DD140459A5 - Verfahren zur herstellung von 2,5-diketogluconsaeure - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Pie· Erfindung betrifft die Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, von 2-Ketogulonsäure und 2-Ketoglu.consäure.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

2,5-Diketogluconsäure ist ein brauchbares Zwischenprodukt bei der Synthese von Vitamin C. Bislang wurde 2,5-Diketoglucons&ure von mehreren unterschiedlichen Arten von Bakterien wie Acetobacter melanogenum, Acetobacter aurantiuin, Gluconoacetobacter rubiginosus, Gluconoacetobacter liquifaciens und Pseudomonas sesami gebildet. Die Verwendung dieser Mikro-' Organismen ist jedoch vom technischen Standpunkt aus nicht

vollständig zufriedenstellend wegen der großen Mengen an braunen oder gelblich-braunen Pigmenten als Nebenprodukten der Kultivierung, wodurch die Reinheit der gleichzeitig gebildeten 2,5-Diketogluconsäure vermindert wird.

In der US-Patentschrift 3 790 444 ist die Bildung von 2,-5-Diketoglucon'säure ohne begleitendes, braunes Pigment durch eine neue Species, welche als Acetobacter fragunr bezeichnet wird, beschrieben

.Ziel der Erfindung;

Die vorliegende Erfindung betrifft ein wirtschaftliches Verfahren auj? .Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure unter Verwendung von leicht zugänglichen, öffentlich aufbewahrten Stämmen von Acetobacter cerinus. Zwei dieser Stämme , nämlich IFO 3263 und J266,bilden 2,5~Diketogluconsäure in Ausbeuten von > 95 %» · bezogen auf Glucose.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

2,5~2iketogluconsäure ist als Zwischenprodukt zur Herstellung von Ascorbinsäure brauchbar. Eine wäßrige Lösung von 2,5~I⁾iketcgluconsäure kann selektiv reduziert werden, um ein Gemisch von 2~Ketogulonat und 2-Xetogluccnat zu bilden, welche zu Ascorbinsäure und Erythrobinsäure (Isoascorbinsäure) umgewandelt werderkönnen. . .

2,5~Diketogluconsäure wird einfach durch die bakterielle Wirkung auf Glucose gebildet, wobei gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren leicht zugängliche Stämme von Acetobacter cerinus eingesetzt werden. Alle die aufgeführten, öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus wurden untersucht und zeigten bei dieser Untersuchung, daß sie Ketosäuren in einer Ausbeute von 50 bis 95 %» bezogen auf Glucose, bilden. Venn Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 verwendet wird, besteht die gebildete Ketosäure vollständig aus der gewünschten 2,5-Diketogluconsäure in Ausbeuten von > 95 %» bezogen auf Glucose. Die zugänglichen, Öffentlich gehaltenen Stämme von Acetobacter cerinus sind wie folgt:

08 86

IFO 5262 (ATCG 12503)

5265 .

5264-

3265 5266 3267 5268 3269

Diese Stämme von Acetobacter ceri'nus werden in einem Medium besuchtet, dessen Hauptkohlenstoffquelle Glucose ist. Diese .Mikroorganismen erfordern keine kostspieligen Quellen für organischen Stickstoff wie Pepton oder Fleischextrakt. Wenn Harnstoff und Quellen für anorganischen Stickstoff wie Anrmonium-sulfat, Ammoniumnitrat oder Ammoniumphosphat verwendet werden, •wird Nikotinsäure als essentieller Wachsturasfaktor zügesetst. .

Die Glucosekonzentration in dem Medium variiert 'zwischen 2,5 vmu 20 %i vorzugsweise zwischen 10 und 12.%, um 2,5-Diketogluconsäure in besonders wirtschaftlicher V/eise zu erhalten. Die Ferroentationstemperatur liegt zwischen 20 ⁰C und 35 ⁰C und vorzugsweise zwischen 25 und 30 C, ganz besonders bevorzugt in der 'Nähe von 28 ⁰C. Der.Anfangs-pH-Vert des Kulturmediums kann· von" 5λ5 bis 7>5 ¹^d vorzugsweise von 5 bis 6 variieren. Im Verlauf der Fermentation wird der pH-Wert bei etwa 5>5 durch Zugabe von Jiötriumhydroxidlösung gehalten. Calciumcarbonat kann zur pK-Steuerung verwendet werden, und es wird in einem Ansatzmedium i>ech der Autoklavenbehandlung in einer Menge von 30 g pro 110 g zugesetzt.

dem Impfen wird das Pementationsmedium mit einem mechanischen Rührer bei etwa 17ΟΟ IJpm gerührt, und es wird in einer Rate von 0,5 bis 1 Volumen Luft pro Volumen der Brühe pro* Minute belüftet.

der Verwendung von Acetobacter cerinus IFO 3263 oder 3266 wird die Fermentat-ion solange durchgeführt, bis eine Ausbeute

von 2,5-Diketogluconsäure von wenigstens 90 %, bezogen auf Glucose, erhalten wird, wobei dies üblicherweise 56 bis 40 Stunden erfordert.

Papierchromatografisch wurde bestimmt, daß die Umwandlung von Glucose zu 2,5~Diketogluconsäure auf folgenden Wegen verläuft:

Glucose —δ* 2-Ketogluconsäure ~-S> 2,5-Diketogluconsäure Glucose -9* 5-Ketogluconsäiire — > 2_ip-Diketogluconsäure.

Als Chromatografierpapier wurde handelsübliches Filterpapier (Whatman Mo«. 1 und No. 4) verwendet, als Lösungsmittelsysteia MethyläthylketonjAcetonrAmeisensäureiWasser (80:6:2:12). Die Flecken der Säure wurden durch Besprühen mit einer 0,2 %igen äthanolischen Lösung von o-Phenylendiamin, welche 1 % Salpetersäure enthielt, und Erwärmen auf etwa ?0 ⁰C lokalisiert, wobei 5-Eetogluconsäure eine blaue Färbung, 2-Ketogluconsäure eine gelbe Färbung und 2,5-Diketogluconsäure eine grüne Färbung ergeh. Zur Identifizierung kann ebenfalls die Hochdruckflüssigkeit schromatografie eingesetzt werden.

2_S5-I⁾ike1;ogluconsäure kann aus der zum Schluß erhaltenen Fermentationsbrühe nach jeder beliebigen, dem Fachmann an sich bekannten, konventionellen Arbeitsweise abgetrennt und gewonnen werden. Pie filtrierte Fermentationsbrühe kann als solche durch Behandlung mit einem Borhydrid weiterverarbeitet werden, und das erhaltene Gemisch von 2-Zetogluconsäure und 2-Ketogulonsäure kann unter Bildung von Ascorbinsäure und Erythorbinsäure hydrolysiert werden.

A us f ühruji gsbe i spiele: .

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert

Das folgende wäßrige Impfmedium wurde'hergestellt:

Bestandteil · g/l

Glucose 25

Maisquellwasser · 5

PO₄ . 0,5

K₂HPO₄ 0,5

0,2 pH =6,2

Eine Schütuelflasche, welche 1 1 des Mediums enthielt, wurde 30 Minuten "bei 121 ⁰C im Autoklaven behandelt. Der pH-Wert des abgekühlten Mediums lag bei 5iO. Zellen von Acetcbacter cerinus IFO 3263 aus einer Iiähragar/Schrägplatte (5 nil einer 20 ml sterilen, wäßrigen Suspension) wurden in die Flasche gegeben, die dann auf einem Drehschuttier bei etwa 28 ⁰C für etv:a 2M- Stunden geschüttelt wurde.

Eine Teilmenge der Kulturzüchtungsbrühe, welche zur Bereitste lung einer 5 Vol./Vol.-% Impfmenge ausreichte, wurde in einen 4-1-Permenta.tor gegeben, der 2 1 des folgenden Produktionsniedrums enthielt:

Bestandteil g/l

Glucose 110 Haisquellwasser 0,5

(NH₄)₂HP0^ 0,58

KH₂PO₄ 1,5

MgSO₄.7H₂O 0,5

Harnstoff 0,5

CuSO₄.5H₂O * 1 mg

Nikotinsäure 500'ug,. pH e. 6,0

Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von etwa 28 ⁰C unter Rühren bei i?00 Upm und Belüftung mit einer Rate von 0,75 Volumen

pro Volumen der Brühe pro Hinute durchgeführt« Nach einer Fermentationsperiode von etwa 20 Stunden wurde sterile Glucose (5> g/i) zugesetzt ο Der pH-Wert .'wurde-auf 5» 5 durch Zugabe von Hatriumhydroxidlösung gehalten» Die Fermentation wurde fortgeführt , bis eine Ausbeute von 2,5~Diketogluconsäure von > 95 %» bezogen auf Glucose, erreicht war. .

Die -Arbeitsv;eise von Beispiel 1 wurde rut. vergleichbaren Ergebnissen wiederholt, viobei Acetobacter cerinus IFO 5266 eingesetzt wurde. ·

Claims (2)

1. Erf indungsanspriich

   1. Verfahren zur Herstellung von 2,5-Diketogluconsäure, dadurch gekennzeichnet., daß Acetobactei· cerinus in einem Glucosemedium aerob vermehrt wird und dann die erhaltene 2,5~Diketogluconsäure gewonnen wird oder die Fermentaticnsbrühe durch selektive Reduktion unter Bildung von 2-Ketogulonsäure und 2-Xetogluconsäure verarbeitet wird,

   2· Verfahren nach 3?unkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glucosekonzentration im Medium von 2,5 bis 20 % beträgt, die Fermentationstemperatur von 20 ⁰C bis 35 ⁰C ist, der anfängliche pH-Wert von 3*5 "bis 7_?5 beträgt und der pH-Vert während der Permentation bei etwa 5,5 gehalten wird.

   J. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm IFO 3263 verwendet wird.
2. 4. Verfahren nach . Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Acetobacter cerinus der Stamm IFO 3266 verwendet wird.