DD154367A1 - Verfahren zur herstellung von biomasse fuer die impfstoffproduktion - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion geeigneter Biomasse, zur Herstellung von Impfstoffen fuer die Human- oder Veterinaermedizin. Ziel der Erfindung ist ein oekonomisches Verfahren mit hohem Biomasseertrag fuer Totimpfstoffe bzw. hoher Vitalitaet fuer Lebendimpfstoffe. Die Aufgabe wird erfindungsgemaess durch die gezielte Anwendung der Naehrstoffsubstitution und/ oder Kreislauffuehrung des Kulturfiltrates mit oder ohne Behandlung von Ionenaustauschern geloest. Die hohe Bakterienkonzentration wird durch Zusatz geeigneter Naehrstoffgemische und die Vitalitaet durch geeigneten physiologischen Zustand der Bakterien erreicht.

Description

Verfahren zur Herstellung von Biomasse für die Impfst offpr odukt ion

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung biologisch besonders gekennzeichneter Biomasse (Vitalität, Immunogene u.a.) zur Herstellung von Impfstoffen unter Verwendung von Fermentoren. Das Verfahren bezieht sich insbesondere auf aerobe Impfstoffe der Human- und Veterinärmedizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß die Vermehrung von Mikroorganismen von fünf Faktoren im Kulturmedium abhängig ist:

1. Speziesabhängige endogene Faktoren

2. Konzentration an Nährstoffen, Spurenelementen und Wuchsfaktoren

3. Zellkonzentration (V/asserwert)

4. Konzentration an Stoffwechselprodukten

5. Milieufaktoren

Speziesabhängige endogene Faktoren sind bei pathogenen Stämmen besonders ausgeprägt. Deshalb wird die kontinuierliche Kultivierungsforft für pathogene Stämme wenig angewandt, da sie zu genetischen Veränderungen und damit zu schwerwiegenden irreversiblen Veränderungen der Mikroorganismen führt·

Ein entscheidender Faktor zur Vermehrung pathogener Bakterien ist die qualitative und quantitative Nährbodenzusammensetzung, die außerdem eineti erheblichen Einfluß auf die genetische Stabilität der Mikroorganismen ausübt.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Biomasse fur die Impfstoffproduktion gehen deshalb unter Verwendung komplexer Nährböden bzw. komplexer Nährböden mit Zusätzen definierter Nährstoffe von der statischen Submerskultur aus· Durch unterschiedliche Sauerstoffsättigung während des Kultivierungsprozesses, bedingt durch die Ausstattung der Züchtungsgefäße, variiert der Ernährungszustand und damit die immunbiologischen Eigenschaften der pathogenen Bakterien.

Eine Steigerung de*¹ Zellkonzentration erreichten AVERDUNK, BORNER und DA FONSECA-WOLLHEIM (ZbI. Bakt. I. Abt. Orig. 217:14-27 (1971) durch Substitution des Zellzuchtmediums mit Aminosäuren. Ähnlich kann der Komplexanteil im Nährmedium durch Substitution mit Aminosäuren u.a· Stoffen reduziert werden. (Patent DDR 115919)

Auf Grund von Erfahrungen werden zur Züchtung von Mikroorganismen flir die Impfst off produkt ion, im Gegensatz zu den in der technischen Mikrobiologie verwendeten Nährmedien, teure Komplexmedien verwendet, die zur Erreichung der erforderlichen Zellkonzentration, Peptide und/oder andere noch unbekannte Wuchsfaktoren enthalten massen.

In der Impfstoffprodukt ion wird die Zellkonzentration noch schneller zum wachstumsbegrenzenden Faktor als in der technischen Mikrobiologie. Zur Erhöhung des Zellerträges könnte deshalb, wie in der Offenlegungsschrift DE 2604993 beschrieben, die Kulturlösung unter kontinuierlicher Entfernung der Bakterienmasse im Kreislaufprozeß gefahren und das Kulturfiltrat zumindest teilweise mehrfach ausgenutzt werden. Das in der Offenlegungsschrift DE 2431002 beschriebene Verfahren der Rückführung des Kulturfiltrates zusammen mit den abgetöteten Mikroorganismen ist für die Impfst offproduktion wenig geeignet, da pathogene Bakterien kaum über die zum Aufschluß erforderlichen Exoenzyme verfügen.

Nach der Auslegeschrift DE 1642600 erfolgt die Kultivierung von Mikroorganismen im Kreislauf und Ruhephase. Diese Kultivierungsforra ist für pathogene Bakterien nur begrenzt

einsetzbar, da sie unter diesen Bedingungen keinen wesentlichen Zuwachs an-Biomasse bringt und vom technischen Aufwand her zu umfangreich ist.

Die kontinuierliche oder diskontinuierliche Gewinnung von konzentrierter Biomasse pathogener Mikroorganismen für die Impfst offproduktlon muß unter Ausschluß von Kontaminationen erfolgen. Als bekannte Methoden können aus der technischen Mikrobiologie die kontinuierliche bzw. diskontinuierliche Separation oder bei einigen Bakterien (R-Formen) auch die Möglichkeit zur Sedimentation genutzt werden/Für die letzte Form der Konzentrierung von Biomasse kann mit Erfolg: die von LEONOVICH (1952, Main beer fermentation in closed tanks, Trudy VN II PP 2) angegebenen Absetzgefäße verwendet werden·

Nach Beschreibung aus der Literatur werden auch Stoffwechselprodukte zum wachstumsbegrenzenden Faktor. Deshalb wird in der Offenlegungsschrift DE 2152549 das Kulturmedium mit Α-Kohle kontraktiert bzw. GERHARDT und SCHULTZ (J.Ferm.Technol. Vol. 44: 349-356 (1966)) haben sie kontinuierlich durch Dialyse abgeführt und erreichten so Zelldichten bis zu 10¹² Zellen/cm^,

Milieubedingungen haben sowohl in der Impfstoffproduktion als auch in der technischen Mikrobiologie die gleiche Bedeutung.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung ist die optimale Gewinnung von Biomasse mit bestimmten immunbiologischen Eigenschaften für Impfstoffe und zusätzlich mit hoher Vitalität für* Lebendimpfstoffe zur Herstellung des Impfstoffes.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Entsprechend dem Ziel der Erfindung leiten sich die Aufgaben, die durch die Erfindung zu lösen sind, ab. Die Steigerung der Biomassebildung erfolgt durch diskontinuierliche oder kontinuierliche Substitution von Nährstoffen zum Startmedium in der Konzentration, daß sie nicht zum

limitierenden Faktor wird. Überraschend konnte gefunden werden, daß bei pathogenen Bakterien,die Milieubedingungen ausgeschlossen, die Einwirkung der wachstumsbegrenzenden Faktoren mit folgender Reihenfolge abnehmen: Nährstoffe> Stoffwechselprodukte = Zellkonzentration Dadurch wird die Nährstoffsubstitution bzw. die Versorgung mit Nährstoffen während der Kultivierung in der Konzentration unter der Voraussetzung, daß stets die logarithmische Wachstumsphase erhalten bleibt, von entscheidender Bedeutung zur Erreichung hoher Bakterienkonzentrationen bzw. in der kontinuierlichen Kultur zur Vermeidung genetischer Veränderungen.

Unter diesen Bedingungen, so wurde ferner gefunden, entspricht die Biomassebildung den naturlichen Bedingungen, wenn die Milieubedingungen der Biomassekonzentration angepaßt werden.

In vielen Fällen, z.B. bei Escherichia coli, begrenzt die Löslichkeit des Komplexanteils in wäßriger Lösung die weitere Erhöhung der Biomasse. Überraschend wurde gefunden, daß der Zusatz essentieller Aminosäuren genügt, um Komplexanteile zu ersetzen/einzusparen.

Zellkonzentration und StoffWechselprodukte werden zum wachstumsbegrenzenden Faktor, wenn eine Zelldichte von 5 x 10¹¹ bis 1 χ 10¹² Zellen/cm , in Abhängigkeit von der verwendeten Spezies, erreicht ist. Diese Zelldichte ist für die Ökonomie des Totimpfst offes von großer Bedeutung.

Da es in der statischen Kultur "von selbst" zu einer kontinuierlichen Abnahme der Lebendkeimzahl kommt und dabei der Kinetik eine Reaktion 1. Ordnung folgt, ist die Abnahme der Zahl lebender Zellen der Zahl der vorhandenen lebenden Zellen proportional, d.h. die Lebendzellzahl nimmt in Abhängigkeit von der Zeit exponentiell ab. Durch Bestimmung des Nährstoffpools konnte festgestellt werden, daß die Bakterien gute Überlebenschancen haben, die im guten Ernährungszustand sind (am Ende der log. Wachstumsphase stehen),

denen die Energiequellen entzogen werden und die während der Wachstumsphase eine Zelldichte von ca, 2 χ 10¹⁰ Lebendzellen/cnr nicht überschritten haben, d.h. nach Beendigung der Kultivierung müssen die Bakterien die Zeitdauer zur Entwicklung einer Generation als Ruhephase durchmachen. In dieser Form kann die lebende Bakterienmasse mit einer Konzentration zwischen 2 und 5 χ 10¹⁰ Lebendzellen/ cm bei einer Temperatur zwischen +5 bis +10° C bis vier Stunden und bei Temperaturen um 37° C unter Fortsetzung der Belüftung während der Fermentation bis 12 Stunden erhalten werden, um sie dann der Lyophilisation zuzuführen.

Es war nicht vorherzusehen, daß in diesem Kulturfiltrat, nach Substitution der Nährstoffe, in Form als Komplexmeaium mit geeigneter Hährstoffzusammensetzung oder als definierte Fährstofflösung, erneut die gleiche lebende Bakterie nmasse produziert werden kann. Dieser Prozeß kann ca. zweimal wiederholt werden. Der Prozeß dieser Form der Bakteriengewinnung kann im Kreislauf diskontinuierlich bzw. kontinuierlich im Zweistufenverfahren erfolgen.

Ausführungsbeispiele

Anhand von Beispielen wird die vorliegende Erfindung näher erläutert und einer bekannten Verfahrensweise gegenübergestellt·

Ein Vergleich der spezifischen Kennziffer zeigt die Vorteile, die sich hinsichtlich Biomasseerzeugung aus dem neuen Verfahren ergeben.

Beispiel 1

In einem 2,5 Ltr. RÜhrkesselfermentor, der für die kontinuierliche aerobe Fermentation einschließlich Meßtechnik ausgestattet ist, wurde eine Bakterienkultur (S. cholerae suis) in Gegenwart eines Fleischtrypton-ZHefeextraktmediums kontinuierlich unter folgenden Bedingungen gezüchtet und nach bekannten Methoden konzentriert.

Arbeitsmenge im Fermentor	1 kg
Verweilzeit	2,25 h
NährЪоdenzulauf	40 Gew.%
Temperatur	37° C
5 pH-Wert	7,5 Anfa
	Ende
Redoxpotential	120-160 mV

Die Ergebnisse eines eintägigen Versuches und in folgender Tabelle in Spalte 1 angegebenen und den Ergebnissen eines Fermentationsversuches unter gleichen Bedingungen, aber ohne substituierende Rezyklofermentation in Spalte gegenübergestellt·

Dimension

Biomasseerze ugung	1,32	0,38	g/a
Spez. Nährboden verbrauch
15 Fleischtrypton	0,95	5,0	g Fleischtrypton/g Bio masse
Hefeextrakt	0,95	5,0	g Hefeextrakt/g Biomass
Glucose	4|7	5,0	mg Glueöse/g Biomasse
Überlebensrate	50	25
20 Prod.Impfdosen	8300	1040	ID/h
Kosten	3,40	4,80	МД
Beispiel 2

In der Versuchsanlage entsprechend Beispiel 1 wurde ein Versuch zur diskontinuierlichen Züchtung von S.cholerae suis unter folgenden Bedingungen durchgeführt: (nicht genannte Parameter wie im Beispiel 1)

Verweilzeit 6 h

Nachreifungszeit (stationäre 1 h Phase)

Konzentrierungszeit 1 h

Die Versuchsdauer beträgt 1 Tag. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse in Spalte 1 dargestellt· Spalte 2 zeigt zum Vergleich die Ergebnisse eines Kontrollversuches nach einem bekannten Verfahren.

1 2 Dimensionen

Biomasseerzeugung 0,38 0,38 g/h

Spes.Nährstoffverbrauch

Fleisohtrypton 5,0 5,0 mg Fleischtrypton/

g Biomasse

Hefeextrakt 33 5,0 mg Hefeextrakt/

g Biomasse

Glucose 33 5,0 mg Glucose/g Biomasse

Überlebensrate 50 25 %

Prod. Impfdosen 2100 1040 ID/h

Kosten 2,90 4,80 МД

Claims (7)

Erfind uneisan s pr uc h

1· Verfahren zur Herstellung von Biomasse fUr die Impfst off produkt ion mit hoher Keimzahl, vorzugsweise Lebe ndkeimzahl, dadurch gekennzeichnet, daß sie im diskontinuierlichen Verfahren nach mehrmaliger, Vorzugsweise zweimaliger Rückführung des von Bakterien befreiten Kulturmediums und Substitution der Nährstoffe, vorzugsweise nur 25 bis 50 # der Nährstoffe, unter optimalen Milieubedingungen erfolgt.

2· Verfahren zur Herstellung von Biomasse nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß Rückführung des bakterienfreien Kulturmediums und Substitution der Nährstoffe kontinuierlich erfolgen.

3· Verfahren zur Herstellung von Biomasse nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die essentiellen Nährstoffe, vorzugsweise Aminosäuren, als Komplexmedium und/oder als definierte Aminosäuren zugeführt werden«

4· Verfahren zur Herstellung von Biomasse nach Punkt 1 and 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung von Biomasse mit hohem Lebendkeimanteil die Nährstoffe nur

10 3

zur Bildung von 1 bis 3x10 Zellen/cm , vorzugsweise 2 χ 10 Zellen/cm zugeführt werden.

5» Verfahren zur Herstellung von Biomasse nach Punkt 4, dadurch gekennzeichnet, daß die produzierte Biomasse wenigstens für den Zeitraum von 1 bis 5 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, mit limitierender Energiequelle fermentiert wird, vorzugsweise bei 0 % Glucose.

6· Verfahren zur Herstellung von Biomasse nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß die produzierte lebende Biomasse nur bis zu einer Konzentration von 5x10 Lebendzellen/cm³ konzentriert wird.

7· Verfahren zur Herstellung von Biomasse mit hoher Gesamtkeimzehl, dadurch gekennzeichnet, daß zu einer

statischen Stibinerskultür unter optimalen Milieubedingungen die Versorgung mit essentiellen Nährstoffen, vorzugsweise Aminosäuren, als Komplexmedium und/oder als definierte Aminosäuren in der aur Erzeugung der festgesetsten Biomasse zugeführt werden.