DD148298A5 - Verfahren zur reinigung von insulin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhoehung der Reinheit von Insulin mit hoher Produktivitaet, bei dem betraechtlich verminderte Mengen an Proinsulin und anderen verunreinigenden Proteinen anfallen. Erfindungsgemaesz wird ein vernetzter Dextrangelkationenaustauscher mit Sulfoalhyl- oder Carboxymethylgruppen gequollen und aequilibriert, eine Saeule mit dem gequollenen Gel gefuellt, ein teilweise gereinigtes Insulin in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 12% (Gewicht/Volumen) in einem sauren waeszrigen Medium mit einem pH von 2,5 bis4,5, das 4 bis 8 Mol/l Medium Harnstoff enthaelt, geloest, diese Insulinloesung mit dem eingefuellten Gel kontaktiert und das Insulin aus dem Kationenaustauschergel bei 5 bis 20 Grad C mit einem Mittel eluiert,das aus einem sauren waeszrigen Medium besteht, das ein anorganisches Salz enthaelt. Das Salz liegt im waeszrigen Medium in einer fortschreitend steigenden Konzentration vor, beginnend bei 0,2 Mol/l und endend bei etwa 0,4 Mol/l.

Description

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X-5317A Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana; V.St.A.

Verfahren zur Reinigung von Insulin Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung bezieht sich auf die Erzeugung von Insulin, insbesondere von hochreinem Insulin durch Verwendung eines Kationenaustauschergels. Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Seit seiner·Entdeckung im Jahr 1921 als Bestandteil des Pankreas hat Insulin weltweit große Bedeutung für die Behandlung von Diabetes mellitus erlangt. Da die zur Entfernung von Insulin aus dem Pankreasgewebe angewandten Extraktionsverfahren gleichzeitig zur Entfernung beträchtlicher Mengen an Nichtinsulinproteinen führen, sind beträchtliche Anstrengungen für das Finden und die Entv/icklung von Verfahren zur Reinigung von Insulin, d. h. Verfahren zur Abtrennung von Insulin von Nichtinsulinprotein aufgewandt worden.

Eines der frühesten Verfahren beruht auf der Ausnutzung des Umstands, daß Protein bei seinem isoelektrischen Punkt die geringste Löslichkeit zeigt. So betrifft die US-PS 1 469 994 ein Reinigungsverfahren, wobei die

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Nichtinsulinproteine in einem wäßrigen Pankreasextrakt bei ihrem isoelektrischen Punkt ausgefällt werden.

In der US-PS 1 520 673 ist die isoelektrische Insulinfällung aus einem wäßrigen Pankreasextrakt bei pH-Werten von etwa 4 bis 7, vorzugsweise zwischen 4,5 und 5,5, angegeben.

Bei einem anderen frühen Verfahren wird die Insulinfällung durch Zugabe eines anorganischen Salzes in ausreichender Menge bewirkt. Die US-PS 1 547 515 betrifft das erste Verfahren zum Aussalzen von Insulin aus einem Extraktionslösungsmittel durch Zugabe von Natriumchlorid.

In der US-PS 2 449 076 ist ein anderes Aussalzverfahren zur Insulinreinigung angegeben. Dabei wird Insulin aus einem neutralisierten Extrakt durch Zugabe von Natriumchlorid ausgesalzen, abfiltriert, erneut gelöst und unter Verwendung einer geringeren Natriumchloridkonzentration wieder ausgesalzen.

Bei einem weiteren Verfahren zur Reinigung von Insulin wird das Insulin aus der Lösung als ein Zink-Insulin-Komplex gefällt oder kristallisiert. Allgemein ausgedrückt wird Zinkinsulin aus einer gepufferten Zinkionen enthaltenden wäßrigen Lösung gefällt. Es sind die verschiedensten Puffer angewandt worden, nach US-PS 2 626 beispielsweise ein Citronensäure-Citrat-Puffer.

Die US-PS 2 663 666 betrifft ein Verfahren der Insulinreinigung, wobei der pH-Wert eines sauren wäßrigen Pankreasextrakts nacheinander auf 4,0 bis 5,5, 7,8 bis 8,5 und 3,0 bis 3,5 eingestellt, die erhaltene Mischung nach jeder pH-Wert-Einstellung filtriert und der Rückstand

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von unerwünschten sauren und basischen Bestandteilen des Extrakts jeder Filtration verworfen wird. Insulin wird dann aus dem letzten Filtrat gewonnen.

Die derzeitigen technischen Verfahren zur Insulinreinigung können wenigstens drei der oben beschriebenen Arbeitsweisen umfassen, beispielsweise eine oder mehrere Salzfällungen bei verschiedenen Salzkonzentrationen, eine oder mehrere isoelektrische Fällungen und wenigstens eine Zinkkristallisation.

Die US-PS 2 878 159 betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Insulin durch überleiten eines wäßrigen Pankreasextrakts über ein Kationenaustauscherharz vom Carbonsäuretyp. In US-PS 3 069 323 ist die Verwendung eines Aminocellulose-Anionenaustauscherharzes in einem vergleichbaren Verfahren angegeben.

Die GB-PS 1 054 523 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von kristallinem Insulin aus wäßrig-alkoholischen Pankreasextrakten oder wäßrigen Lösungen von Insulin, wobei diese Extrakte oder Lösungen mit einem sulfonierten Kationenaustauscherharz bei einem pH-Wert von über 7/4 oder unter 3,5 in Berührung gebracht werden. Außerdem wird nach der US-PS 3 221 008 Zinkinsulin einer Säulenchromatographie an dem Kationenaustauscher "Dowex 50/X1", einem sulfonierten Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat in Perlform unterworfen.

Die JP-PS 6492/63 und die BE-PS 676 879 betreffen die Verwendung einer Carboxymethylcellulose bei der Insulinreinigung.

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Außer den oben erwähnten Kationen- und Anionenaustauscherharzen und Carboxymethylcellulosesubstraten sind auch Dextrangele bei der Behandlung von Insulin verwendet worden. Nach der DE-PS 2 212 695 wird ein als Epichlorhydrin-vernetztes Dextrangel bezeichnetes Gel verwendet, dessen Hydroxylgruppen größtenteils alkyliert sind. Wie in den US-PS 3 876 623 und 3 878 186 angegeben, ist auch eine Gelfiltration bei der Reinigung von Alkali- oder Ammoniuminsulin angewandt worden.

In der US-PS 3 097 676 ist die Behandlung von Insulin an einer chromatogräphischen Säule aus einem Anionenaustäuscher und seine Elution aus dieser Säule mit einem Elutionsmittel angegeben, das Wasser und einen mit Wasser mischbaren einwertigen aliphatischen Alkohol enthält.

Wie sich aus den vorstehenden Ausführungen ergibt, ist zwar die Literatur auf dem Gebiet der chromatographischen Reinigung von· Insulin ziemlich umfangreich, doch besteht nach wie vor Bedarf an einem Verfahren, das die Erzeugung von hochreinem Insulin durch Entfernung von Nichtinsulinproteinen, wie Proinsulin, proinsulinartigen Proteinen, Somatostatin und Glucagon, unter möglichst gering gehaltenen Insulinverlusten ermöglicht. Proinsulin und proinsulinartige Proteine sind die hauptsächlichsten Nichtinsulinbestandteile in technisch erzeugten Insulinsorten. Diese Bestandteile machen zwar im allgemeinen weniger als etwa 8 Gewichtsprozent von technisch erzeugten Zinkinsulinsorten aus, doch wird angenommen, daß einige dieser Bestandteile von antigener oder immunogener Natur sind. In diesem Zusammenhang wird u.a. auf Chance et al., Science, Bd.. 161, S. 16.5 (1968); Steiner et al., Diabetes, Bd. 18, S. 725 (1968); Bromer, BioScience, Bd. 20,

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S. 702 (1970) und Rubenstein et al., Ann. Rev. Med., Bd. 22, S. 1 (1971) hingewiesen. Es besteht daher weiter das Bedürfnis danach, daß ein anderes Verfahren zur Entfernung von Nichtinsulinproteinen aus Insulin gefunden wird, das mit möglichst geringen Insulinverlusten verbunden ist und in technischem Maßstab durchgeführt werden kann.

Die Bezeichnung "Insulin", wie sie hierin gebraucht wird, umfaßt nicht nur Insulin selbst, sondern alle insulinartigen Proteine, wie Desamidoinsulin. Da Insulin und insulinartigen Proteine vergleichbare hypoglykämische Wirkungen haben, ist es gewöhnlich nicht erforderlich, Insulin von allen anderen Pankreasproteinen abzutrennen. Mit anderen Worten ausgedrückt, ein homogenes Insulin ist normalerweise nicht erforderlich. Wie oben ausgeführt, ist es aber in hohem Maße erwünscht, Nichtinsulinproteine, wie Proinsulin, proinsulinartige Proteine, Somatostatin und Glucagon, in großem Maßstab von Insulin abzutrennen und dadurch zu einem Produkt mit möglichst geringen möglichen antigenen oder immunogenen Eigenschaften zu gelangen. Ziel der Er-findur.g:

Es ist dies der Zweck, auf den das erfindungsgemäße Verfahren gerichtet ist. Manche bekannte Verfahren ermöglichen zwar ein gewisses Maß an Abtrennung von Nichtinsulinproteinen von Insulin, doch kann dies im allgemeinene nur mit dem Verlust erheblicher Mengen an Insulinprodukt erkauft werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht dagegen die Erzeugung von hochreinem Insulin in technischem Maßstab und bei minimalem Insulinverlust.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

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Die Aufgabe, die sich die Erfindung gestellt hat, die Schaffung eines Verfahrens zur Reinigung von Insulin, wird durch die Verwendung eines Kationenaustauschergels unter Bedingungen gelöst, die zu einer hohen Insulingewinnung und zu beträchtlich verminderten Mengen an Proinsulin und anderen verunreinigenden Proteinen führen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erhöhung der Reinheit von Insulin ist dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein vernetzter Dextrangelkationenaustauscher mit Sulfoalkyl- oder Carboxymethylgruppen gequollen und äquilibriert,

b) eine Säule mit dem gequollenen Gel gefüllt,

c) ein teilweise gereinigtes Insulin in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) in einem sauren wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5, das Harnstoff in einer Konzentration von etwa 4 bis 8 Mol/l Medium enthält, gelöst,

d) diese Insulinlösung mit dem Kationenaustauschergel in der Säule in Berührung gebracht und

e) das Insulin aus dem Kationenaustauschergel bei einer Temperatur von etwa 5 bis 25 ⁰C mit einem Elutionsmittel eluiert wird, das aus einem sauren wäßrigen Medium besteht, das ein anorganisches Salz enthält, wobei dieses anorganische Salz in dem sauren wäßrigen Medium in einer fortschreitend steigenden Konzentration vorliegt, die bei oder unter etwa 0,2 Mol/l beginnt und sich bis tvi etwa 0,4 Mol/l erstreckt.

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Zur Erzielung eines noch höheren Grades an Insulinreinheit kann das Insulin, das der vorstehend beschriebenen Reinigung unterworfen wird, dasjenige sein, das durch Behandlung mit einem Anionenaustauschergel unter definierten Bedingungen erhalten worden ist.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erhöhung der Reinheit von Insulin ist somit dadurch gekennzeichnet, daß

a) ein vernetzter Dextrangelanionenaustauscher gequollen und äquilibriert,

b) eine Säule mit dem gequollenen Anionenaustauschergel gefüllt,

c) ein teilweise gereinigtes Insulin in einer. Konzentration von 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) in einem neutralen oder mäßig alkalischen wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7 bis 9 und einem Gehalt an Harnstoff in einer Konzentration von etwa 4 bis 8 Mol/l gelöst,

d) die Insulinlösung mit dem Anionenaustauschergel in Berührung gebracht,

e) Insulin aus dem Anionenaustauschergel bei einer Temperatur von etwa 5 bis 10 ⁰C mit einem neutralen oder mäßig alkalischen wäßrigen Meidum als Elutionsmittel, das ein anorganisches Salz in fortschreitend steigender Konzentration von bis zu etwa 0,2 Mol/l enthält, eluiert,

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f) ein vernetzter Dextrangelkationenaustauscher mit Sulfoalkyl- oder Cärboxymethylgruppen gequollen und äquilibriert,

g) eine Säule mit dem gequollenen Kationenaustauschergel gefüllt, . '

h) eine Lösung des nach Stufe e) erhaltenen Insulins in einem sauren wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5, einem Harnstoffgehalt von etwa 4 bis 8 Mol/l Medium und einer Konzentration von 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) mit dem Kationenaustauschergel in Berührung gebracht und

i) das Insulin aus dem Kationenaustauschergel bei einer Temperatur von 5 bis 25 ⁰C mit einem sauren wäßrigen Medium als Elutionsmittel, das anorganisches Salz in fortschreitend steigender Konzentration enthält, die bei oder unter 0,2 Mol/l beginnt und sich bis hinauf zu etwa 0,4 Mol/l erstreckt, eluiert wird.

Das Insulin, das der Reinigung durch das erfindungsgemäße Verfahren unterworfen wird, ist bereits teilweise gereinigt, beispielsweise durch Salzfällung, isoelektrische Fällung und/oder Zink- oder Alkalikristallisation. Im allgemeinen hat das als Ausgangsmaterial verwendete Insulin eine Reinheit von wenigstens etwa 80 % und höchstwahrscheinlich einen noch höheren Reinheitsgrad, nämlich eine Reinheit von etwa % oder noch höher.

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Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt also im wesentlichen eine Kationenaustauscherbehandlung oder aber eine Anionenaustauscherbehandlung, an die sich eine Kationenaustauscherbehandlung anschließt. Der Kationenaustauscher ist ein vernetztes Dextrangel mit stark sauren funktioneilen Gruppen. Zu solchen Gruppen gehören Sulfoalkyl- oder Carboxymethylgruppen, und von den Sulfoalkylgruppen insbesondere solche mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen. Zu den bevorzugten vernetzten Dextrangelen gehören die Sephadexreihen (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey, V.St.A.). Bei diesen Reihen handelt es sich um die genau als CM-Sephadex bezeichnete, das Carboxymethylgruppen als die funktioneilen Gruppen enthält, oder die genau als SP-Sephadex bezeichnete, die Sulfopropylgruppen als die funktioneilen Gruppen enthält.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Verwendung einer chromatographischen Säule durchgeführt. Auf die Art der verwendeten Säule kommt es nicht an. Höhe, Durchmesser und Gestalt der Säule hängen von den jeweils erwünschten Betriebsparametern ab.

Die Insulinreinigung wird im allgemeinen mit einer Beladung von 1 bis 120 g je Liter gequollenen und äquilibrierten Kationenaustauschers und vorzugsweise von 50 bis 100 g/l durchgeführt. Optimale Bedingungen lassen sich selbstverständlich für das jeweilige System ohne weiteres ermitteln. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zu behandelnde Insulin allgemein gesprochen in einem sauren wäßrigen Medium von definierter Zusammensetzung und mit definierten Eigenschaften gelöst. Das saure wäßrige Medium enthält eine Säure in einer Menge, die einen End-pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,5 ergibt. Vorzugsweise liegt

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der End-pH-Wert zwischen etwa 3,2 und 4,2 und insbesondere zwischen 3,6 und 4,2. Ganz besonders bevorzugte End-pH-Werte sind 3,6 und 4,2. Zu geeigneten Säuren gehören Salzsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, η-Buttersäure, Isobuttersäure und Pentansäure. Vorzugsweise werden Essigsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure verwendet, wobei von diesen drei Säuren Essigsäure die am meisten bevorzugte ist.

Außer der Säure enthält das saure wäßrige Medium Harnstoff. Der Harnstoff ist in einer Menge zugegen, die eine Endkonzentration des Harnstoffs von etwa 4'bis 8 Mol/l ergibt. Vorzugsweise liegt die Harnstoffkonzentration zwischen etwa 7 und 8 Mol/l und insbesondere bei etwa 7 Mol/l.

Die Lösung des Insulins in einem sauren wäßrigen Medium mit einer Konzentration von etwa 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) wird mit dem Kationenaustauschergel in Berührung gebracht, das vorher gequollen und äquilibriert worden ist, vorzugsweise durch Behandlung mit saurem wäßrigen Medium, das eine kleine Menge bis zu etwa 0,15 Mol/l anorganisches Salz enthalten kann.

Dann wird das Insulin aus dem Kationenaustauschergel eluiert. Die Elution wird bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 25 ⁰C, vorzugsweise bei etwa 5 ⁰C, durchgeführt. Das Eluiermedium (Elutionsmittel) besteht aus einer Mischung von saurem, wäßrigen Medium mit anorganischem Salz. Das saure wäßrige Medium, das einen Teil des Elutionsmittels bildet, kann, aber muß nicht das gleiche sein wie das saure wäßrige Medium, das zum Aufbringen des Insulins auf das Kationenaustauschergel verwendet wird. Das anorganische Salz, das den anderen Bestandteil des Elutionsmittels bildet, kann ein

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beliebiges aus einer großen Vielfalt von Salzen sein. Beispiele für anorganische Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Ammoniumchlorid. Das bevorzugte Salz ist Natriumchlorid.

Das eluierende Medium aus einer Mischung von saurem wäßrigen Medium mit anorganischem Salz wird mit dem Kationenaustauschergel in Berührung gebracht, und das Insulin wird daraus eluiert. Das anorganische Salz wird in Form eines Salzgradienten in der Weise eingesetzt, daß die Salzkonzentration in dem dem Kationenaustauschergel zugeführten sauren wäßrigen Medium stufenweise oder kontinuierlich steigt. Im allgemeinen wird die Salzkonzentration fortschreitend über einen Bereich von etwa 0,2 Mol/l oder darunter bis zu etwa 0,4 Mol/l, vorzugsweise bis etwa 0,36 Mol/l und insbesondere bis zur vollständigen Elution des Insulins erhöht. Diese vollständige Elution ist im allgemeinen erreicht, ehe eine der vorstehend genannten oberen Grenzen der Salzkonzentration erreicht ist.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Insulinreinigung wird das Insulin vor seiner Behandlung mit dem Kationenaustauschergel gemäß der Erfindung einer Reinigung durch ein AnionenaustaüSchergelverfahren unterworfen. Diese Reihenfolge ist als solche eine weitere Möglichkeit im Rahmen der Erfindung.

Bei Anwendung dieser Reihenfolge wird das Insulin mit einer Reinheit, wie sie oben für die Kationenaustauscherbehandlung beschrieben wurde, der Reinigung unter Verwendung eines Anionenaustauschergels unterworfen.

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Der Anionenaustauscher ist ein vernetztes Dextrangel, entweder mit schwach basischen oder mit stark basischen Gruppen (Beispiele für geeignete Anionenaustauschergele sind solche der Sephadexreihe der Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, New Jersey, V.St.A.). Im einzelnen ist DEAE-Sephadex, ein vernetztes Dextrangel mit Diethylaminoethylgruppen, ein schwach basisches Anionenaustauschergel und QAE-Sephadex, ein vernetztes Dextrangel mit Diethyl-(2-hydroxypropyl)aminoethylgrüppen, ein stark basisches Anionenaustauschergel. Von diesen beiden ist DEAE-Sephadex bevorzugt.

Die Anionenaustauschergelbehandlung wird auch unter Verwendung einer chromatographischen Säule, im allgemeinen unter Beladungsbedingungen durchgeführt, wie sie oben für die Kationenaustauscherbehandlung beschrieben wurden.

Bei der Durchführung der Anionenaustauscherstufe des erfindungsgemäßen zweistufigen Insulinreinigungsverfahrens wird das zu reinigende Insulin in einem gepufferten neutralen oder alkalischen wäßrigen Medium gelöst, das etwa 4 bis 8 Mol Harnstoff je Liter enthält und einen End-pH-Wert von etwa 7 bis 9 aufweist.

Das gepufferte Medium kann unter Verwendung der verschiedensten verfügbaren Puffer hergestellt werden. Beispiele für geeignete Puffer sind Glycin-Natriumhydroxid und tris(Hydroxymethyl)aminomethan. Normalerweise wird das gepufferte Medium durch Lösen des jeweiligen Puffers in Wasser, Zusatz von Harnstoff bis zu der gewünschten Konzentration und, falls erforderlich, Einstellen des gewünschten pH-Werts der Lösung durch Zugabe einer ausreichenden Menge, beispielsweise einer Säure, wie Salzsäure, hergestellt.

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Wie bereits erwähnt, enthält das gepufferte Medium Harnstoff in einer Menge von etwa 4 bis 8 Mol/l. Vorzugsweise liegt die Harnstoffkonzentration zwischen etwa 7 und 8 Mol/l und insbesondere bei etwa 7 Mol/l.

Der End-pH-Wert des gepufferten Mediums liegt etwa zwischen 7 und 9. Vorzugsweise liegt er bei etwa 8,0 bis 8,5 und insbesondere bei 8,1.

Das in dem gepufferten neutralen oder alkalischen wäßrigen Medium in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) gelöste Insulin wird mit dem Anionenaustauschergel in Berührung gebracht, das vorher gequollen und äquilibriert worden ist, vorzugsweise durch Behandlung mit einer gewissen Menge des ausgewählten Puffermediums.

Dann wird das Insulin aus dem Anionenaustauschergel eluiert. Die Elution wird bei einer Temperatur von 5 bis 10 ⁰C und vorzugsweise von 5 ⁰C durchgeführt. Das eluierende Medium (Elutionsmittel) besteht aus einer Mischung aus gepuffertem neutralem oder alkalischem wäßrigen Medium und einem anorganischen Salz. Das gepufferte neutrale oder alkalische wäßrige Medium, das einen Teil des Elutionsmittels ausmacht, ist vorzugsweise das gleiche Medium, das zum Aufbringen des Insulins auf das Anionenaustauschergel verwendet wird. Das anorganische Salz, das den anderen Bestandteil des Elutionsmittels ausmacht, kann ein beliebiges der verschiedensten Salze sein. Beispiele für anorganische Salze sind Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Ammoniumchlorid, wobei Natriumchlorid bevorzugt ist.

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Das eluierende Medium aus einer Mischung des gepufferten neutralen oder alkalischen wäßrigen Mediums mit dem anorganischen Salz wird mit dem Anionenaustauscherharz in Berührung gebracht, und das Insulin wird daraus eluiert. Das anorganische Salz wird als Salzgradient in einer Weise eingesetzt, wobei die Salzkonzentration in dem gepufferten neutralen oder alkalischen wäßrigen Medium, das dem Anionenaustauschergel zugeführt wird, stufenweise oder kontinuierlich ansteigt. Die Salzkonzentration wird im allgemeinen fortschreitend über einen Bereich erhöht, der von 0 bis 0,2 Mol/l oder vorzugsweise bis etwa 0,13 Mol/l, insbesondere bis zur vollständigen Durchführung der Elution des Insulins reicht. Letzteres erfolgt im allgemeinen vor Erreichen der oben erwähnten oberen Grenzen der Salzkonzentration.

Das aus dem Anionenaustauschergel eluierte Insulin mit einem verringerten Gehalt an Proinsulin und proinsulinartigen Proteinen wird wie oben beschrieben unter Verwendung eines Kationenaustauschergels weiter gereinigt. Das Insulin kann vor dem Aufbringen auf das Kationenaustauschergel aus dem Eluat gewonnen werden, oder das durch Zugabe von verdünnter Säure, wie verdünnter Salzsäure, auf den entsprechenden niedrigeren pH-Wert eingestellte Eluat kann als solches zum Aufbringen des Insulins auf das Kationenaustauschergel verwendet werden.

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Sowohl bei der Behandlung mit Kationenaustauschergel als, auch bei der mit Anionenaustauschergel wird der Elutionsverlauf mit Hilfe üblicher Mittel verfolgt. Ein besonders günstiges Verfahren besteht in der Messung der Ultraviolettabsorption bei 280 ΐημ jeder aufgefangenen Eluatfraktion. Diejenigen Fraktionen, die Insulin der angestrebten Reinheit enthalten, werden vereinigt, und das Insulin wird daraus gewonnen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann außerdem je nach Wunsch mit anderen Reinigungsverfahren kombiniert werden. Beispielsweise kann die Reinheit des aus dem erfindungsgemäßen Kationenaustauschergelverfahren gewonnene Insulins dadurch weiter gefördert werden, daß. es einer zweiten Kationenaustauschergelbehandlung unterworfen wird. Außerdem oder stattdessen kann das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Insulin einer Gelfiltrationsbehandlung unterworfen werden, wie sie beispielsweise in den US-PS 3 876 623 und 3 878 186 angegeben ist.

Zinkinsulin ist derzeit die wichtigste Form von im Handel befindlichem Insulin. Deshalb wird das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene hochreine Insulin gewöhnlich in Zinkinsulin übergeführt. Die Überführung in Zinkinsulin erfolgt vorzugsweise bei pH 6,0 in Gegenwart eines Ammoniumacetatpuffers. Es ist nicht nötig, das Insulin aus dem eluierenden Medium zu isolieren oder die Lösung von gereinigtem Insulin einzuengen, ehe mit Zink kristallisiert wird. Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, daß das in Lösung befindliche Insulin, so wie es bei der EIution erhalten wird, in ausreichender Konzentration vorliegt und Salz- oder isoelektrische Fällungen nicht erforderlich sind, wobei derartige Maßnahmen jedoch, falls erwünscht, angewandt werden können.

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Das so erhaltene Zinkinsulin ist von außergewöhnlxcher Reinheit. Seine Reinheit kann durch verschiedene Methoden nachgewiesen werden. Das Zinkinsulin kann direkt auf Nichtinsulinproteinbestandteile, wie Proinsulin und Glucagon, analysiert werden. Die Gegenwart von Proteinen mit hohem Molekulargewicht, wozu in der Regel Protaminase, ein proteolytisches Enzym, gehört, kann durch Bestimmung der Stabilität einer Protamininsulinsuspension bei erhöhter Temperatur ermittelt werden. In Gegenwart von Protaminase erfolgt aufgrund des Protaminabbaus Dissoziation des Protamin-Insulin-Komplexes. Physikalische Eigenschaften, wie Löslichkeit des.Zinkinsulins bei neutralem pH-Wert und Färbung der erhaltenen Lösung, können bestimmt werden. Schließlich kann die Wirksamkeit des Insulins durch biologische und immunologische Prüfungen bestimmt werden.

Ausführunpsbeisniele;

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. "

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Beispiel 1

Zu 50 ml einer kalten 0,5n Essigsäure, die Harnstoff in 7-molarer Konzentration enthält und einen pH-Wert von 3,6 aufweist, werden 500 mg Rxnderzinkinsulinkristalle gegeben, die durch Anionenaustauscherchromatographie an' DEAE-Sephadex teilweise gereinigt worden waren. Die Analyse der Lösung ergibt eine Insulinkonzentration von 266 Einheiten/irii (13 284 Einheiten), eine Proinsulinkonzentration von 131 mcg/ml (6 535 meg, 13 070 ppm) und eine Gesamtprotexnkonzentration aufgrund der Messung der optischen Dichte (280 ταμ) von 9,73 Einheiten/ml.

Die Lösung wird auf eine Säule mit den Ab Messungen von 1,5 χ 45 cm aus SP-Sephadex C-25 aufgebracht, das vorher bei 5 ⁰C in 7m Harnstoff-0,5n Essigsäure, pH 3,6, äquilibriert worden war. Die Säule wird mit einer Mischung aus dem Harnstoffessigsäurepuffer und einem Natriumchloridgradienten von 0,0 bis 0,25m eluiert. Fraktionen von jeweils 10 bis 15 ml werden aufgefangen und durch Bestimmung der prozentualen Durchlässigkeit bei 280 χημ analysiert. Die Fraktionen werden zu 5 Häuptfraktionen vereinigt und auf Insulin, Proinsulin und optische Dichte analysiert. Die gereinigte Insulinfraktion (Fraktion 4) enthält 78,26 % des Insulins, 74,5 % der optischen Dichteeinheiten und 484 ppm Proinsulin.

Beispiel 2

Zu 200 ml einer 0,5n Essigsäure, die Harnstoff in 7-molarer Konzentration enthält und einen pH-Wert von 3,6 hat, werden 25,0 g Rindernatriuminsulin gegeben. Die Analyse der Lösung ergibt 632 687 Einheiten Insulin, 509 639 meg (20 385 ppm) Proinsulin und einen Gesamtproteingehalt von 21 .970 optischer Dichteeinheiten (280 ΐημ) .

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Die Lösung wird auf eine 2,5 χ 90 cm messende Säule aus SP-Sephadex C-25 aufgebracht, das vorher in 7m Harnstoff-0,5n Essigsäure-0,05m Natriumchlorid, pH 3,6, von 5 ⁰C äquilibriert worden ist. Die Säule wird in einer Geschwindigkeit von 1,0 ml/Minute unter Verwendung einer Mischung aus dem Harnstoffessigsäurepuffer und Natriumchlorid mit Natriumchloridgradienten von 0,05 bis 0,225m und 0,225 bis 0,36m eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen, die auf Proinsulin und auf die optische Dichte bei 280 ΐημ analysiert werden. Die Fraktionen werden zu sieben Hauptfraktionen vereinigt und auf Insulin, Proinsulin und optische Dichte geprüft. Die Hauptinsulinfraktion enthält 94,78 % der Insulineinheiten, 90,4 % der optischen Dichteeinheiten und nur 9,6 % des Proinsulins (2 917 ppm).

Beispiel 3

Ein Teil der nach Beispiel 2 erhaltenen Rinderinsulinfraktion wird mit einem gleichen Volumen Wasser verdünnt und an 180 ml frischem SP-Sephadex C-25 (10 ml gequollenes Gel/g, 0. D. 280) adsorbiert.

Das Material enthält etwa 404 220 Einheiten Insulin und 47 636 meg Proinsulin (2917 ppm). Das Gel wird mit Wasser gewaschen und dann erneut in 7m Harnstoff-0,5n Essigsäure, pH 3,6, augeschlämmt und auf eine Säule aus SP-Sephadex C-25 (2,5 χ 90 cm), das vorher bei 5 ⁰C in dem gleichen Harnstoff-Essigsäurepuffer äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wird mit einer Mischung aus 7m Harnstoff-0,5n Essigsäure, pH 3,6 und Natriumchlorid in Gradienten, von 0,05 bis 0,225m und 0,225 bis 0,36m eluiert. Vereinigte Fraktionen werden auf prozentuale Transmission, optische Dichte und Proinsulin analysiert.

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Auf der Grundlage dieser Analysenergebnisse werden bestimmte Fraktionen miteinander vereinigt. Die Analyse der gereinigten Fraktionen mit dem höchsten Insulinbestandteil ergibt 351 7.17 Einheiten Insulin und 19 meg Proinsulin (1 ppm).

Bei. spiel 4

4,5 kg DEAE-Sephadex A-25 werden gequollen, von Feinteilchen befreit' und in einem Puffer äquilibriert, der 0,01m tris(Hydroxymethyl)aminomethan, 0,001m Ethylendiamintetraessigsäure, 7m Harnstoff und Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 8,1 enthält. Das so vorbereitete DEAE-Sephadex A-25 wird in eine chromatographische Säule mit den Abmessungen 21,5 χ 85 cm eingefüllt.

1,9 kg teilweise gereinigtes salzfreies Schweineinsulin mit einem Proinsulingehalt von etwa 10 000 ppm werden in dem Puffer mit einem pH-Wert von 8,1 gelöst, und die Lösung wird zur Klärung filtriert. Das Filtrat wird dann auf die DEAE-Sephadex-A-25-Säule aufgebracht.

Die Säule wird eluiert unter Verwendung von (1) des Puffers, von pH 8,1 mit einem Gehalt von 0,02m Natriumchlorid, (2). einer Mischung aus dem Puffer von pH 8,1 und Natriumchlorid bei einem Gradienten von 0,02 bis 0,06m an Natriumchlorid und (3) einer Mischung aus dem Puffer von pH 8,1. und Natriumchlorid bei einem Gradienten von 0,06 bis 0,13m Natriumchlorid. Die Elution des Insulins, seiner. Vorlaufer und anderer Pankreashormone wird in den Elutionsmittelfraktionen durch bestimmte Radioimmunprüfungen, Polyacrylamidelektrophorese, Hochdruckflüssigchromatographie und Ultraviolettlichtabsorption verfolgt.

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In dem letzten Gradienten eluiertes gereinigtes Insulin wird mit Salzsäure auf pH 3,6 angesäuert. Die Analyse des gewonnenen Insulins in einer Fraktionsvereinigung, die einer Proteingewinnung von mehr als 88 % entspricht, ergibt eine Verminderung des Proinsulingehalts auf unter 300 ppm.

14 1 der angesäuerten Lösung, die 720 g Insulin enthält, werden durch Chromatographieren an SP-Sephadex C-25 weiter gereinigt. 1,5 kg SP-Sephadex C-25 werden gequollen, von Feinteilen befreit und in einem Puffer äquilibriert, der 0,1m Essigsäure, 7,0m Harnstoff und Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 3,6 enthält. Das so vorbereitete SP-Sephadex C-25 wird in eine chromatographische Säule von 10 χ 90 cm eingefüllt. Nach dem Aufbringen der Insulinlösung auf die Säule wird mit einer Mischung aus dem vorstehend beschriebenen Puffer und Natriumchlorid in einem Gradienten von 0,15 bis 0,35m eluiert.

Mit Hilfe der obengenannten Maßnahmen wird in hohem Maße gereinigtes Schweineinsulin in Eluatfraktionen festgestellt. Entsprechend gewählte Fraktionen werden vereinigt und dann in 2 Fraktionen aufgeteilt. Eine Fraktion wird durch Gelfiltration an Sephadex G-25 und die andere durch Gelfiltration an Sephadex G-50 von Harnstoff befreit, wobei einmal 0,5n und das andere mal 1,On Essigsäurelösungen verwendet werden. In beiden Fällen wird das Insulin aus der harnstoffreien Lösung als Zinkinsulin kristallisiert. Die Prüfung des Insulins ergibt:

(a) im Fall des beim Filtrieren mit Sephadex G-25 erhaltenen Produkts zeigt eine 98 % ausmachende Fraktion eine weitere Verminderung des Proinsulingehalts auf 184 ppm, einen Glucagongehalt von 1,4 ppm, einen Pankreaspolypeptidgehalt von 5 ppm und einen Somatostatingehalt von 9 ppb,

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(b) im Fall des beim Filtrieren mit Sephadex G-50 erhaltenen Produkts zeigt eine 78 % ausmachende Fraktion eine weitere Verminderung des Proinsulingehalts auf 0,8 ppm, einen Glucagongehalt von 1,4 ppm, einen Pankreaspolypeptidgehalt von 0,3 ppm und einen Somatostatingehalt von 7 ppb (b = 100m) . .

Beispiel 5

2,3 kg teilweise gereinigtes salzfreies Insulin vom Rind werden in dem in Beispiel 4 beschriebenen Puffer von pH 8,1 gelöst. Die Insulinlösung wird auf eine frisch bereitete Säule aus DEAE-Sephadex A-25 von 21,5 χ 80 cm aufgebracht, das in dem Puffer von pH 8,1 äquilibriert worden war. Das als Ausgangsmaterial verwendete Rinderinsulin enthält über 20 000 ppm Proinsulin, etwa 500 ppm Pankreaspolypeptid, etwa 400 ppm Glucagon und über 400 ppb Somatostatin. Die Säule wird eluiert, unter Verwendung von (1) Puffer von pH 8,1, der bezüglich Natriumchlorid 0,02 molar ist, (2) eine Mischung aus dem Puffer von pH 8,1 und Natriumchlorid bei Gradienten von 0,2 bis . 0,6m und' (3). einer Mischung aus dem Puffer von pH 8,1 •und Natriumchlorid bei Gradienten von 0,6m bis 0,13m. Die Elution des Insulins, seiner Vorläufer und andere Pankreashormone wird in den Eluatfraktionen durch bestimmte Radioimmunoprüfungen, Polyacrylamidelektrophorese, Hochdruckflüssigchromatographie und Ultraviolettlichtabsorption verfolgt. In den letzten Gradienten eluiertes gereinigtes Insulin wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,6 angesäuert. Die Analyse des Insulins in einer bestimmten Vereinigung von Fraktionen ergibt 81 % zurückgewonnenes Protein, das einen Proinsulingehalt von 11 000 ppm aufweist.

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15,0 1 der angesäuerten Lösung mit einem Insulingehalt von 770 g werden auf eine frisch bereitete Säule aus SP-Sephadex C-25 von 10 χ 90 cm, das in dem in Beispiel 4 beschriebenen Puffer von pH 3,6 äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wird mit einer Mischung aus dem Puffer von pH 3,6 und Natriumchlorid in einem Gradienten von 0,15 bis 0,35m eluiert. Hochreines Rinderinsulin wird aufgefangen, von Harnstoff durch Gelfiltration an Sephadex G-50 in 1,On Essigsäure befreit und als Zinkinsulin kristallisiert. Die Analyse des Insulins ergibt eine Gewinnung von 75 % des Proteins in einer größeren Fraktionsvereinigung mit einem Proinsulingehalt von weniger als 40 ppm.

Beispiel 6

In 91 ml 7m Harnstoff-0,1m Essigsäure-O,1m NaCl wird ein Rinderinsulin gelöst, das aus 5,75 g Protein mit einem Gehalt von 156 839 Einheiten Insulin und 295 750 meg Proinsulin (51 390 ppm) besteht. Die Mischung wird mit 10-prozentiger HCl auf pH 3,6 eingestellt. Die Lösung wird auf eine Säule von 1,8 χ 45 cm SP-Sephadex C-25 (Bettvolumen 115 ml) aufgebracht, das vorher in dem gleichen Puffer bei 5 ⁰C äquilibriert worden war» Die Säule wird mit einem Natriumchloridgradienten von 250 ml 0,15m Salz im Puffer, verstärkt durch 2000 ml 0,35m Salz im Puffer, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,01 ml/ Minute eluiert. Das Proteinelutionsprofil der Eluatfraktionen wird durch die prozentuale Durchlässigkeit ermittelt. Die Eluatfraktionen werden zu drei Fraktionen (A, B und C). vereinigt und auf Insulin, Proinsulin und Protein geprüft. Die größere insulinhaltige Fraktion

(C) zeigt eine 82,4-prozentige Verminderung des Proinsulingehalts (9 061 ppm) und die Gegenwart von 100,6 % der Insulineinheiten.

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Beispiel 7

Ein Rinderinsulinpräparat von 5,75 g Protein mit einem Gehalt von 158 340 Einheiten Insulin und 2 60 400 mcg Proinsulin (45 208 ppm) wird in 84 ml 7m Harnstoff-0,1m Essigsäure-O,1m NaCl gelöst. Die Mischung wird mit 10-prozentiger HCl auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt. Die Lösung wird auf eine 1,8 χ 45 cm messende Säule aus SP-Sephadex C-25 (Bettvolumen 115 ml) aufgebracht, das vorher in dem gleichen Puffer bei 5 ⁰C äquilibriert worden war. Die Säule wird mit einem Natriumchloridgradienteri von 250 ml 0,15m Salz im Puffer, verstärkt durch 2000 ml 0,35m Salz im Puffer, bei einer Strömungsgeschwindingkeit von 1,06 ml/Minute eluiert. Das Proteinelutionsprofil der Eluatfraktionen wird durch die prozentuale Durchlässigkeit ermittelt. Die Eluatfraktionen werden zu drei Fraktionen (A, B und C) vereinigt und auf Insulin, Proinsulin und Protein untersucht. Die Hauptinsulinfraktion (C) zeigt eine 60,4-prozentige Verminderung des Proinsulingehalts (17 937 ppm) und die Gegenwart von 85,6 % der Insulineinheiten.

Beispiel 8

5,75 g eines Rinderinsulinpräparats mit einem Gehalt an 153 000 Einheiten Insulin und 292 740 meg Proinsulin (50 788 ppm) werden in 84 ml 7m Harnstoff-0,1m Essigsäure-0,1m NaCl gelöst. Die Mischung wird mit 10-prozentiger HCl auf einen pH-Wert von 3,6 eingestellt. Die Lösung wird auf eine 1,8 χ 45 cm messende Säule aus CM-Sephadex C-25 (Bettvolumen 115 ml) aufgebracht, das vorher in dem gleichen Puffer bei 5 °C äquilibriert worden war. Die Säule wird mit einem Natriumchloridgradienten von 250 ml 0,15m Salz im Puffer, verstärkt durch 2000 ml 0,35m Salz

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im Puffer, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,73 ml/ Minute eluiert. Das Proteinelutionsprofil der austretenden Fraktionen wird durch die prozentuale Durchlässigkeit ermittelt. Die Eluatfraktionen werden zu drei Fraktionen (A, B und C) vereinigt und auf Insulin, Proinsulin und Protein geprüft. Die Hauptinsulinfraktion (C) zeigt eine 37,1-prozentige Verminderung des Proinsulingehalts (31 963 ppm) und das Vorliegen von 94 % der Insulineinheiten.

Beispiel9

5,75 g eines Rinderinsulinpräparats mit einem Gehalt an 168 652 Einheiten Insulin und 2 64 000 meg Proinsulin (45 754 ppm) werden in 84 ml 7m Harnstoff-0,1m Essigsäure-0,1m NaCl gelöst. Die Mischung wird mit 10-prozentiger HCl auf pH 4,2 eingestellt. Die Lösung wird auf eine 1,8 χ 45 cm messende Säule von CM-Sephadex C-25 (Bettvolumen 115 ml) aufgebracht, das vorher in dem gleichen Puffer bei 5 ⁰C äquilibriert worden war. Die Säule wird mit einem Natriumchloridgradienten von 250 ml 0,15m Salz im Puffer, verstärkt durch 2000 ml 0,35m Salz im Puffer, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,73 ml/Minute eluiert. Das Proteinelutionsprofil der austretenden Fraktionen wird durch die prozentuale Durchlässigkeit ermittelt. Die Eluatfraktionen werden zu drei Fraktionen (A, B und C) vereinigt und auf Insulin, Proinsulin und Protein geprüft. Die Hauptinsulinfraktion (C) zeigt eine 35-prozentige Verminderung des Proinsulingelats (29615 ppm) und das Vorliegen von 90 % der Insulineinheiten.

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Beispiel

10

Ein Schweineinsulinpräparat mit einem Gehalt von 216,0 χ 10 Einheiten Insulin, 8968 g Protein und 129 χ 10 mcg Proinsulin (14 384 ppm) wird in 76 1 kaltem Trispuffer mit EDTA und 7m Harnstoff gelöst. Die Mischung wird mit 1000 ml 10-prozentigem NaOH auf pH 8,1 eingestellt. Die Lösung wird mit 7 kg Filterhilfe (Hyflo supercel) durch ein Plattenrahmenfilter filtriert, das vorher mit 1 kg Filterhilfe in dem gleichen Puffer beschichtet war. Die Presse wird mit 10 1 kaltem Puffer gewaschen, und die Waschflüssigkeit wird mit der Probe vereinigt. Das Ganze wird auf eine Amicon-Säule (365 χ 100 cm) aufgebracht, die 1OO" 1 DEAE Sephadex A-25 enthält, das bei 5 ⁰C unter Verwendung des gleichen Puffers äquilibriert worden war. Anschließend werden 40 1 Puffer mit einem Gehalt von 0,04m NaCl aufgebracht. Dann wird die Säule mit einem Natriumchloridgradienten eluiert, der durch Einführung von 80 1 0,04m Salz im Puffer mit 200 1 0,13m Salz im Puffer entwickelt wird. Mit A, B, Dl, MS und D2 bezeichnete Fraktionen werden aufgefangen. Proben davon werden auf Insulin, Proinsulin und Protein (°^D276^ ^^e~ prüft. Es werden folgende Ergebnisse erhalten:

Fraktion	Liter	' Insulin, %	OD276, %	Proinsulin % (ppm)
A	120	0,03	1,2	0,8 (11 000)
B	135	1/2	7,0	47,2 (9* 2 000)
Dl	18	7,4	8,1	19,4 (33 000)
HS	144	79,5	68,3	29,4 ( 5 700)
D2	61	5,7	5,0	0,8 ( 1 700)

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Die Hauptstrom-Fraktion (MS), 144 I₇ wird mit 3400 ml 10-prozentiger HCl auf pH 3,6 eingestellt und auf eine Amicon-Säule (365 χ 100 cm) aufgebracht, die 100 1 CM-Sephadex C-25 enthält, das in 0,1n Essigsäure-7m Harnstoff puff er mit einem NaCl-Gehalt von 0,1m, pH 3,6, bei 5 ⁰C äquilibrxert worden war. Die Säule wird mit einem Natriumchloridgradienten eluiert, der durch Einführung von 80 1 0,1m Essigsäure-7m Harnstoff-O,15m NaCl mit 300 1 0,1m Essigsäure-7m Harnstoff-O,3m NaCl beim pH 3,6 entwickelt wird. Zwei als C-3 und MS bezeichnete Fraktionen werden aufgefangen, und Proben werden auf Insulin, Proinsulin und Protein (OD ) geprüft. Die Ergebnisse sind wie-folgt:

__D „ Proinsulin,

Fraktion Liter Insulin, % 276 ' ppm

C4 3 10 8,5 7,0 5000

MS 72 107,0 81,5 1200

Claims (21)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Erhöhung der Reinheit von Insulin,

   dadurch gekennzeichnet, daß

   a) ein vernetzter Dextrangelkationenaustauscher mit Sulfoalkyl- oder Carboxymethylgruppen gequollen und äquilibriert,

   b) eine Säule mit dem gequollenen Gel gefüllt,

   c) ein teilweise ge.reinigtes Insulin in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) in einem sauren wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5, das Harnstoff in einer Konzentration von etwa 4 bis 8 Mol/l Medium enthält, gelöst,

   d) diese Insulinlösung mit dem Kationenaustauschergel in der Säule in Berührung gebracht und

   e) das Insulin aus dem Kationenaustauschergel bei einer Temperatur von etwa 5 bis 25 ⁰C mit einem Elutionsmittel eluiert wird, das aus einem sauren wäßrigen Medium besteht, das ein anorganisches Salz enthält, wobei dieses anorganische Salz in dem sauren wäßrigen Medium in einer fortschreitend steigenden Konzentration vorliegt, die bei oder unter etwa 0,2 Mol/l beginnt und sich bis zu etwa 0,4 Mol/l erstreckt.

   2 18159
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch

   gekennzeichnet , daß ein vernetztes

   Dextrangel verwendet wird, das Carboxymethyl- oder SuIfopropy!gruppen enthält.
3. 3. Verfahren nach Punkt * 2, dadurch gekennzeichnet , daß eine Insulinkonzentration in dem sauren wäßrigen Medium von etwa 5 % (Gewicht/Volumen) angewandt wird.
4. 4. . Verfahren nach Punkt .2, dadurch gekennz eichnet , daß der pH-Wert des sauren wäßrigen Mediums bei 3,2 bis 4,2 liegt.
5. 5. Verfahren nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Wert des sauren wäßrigen Mediums 3,6 beträgt.
6. 6. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß als Säure in dem sauren wäßrigen Medium Essigsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure verwendet wird.
7. 7. Verfahren nach Punkt ι 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Säure Essigsäure verwendet wird.

   2 18159
8. 8. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß das verwendete saure wäßrige Medium Harnstoff in einer Konzentration von 7 bis 8 Mol/l enthält.
9. 9. Verfahren nach Punkt 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Harnstoffkonzentration etwa 7 Mol/l beträgt.
10. 10. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Elution bei einer Temperatur von etwa 5 ⁰C durchgeführt wird.
11. 11. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß als anorganisches Salz Natriumchlorid verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Punkt " 11» dadurch gekennz eichnet , daß die angewandte Konzentration des anorganischen Salzes in den Elutionsmitteln bis hinauf zu 0,36 Mol/l reicht.
13. 13. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet , daß das saure wäßrige Medium einen pH-Wert von 3,2 bis 4,2 aufweist und aus wäßriger Essigsäure besteht, die Harnstoff in einer Konzentration von etwa 7 Mol/l enthält, die Elution bei einer Temperatur von etwa 5 ⁰C durchgeführt wird und das Elutionsmittel aus einer Mischung des sauren wäßrigen Mediums mit Natriumchlorid in fortschreitend zunehmender Konzentration besteht, die bei oder unter 0,2 Mol/l beginnt und bis hinauf zu 0,36 Mol/l reicht.

    21βί 59
14. 14. Verfahren nach Punkt 13, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Wert des sauren wäßrigen Mediums bei etwa 3,6 liegt.
15. 15. Verfahren zur Erhöhung der Reinheit von Insulin, dadurch gekennzeichnet, daß

    a) ein vernetzter Dextrangelanionenaustauscher gequollen und äquilibriert,

    b) eine Säule mit- dem gequollenen Anionenaustauschergel gefüllt,

    -c) ein teilweise gereinigtes Insulin in einer Konzentration von 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) in einem neutralen oder mäßig alkalischen wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 7 bis 9 und einem Gehalt an Harnstoff in einer Konzentration von etwa 4 bis 8 Mol/l gelöst,

    d) die Insulinlösung mit dem Anionenaustauschergel in Berührung gebracht,

    e) Insulin aus dem Anionenaustauschergel bei einer .Temperatur von etwa 5 bis 10 ⁰C mit einem neutralen oder mäßig alkalischen wäßrigen Medium als Elutionsmittel, das ein anorganisches Salz in fortschreitend steigender Konzentration von bis zu etwa 0,2 Mol/l enthält, eluiert,

    2 1815 9

    f) ein vernetzter Dextrangelkationenaustauscher mit Sulfoalkyl- oder Carboxymethylgruppen gequollen und äquilibriert,

    g) eine Säule mit dem gequollenen Kationenaustauschergel gefüllt,

    h) eine Lösung des nach Stufe e) erhaltenen Insulins in einem sauren wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von 2,5 bis 4,5, einem Harnstoffgehalt von etwa 4 bis 8 Mol/1 Medium und einer Konzentration von 0,5 bis 12 % (Gewicht/Volumen) mit dem Kationenaustauschergel in Berührung gebracht und

    i) das Insulin aus dem Kationenaustauschergel bei einer Temperatur von 5 bis 25 ⁰C mit einem sauren wäßrigen Medium als Elutionsmittel, das anorganisches Salz in fortschreitend steigender Konzentration enthält, die bei oder unter 0,2 Mol/l beginnt und sich bis hinauf zu etwa 0,4 Mol/l erstreckt, eluiert wird.
16. 16. Verfahren nach Punkt 15, dadurch gekennz eichnet , daß der pH-Wert des verwendeten sauren wäßrigen Mediums bei 3,2 bis 4,2 liegt und der pH-Wert des neutralen oder alkalischen wäßrigen Mediums bei 8,0 bis 8,5 liegt.
17. 17. Verfahren nach Punkt 16, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert des verwendeten sauren wäßrigen Mediums bei 3,6 und der pH-Wert des verwendeten neutralen oder alkalischen wäßrigen Mediums bei 8,1 liegt.

    -32- 2 1815 9
18. 18. Verfahren nach Punkt 15, dadurch gekennzeichnet , daß als Säure in dem sauren wäßrigen Medium Essigsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure verwendet wird.
19. 19. Verfahren nach Punkt 15, dadurch

    gekennzeichnet , daß »

    a) bei der Behandlung von Insulin unter Verwendung eines Anionenaustauschergels ein neutrales oder alkalisches wäßriges Medium verwendet wird, das einen pH-Wert von etwa 8,0 bis 8,5 aufweist und Harnstoff in einer Konzentration von etwa 7 Mol/l enthält, die Elution bei einer Temperatur von 5 ⁰C durchgeführt und ein Elutionsmittel verwendet wird, das aus einem neutralen oder alkalischen wäßrigen Medium mit einem Gehalt an Natriumchlorid besteht, wobei das Natriumchlorid in dem neutralen oder mäßig alkalischen wäßrigen Medium in einer fortschreitend steigenden Konzentration zugegen ist, die sich bis hinauf zu 0,13 Mol/l erstreckt, und

    b) bei der Behandlung von Insulin unter Verwendung eines Kationenaustauschergels ein saures wäßriges Medium verwendet wird, das einen pH-Wert von 3,2 bis 4,2 aufweist und wäßrige Essigsäure und Harnstoff in einer Konzentration von 7 Mol/l enthält, die Elution bei einer Temperatur von 5 ⁰C durchgeführt und ein Elutionsmittel verwendet wird, das aus einem sauren wäßrigen Medium mit einem Gehalt an Natriumchlorid besteht, wobei das Natriumchlorid in dem sauren wäßrigen Medium in fortschreitend an- . steigender Konzentration vorliegt, die sich bis hinauf zu 0,36 Mol/l erstreckt.

    - 33 - 21815 9
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Wert des verwendeten neutralen oder alkalischen wäßrigen Mediums 8,1 beträgt.
21. 21. Verfahren nach Punkt 19, dadurch gekennzeichnet , daß der pH-Wert des verwendeten sauren wäßrigen Mediums 3,6 beträgt.