DD145182A3 - Verfahren zur biotechnischen herstellung von cellulose und beta-glucoside spaltenden enzymen - Google Patents

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Wolfgang F Hirte
Ingrid Glathe
Annelies Gradel
Werner Schade
Johann Huber
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Wolfgang F Hirte
Ingrid Glathe
Annelies Gradel
Werner Schade
Johann Huber
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Description

-a- 14 9914
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Cellulose und B-Glucoside spaltenden Enzymen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Cellulose- und ß-GlucosidespaItenden Enzymen im Emers- und Submersverfahren mittels eines Stammes aus der Gattung Gliocladium.
Zur biotechnischen Herstellung von Cellulasen werden verschiedene Schimmelpilze, z« Bc Aspergillus- oder Trichodermaarten, verwendet. Der Einsatz eines Gliocaldium-Stammes zur biotechnischen Herstellung von Cellulose und ß-Glucosidespaltenden Enzymen isfc bisher noch nicht erwähnt worden, obwohl bekannt
ρ I
ist, daß mehrere Arten der Gattung Gliocladium zum Abbau zellulosehaltiger Materialien befähigt sind. Zweck der Erfindung ist es, einen Stamm einzusetzen, der es gestattet, unter produktionstechnischen Bedingungen rentabel Cellulasen (Cj und 0χ) und ß-Glucosidasen in hoher Ausbeute zu gewinnen, die zur Spaltung von Cellulose aus natürlichen Pflanzenmaterialien eingesetzt werden können, so z. B. zum Aufschluß von Obst und Gemüse zur Erhöhung der Saftausbeute, zur Herstellung von Mazeraten und Säften sowie für diätetische Zwecke, zum Aufschluß von Futtermitteln und von Holz und holzartigen Pflanzenmaterialien.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Verwendung eines Stammes der Gattung Gliocladium und durch geeignete Kultivierungsbedingungen zu dem genannten Ziel zu gelangen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß zur biotechnischen Herstellung von Cellulose und ß-GlucosidespaItenden Enzymen im Emers- oder Submersverfahren mittels eines Stammes aus der Gattung Gliocladium ein insbesondere unter Verwendung von Cellulosesubstraten selektierter und vorzugsweise in einem Medium mit Cellulose und Grünmehl kultivierter Stamm von Gliocladium spec, Kleinraachnowi verwendet wird.
*. ,1 f<'1 " 1 M ι": .",
Der verwendete Stamm von Gliocladiiun spec· Kleinmachnowi mit der Stammanmeldungsnuiamer 264-2, Anmeldungsjahr 1968» (Stammsammlung der Humboldt„Universität, Kleinmachnow "b. Berlin, Bereich Mikrobiologief Sektion ITahrungs gut er wir tschaft und Lebensmitteltechnologie, DDR), der durch ein Screening-Programm unter Yerwendung von natürlichen Zellulosesubstraten selektiert und dessen cellulolytische Aktivitäten (O^-Aktivitäten) durch geeignete Kultivierungsbedingungen weiter gesteigert wurden, grenzt sich nach dem Bestimmungsschlüssel von E a ρ e r und Thorn (Kaper, K« und Ch, Thorn, A manual of the Penicillia, Williams and Wilkins Company, Baltimore 1949, S* 674—68?) von den dort "beschriebenen Arten und Unterarten dieser Gattung durch den Aufbau seines konidientragenden Apparates deutlich ab.
Der Stamm Gliocladium spece Kleinmachnowi ist durch folgende Merkmale gekennzeichnet:
Makroskopisches Wachstum:
Farbe:
Myzel:
Konidienbildung:
Köpfchen:
Konidientrager:
Mikrobiologische Merkmale:
Auf Malz-, Czapek-Dox-, Hafer-Erbsmehlagar ausgebreitet, samtig, selten spinnwebartiges Luftmyzel über samtigem. Oberseite dunkel-grünlich, Unterseite farblos
niederliegend, teilweise Luftmyzel} septiert, glatt
In Köpfchen am Ende eines unterschiedlich differenzierten konidientragenden Apparates
Köpfchen rund, durch in Schleim zusammengehaltene Sporenanhäufungen: durchschnittlich trägt 1 Konidienträger 1 bis 3» selten 4· Köpfchen. Köpfchen unterschiedlich groß, je nach Ausbildung des konidientragenden. Apparates.
Meist auf niederliegendem Myzel, seltener im Luftmyzel entstehend, unterschiedlich warzig, je nach Nährboden
Koni dientragender Apparat:
Metulae: Sterigmata
Sporen:
Länge: sehr unterschiedlich, 14 bis 100/4 verzweigt und unverzweigt 1 bis 3 Stockwerke. Meist 1 bis 2 Stockwerke: Metulae, Sterigmataβ Selten 3 Stockwerke: Zweige, Metulae, Sterigmata, in diesem Falle penicilliumähnlich· Zweige einzeln abgehend, seltener gegenständig oder wirbelig. Glatt
Stehen meist zu viert, entweder auf Metulae oder Seitenzweigen oder am Ende eines unverzweigten Konidienträgers, birnenförmig, 6 Ms 9 yA' lang; 2,5 bis 3,5/i^breit, glatt. Durch Schleim zusammengehalten, dicht gedrängt auf den Sterigmata. Rundlich bis leicht elliptisch, ca« 4 //im Durchmesser, glatt.
Die biotechnischen Verfahren zur Herstellung der Cellulasen und ß-Glucosidasen können in Submers- und Emerskulturen durchgeführt v/erden.
Die Enzymproduktion erfolgt unter Verwendung billiger, natürlicher Ausgangsmaterialien, wobei ein Zusatz von nativer Cellulose zum Kulturmedium die Enzymaktivität wesentlich erhöht.
Die Enzymproduktion im Emersverfahren erfolgt auf angefeuchteten "pflanzlichen Materialien, vorzugsweise Weizenkleie und/ oder Grünmehl. Der sterile Nährboden wird mit Sporen bzw· vegetativen Myzelien beimpft· Die Inkubation erfolgt etv/a bei 25 bis 35 0C und dauert 2 bis 4 Tage.
Bei der Enzymproduktion im Submersverfahren wird von einer Sporenkonserve ausgegangen, wobei die Sporen von Gliocladium spec* Kleinmachnowi auf Weizenkleie- oder Bierwürzeagar vermehrt werden.
Nach einer Inkubation von 2 bis 14 Tagen bei 25 bis 35 0C werden die Sporen mit P/asser abgeschwemmt· Die Sporensuspension wird zur Beimpfung der nachfolgenden Inooulumstufe benutzt (1. Vorkultur)*
-4-1
Mit dieser ersten Vorkultur werden je nach Bedarf und Größedes Produktionsumfanges weitere Propagationsstufen (Vorkulturen) angelegt. Die Vorkulturen dienen zur Beimpfung des Produktionsmediuins, Die erforderliche Impf menge beläuft sich auf 0,5 bis 10 %, wobei sich das Impfmaterial in der logarithms chen Wachs turns phase befinden muße Die Zusammensetzung der Nährlösung für die Impfstufen und das Produktionsmedium sind gleich» Sie enthalten Cellulose, Grünmehl und anorganische Salze«
Die Enzymproduktion erfolgt entweder im Schüttelkolben, im halb- oder im großteuhnischen Maßstab·· Die großtechnische Produktion'erfolgt in Tanks mit Zwangsbelüftung und Bührung unter sterilen Bedingungen. Zur Bekämpfung der Schaumbildung während der Fermentation werden pflanzliche oder tierische Fette und öle oder Öle auf Silikonbasis eingesetzt.
Die Fermentation ist beendet, wenn das Myzel in Autolyse übergegangen ist und die 'Enzymaktivitäten ihre Endwerte erreicht haben.
Die Myzel- und Nährbodenbestandteile werden von der Kulturlösung abgetrennt. Aus dem Filtrat wird in üblicher Weise entweder durch Einengen im Vakuum ein Konzentrat oder durch Fällung mit anorganischen Salzen oder organischen Lösungsmitteln oder durch Gefriertrocknung ein festes Präparat hergestellt.
Auf Grund der hohen Aktivitäten anC1- und C -cellulolytischen Enzymen sowie ß-Glucosidasen ist es möglich, natürliche, zellulosehaltige Ausgangsmaterialien zu spalten.
Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden: .
Beispiel 1
Zur Herstellung von Cellulose- und ß-GluGOSide spaltenden Enzymen im Labormaßstab werden Sporen aus der Konserve (1/3 Luvos-Heilerde II, 1/3 Seesand, 1/3 Aktivkohle) oder einer Würzeagar-Erhaltungskultur (2 % ungehopfte Würze, 2 % Agar, pH 5j6) auf Weizenkleie- oder Bierwürze-Agar überimpft.
5.5-v -·;:-; e C ,C-
(Zusammensetzung des Weizenkleieagars: 5 % Weizenkleie, 2 % Agar, pH 5»6)· Nach einer Inkubation von etwa 8 bis 14· Tagen werden die Sporen, von der Agarkultur mit Leitungsv/asser abgeschwemmt und je 10 bis 50 Millionen in 100 ml Produktionsmedium eingeimpft. Dieses hat folgende Zusammensetzung: 0,5% Cellulose, 1,0 % Grünmehl, alkalisch aufgeschlossen, 0,2 % NH^H2PO4, 0,1 % KH2PO^, 0,05 % MgSO^ .. 7 H2O, Leitungswasser, pH 5»6. Es wird auf einer Schüttelmaschine mit 220 Ausschlägen /Minute 3 "bis 4- Tage geschüttelt, dann wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum bei 25 bis 50 0C auf etwa 1/5 eingeengt
Folgende Aktivitäten v/urden erreicht:
Cj-Aktivität: 50 E/ml (Plüssipräparat)
2800 E/ml (Pestpräparat) Cx-Aktivitat: 750 E/g
ß-Glucosidase-Aktivitätswert: 397 Kolorimetereinheiten
A kt ivi t ät sb e s t immungen :· C1-Aktivität:
Bestimmung in Anlehnung an die Filterpapiermethode naoh KITAMIKADO und TOIAMA (Hakko, Kogaku, Zassku 40, 85 (1962) und ref. 0. A. 62, 1900, (1965) unter Verwendung von M1-Chromatografiepapier (Filtrak, Niederschlag) als Substrat:
Zur Ermittlung der Aktivität in Flüssigpräparaten oder Kulturlösungen wird 1 ml der Enzymlösung in 4 ml Puffer gegeben (Phosphat-Puffer nach SÖEBNSBN.pH 5,6). Die Berechnung erfolgt nach folgender Formel:
10 000
Ε φ .
1 - Zeit d. Auflösg. in min.
Hierbei wird die vollständige Auflösung des Filterpapiers in 1 Minute mit einer Aktivität von 10 000 E bewertet.
Zur Ermittlung der Aktivität in festen Präparaten wird eine 1 %ige Enaymlösung in o« a. Paffer hergestellt.
-6- 1
Die Berechnung erfolgt nach folgender Formel:
10 000 1000
E/g a — — χ
Zeit d· Auflösg. in min. mg Enzym" C -(CMC)-Aktivität
Die. Bestimmung der C -Aktivität erfolgt durch Messung des Viskositätsa"bfaIls der Na-Carboxymethylcellulose. Die cellulolytische C -Aktivität in Enzympräparaten wird ausgedrückt als die Menge ITa-Carboxymethylcellulose in einer Untersuchungslösung, welche unter bestimmten Bedingungen durch 1 g Enzym zu einem 25 %igen Viskositätsabfall der Ausgangsviskosität geführt hat.
g Na-Carboxymethylcellulose
χ - g Enzym
B-Gluc osida se-Akt ivit ät_:
Die Glueosidase-Aktivität wird durch Abbau einer p-Nitrophe~ nyl-B-Glucosidlösung ermittelt (ITOKERANS, B., PhySiol. Plant« JiO, 198, (1957)· Die Enzymaktivitätswerte werden ausgedrückt durch die Größe des Anstiegs der Licht adsorption bei 400 unu Die Aktivitätsangaben sind Kolorimeterwerte, ermittelt am Havemannkolorimeter. ·
Beispiel 2
Zur Herstellung von Cellulose- und ß-Glucosidespaltenden Enzymen im großtechnischen Maßstab wird von der im Beispiel 1 dargestellten Weizenkleie- oder Bierwürzeagarkuitur ausgegangen.
Mit den Sporen dieser Stufe wird die 1. Vorkultur (10-50 Millionen Sporen auf 100 ml Nährlösung) beimpft« Die beimpfte Kulturlösungs 0,5 % Cellulose, 150 % alkalisch aufgeschlossenes Grünmehl, 0,2 % Im21H2PO^, 0f2 % KH2PO^ 0,05 % MgSO^* 7 H2O wird in Kolben auf Schüttelmaschinen bei 30 0C inkubiert« Der pH-Wert vor dem Beimpfen wird auf 4s0-5,6 eingestellt»
- 7 - . 1 4 991 4
Nach 16 bis 24· stündiger Kultur wird das Myzel zur weiteren Vermehrung unter sterilen Bedingungen zur 2· Vorkultur überimpft· Die Vermehrung dieser Stufe erfolgt in 200 1 großen Impf tanks aus nichtrostendem Stahl. In den Tanks werden 120 1 Nährlösung mit gleicher Zusammensetzung wie bei der 1· Vorkultur zubereitet, sterilisiert und beimpft· Die Impfmenge aus der 1· Vorkultur beträgt 1,2 bis 6 1. 16 bis 24· Stunden nach Inkubationsbeginn wird mit dem Material der 2· Vorkultur die Nährlösung in einem 12 000 1 Tank aus nichtrostendem Stahl beimpft«, Zusammensetzung und pH-Wert.der Nährlösung sind ebenso wie bei der 1· Vorkultur· Die Tankausrüstung entspricht der klassischen Antibiotika-Batch-Kultur. Der Tankinhalt beträgt 9000 1 und wird mit 100 bis 500 1 der 2· Vorkultur beimpft. Während der Kulturdauer von 70 bis 90 Stunden (je nach Beimpfungsmenge und angestrebter Kulturdauer) wird im Verhältnis 0,5 : 1/Min.; d· h· 0,5 nr sterile Luft auf 1 irr* Kultur lösung je Minute belüftete Die Schaumbekämpfung erfolgt mit pflanzlichen ölen (Rapsöl) oder mit ölen auf Silikonbasis·
Die Fermentation wird beendet, nachdem das Myzel teilweise in Lyse übergegangen ist· Der End-pH-Wert beträgt 4-,O bis 4,5· Das Myzel wird durch Separation von der Flüssigkeit getrennt· Das Filtrat wird in einem Vakuum-Umlaufverdampfer auf etwa 1/5-1/10 des Ausgangsvolumens bei 30 0C eingeengt·
Die Enzymaktivitäten des Konzentrates betragen:
Oj-Cellulase: 150 E/ml Cx-Cellulase: 32 E/ml.
Aus dem Konzentrat kann anschließend die Fällung des Enzymkomplexes nach bekannten Methoden, wie beispielsweise mit NH^-Salzen, Aceton oder Tannin vorgenommen werden· Die anfallenden Fällungsprodukte werden im Vakuum getrocknet· Die Aktivität der Fällungsprodukte beträgt bei
Oj-Cellulase 2880 E/g Cx-Cellulase 750 E/g ß-Glueesidase 350 Kolorimetereinheiten.
Beispiel 3 .
Zur Herstellung von Cellulase- und ß-G-lucosidespaltenden Enzymen im großtechnischen Maßstab wird von der im Beispiel 1 dargestellten Weizenkleie- oder Bierwürzeagar-KuItür ausgegangen· Mt den Sporen dieser Stufe wird die Vorkultur in einem 2000 1 Impf tank "beimpft.
Nach 16 "bis 2A-stündiger Kultur in dem wie in Beispiel 2 angegebenen Medium wird das Myzel unter sterilen Bedingungen in einen Iroduktionstank überführt. Die Impf menge beträgt 3 bis 10 %. Die Kultivierung im Ecoduktionstank, die Gewinnung des Filtrates, Konzentrates und der Fällungsprodv.kte erfolgt, in Beispiel 2 angegeben wurde· Die Enzymaktivitäten entspre chen ebenfalls denen in Beispiel 2.
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Claims (1)

  1. -9- 149914
    Patentanspruch
    Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Cellulose und B-GlucosidespaItenden Enzymen im Emers- oder Submersverfahren mittels eines Stammes aus der Gattung Gliocladium, dadurch gekennzeichnet, daß ein insbesondere unter Verwendung von Cellulosesubstraten selektierter und vorzugsweise in einem Medium mit Cellulose und Grünmehl kultivierter Stamm von Gliocladium spec. Eleinmachnowi verwendet wird·
DD14991470A 1970-08-28 1970-08-28 Verfahren zur biotechnischen herstellung von cellulose und beta-glucoside spaltenden enzymen DD145182A3 (de)

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