DD142130A3 - Verfahren zur herstellung von cellulasen und hemicellulasen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Cellulasen und Hemicellulasen mit Hilfe eines Stammes der Gattung Trichoderma. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Verwendung eines geeigneten MikroorganismenStammes unter geeigneten Kultivierungsbedingungen und Aufarbeitungs- ’ verfahren ein Enzympräparat mit besonders hohen cellulolytischen und hemicellulolytischen Aktivitäten zu gev/innen. Durch ein umfangreiches Screening auf Holz und die Eignung zur Hydrolyse von mechano-chemisch aufgeschlossenem Stroh als Siebstufe wurde ein als Subspecies nonverrucosa benannter Trichoderma viride-Stamm selektioniert und phä- · notypisch optimiert. Die Enzymproduktion im Emers- oder Submersverfahren erfolgt unter Verwendung’billiger, pflanzlicher Ausgangsmaterialien, z.B. Grünmehl (hydrolytisch aufgeschlossen), mit oder ohne k. Zusatz von Zellulosen unter Kultivierungsbedingungen, bei denen eine maximale Enzymausschüttung stattfindet. Nach Abtrennung der Myzel- · und Nährbodenbestandteile wird ein Kulturfiltrat bzw. Konzentrat / oder Festpräparat mit hohen C-j-cellulolytischen. Aktivitäten gewonnen, -·- das zum Abbau zellulosereicher Roh- und Abfallstoffe besonders ge-' eignet ist.

Description

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Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Zellulose- und hemizellulosespaltenden Enzymen im Eniers- und Submersverfahren mittels eines selektionierten und optimierten Stammes aus der Gattung Trichoderma·

Mit Hilfe der angegebenen Enzyme werden zellulosereiche Roh- und Abfallstoffe gespalten, so daß ihre löslichen Spaltprodukte durch Mikroorganismen weiter verwertet werden können, z« B, zur Gewinnung von mikrobiellem Eiweiß und verschiedenen mikrobiellen Endprodukten wie Alkohol oder organischen Säuren, Y/eiterhin werden Cellulasen zur Optimierung und Rationalisierung von Verfahren in der Lebensmittelindustrie eingesetzt, so z_e B« zur Erhöhung der Saftausbeute bei Obst und Gemüse, zur Herstellung.von Mazeraten und Säften sowie zur Erhöhung der Alkoholausbeute bei der Spritkerstellung·

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen.

Der effektive Einsatz eines Cellulasepräparates verlangt ein geeignetes Spektrum von cellulolytischen und hemicel· lulolytischen Enzymen» Zur Bildung von Glukose aus der

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Zellulose von Stroh u· a. zellulosereichen Roh- und Abfallprodukten müssen hohe Cj-, C -cellulolytische, bestimmte Cellobiase- und Hemicellulase-Aktivitäten vorhanden sein· Eine Anzahl von Cellulasepräparaten besitzt nicht das geeignete Enzymspektrum, da einzelne Enzymkomponenten geringere Aktivitäten aufweisen, wie z# B· Präparate von Aspergillusund Penicillium-Arten· Auch die mit Hilfe der Stämme Gliocladium spec· KLeinmachnowi und Penicillium citreoviride produzierten Cellulasen besitzen noch nicht die geeignete Zusammensetzung der notwendigen Enzymaktivitäten· Dagegen produzieren Trichoderma-Arten, vor allem T· viride ein besonders geeignetes Enzymspektrum zum Abbau von zellulosereichen Roh- und Abfallstoffen·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Cellulasepräparat unter produktionstechnisch rentablen Bedingungen herzustellen, das hohe Enzymaktivitäten und ein geeignetes Enzymspektrum von Cellulasen und Hemicellulasen besitzt«*

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Verwendung eines geeigneten Stammes der Gattung Trichoderma unter geeigneten Kultivierungsbedingungen und Aufarbeitungsverfahren ein Enzympräparat zu gewinnen, das ein geeigneteres Enzymspektrum mit höherer Aktivität besitzt als die bisher beschriebenen Stämme·

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein' Stamm mit hohen cellulolytischen und hemicellulolytischen Aktivitäten aus geeigneten zellulosehaltigen Substraten unter Bedingungen, die die Cellulasebildner besonders entwickeln lassen, isoliert, durch geeignete Screeningmethoden aus einer Vielzahl von ebenfalls cellulolytisch aktiven Mikroorganismen ausgewählt und durch phänotypische Optimie-

rung seine Enzymaktivität gesteigert wird«

Isolation und Selektion des 5ausgewählten Organismus

Holzstücke v/erden in einer feuchten Kammer bei verschiede« nen Temperaturen im Bereich von 20 - 6Ö °0 inkubiert und die sich darauf entwickelnden Mikroorganismen auf geeignete zellulosehaltige Nährböden mit Hilfe von Anreicherungsund Verdümungsmethoden abisolierte Die isolierten Organismen v/erden durch ein spezielles Screening-Verfahren in verschiedenen Siebstufen ausgewählt, so auf phosphorsäuregeschwollener Zellulose im Clearing-Test nach (RAUTELA und COWLING (Appl. Microbiol« t£, 892 (1966)) und in Submerskultivierung durch Erfassung der C₁-, C-, Cellobiase-, Xylanase- und Lxchenaseaktivitäten« Dabei müssen sich besonders hohe Enzymaktivitäten zeigen, wobei die der zwei Cellulasebildner Gliocladium spec₀ und Penicillium citreo·« viride als Basisaktivitäten zu erreichen sind_e Die besondere Signung zur enzymatischen Hydrolyse von Stroh vsrird an mechano-cheinisch aufgeschlossenem Stroh als entscheidende Screening-Stufe getestet»

Stammbeschreibung

Der selektionierte Stamm konnte nach dem Bestimmungsßchlüssel für Trichoderma-Arten nach RIPAI (Mycolc Paper Jl^j 1 " 56 (1969)) nicht exakt einer Art zugec>ranet werden, steht aber Trichoderma viride nahe»

Der Stamm der Gattung Trichoderma ist durch folgende Merkmale gekennzeichnet:

l'^^ML^A^IiSi^ite^^iHSi« ^f Malz-, Czapek-Dox- und Hafer·» Erbsmehl'»Agar ausgebreitetes, niedriges, lockeres, teilweise spinnwebartiges Myzel j letzteres vor allem auf Hafer-Erbsraehl~.Agar_e Das' spinnv/ebartige I^yzel übersieht eine lockere

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Die P_arbtönung ist im allgemeinen graugrün und wird mit zunehmendem Alter intensiver dunkelgrün - blaugrün« Gelegentlich tritt eine gelbgrüne Parbtönung auf» Häufig treten zuerst dunkelgrünere Stellen auf, bedingt durch eine tuffartige Sporenbildung,

Die Unterseite ist farblos; nur auf Hafer-Erbsmehl tritt ein typischer Kokusnußgeruch auf·

Mikroskopisches Wachstum: Hiederliegendes Myzel, teilweise von Luftmyzelfäden überzogen. Das Myzel ist glatt, farblos· Nur auf Hafer-Erbsmehl bilden sich hyaline ChIamydosporen, die rund - schwach oval sind· Sie entstehen entweder direkt in der Hyphe oder terminal an kurzen Seitenzweigen.

Die Konidienträger sind unterschiedlich lang, je nach der Yerzweigungsintensität (14 - 50^ Länge)· Konidienträger, die in Tuffen gebildet werden, sind stärker verzweigt· Die Seitenzweige gehen im stumpfen Winkel oder rechtwinklig ab« Sie stehen entweder einzeln oder unregelmäßig wirtelig zu 2 - 3# Die Seitenzweige sind 8,5 - 15yu lang und enden immer mit einer Phialide. Konidienträger und Seitenzweige sind gewöhnlich glatt, auf Czapek-Dox-Agar bilden sich jedoch gelegentlich Warzen aus· Die seitlich gebildeten Phialiden stehen einzeln sowie in falschen Wirtein zu 2 - 5> sie entspringen rechtwinklig oder stumpfwinklig am Seitenzweig. Ihre Länge variiert von 6 - 11/i; die einzeln abgehenden Phialiden sind länger (9 - 11/*)· An der Spitze der Phialiden entstehen Sporen, zu 1 - 12, die zusammengeballt aneinanderheften und ein köpfchenartiges Aussehen ergeben« Die Sporen sind rundlich schwach oval (1,8 - 2,3/i x 2,8 - 3,7/u)· Auf Czapek-Dox-Agar sind die Sporen im allgemeinen rundlicher (1,9 3»1/i 0)· Alle Sporen sind glatt und haben keine Anzeichen von Warzen, was sonst typisch ist für Trichoderma viride· Aus diesem Grunde, sowie einiger weiterer kleinerer Abweichungen dürfte der vorliegende Stamm sich deutlich von typischen T-richoderma viride-Stämmen unterschei-

den, wenn er auch morphologisch ihm ähnlich isW Er. wird somit zukünftig als T* viride subspec« nonverrucosa angesprochen«

Der beschriebene Stamm ist in der Stammsammlung der Humboldt-Universität, Kleinmachnow bei Berlin, Bereich Mikrobiologie der Sektion Hahrungsgüterwirtschaft und Lebensmitteltechnologie unter der Hr* 2713 .(Anmeldungsjahr 1975) registriert«

Die biotechnischen Verfahren zur Herstellung der Cellulasen, Hemicellulasen und ß~Glukosidasen können in Submers- und Emerskulturen durchgeführt werden* Die Enzymproduktion erfolgt unter Verwendung billiger, natürlicher Äusgangsmaterialien, wobei ein Zusatz von na» tiver Zellulose zum Kulturmedium die Enzymaktivitäten wesentlich erhöhte Zur Steigerung bestimmter Enzymaktivitäten können oC - und/oder ß-Glukoside dem Medium zugesetzt werden*

Die Enzymproduktion im Emersverfahren erfolgt auf angefeuchteten pflanzlichen Materialien, vorzugsweise Weizenkleie und/öder Grünmehl* Der sterile Fährboden wird mit Sporen hzvu vegetativen Myzelien beimpft* Die Inkubation erfolgt etwa bei 25 bis 35 ⁰C und dauert 2 bis 8 Tage*

Bei der Enzymproduktion im Submersverfahren v/ird von einer Kulturenkonserve ausgegangen, wobei auf Weizenkleiö-Grünmehl oder Bierwürze agar geimpft wird.«

Fach einer Inkubation von 5 - 14 Tagen bei 25 - 35 ⁰C wird nochmals auf die"gleichen Medien abgeimpft und in gleicher Weise kultiviert.

Mit Sporen bzw, einem Sporen/Myzelgemisch wird die nachfol-. gende Inokulumstufe beimpft* Diese kann eine Produktions- oder eine Vorkulturstufe sein« Mit einer Vorkultur werden je nach Bedarf und Größe des Produktionsumfanges v/eitere Propagationsstufen (Vorkulturen), angelegt* Diese Vorkulturen dienen zur Beimpfung des Produktionsmödiums»' Die erforderli-

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ehe Impfmenge belauft sich auf 0,5 bis 20 %₉ wobei sich das Impfmaterial· in der logarithmischen Wachstumsphase befinden muß. Die Zusammensetzung der Nährlösung für die Impf stuf en und das Produktionsmedium sind gleich. Sie enthalten Zellulose, Grünmehl und anorganische Salze, gegebenenfalls zusätzlich oC- und ß-Glukoside*^: Die Enzymproduktion erfolgt entweder in Schüttelkolben, im halb- oder großtechnischen Maßstab* Die großtechnische Produktion erfolgt in Tanks mit Zwangsbelüftung und Rührung unter sterilen Bedingungen. Zur Bekämpfung der Schaumbildung während der Fermentation werden pflanzliche oder tierische Fette und Öle oder Öle auf Silikonbasis eingesetzt* Die Fermentation ist beendet, wenn das Myzel in Autolyse übergegangen ist und/oder die Enzymaktivitäten ihre Endwerte erreicht haben*

Die Myzel- und Nährbodenbestandteile werden von der Kulturlösung abgetrennt* Aus dem Filtrat oder Zentrifugat wird in üblicher Y/eise entweder durch Einengen im Vakuum und/oder Ultrafiltration und/oder Gelfiltration ein Konzentrat oder durch Fällung mit anorganischen Salzen, organischen Lösungsmitteln, durch Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung ein festes Präparat hergestellt*

Ausführungsbeispiele · · --

Beispiel 1: ·

Zur Herstellung von Zellulose-, hemizellulose- und ß-glukosidespaltenden Enzymen im Labormaßstab werden Sporen bzw* das Sporen/Myzel-Gemisch aus der Konserve (1/3 . luvos-Heilerde II, 1/3 Seesand, 1/3 Aktivkohle) oder einer Würzeagar-Erhaltungskultur (2 % ungehopfte Würze, 2 % Agar, pH 5,6) auf Weizenkieie-Grünmehl- oder Bierwürze-Agar überimpft. (Zusammensetzung des Weizenkleie-Grünmehlagars; 0,5 % Weizenkleie, 0,5 % Grünmehl, 2,5 % Agar in Leitungswasser). Nach einer Inkubation von etwa 6-14 Tagen wird eine Öse voll Sporen in 100 ml Produktionsmedium eingeimpft.

i% A *> ρ

w ö <ά α

Dieses hat folgende Zusammensetzung: 0,5 % Zellulose, 1,0 % Grünmehl, alkalisch aufgeschlossen, 0,2 % M₄H₂PO₄, 0,1 % IUI₂PO₄, 0,05 % MgSO₄ · 7 H₂O, Leitungswasser, pH 5,2 - 5»6*

Es wird auf einer Fanal-Schüttelmaschine 3-6 Tage bei einer Temperatur von 28 ⁰C - 2 ⁰C geschüttelt, dann abfiltriert und das Piltrat im Vakuum bei 25 - 50 ⁰C auf etwa 1/10 des Volumens eingeengt«¹ folgende Aktivitäten v/erden erreicht: C₁ - Aktivität: 100 - 150 E/ml'KP C_x - « : 30 - 35 g IfeCMC/ml KF. Cellobiase - " : 100 - 150 mU/ml KP Xylanase - ^M : 4 - 6 mg) Glukose

Lichenase - t 5-9 mg] Gleichwerte/ml KP

Die Bestimmungen der Enzymaktivitäten wurden wie folgt durchgeführt: Cj-Aktivität:

Bestimmung in Anlehnung an die Filterpapiermethode nach ' KITAMIKADO und TOYiJLA. (Hakko Kogaku Zasshi 40, 85 (1962), ref* C_£,A_e 62, 19C0 (1965)) unter Verwendung von FH^-Chromatografiepapier (Filtrak, !Niederschlag) als Substrat?

Zur Ermittlung der Aktivität in Flüssigpräparaten oder Kulturlösungen wird 1 ml der Enzymlösung in 4 ml Puffer gegeben (Phosphat-Puffer nach SÖREKSEIT pH 5*1) und mit 1 Stück Filterpapier von 1,5 x 1,5 era Kantenlänge beschickt«· Auf einer Schüttelmaschine (Universaleohüttelma«· schine Thys 1, VEB Labortechnik Ilmenau) v/erden die Proben bei einer Schüttelfrequenz von 120 Schwingungen/Min und einer Amplitude von 2 cm bei 38 ⁰C im Brutschrank oder Ther» moraum geschüttelt» Die Zeit, welche die völlige Zerstörung des Filterpapiers angibt, wird vermerkt,

C-(CMC)-Aktivitat:

Die Bestimmung der C »Aktivität erfolgt durch Messung des Viskositätsabfalles der !^'Carboxymethylcellulose* Die .C -

196387 -»^J;

Aktivität in Enzympräparaten wird ausgedrückt als die Menge Ba-CMC in einer Untersuchungslösung, welche unter be-

. stimmten Bedingungen durch 1 g oder 1 ml Enzym zu einem 25 %igen Viskositätsabfall der Ausgangsviskosität geführt hat« Die Messung wird im Ubbelohde-Viskosimeter 1 durchgeführt,

Cellobiase-Aktivitäti

Diese Aktivität wird durch Abbau von Cellobiose zu Glukose mit Hilfe des Fermognostbesteckes des AWD Dresden bestimmt* Hierbei wird die Glukose durch die Glukoseoxydase-Reaktion ermittelt*

Hemicellulase-Aktivität:

Es wird der Abbau von Hemicellulasesubstraten (z«B« Xylan) durch Bestimmung der reduzierenden Zucker mit Hilfe der Dinitrosalicylsäuremethode nach SUMIiER (J, biol« Chern« ££, 5 (1921) bestimmt.

Beispiel 2:

Zur Herstellung von Zellulose-, hemizellulose- und ß-glukosidespaltenden Enzymen im großtechnischen Maßstab wird von der im Beispiel 1 dargestellten Weizenkleie-Grünmehl- oder Bierwürzeagarkultür ausgegangen« Mit Sporen dieser Stufe wird die 1· Vorkultur (1 Öse in 100 ml Nährlösung) beimpft«

Die beimpfte KuItürlösung: 0,5 % Zellulose, 1,0 % alkalisch aufgeschlossenes Grünmehl, 0,2 % M₄H₂SO₄, 0,2 % KH₂PO., 0,05 % MgSO₄ · 7 H₂O wird in Kolben auf Schüttelmaschinen

bei 28 ⁰C - 2 ⁰C inkubiert« Der pH-Wert vor dem Beimpfen wird auf 4,0 - 5,6 eingestellt. Uach 16 bis 24-stündiger Kultur wird das Myzel zur weiteren Vermehrung unter sterilen Bedingungen zur 2«' Vorkultur überimpft« Die Vermehrung dieser Stufe erfolgt in 200 1 großen Impftanks aus nicht-

'35 rostendem Stahl· In den Tanks werden 120 1 nährlösung mit gleicher Zusammensetzung wie bei der 1. Vorkultur zubereitet, sterilisiert und beimpft« Die Impf menge aus der 1« Vor-

kultur beträgt 1,2 bis 121» 1t> - 72. Stunden nach Inlcubationsbeginn wird rait dem Material der 2* .Vorkultur die. Nährlösung in einem 12000 1 - Tank aus nichtrostendem Stahl beimpfte Zusammensetzung und pH-Wert der Nährlösung sind ebenso wie bei der 1* Vorkultur* Durch Steuerung des pH-Wertes ist es möglich, das Enzyraspektrum in bestimmten Grenzen zu verändern·¹ Die Tankausrüstung entspricht der klassischen Antibiotika-Batch-Kultur« Der Tankinhalt beträgt 9000 1 und wird mit 100 bis 1000 1 der 2„ Vorkultur beimpfte Während der Kulturdauer von 48 bis 144 Stunden' (je nach Beimpfungsmenge und angestrebter Kulturdauer) wird im Verhältnis 0,15 - 0,5 : 1/Uin«; d_eh» 0,15 - 0,5 m·³ sterile Luft auf 1 v? KL/Min» belüftet«

Die Schaumbekämpfung erfolgt mit pflanzlichen Ölen (Rapsöl) oder mit Ölen auf Silikonbasis« Die Fermentation wird beendet, nachdem das Myzel teilweise in Lyse übergegangen ist, oder die festgelegten Enzymparameter· erreicht sind« Je nach Kultivierungsdauer können die Verhältnisse der Enzymaktivitäten zueinander verschoben werden» z_e B₅ kann durch längere Kultivierungszeit die Cellobiase-Aktivität erhöht und die C.»Aktivität vermindert werden«

Das Rüyzel wird durch Separation von der Flüssigkeit getrennte Folgende Aktivitäten im KuIturfiltrat können erreicht werden:

C₁ - Aktivität: 120 - 180 E/ml KF C_x » : 20 - 30 g 2TaCMC/ml KF

Cellobiase - " : 50 - 150 mU/ml KF XylanasG - " : 4-7 mg G-lukose-Gleichwerte/

mI/K.P Lichenase ~ " : 5-10 mg Glu3jose-Gleichwerte/

ml /KF

Das FiItrat wird im Vakuum bei 30 ⁰C auf 1/5 - 1/10 des Ausgangsvolumens eingeengt*

Bei der Rückverdünnung des Konzentrates zeigt sich ein maximaler Aktivitätsverlust von 10-20 %* Aus dem Konzentrat kann anschließend die Fällung des Ensymkoinplexes nach bekannten Methoden, wie beispielsweise mit Ϊ3Η.-»Salzen, Aceton oder Tannin vorgenommen werden«.

Claims (3)

196387 - Erfindungsanspruch

1» Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Cellulasen und Hemicellulasen im Emers- oder Submersverfahren mittels eines Stammes der Gattung Trichoderma, dadurch gekennzeichnet, daß ein in einem Screening aus Holzstücken isolierter und infolge seiner besonderen, durch sein Enzymspektrum bedingten Wirksamkeit auf Stroh selektionierter Stamm Trichoderma viride subspec« nonverrucosa sowie seine daraus entstehenden genetischen Varianten in einem Medium mit Zellulose mit oder ohne Grünmehl, mit oder ohne hydrolytisch aufgeschlossenem Grünmehl bzw» allein Verwendung findet«

2· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch jeweiligen Zusatz vonoC- und/oder ß-glukosidisch gebundenen Kohlenhydraten zum Medium eine Steigerung spezieller cellulolytischer, hemicellulolytischer und Cellobiaseaktivitäten erreicht wird· ;

3· Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe seiner Enzymaktivitäten, die während seiner Kultivierung entstehen, zellulosehaltige Substrate aufgeschlossen werden, die zur eigenen Biomasse- und Produktbildung oder zur Biomasse- und Produktbildung anderer Mikroorganismen dienen.