxytoluen (BHT)	24	120
Butyrovaný hydroxyanisol (BHA)	24	120
Surová ethylacetátová frakce kakaa	22	110
Frakce A-C	20	100
Frakce D-E	20	100

Tabulka 8

Oxidační stabilita oleje z podzemnice olejné s různými antioxidanty ppm 100 ppm

Vzorek

Průměr

Kontrolní

Butyrovaný hydroxytoluen (BHT)

Butyrovaný hydroxyanisol (BHA)

Surová kakaová frakce

Frakce A-C

Frakce D-E

1,5U

16.5 + 2,1

13.5 + 2,1

18,0 + 0,0

16,0 + 6,4

14,0 + 1,4 + 0,7

12.5 + 2,1

14,0 + 1,4

19,0 + 1,4

17.5 + 0,0

12.5 + 0,7

Tyto výsledky demonstrují zvýšenou oxidační stabilitu arašídového oleje se všemi testovanými aditivy. K nejvyššímu zvýšení oxidační stability došlo u vzorku naroubovaného surovým ethylovým výtažkem kakaa. Tyto výsledky demonstrují, že kakaové výtažky obsahující prokyanidiny mají antioxidační potenciál rovný shodným množstvím syntetického BHA a BHT nebo vyšší. V souladu s vynálezem lze kakaové výtažky použít namísto BHA a BHT například jako antioxidant a/nebo potravinářské aditivum. A v tomto ohledu je třeba zmínit, že vynález je z jedlého zdroje. Na základě těchto výsledků může odborník v daném oboru rovněž snadno určit vhodné množství extraktů pro takové aplikace, např. množství přidávané do potravin bez zbytečných experimentů.

Příklad 10: Studie inhibice Topoisomerásy II enzymy, které DNA řetězců a tím (Wang J. C. , DNA 665-697 (1985)).

DNA topoisomerása I a II jsou katalyzují štěpení a opakované spojování kontrolují topologické stavy DNA Topoisomerases, Ann. Rev. Biochem., 54,

Kromě studie intracelulární funkce topoisomerásy, bylo jako jedním z nejpodstatnějších nálezů označení topoisomerásy II za primární buněčný cíl pro celou řadu klinicky důležitých protinádorových sloučenin (Yamashita Y. , Kawada S.-Z. a Nakano H., Induction of

Mammalian Toooisomerase

Cleavage by

II Dependent DNA Monintercalative Flavanoids, Genostein and Orbol., Biochem Pharm, 39:4, 737-744 (1990)) zahrnujících vnitřně katalytická činidla (m-AMSA, Adriamycin a ellipticin), stejně jako vnitřně nekatalycké epipodofyllotoxiny. Několik linií ukazuje, že společnou vlastností některých protinádorových léčiv je stabilizace komplexu DNAtopoisomerásy II („čistícího komplexu”), který po vystavení denaturujicím činidlům vede k indukování DNA štěpení (Muller M.T., Helal K., Soisson S. a Spitzer, J.R., A Rapid and Quantitative Microtiter Assa for Eukaryotic Topoisomerase II , Nuc. Acid Res., 17:9 499 (1989)). Bylo zjišrěno, že tvorba čistícího komplexu spočívající v tom, že protinádorová léčiva produkují objemné DNA aduktů, vede k zahubení buněk.

V souladu s tímto přitažlivými modelem se použil nový specifický induktor čistícího komplexu DNAtopoisomerásy II jako protirakovinové, protinádorové a protineoplastické činidlo. Při pokusech identifikovat aktivity cytotoxické sloučeniny, jejichž cílem je DNA, se testovaly zvýšené cytotoxické účinky kakaové prokyanidy proti několika buněčným liniím cutlivým na poškození DNA a provedl se enzymatický test za použití lidská topoisomerásy II získané z lymfomu.

A. Dekatenace kinetoplastické DNA topoisomerázou II

Inhibice topoisomerásové II dekatenace kinetoplastové DNA in vitro se určila podle Mullera M.T., Helala K., Soissona S. a Spitzera, J.R., A Rapid and Quantitative Microtiter Assa for Eukaryotic Topoisomerase II , Nuc. Acid Res., 17:9 499 (1989) následujícím způsobem. Z lidského lymfonu se modifikací metod Millera K.G, Lia L.F. a Englunga P.A., Homogenous Type II DNA Topoisomerase from Hela Cell Nuclei, J. Biol. Chem., 256:9 334 (1981) a Dankse M.K., Schmidta C.A., Cirtaina M.C., Suttlea D.P. a Bečka W.T., Altered Catalytic Activity of and DNA Cleavage by DNA Topoisomerase II from Human Leukemic Cells Selected for Resistance to VM-26, Biochem., 27:8 861 (1988) připravily jaderné extrakty mající topoisomerásovou II účinnost. Jedna jednotka čištěného enzymu byla dostatečná pro dekatenaci 0,25 pg kinetoplastické DNA během 30 minut při 34°C. Kinetoplastové DNA se získala z trypanosomu Crithidía fascículata. Každá reakce se prováděla v 0,5 ml mukrocentrifugové zkumavce obsahující 19,5 μΐ H₂O, 2,5 μΐ desetinásobku pufru (jeden násobek pufru obsahuje 50 mM tris-HCl, pH 8,0, 120 mM KCI, 10 mM MgCl₂, 0,5 mM ATP, 0,5 mM dithiothreitolu a 30 μς BSA/ml), 1 μΐ kinetoplastické DNA (0,2 μς) a 1 μΐ DMSO - obsahující různé koncentrace kakaových prokyanidinových frakcí.Tato kombinace se dokonale promísila a udržovala v ledu. Jedna jednotka topoisomerásy se přidal bezprostředně před inkubací do vodní lázně o teplotě 34 °C, kde se nechala 30 minut.

Po inkubaci se dekatenační test zastavil přidáním 5 μΐ koncového pufru (5% sarokosylu, 0,0025% bromofenolové modři, 25% glycerolu) a vzorek se umístil na led. DNA se podrobila na 1% agarosovém gelu elektroforéze v TAE pufru obsahujícím ethidiumbromid (0,5 μg/ml). Osvětlení UV při 310 nm vlnové délce umožnilo visualizaci DNA. Gely se vyfotografovaly za použití fotoaparátu Polaroid Land.

1% agarosového

Obr. 17 ukazuje výsledky těchto experimentů. Zcela katenovaná kinetoplastická DNA nemigrovala do gelu. Dekatenace kinetoplastové

DNA

DNA monomerní migrují do gelu. prokyanidinů se topoisomerásou II generuje pásy (monomerní kruh, formy I a II), které Inhibice enzymu přidáním kakaových projevuje na postupném vymizení monomerních pásů, jako vzrůstající koncentrace. Z těchto výsledků vyplývá, že prokyanidinové frakce A, 3, D a E inhibují topoisomérásu II při koncentracích pohybujících se v rozmezí od 0,5 do 5,0 pg/ml. Tyto inhibiční koncentrace byly velmi podobné koncentracím získaným pro mitoxanthron a m-AMSA [4'—(9— akridinylamino)methansulfon-m-anisidid].

B. Buněčné linie citlivé na léčivo

U kakaových prokyanidinů se zjišťovala cytotoxicita proti několika buněčným liniím DNA citlivých na poškození. Jednou z těchto buněčných linií byl mutant opravující rozštěpení dvojitého řetězce xrs-β DNA vyvinutý P. Jeggoem P.A., Caldecottem K., Pidsleyem S. a Banksem G.R., v článku „Sensitivity of Chinese Hamster Ovary Mutants Defective in DNA Double Strand Break Repair to

Topoisomerase II Inhibitors, Cancer Res., 49:7 057 (1989) (Kemp L.M., Sedgwick S.G., a Jeggo P.A., X-ray Sesitive Mutants of Chinese Hamster Ovari Cells Defective in Double Strand Break Rejoining, Mutat. Res., 132:189 (1984)). DNA opravná deficience xrs-6 buněčné linie udílí sloučeninám, které produkují štěpení DNA dvojného řetězce, například bleomycinu, a sloučeninám, které inhibují topoisomerásu a mohu tak vyvolávat štěpení dvojného řetězce nepřímo, citlivost zejména vůči rentgenovému záření (Warters R.L., Lyons B.W., Li T.M. a Chen D.J., Topoisomerase II Activity a DNA Double-Strand Break Repair Deficient Chinese Hamster Ovary Cell Line, Mutant. Res., 254:167 (1991)). Cytotoxicita proti deficienční linii se porovnala s cytotoxícitou proti COH linii schopné opravit LNA, BR1. Zvýšená cytotoxicita proti pro opravu deficienční (xrs6) linii se intrepretovala jako evidence vzniku štěpení DNA štěpitelného dvojného řetězce.

Pro opravu DNA kompetentní CHO linie BR1 byla vyvinuta Barrowsem, L.R., Borchersem, A.H., a Paixtonem, M.B., Transfectant CHO Cells Expressing O^s-alkylguarine-DNAalkyltransferase Display Increased Resistance to DNA Damage Other than 0°-guanine Alkylation, Carcinogenesis, 8:1 853 (1987), která exprimuje 0⁶-alkylguanin-DNAalkyltransferasu, kromě normálních DNA opravujících enzymů. Obě tyto linie se nechaly růst jako moncvrstvy v alfa-MM obsahujícím sérum a antibiotika, jak popisuje příklad 6. Buňky byly udržovány ve zvlhčené 5% CO₂ atmosféře při 37°C. Před ošetřením kakaovými prokyanidy se buňky rostoucí jako monovrstvy spojily za použití trypsinového ošetření. Testy se prováděly za použití MTT testovacího postupu popsaného v příkladu 6.

Výsledky (obr. 18) nenaznačují žádné zvýšení cytotoxicity proti xrs-β buňkám, což nabízí možnost, že kakaové prokyanidy pro inhibici topoisomerásy II využily jiný způsob než štěpení štěpitelného dvojného řetězce. To znamená, že kakaové prokyanidy vzájemně vnitřně reagovaly s topoisomerásou II před tím, než reagoval s DNA za vzniku nerozštěpitelného komplexu.

komplex jsou anthracyklinu, akridinů a protinádorové, aolikace a

Sloučeniny tvořící nerozštěpitelný relativně novým objevem. Členy podofyliních alkaloidů, anthracendionů, ellipticinů jsou využívány pro klinické protirakovinové nebo antineoplastické produkují štěpitelné komplexy (Liu L.F. DNA Toposimerase Poisons as Antitumor Drugs, Ann. Rev. Biochem., 58, 351-375 (1989)) v nedávné době bylo identifikováno několik inhibitorů topoisomerásy II, které, jak se zdá, neprodukují štěpitelné komplexy. Tyto inhibitory zahrnují amonafid (Hsiang I.H., Jiang J.B. a Liu L.F., Topoisomerase II Mediated DNA Cleavage by Amonaside and Its Structural Analogs, Mol. Pharmacol., 36, 371-376 (1989)), distamycin (Fesen M. a Pommier Y., Mammarial topoisomerase II Activity is Modulated by the DNA Minor Groove Binder - Distainycin in Simian Virus 40 DNA, J. Biol., Chem., 264, 11 354-11 359 (1989)), flavanoidy (Yamashita Y., Kawada S.-Z. a Nakano H., Induction of Mammalian Topoisomerase II Dependent DNA Cleavage by Monintercalative Flavanoids, Genostein and Orbol., Biochem Pharm, 39:4, 737-744 (1990)), saintopin

Nokano H., (Yamashita Y., Kawada S.-Z., Fujii N. a Induction of Mammalian DNA Topoisomerase I and II Mediated DNA Cleavage by Saintopin, a New Antitumor Agent from Fungus, Biochem., 30, 5 838-5 845 (1991)), membraanon (Dra ke F.H., Hofmann G.A.

Mong S.M., Bartus J.O.,

Hertzberg R.P., Johnson R.K., Matten M.R. a Mirabelli C.K., In vitro and Intercellular Inhibition of topoisomerase II by the Antitumor Agent Membranone Cancer Research, 49, 2 578-2 583 (1989)), terpenoidy (Kawada S.Z., Yamashita Y., Fujii N. a Nakano H., Induction of Head Stable Topoisomerase II-DNA Cleavable Complex by Nonintercalative Terpenoids, Terpetecin and Clerocidin, Cancer Research, 51, 2 922-2 929 (1991)), anthrapyrazoly (Fry D.W., Boritzki T.J., Besserer J.A. a Jackson R.C., In vitro Strand Scission and Inhibition of Nucleic Acid Synthesis on L1210 Leukemia Cells by a New Class of DNA Complexes, the Anthra [1,9-CD]Pyrazol-6(2H)-ones (Anthrapyrazoles) , Biochem., Pharmacol·., 34, 3 499-3 508 (1985)), dioxopiperaziny (Tanabe K., Ikegami Y. , Ishda R. a Andoh T., Inhibitoin of Topoisomerase II by Antitumor Agents bis (2, 6dioxopiperazine) Derivatives, Cancer Research, 51, 4 9034 908 (1991)) a námořní akridin-dekricin (Burres N.S., Sazesh J., Gumawardana G.P. a element J.J., Antitumor Activity and Nucleis Acid Binding Properties of Dercitin, a New Acridine Alkaloid Isolated from a Marině Dercitus Species Sponke, Cancel Research, 49, 5 267-5 274 (1989)).

Protože kakaové prokyanidiny inaktivují před vznikem štěpitelných komplexů topoisomerásu II, mají buď samotné, nebo v kombinaci s dalšími známými a mechanisticky definovanými inhibitory topoisomerásy II určitou chemoterapeutickou hodnotu. Kromě toho se rovněž zdá, že kakaové prokyanidy jsou novou třídou inhibitorů topoisomerásy II, (Kashiwada Y., Nonaka G.I., Nishioka I., Lee K.J.H., Bcri I., Fukushima Y., Bastow K.F. a Lee K.H., Tannin as Potent Inhibitors of DNA Topoisomerse II in vitro, J. Pharm. Sci., 82:5, 487-492 (1993)) a mohly by být tedy méně toxické vůči buňkám, než další známé inhibitory, čímž by se zvyšovala jejich použitelnost při chemoterapii.

Buněčná linie MCF-7 (ADR) lidské prsní rakoviny, která exprimuje glykoprotein (gp 170) vázaný na membrán který vykazuje resistenci vůči více léčivům (Leonessa F., Jacobson M., Boile. L., Lippman, J., McGarvey M. a Clarke R. , Effect of Tamoxifer on the Multidrug - Resistant Fhenotype in Human BreastCancer Cells: Isobolograms, Drug Accumulation. and M170,000 Glycoprotein (gp 170) Binding Studies, Cancer Research, 54, 441-447 (1994)) její parentální linie MCF-7 pl68 se použily pro testování účinků kakaové frakce D&E. Jak ukazuje obrázek 19, parentální linie byla inhibována při zvyšujících se dávkových koncentracích frakce D&E, zatímco Adriamycinová (ADR) rezistentní linie byla při vyšších dávkách méně ú činná. Tyto výsledky ukazují, že kakaová frakce D&E má vliv na buněčné linie odolné proti většímu počtu léčiv.

Příklad 11: Syntéza prokyanidinů

Syntéza se prováděla postupem, který vyvinuly Delcour J.A., Eerreira D. a Rouks D.G. a je popsán v „Synthesis of Condensed Tannins, Part 9, The Condensation Sequence of Leucocyanidin with (+)-Catechin and with the resultant Procyanidins, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I., 1 711-1 717 (1983), a který se prováděl bez dalších modifikací. Kromě kondenzování (+)-katechinu s dihydrokvercetinem za redukujících podmínek, se rovněž použil (-)-epikatechin, s cílem reflektovat vyšší koncentrace (-)-epikatechinu, než jaké jsou přirozeně obsaženy v nefermentovaných kakaových bobech. Tyto produkty syntézy se izolovaly, čistily, analyzovaly a identifikovaly postupy popsanými v příkladech 3, 4 a 5. Tímto způsobem se připravily biflavanoidy, triflavanoidy a tetraflavanoidy a ty se použily jako standardy způsobem popsaným výše v souvislosti s kakaovými výtažky.

Příklad 12: Test normálních fázových polopreparativních frakcí

Vzhledem k tomu, že jsou polyfenolové výtažky kompozičními komplexy, je nezbytné určit, které složky byly při čištění, testech dávka - odezva a obsáhlé strukturní identifikaci aktivní proti liniím rakovinových buněk. Pro separování kakaových prokyanidinů se bázi oligomerní velikosti se použila polopreparativní HPLC separace (příklad 3B) s normálními fázemi. Kromě původního výtažku se připravilo 12 frakcí (obr. 2B a 150) a ty se testovaly v dávkách 100 μΐ/ml a 25 μΐ/ml proti Hela buněčné linii s cílem určit, který oligomer vykazuje nejvyšší aktivitu. Jak ukazuje obr. 20, frakce 4 až 11 (pentamer až dodekamer) vykazují IC₅₀ hodnoty přibližně 25 μΐ/ml. tyto výsledky ukazují, že tyto specifické oligomery mají nejvyšší účinnost proti Hela buňkám, kromě toho normální fázová HPLC analýza kakaové frakce D&E ukázala, že tato frakce je obohacena zmíněnými specifickými oligomery.

Z předcházejícího je zřejmé, že tento kakaový výtažek a kakaové polyfenoly, stejně jako způsob jejich výroby a sada podle vynálezu jsou využitelné. V tomto ohledu je třeba zmínit, že vynález pcohází z jedlého zdroje a účinnost in vitro může demonstrovat alespoň nějakou účinnost in vivo, zejména vezmou-li se v úvahu výše diskutované dávky.

Kromě toho výše uvedený popis ukazuje, že kakaový výtažek a kakaové fenoly, stejně jako jejich kompozice, způsob jejich výroby a sada podle vynálezu mají antioxidační účinnost shodnou s účinností BHT a BHA a stejně tak i oxidační stabilitu. Takže vynález lze rovněž použít namísto BHT nebo BHA ve známých aplikacích BHA resp. BHT, jako antioxidant, například antioxidační potravinové aditivum. Vynález lze rovněž použít namísto inhibitorů topoisomerásy u v současné době známých aplikací. V souladu s tím vynález nabízí celou řadu kompozic a způsobů, například antioxidační nebo konzervační kompozice, kompozice inhibující tcpoisomerásu, způsoby konzervace potravin nebo libovolných požadovaných výrobků, například před oxidací a způsoby inhibování topoisomerásy, které zahrnují buď výtažek kakaa a/nebo kakaový polyfenol nebo polyfenoly, nebo které zahrnují uvedení potraviny, výrobku nebo topoisomerásy do kontaktu s příslušnou kompozicí nebo s kakaovým výtažkem a/nebo kakaovým polyfenolem nebo polyfenoly.

Claims (14)

1. V podstatě čistý kakaový výtažek nebo syntetický polyfenol nebo polyfenoly, vyznačený tím , že obsahuje oligomery 3 až 12 polyfenolů nebo polyfenolů.

2. V podstatě čistý kakaový výtažek podle nároku 1, vyznačený tím , že je vyroben způsobem zahrnuj ícím:

redukování kakaových bobů na prášek, odtučnění prášku, a extrahování a čištění kakaového polyfenolů nebo polyfenolů z prášku.

3. V podstatě čistý kakaový výtažek podle nároku 2, vyznačený tím , že způsob redukování kakaových bobů na prášek zahrnuje:

vymražování bobů a dužiny, zbavení vymražené hmoty dužiny, zbavení vymražených kakaových bobů slupky, a namletí slupek zbavených bobů.

4. V podstatě čistý kakaový výtažek podle některého z nároků 2 nebo 3, v y z n a č e n ý tím , že způsob výroby dále zahrnuje čistění výtažku gelovou permeační chromatografii a/nebo preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografii (HPLC).

5. V podstatě čistý kakaový výtažek podle nároku 1, vyznačený tím , že v podstatě obsahuje oligomery 5 až 12 polyfenolu nebo polyfenolů.

6. Antioxidační kompozice, vyznačená tím, že obsahuje v podstatě čistý kakaový výtažek nebo syntetický kakaový polyfenol nebo polyfenoly podle nároku 5 a vhodný nosič.

7. Antioxidační kompozice podle nároku 6, vyznačená tím, že obsahuje kakaové prokyanidiny vyrobené způsobem zahrnujícím:

redukování kakaových bobů na prášek, odtučnění prášku, a extrahování a čištění kakaového polyfenolu nebo polyfenolů z prášku.

8. Antioxidační kompozice podle nároku 7, vyznačená tím, že způsob redukování kakaových bobů na prášek zahrnuje:

vymražování bobů a dužiny, zbavení vymražené hmoty dužiny, zbavení vymražených kakaových bobů slupky, a namletí slupek zbavených bobů.

9. Antioxidační kompozice podle nároku 7 nebo 8, v y značená tím, že způsob výroby dále zahrnuje čistění výtažku gelovou permeační chromatografií a/nebo preparativní vysokovýkonnou kapalinovou chromatografií (HPLC) .

10. Sada pro ošetření pacienta, v případě potřeby ošetření antineoplastickým činidlem, vyznačená tím , že v podstatě obsahuje čistý kakaový výtažek nebo syntetický kakaový polyfenol nebo polyfenoly podle nároku 5 a vhodný nosič.

11. Sada podle nároku 10, vyznačená tím, že obsahuje instrukce pro směšování jednotlivých složek nebo informace týkající se způsobu podání pacientovi.

12. Lyofilizovaná antineoplastická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje v podstatě čistý kakaový výtažek nebo syntetický kakaový polyfenol nebo polyfenoly podle nároku 5 a vhodný nosič.

13. Antioxidační nebo konzervační kompozice, vyznačená tím, že obsahuje v podstatě čistý kakaový výtažek nebo syntetický kakaový polyfenol nebo polyfenoly podle nároku 1.

14. Kompozice inhibující topoisomerásu, vyznačená t í m , že obsahuje v podstatě čistý kakaový výtažek nebo syntetický kakaový polyfenol nebo polyfenoly podle nároku 1.