DD148235A5

DD148235A5 - Verfahren zur herstellung eines ausgewaehlten proteins

Info

Publication number: DD148235A5
Application number: DD79213428A
Authority: DD
Inventors: Walter Gilbert; Stephanie A Broome; Lydia J Villa-Komaroff; Argiris A Efstratiadis
Original assignee: Harvard College
Priority date: 1978-06-08
Filing date: 1979-06-06
Publication date: 1981-05-13
Also published as: IE48156B1; WO1980000030A1; IL57491A0; IL57491A; BG60444B2; ATE5001T1; FI791841A7; AU524856B2; CA1215920A; NZ190524A; JPH0755151B2; PT69737A; EP0006694B1; DE2966291D1; ZA792486B; MX6339E; EP0006694A3; IE791115L; AU4775279A; JPS6246160B2

Abstract

Ein Plasmid- oder Bakteriophagen-Gen fuer ein periplasmisches oder extrazellulaeres Bakterienprotein wird gespalten, eine doppelstraengige DNS-Sequenz, die fuer ein ausgewaehltes Protein oder einen Teil davon von einer eukaryotischen Zelle wie Insulin kodiert, wird durch DNS-Rekombinationstechniken in das gespaltene Gen eingefuegt und zur Transformation eines Bakteriums verwendet und das ausgeschiedene ausgewaehlte Protein wird gesammelt.

Description

12 399 56 ET

Verfahren zur Herstellung eines ausgewählten Proteins

An\'/_eji_clun,^sgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung spezifischer Proteine in Bakterien und ihre Ausscheidung aus der Bakterienzelle, und betrifft speziell die Einführung der DNS₇ die das vorgesehene nicht-bakterielle Protein oder einen Teil eines Proteins darstellt, durch Rekombinationstechniken in das Plasmid- oder Bakteriophagen-Gen für entweder ein periplasmisches oder ein extrazelluläres Protein, anschließend als "Trägerprotein" bezeichnet, die Transformation eines IVirtsbakteriums mit dem rekombinierten Gen und Züchtung des transformierten Wirtes zur Ausscheidung des Proteins. Das auf diese Weise· erzeugte Protein kann mit Hilfe herkömmlicher Verfahren aus dem Kulturmedium oder von dem periplasmischen Raum je nach der Wahl des Trägerprotein-Gens gesammelt werden.

Charakteristik der^bekannten technischen Lösungen; Bekannt ist die Einführung von DNS, die ein spezifisches Protein darstellt, in das Gen für ein intrazelluläres Protein. Scheller, u.a., Science, 196, 177 - 180 (1977)c Das Problem dabei ist jedoch, daß auf diese Weise erzeugte Proteine mit anderen intrazellulären Proteinen vermischt werden und daher durch Enzyme in der Zelle abgebaut werden, so daß es schwierig i3t, das erwünschte Proteinprodukt in reiner Form zu gewinnen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die oben genannte Schwierigkeit kann mit Hilfe der Erfindung ausgeschaltet v/erden, und zwar durch die Bereitstellung einer Methode für die Erzeugung eines ausgewählten Proteins oder eines Teiles davon durch die Einführung von DNS, die das ausgewählte

1 3428

Protein oder den Teil davon repräsentiert, in ein Bakterien-Gen, gekennzeichnet durch die Teilung des Bakterien-Gens für ein extrazelluläres oder periplasmisches Trägerprotein, Einfügung eines nicht-bakteriellen DNS-Fragmentes, das für das ausgewählte Protein oder den Teil davon kodiert, durch einen Rekorabinationsschritt in die Teilungsstelle, Transformation eines Wirtsbakteriums mit dem rekombinierten Gen und Züchtung der transformierten Bakterien zur Ausscheidung des ausgewählten Proteins oder Teiles davon.

Zum Beispiel kann durch die Verwendung eines Gens für ein Trägerprotein, das eine Führersequenz hydrophober Aminosäuren an seinem Aminoendpunkt hat und das normalerweise durch die Membran der Zelle, in aer es erzeugt wird, ausgeschieden wird, und zwar unter Teilung der hydrophoben Führersequenz während aer Ausscheidung, ein ausgewähltes Protein erzeugt werden, das entweder aus dem periplasmischen Raum oder aus dem Medium, in dem das Bakterium gezüchtet wird, je nach der Wahl des Trägerproteins gewonnen werden kann. Auf diese Weise wird eine Verunreinigung durch andere in dem Bakterium vorhandene Proteine vermieden, während eine größere Stabilität erzielt wird, weil die Enzyme in der Bakterienzelle, die Fremdproteine abbauen, ausgeschaltet werden. Zu den Bakterien-Genen für Trägerproteine, die für die Erfindung Verwendung finden können, gehören die Gene für antibiotische Resistenz, wie das Gen für Penicillinresistenz oder Penicillinase, das Gen für Chloramphenicol-Resistenz oder das Gen für Tetracyclin-Resistenz, sowie das Gen für alkalische Phosphatase und das Gen für bakterielle Ribonuclease«

Gene oder DNS-Fragmente, die für zahlreiche Proteine oder Teile davon kodieren, können in das bakterielle Trägerprotein-Gen durch das erfindungsgeraäße Verfahren eingebaut werden. Diese Proteine umfassen die verschiedensten nicht-

- 3- 213 42

bakteriellen Proteine wie eukaryotische Zellproteine und Virenproteine. Von besonderer Bedeutung sind eukaryotische Zellproteine wie Insulin, Wachstumshormon des Menschen, Interferon und andere pharmakologisch aktive Proteine. Diese werden durch ihre entsprechenden Gene als Vor-Proteine oder Vorläufer-Proteine synthetisiert und haben an ihrem Aminoendpunkt eine Reihe hydrophober Aminosäuren. Diese hydrophobe Führersequenz ist mit der bakterieller Proteine, die durch die Bakterienmembran ausgeschieden werden, nicht identisch. Daher ist die Tatsache, daß Vor-Insulin oder andere Vor-Proteine höherer Zellen eine hydrophobe Führersequenz enthalten, an sich noch keine Basis für die Annahme, daß ein derartiges Vor-Protein in der Bakterienzelle vollentwickelt werden kann, selbst wenn es in der Zelle synthetisiert werden könnte. Durch "das erfindungsgemäße Verfahren wird nicht nur die Synthese vollentwickelter Proteine eukaryotischer Zellen innerhalb von Bakterienzellen und die Ausscheidung daraus zur Verfügung gestellt, sondern auch die Synthese in Bakterienzellen und die Ausscheidung daraus von anderen extrazellulären Produkten von kommerziellem Interesse ermöglicht. Dazu gehören andere verschmolzene Proteine und verschmolzene Proteine, die aus Trägerproteinen nach obiger Definition bestehen, die spezifische Determinanten tragen, zum Beispiel Virusantigene wie Überzugsproteine (coat protein) oder andere Antigenproteine von Viren. Diese letzteren verschmolzenen Proteine sind für die Herstellung von Impfstoffen (Vakzinen) wertvoll, da sie infolge ihres Antigencharakters in der Lage sind, die Erzeugung einer Immunreaktion, die für die Viren spezifisch ist, zu induzieren. Derartige Vakzine werden ungewöhnlich sicher sein, da sie keinerlei lebendes oder inaktiviertes Virenmaterial enthalten werden. Außerdem ist es durch das Verfahren möglich, Vakzine gegen Viren zu schaffen, die nicht in Kulturen gezüchtet werden können.

Aus führun.qsbei spiel

Die Fig. 1, 2 und 3 der Zeichnung zeigen die vollständige Basensequenz für das E. coli Penicillinase-Gen, das sich auf dem Plasmid pBR322 zusammen mit der entsprechenden Aminosäuresequenz des Proteins, für das es kodiert, befindet.

Das folgende spezifische Beispiel soll das Wesen der Erfindung ohne eine Einschränkung derselben deutlicher machen.

Beispiel

Als Trägerprotein wurde E. coli/Ü-scherichia coli__7 Penicillinase verwendet, für das das Gen auf dem kleinen Plasmid pBR322 getragen wird. Eine -Restriktionsenzymkarte dieses Gens wird in der Zeichnung gezeigt. Dieser Plasniidvektor wurde von Bolivar, u.a. Gene, 2, 95 - 113 (1977) beschrieben. Als Wirtsbakterium wurde E. coli 1776⁺' verwendet; siehe Curtiss, u.a· in Recombinant Molecules: Impact on Science and Society, Proceedings of the Tenth Miles International Symposium (Rekombinationsmoleküle, Bedeutung für Wissenschaft und Gesellschaft), Herausgeber Beers & Bassett, 45 - 56 (1977). Die Wirts-Vektor-Kombination ist ein bestätigtes EK2-System, das vom United States National Institute of Health (Nationales Gesundheitsinstitut der USA) (NIH) am 7. OuIi 1977 bestätigt wurde.

Das Plasmid trägt eine Pst /providencia stuartii endonuclease7~ Restriktionsstelle des Penicillinase-Gens, die der Position der Aminosäuren 181 und 182 entspricht, wie es in der Zeichnung angegeben ist. Doppelsträngige cDNS wurde von RNS-haltigem

' Eine Hinterlegung der Escherichia coli X 1776 erfolgte in der American type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, und steht dort aer Veröffentlichung unter der Bezeichnung ATCC Nr. 31244 zur Verfugung.

213428

Preproinsulin in RNS (PPI-mRNS), isoliert von einem durch Röntgenstrahlen induziertem transplantierbarem B-Zellen-Tumor bei Ratten, synthetisiert (Chick/ u.a. Proc. Natl. Acad. Sei., USA ^fP.N.A.S_-J?, 74, 628 - 632 (1977) ). Mengen von jeweils 20 g gefrorenen Tumorschnitten wurden mit sterilem Sand im Mörser mit der Mörserkeule zerrieben, und die zytoplasmatische DNS wurde aus einer post-nuklearen überstehenden Flüssigkeit durch Mg -Präzipitation (Palmiter, Biochemistry, 13, 3603 - 3615 (1974)) und anschließende Extraktion mit Phenol und Chloroform reindargestellt. Diese DNS wurde durch Aligo-dT-Zellulose-Chromatographie (Aviv, u.a. P.N.A.S., j59, 1408 - 1412 (1972)) weiter gereinigt und direkt als Schablone für die Synthese doppel-strängiger cDNS gemäß der Beschreibung (Efstratiadis u.a.I, Cell, 7, 279 - 288 (1976)) verwendet, mit dem Unterschied, daß ein spezifischer (dpT)_g dpGpC-Primer (Collaborative Research) für die Rücktranskription verwendet wurde. Die Konzentrationen von RNS und Primer betrugen

32 7 mg/ul bzw. 1 mg/u 1. Alle vier c<-- P-dNTPs lagen bei 1,25 mM (endgültige spezifische Aktivität 0,85 Ci/m Mol). Die Rücktranskription betrug 2 % der Einsatz-RNS, und 25 % davon wurden schließlich in dem doppelsträngigen DNS-Produkt zurückgewonnen.

Die doppelsträngige cDNS wurde mit Hilfe der folgenden Verfahrensweise in die Pst-Stelle von Plasmid pBR322 eingebaut: pBR322 DNS (5,0 ng) wurde mit Pst linearisiert, und etwa 15 dG Reste wurden pro 3'-Ende durch Terminaltransferase bei 15 ⁰C in Gegenwart von 1 mM Co ⁺ (Roychoudhury, u.a. Nucleic Acids Res., 3, 101 - 116 (1976)) und lOO^ug/ml sterilisierter Gelatine hinzugefügt. Die gleiche Verfahrensweise wurde für die Zugabe von dC-Resten zu 2,0 ug doppelsträngiger cDNS angewandt. Die Reaktionsgemische wurden mit Phenol extrahiert und mit Äthanol ausgefällt. Die dC-endende doppelsträngige cDNS wurde in einem 6 %igen Polyacrylamidgel unter natürlichen Bedingungen der Elektrophorese unterzogen. Nach der

Autoradiographie wurden Moleküle im Größenbereich von 300 bis 600 Basenpaaren (0,5 ug) aus dem Gel eluiert (Efstratiadis, u.a. in Methods in Molecular Biology, 8, 1 bis 124 (1976)). Die eluierte doppelsträngige cDNS wurde durch Äthanolpräzipitation eingeengt, in 10 mM Tris mit einem pH-Wert von 8 erneut gelöst, und mit 5 ug dG. endendem pBR322 vermischt und gegen 0/1 M NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris mit einem pH-Wert von 8 dialysiert. Das Gemisch (4 ml) wurde dann 2 Minuten lang auf 56 ⁰C gehalten/ und anschließend folgte eine Wärmebehandlung (annealing) von 2 Stunden bei 42 ⁰C. Die Hybrid-DNS wurde zum Transformieren von E. coli 1776 verwendet. Die Anwendung von Oligo dc-dG-Knoten regeneriert die Pst-Schnitte, so daß der Insert später abgeschnitten werden kann.

Die Transformation von E. coli 1776 (ein E!<-2-Wirt mit pBR322, ein ΕΚ-2-Vektor) wurde in einem biologischen Sicherheitskabinett in einer physikalischen Sicherheitseinrichtung P3 in Übereinstimmung mit N.I.H.-Richtlinien für Rekombinations-DNS-Forschung, veröffentlicht im Federal Register, 7. OuIi 1976, durchgeführt.

1776 wurde durch ein Transfektionsverfahren transformiert

(Enea, u.a., 0. Mol. Biol., 96, 495 - 509 (1975)), das folgendermaßen leicht modifiziert worden war: 1776 wurde in L* Bouillon /~10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl (Difco)__7 ergänzt durch 10 iig/ml Diaminopimelinsäure und 40 ju g/ml Thymidin (Sigma) auf Α,-₉₀ von 0,5 gezüchtet. Eine 200-ml-Portion der Zellen wurde bei 3000 U/min sedimentiert und durch Schwenken in 1/10 Volumen kalter Pufferlösung, die 70 mM MnCl₂, 40 mM NaAc, pH-Wert 5,6, 30 mM CaCl₂ enthielt und 20 Minuten lang auf Eis gehalten wurde, erneut suspendiert. Die Zellen wurden repelletisiert und in 1/30 des ursprünglichen Volumens in der gleichen Pufferlösung resuspendiert. Die wärmebehandelte DNS (2 ml) wurde zu den Zellen gegeben.

— 7 —

-r- 213 4 2 8

Aliquoten dieses Gemischs (0,3 ml) Wurden in sterile Röhrchen gegeben und 60 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden anschließend 2 Minuten lang auf 37 ⁰C gehalten. In jedes Röhrchen wurde Bouillon (0,7 ml) gegeben, und die Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei 37 ⁰C inkubiert. Hine 200-μΙ-Portion der Zellen wurde auf sterile Nitrocellulosefilter (Millipore) verteilt, die über Agarplatten, die 15 ug/ml Tetracyclin enthielten, lagen. (Die Filter wurden vor Gebrauch zur Entfernung von Detergenzien gekocht). Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37.⁰C inkubiert. Es wurden Duplikate der Filter angefertigt. Die die Transformanten enthaltenden Nitrocellulosefilter wurden von dem Agar abgenommen und auf eine Schicht steriles Whatman-Filterpapier gesetzt. Oben auf das die Kolonien enthaltende Filter wurde ein neues steriles Filter gesetzt, und mit Hilfe eines sterilen Samttuches und eines zweiten Blockes wurde Druck angewandt. Eine sterile Nadel wurde zum Verschließen der Filter verwendet. Das zweite Filter wurde auf eine neue Agar-Platte gesetzt und 48 Stunden lang bei 37 C inkubiert. Die auf dem ersten Filter befindlichen Kolonien wurden mit Hilfe der Grunstein-Hogness-Technik (P.N.A.S., 72, 3961 - 3965 '(1975)) untersucht, wobei als Sonde ein 80-Nucleotid langes Fragment diente, hergestellt durch Hae III-Digestion von cDNS mit hoher spezifischer Aktivität, kopiert von der Oligo-dT-gebundenen RNS der Ratte. Positive Kolonien wurden erneut durch die HART-Methode (Paterson, u.a., P.N.A.S., 74, 4370 - 4374 (1977)) wie folgt untersucht: Plasmid DNS (etwa 3 jug) wurde mit Pst digeriert, in Äthanol ausgefällt und direkt in 20 iil entionisiertes Formamid hineingelöst. Nach Erhitzen von 1 Minute auf 95 ⁰C wurde jede Probe auf Eis gesetzt. Nach der Zugabe von 1,5 ug Oligo (dT)-Cellulose-gebundener DNS, PIPES mit einem pH-Wert von 6,4, bis 10 mW und NaCl bis 0,4 M wurden die Gemische 2 Stunden lang bei 50 ⁰C inkubiert. Anschließend wurden sie durch die Zugabe von 75 ill H₂O verdünnt und mit Äthanol in Gegenwart von 10 ug U'eizenkeimen-tRNS ausgefällt, mit 70 %igem

-s - 21342 8

Äthanol gewaschen, in H₂O gelöst und zu einem von Weizenkeimenzellen freien Translationsgeinisch gegeben (Roberts, u.a., P.N.A.S., 70, 2330 - 2334 (1973)). Nach drei Stunden bei 23 ⁰C wurden Duplikat-2-ul-Aliquoten zur Trichloressigsäure-Präzipitation entfernt; der Rest des Reaktionsgemische wurde mit Ribonuclease behandelt, mit Immunoanalysepuffer veidünnt und hinsichtlich der Synthese von immunoreaktivem Preproinsulin mit Hilfe einer Doppel-Antikörper-Immunopräzipitation analysiert (Lomedico u.a., Nucleic Acids Res., 3, 381 - 391 (1976)). Die gewaschenen Immunopräzipitate wurden in 1 ml NCA gelöst (Amersham) und in 10 jul Omnifluor (New England Nuclear) durch Flüssigkeitsszintillation gezählt.

Eine Kolonie wurde durch HART-Screening identifiziert. Der Pst-abschneidbare Insert wurde mit Hilfe der Methode von Maxam und Gilbert (P.N.A.S., 74, 560 - 564 (1977)) sequenziert, um zu zeigen, daß er öer Sequenz von Ratten-Preproinsulin I entspricht. Dieser Insert, markiert durch Einkerbungstranslation mit DNS-Polymerase I, wurde zum Untersuchen von 200 Transformanten mit Hilfe der Grunstein-Hogness-Ana~ lyse verwendet. Es wurden 48 Klone identifiziert/^tiie^'Ratten-Preproinsulin-cDNS-£-n-eep^s—eniireni -Probe hybridisiert wurde,

Diese 48 Klone von transformierter E. coli 1776 wurden unter Anwendung einer.in situ-Radioimmunoanalyse-Technik untersucht, um zu bestimmen, ob die Klone entweder Insulinantigene erzeugten und ob sie verschmolzene Polypeptidketten erzeugten, von denen ein Ende Insulinantigen und das andere Ende Penicillinase (das bakterielle Trägerprotein)-Antigen erzeugte. Die Anwesenheit verschmolzener Polypeptidketten würde darauf hindeuten, daß die Klone Gene enthielten, bei denen es sich um die Fusionsprodukte des Bakteriengens für Penicillinase mit dem eukaryotischen Zellgen für Insulin handeln würde. Solche

21342

verschmolzenen Polypeptidketten wurden tatsächlich gefunden/ und zwar mit Hilfe aer anschließend beschriebenen Technik. Die Technik beruht auf der Tatsache, daß die verschmolzenen Proteine, nach denen gesucht wird, zwei Antigenenden enthalten, von denen sich jedes an seinen entsprechenden spezifischen Antikörper bindet. Ein spezifischer Antikörper wurde auf eine Kunststoffscheibe gelegt, das Antigenprotein von lysierten Bakterienzellen wurde mit der Scheibe in Berührung gebracht, dann wurde die Scheibe abgespült und den radioaktiven Antikörpern ausgesetzt. Ein Proteinmolekül wird sich an den an dem Kunststoff haftenden Antikörper mit einer Antigendeterminante binden und wird seinerseits einen radioaktiven Antikörper mit einer zweiten Determinante binden. Wenn Antipenicillinase auf der Scheibe vorhanden ist und Anti-Insulin markiert ist, nachdem das "Sandwich" gewaschen wurde, dann werden die einzigen noch zurückbleibenden Stellen mit Radioaktivität das Vorhandensein verschmolzener Proteine anzeigen. Ausführlicher erläutert sah die Methode folgendermaßen aus:

Oede Scheibe aus durchsichtigem Polyvinyl (PV) mit einem Durchmesser von 8,25 cm und einer Dicke von 8 mm (Dora May Co., New York) wurde flach zwischen glatte Papierbogen gelegt. In einer Glaspetrischale wurde jede Scheibe dann auf die Oberfläche einer Flüssigkeit von IO ml 0,2 M NaHCO₃ mit einem pH-Wert von 9,2 gelegt, die 60 ug/ml IgG enthielt. Nach 2 Minuten bei Raumtemperatur oder länger wurde die Scheibe herausgenommen, zweimal mit 10 ml kaltem V/aschpuffer (VVB), bestehend aus phosphatgepufferter Salzlösung, 0,5 % normalem MeerscfiWeinchenserum, 0,1 % Rinderserumalbumin und 0,3 mg/ml Streptomycinsulfat gewaschen. Oede Scheibe wurde sofort nach dem Waschen verwendet.

Antigene wurden aus Bakterienzellen durch die Transformation von Kolonien auf 1,5 %ige Agarose, die 0,5 mg Lysozym/ml,

- 10 -

21342

30 mM Tris mit pH-Wert 8 und 10 mM EDTA enthielt, freigesetzt. Die IgG-beschichtete Oberfläche einer PV-Scheibe wurde mit der Oberseite nach unten auf die Agarose und die Bakterienkolonien gelegt und 60 Minuten lang bei 4 ⁰C belassen. Oede Scheibe wurde danach entfernt und dreimal mit 10 ml kaltem WB gewaschen. Durch diesen Schritt wurde die Immunoadsorption von Antigen auf der Festphasen-Antikörperschicht abgeschlossen,

Die Reaktion der !-markierten Antikörper mit dem jetzt an den Scheiben haftenden Antigen erfolgte dadurch, daß 1/5 ml VVB, der 5 χ 10⁶ cpm (γ-Emission) ¹²⁵I-IgG enthielt, auf die Mitte einer flachen Scheibe aus gewöhnlichem Nylongeflecht mit einem Durchmesser von 8,25 cm, die auf den Boden einer Petrischale gelegt worden war, aufgebracht wurde. Das Geflecht diente als Abstandshalter. Dann wurde eine wie in den früheren Schritten behandelte Scheibe mit der Oberseite nach unten auf das Geflecht und die Lösung gelegt und über Nacht bei 4 ⁰C inkubiert. Oede Scheibe wurde danach zweimal mit 10 ml kaltem VVB und zweimal mit Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur zum Trocknen stehen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt waren verschmolzene Proteine sowohl an die gewöhnliche als auch die radioaktiv markierte Schicht von IgG gebunden. Diese Proteine wurden dann mit Hilfe herkömmlicher Autoradiographietechnik unter Verwendung von Kodak Screen-Film oder Kodak X-OMAT R-FiIm und einer DuPont Cronex Lichtquelle plus Verstärkungsschirrn nachgewiesen, wie beispielsweise von Laskey, u.a. FEBS Lett., 82, 314 bis 316 (1977) beschrieben wurde. Es wurden die Anti-Insulin- und die Anti-Penicillinase-IgG-Fraktionen für das obige Verfahren benötigt. Bei dem Anti-Insulin-Antiseruin handelte es sich um ein im Handel erhältliches Produkt, das von Meerschweinchen gewonnen worden war. Das Kaninchen-Anti-Penicillinase-Antiserum wurde durch Injektion von (1 mg reiner) Penicillinase (in vollständigem Freund¹s-Adjuvans (Difco)) in weiße Neuseeland-Kaninchen erzeugt· Aktivierende Injektionen wurden in unvollständigem

- 11 -

Freund¹s Adjuvans (Difco) 2 bis 3 Wochen nach der ersten Injektion verabreicht, und die Kaninchen wurden 1 Woche später zur Ader gelassen.

Die IgG-Fraktionen wurden aus jedem Immunserum durch Ammoniumsulfatpräzipitation und anschließende DEAE-Cellulose (Whatman, DE-52)-Chrornatographie in 0,025 M Kaliumphosphat, pH-Wert 7,3, mit 1:1% Glycerin zubereitet. Fraktionen, die die Masse des durchgelaufenen Materials enthielten, wurden gesammelt, und das Protein wurde durch die Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 40 % ausgefällt. Das resultierende Kügelchen wurde in 1/3 des ursprünglichen Serumvolumens von 0,025 M Kaliumphosphat, pH-Wert 7,3, 0,1 M NaCl, 1 % Glycerin erneut suspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Nach der Dialyse wurde alles zurückgebliebene Präzipitat durch Zentrifugieren entfernt. IgG-Fraktionen wurden in Aliquoten bei - 70 ⁰C aufbewahrt.

üede IgG-Fraktion wurde mit Hilfe der üblichen Methode von Hunter u.a., Biochem. 0., £1, 43 - 46 (1964) radiographiert. , Die 25 jul Reaktionsgemisch enthielten 0,5 M Kaliumphosphat, pH-Wert 7,5, 2 mCi trägerfreies Na I, 150 jug IgG und 2 jjg Chloramin T. Nach 3 Minuten bei Raumtemperatur wurden 8 ug Natriummetahydrogensulfit in 25/Ul PBS zugesetzt, worauf 200/jI PBS, die 2 % normales Meerschweinchenserum enthielten,

/ 125 folgten. Das I-markierte IgG wurde durch Chromatographie auf einer Sephadex G-50-Säule, die mit PBS, das 2 % normales Meerschweinchenseruni enthielt, äquilibriert worden war, ge-

125 reinigt. Die I-IgG-Elutionsfraktion wurde mit PBS, das 10 % normales Meerschweinchenserum enthielt, auf 5 ml verdünnt, durch ein steriles Millipore VC-Filter (0,1 iim Porengröße) filtriert, in Aliquoten geteilt und bei - 70 ⁰C aufbewahrt. Die spezifischen Aktivitäten lagen bei 1,5 χ 10 cpmAjg,

- 12 -

1 77fi

Durch diese Untersuchung wurde ein Klon von X entdeckt, das ein verschmolzenes Protein synthetisierte und abtrennte, das sowohl Penicillinase- als auch Insulin-Antigendeterminante zeigte« Dieses aus dem Periplasma gewonnene Protein ähnelt Insulin bei Radioimmunoanalysen. DNS-Sequenzieren zeigt, daß dieses Protein eine Fusion zwischen Penicillinase und Proin~ sulin ist, wobei die beiden Proteine durch 6 Glycine zwischen Aminosäure 182 von Penicillinase (Alamin) und Aminosäure 4, Glutamin, von Proinsulin verbunden sind. Somit wurde ein höheres Zellhormon in Bakterien in einer als Antigen aktiven Form synthetisiert,

Man wird verstehen, daß die DNS-Sequenz für das vorgesehene eukaryotische Zellprotein in einen Hind Il-Schnitt, der die Position zwischen Aminosäure 101 und 102 des Proteins, für das dieses pBR322-Plasmid kodiert, entspricht oder in einen Taq-Schnitt an der Position, die der Aminosäure 45 entspricht, eingefügt werden kann. In allen Fällen wird es, wenn die eukaryotische ZeIl-DNS durch die willkürliche Hinzufügung von Schweifen oder durch andere Verfahren in Phase angeordnet ist, als ein verschmolzener Teil des Trägerproteins bezeichnet; und das Protein wird aus der Zelle ausgeschieden werden. Außerdem kann die Sequenz des Penicillinase-Gens, wenn sie in diesem Plasmid oder in anderen vorliegt, entweder durch Mutation oder durch direkte DNS-Rekombinations-Techniken wie die Einfügung von DNS-Fragmenten an spezifischen Stellen innerhalb des Gens in einer Weise modifiziert werden, daß neue Restriktionsschnitte, die für Zusammenfügen zweckmäßig sind, eingefügt werden. Beispielsweise kann der Rl-Schnitt am Plasmid pBR322 durch Mutation entfernt werden und eine Rl-Sequenz durch Ligatur in das Penicillinase-Gen eingefügt werden. Obwohl dadurch das Gen inaktiviert werden könnte, würde es die Verwendung dieses Bereichs der DNS zur Synthese eines Trägerproteins nicht stören.

-13 -

21342

Das Segment des Penicälinase-Gens DNS zwischen dem Kode für Aminosäure 23 am Ende des hydrophoben Führers und dem Kode für Aminosäure 45 an dem Taq-Schnitt zum Beispiel kann durch Ergänzen (nibbling back) der DNS durch ein Gemisch entsprechender Enzyme entfernt werden. Ein solches Gemisch ist die Λ-Exonuclease, die den DNS-Strang von dem ö'-Ende zusammen mit dem Enzym Sl zurückbringen wird (chew back), wodurch der einsträngige Überhang entfernt wird. Ein anderes derartiges Gemisch ist T^-DNS-Polymerase, die das 3'-Ende eines DNS-Stranges zusammen mit Sl zurückbringen wird (chew back), wodurch wieder der einsträngige Überhang entfernt wird. Durch gesteuerte Digestion kann das Plasmid-DNS-Molekül entsprechend auf das Fragment, das von dem Rl-Schnitt zu dem für die Aminosäure 23 kodierenden Punkt oder zu anderen Punkten an der hydrophoben Führersequenz verläuft, verkürzt werden, und ein derartiges Fragment kann mit einem ähnlich erzeugten Fragment, das die Insulinsequenz enthält, verschmolzen werden und enzymatisch zu einem passenden Anfangspunkt, vermutlich wieder zu dem Punkt, an dem das ausgereifte Insulinmolekül beginnt, zurückgebracht werden (chewed back). Diese beiden Fragmente können miteinander verschmolzen werden, zum Beispiel durch Verbindung des stumpfen Endes durch die T₄-DNS-Ligase, und diese Fusion kann¹ in das Plasmid eingefügt werden. Diese Fusion erzeugt eine degenerierte Spezies des Trägerproteins, für die das Träger-Gen nur für die hydrophobe E. coli Führersequenz kodiert und das eukaryotische Zellgen den Rest der Strukturinforination liefert. Obwohl solche Konstruktionen im Prinzip einwandfrei entstehen können, entstehen sie in der Praxis wahrscheinlich auf einer zufälligen Basis, wozu das Zusammenfügen zahlreicher Genfragmente, deren Endpunkte in interessanten Bereichen liegen, und die Untersuchung des Mediums, das Klone von Bakterien umgibt, die durch die verschmolzenen Fragmente transformiert wurden, gehören, um Antigen-Aktivität durch eine RIA wie die oben beschriebene als Beweis für die Proteinsynthese nachweisen zu können.

- 14 -

2134 2

Die erfindungsgemäße Verfahrensweise ist nicht auf die Verwendung des E. coli Penicillinase-Gens beschränkt, sondern ist für das Gen jedes ausgeschiedenen Proteins, das von einem multireproduzierten Plasmid oder auf einem Bakteriophagen getragen wird, anwendbar. Sie ist nicht auf Insulin beschränkt, sondern kann auch angewendet werden, um den Ausdruck des verschmolzenen Proteins eines beliebigen DNS-Fragments eines Virus oder einer eukaryotischen Zelle zu finden, das einen Kodierbereich trägt, der, wenn er in Phase übersetzt wird, für Antigendeterminanten in dem Viren- oder eukaryotischen Zellprotein kodiert. Wenn daher Fragmente tierischer Virus-DNS in die Pst- oder Hind II-Stelle des Penicillinase-Gens eingefügt werden, so wird irgendeine Rezeptorbakterie ein verschmolzenes Protein synthetisieren, das unter Anwendung der RIA-Technik erkennbar ist, wozu für das Virenantigen spezifische Antikörper verwendet werden« Dieses verschmolzene Protein kann seinerseits rein dargestellt und zur Stimulierung einer Antikörperreaktion bei Tieren oder Menschen verwendet werden, und zwar entweder für die Produktion von Antikörpern, die auf spezifische Stellen am Virusprotein gerichtet sind, oder als Vakzination gegen das Virus-Antigen» Das verschmolzene Protein wird Hilfs-Determinanten bei einer solchen Vakzination zur Unterstützung der Xinmunreaktion liefern, wenn auch vermutlich aggregierte Zustände des verschmolzenen Proteins in einem Vakzin verwendet werden müßten. Die spezifischen Trägerproteine, die eingesetzt werden wurden, könnten entweder die Bakterienproteine selbst sein oder noch weitere Fusionen zwischen den Bakterienproteinen und anderen zweckmäßigen Sequenzen, um nützliche Hilfsdeterminanten im Trägerprotein zu liefern.

- 15 -

Claims

-"-213428

12 399 56
ET.

Erfindungsanspruch;

1. Verfahren für die Gewinnung eines ausgewählten Proteins oder eines Teiles davon durch die Einfügung von DNS, die das ausgewählte Protein oder den Teil davon darstellt, in ein Bakterien-Gen, gekennzeichnet dadurch, daß das Bakterien-Gen für ein extrazelluläres oder periplasmisches Trägerprotein gespalten wird, in die Spaltungsstelle durch einen Rekombinationsschritt ein nicht-bakterielles DNS-Fragment, das für das ausgewählte Protein oder den Teil davon kodiert, eingefügt wird, ein VVirtsbakterium mit dem rekombinierten Gen transformiert wird und die transformierten Bakterien zur Ausscheidung des ausgewählten Proteins oder eines Teiles davon gezüchtet werden.

2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dein ausgewählten Protein um ein eukaryotisch.es Zellprotein handelt, das einen hydrophoben Führer enthält, der normalerweise während der Ausscheidung aus der eukaryotischen Zelle gespalten wird.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß das Trägerprotein E. coli Penicillinase ist.
4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem ausgewählten Protein um Insulin handelt
5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Trägerprotein E. coli Penicillinase ist und das Bakterien-Gen an der Pst-Restriktionsstelle gespalten wird.

- 16 -

B-B.

G^ATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTG

20 40 60 80 100

CTTA/^GAACTTCTGCTTTCCCGGAGCACTATGCGGATAAAAATATCCAATTACAGTACTATTATTACCAAAGAATCTGCAGTCCACCGTCAAAAGCCCCTTTACAC

CGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAG

120 140 160 180 200

GCGCCTTGGGGATAAACAAATAAAAAGATTTATGTAAGTTTATACATAGGCGAGTACTCTGTTATTGGGACTATTTACGAAGTTATTATAACTTTTTCCTTC

10 20 I 30

Me tSer Il eG I KHi sPheA rg Va IA laLeul I eProPhePheA IaA laPheCysLeuProValPheAldHisProGluTh vLeuValL us Va ILu B A ep

AGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAÄAGTAAAAGAT

220 240 260 280 300

TCATACTCATAAGTTGTAAAGGCACAGCGGGAATAAGGGAAAAAACGCCGTAAAACGGAAGGACAAAAACGAGTGGGTCTTTGCGACCACTTTCATTTTCTA

AlaCluAspClnLeuGlyAIaArgValGIy Tür Il

GCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT

60

eGluLeuAspLeuAsnSerGlyLusIleLeuGluSerPheAraProGluGluArgPheProMetMet

!GAACTGGATCTCAACAGCGGTAÄGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATG

320

360

380

400

CGACTTCTAGTCAACCCACGTGCTCACCCAATGTAGCTTGACCTAGAGTTGTCGCCATTCTAGGAACTCTCAAAAGCGGGGCTTCTTGCAAAAGGTTACTAC

70 80 90 100

SerThrPhelysValLeuLeuCijeGlyA laValLeuSerArgYalAepA IaGIy G InG IuG InLe uC Iy Arg Arg HeHi sTyrSerGlnAenAspLeuVal AGCACTTTT AAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTeAGAATGACTTGGTT

420 440 460 480 . 500

TCGTGAAAATTTCAAGACGATACACCGCGCCATAATAGGGCACAACTGCGGCCCGTTCTCGTTGAGCCAGCGGCGTATGTGATAAGAGTCTTACTGAACCAA

FfG.1

110 120. . 130

GluTyrSerProValThrGluLysRisLeuThrAspGlyMetThrValArgGluLeuCysSerAlaAlalleThrMetSerAspAsnThrAlaAlaAsnLeu

GAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTA

520 540 560 " 580 600

CTCATGAGTGGTCAGTGTCTTTTCGTAGAATGCCTACCGTACTGTCATTCTCTTAATACGTCACGACGGTATTGGTACTCACTATTGTGACGCCGGTTGAAT

140 150 160

LeuLeuThrThrlleGiyGlyProLysGluLeuThrAlaPheLe-uHisAsnMetGivAspHzsValThrArgLeuAspArgTrpGluProGluLeiiAsnGlu

CTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAA

620 640 660 680 700

GAAGACTGTTGCTAGCCTCCTGGCTTCCTCGATTGGCGAA AAAACGTGTTGTACCCCCTAGTACATTGAGCGGAACTAGCAACCCTTGGCCTCGACTTACTT

170 180

Λ lalleProAsnAspGluArgAspThrThry.etProA la

GCCATACCAAACGACGAGCGTGA

720

740

190 200

Ά lat-letA laThrThrLeuArgLusLeuLeuThrGlyGluLeuLeuThrLeuA laSerArgGln

CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAA

ACCACGATGCCTGCAkCAATGGCAACAACGTTGCGi:

780

800

CGGTATGGTTTGCTGCTCGCACTGTGGTGCTACGGhCGTCGTTACCGTTGTTGCAACGCGTTTGATAATTGACCGCTTGATGAATGAGATCGAAGGGCCGTT

210 220 230

GlnLeuIleABpTrpMetGluAlaAspLysValAlaGluProLeuLeuArcSerAlaLeuProAlaGlyTrpPhelleAlaAspLysSerGlyAlaGluGlu

CAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGAtAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAG

820 840 860 880 900

GTTAATTATCTGACCTACCTCCGCCTATTTCAACGTCCTGGTGAAGACGCGAGCCGGGAAGGCCGACCGACCAAATAACGACTATTTAGACCTCGGCCACTC

240 250 260 270

ArcGlySerArcGlyllelleA.laAlaLeuGlyProAspGluLveProSerArglleVaiVallleTyrThrThrGlySerGlnAlaThrMetAspG luArg

CGTGGGTCTCGtGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA

920 940 960 980 1000 1020

GCACCCAGAGCGCCATAGTAACGTCGTGACCCCGGTCTACCATTCGGGAGGGCATAGCATCAATAGATGTGCTGCCCCTCAGTCCGTTGATACCTACTTGCT

FiG.2

286

AsnArgGlnlleAlaGluIleGlyAlaSerLeuIleLysHisTrO

AATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACnTAGA

1060 1080 1100

TTATCTGTCTAGCGACTCTATCCACGGAGTGACTAATTCGTAACCATTGACAGTCTGGTTCAAATGAGTATATATGAAATCT