DD157865A3

DD157865A3 - Verfahren zur gewinnung mikrobieller biomasse

Info

Publication number: DD157865A3
Application number: DD22313280A
Authority: DD
Inventors: Rolf Hedlich; Lothar Wuensche; Klaus Triems; Walter Brendler
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1980-08-06
Filing date: 1980-08-06
Publication date: 1982-12-15

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung mikrobieller Biomasse durch kontinuierliche Kultivierung von Mikroorganismenkulturen im ungeschuetzten Prozess auf unterschiedlichen Kohlenstoff- und Energiequellen,insbesondere auf Kohlenwasserstoffen, wie z.B. Erdoeldestillate, Raffinate und n-Alkangemischen. Der Erfindung liegt die Aufgabe der Erhoehung der Produktivitaet und Stabilitaet des Fermentationsprozesses im unsterilen Prozess zugrunde.Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest,dass geeignete Bakterienstaemme simultan mit dem Hefeproduktionsstamm kultiviert werden.

Description

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Titel

Verfahren zur Gewinnung mikrobieller Biomasse

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung mikrobieller Biomasse durch kontinuierliche Kultivierung definierter Mikroorganismen im ungeschützten Prozeß auf Substraten, die verschiedene Kohlenstoff- und Energiequellen, insbesondere Kohlenwasserstoffe, wie z,B« Erdöldestillate, Raffinate und n-Alkangeraische, enthalten, Die'Erfindung ist einzuordnen in die IPK: C 12 B, 1/20.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen . Die Kultivierung von Hefen zur Gewinnung von mikrobieller Biomasse auf Kohlenwasserstoffen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle im ungeschützten Prozeß ist bekannt· Hierbei wird die'Biomasse nach bekannten Verfahren erzeugt, z„B_# auf der Grundlage von Erdölfraktionen (Destillate, Raffinate) und/oder n-Alkangemischen im Kohlenstoffkettenlängenbereich von C_g bis C₃₅ (DD-PS 105 825) und als Futtermittel in der Tierernährung eingesetzt· Es ist weiterhin bekannt, daß für die schnelle und intensive Verwertung von Kohlenwasserstoffen und anderen mikrobiell verwertbaren Kohlenstoffquellen der Zusatz von Wuchsstoffen (akzessorischen Substanzen) für erforderlich gehalten wird· Bach DD-PS 50 543 erfolgt hierbei die Zugabe von akzessorischen Substanzen durch Verwendung-von Hefe-

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extraktj Abfällen der landwirtschaftlichen Produktion, wie Melasse-und Schlempe der Fermentationsindustrie, bzw_e geringer Mengen wasserlöslicher aliphatischen leicht assimilierbarer Verbindungen, die entweder Produkte des mikrobiellen Stoffwechsels darstellen oder diesem nahestehen, wie organische Säuren oder Zucker* Die in geringen Mengen zugegebenen akzessorischen Substanzen lösen bekanntlich eine Wachstumsförderung der Mikroorganismen aus«, Sie intensivieren bzw« ermöglichen die Umsetzung der. Kohlenstoffverbindungen, z_eB₉ der Kohlenwasserstoffe in Biomasse, dienen aber selbst nicht als Kohlenstoffquelle» Die Verwendung von externen Wuchsstoffen bei der Verhefung von Kohlenwasserstoffen im technischen Maßstab ist jedoch ein bedeutender Mangel der bekannten Verfahren« Sie bedeutet zusätzliche technische Aufwendungen und damit ökonomische Belastung des .jeweiligen Verfahrens* Außerdem stellen die Wuchsstoffe, wie Hefeextrakt oder die genannten anderen geeigneten Stoffe, günstige Hährmedien für Undefinierte Infektionskeime dar*

Es ist, wie bereits festgestellt wurde, bekannt, daß sich im ungeschützten kontinuierlichen Prozeß eine bakterielle Begleitflora einstellt, die unkontrolliert den Prozeßablauf und die Qualität des Endproduktes ungünstig beeinflussen kann« Es ist.auch weiterhin bekannt, daß zwischen der Produktionskultur und der Begleitflora viel~ fältige, z«T*- auch symbiontische bzw« mutualistische Wechselbeziehungen auftreten können (HARRISOlI, D_eE«P*, 1978: Mixed culture .in industrial fermentation processes, Adv, Appl· Microbiol« ,24, 129 - 164)*

Ziel der Erfindung _

Das Ziel der Erfindung besteht in der Erhöhung der Wachstuiüsgeschwindigkeit der Hefen im.Fermentationsprozeß bei

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gleichzeitiger Sicherung der Stabilität des Prozesses mit weniger Aufwand gegenüber den bisher bekannten Verfahren· ' ' ·'

Darlegung des Wesens der Erfindung

5'Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, durch eine neue Verfahrensführung des Kultivierungsprozesses die für die Intensivierung des Prozesses 'der Biomasseproduktion erforderlichen v/achs turas stimulierenden Substanzen im Prozeß selbst zu erzeugen,»

]0 Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man in einem ungeschützten Fermentationsverfahren Hefen auf der Basis flüssiger Kohlenwasserstoffe simultan mit ausgewählten Bakterien der Teile 7 und/oder 8 von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1974) kultiviert.

Die ausgewählten Bakterien assimilieren keine Kohlenwasserstoffe, so daß sie nicht als Substratkonkurrenten auftreten» Sie assimilieren die Stoffwechsel- und Kooxidationsprodukte des Produktionsstammes sowie die im Prozeß anfallenden Lyseprodukte und entfernen damit gleichzeitig im Prozeß anfallende und auf das Wachstum der Hefen inhibierend wirkende Stoffe« Diese ausgewählten Bakterien produzieren wachstumsfördernde Substanzen in solchen Mengen, daß damit die Wachstumsrate der Hefen entscheidend gesteigert wird«

Erfindungsgemäß wird das Verfahren wie folgt realisiert: In ein bekanntes, für die Kultivierung von Hefen auf flüssigen Kohlenwasserstoffen geeignetes Kulturmedium wird ein bekannter Hefeproduktionsstamm und ein ausgewählter bzw, ein Gemisch ausgewählter Bakterienstämine eingeimpft, wobei sich das Verhältnis Hefe:Bäkterien-

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Zellen bei 10 bis 10 : 1 bewegt* Die Kultivierung erfolgt kontinuierlich unter ungeschützten Bedingungen nach bekannten Verfahren. Zur Konstanthaltung der Bakterienkonzentrat ion im kontinuierlichen Kultivierungsprozeß werden die Bakterien und das limitierende Sub-

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str.at nach der Abtrennung der Hefebiomasse aus dem Fermentorablauf mit der wäßrigen Phase zurückgeführt bzw. bei einer Überschreitung der erforderlichen Bakterienkonzentration iia-Prozeß durch eine kurzzeitige Absenkung des pH~Wer-.5 tes nach bekannten Verfahren auf die gewünschte Konzentration eingestellt;

Mit der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird

- —1

eine Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe von/u. = 0,32 h erreichte Demgegenüber wird bei einer Kultivierung von Hefen unter Zusatz von Hefeextrakt· eine Wachstumsgeschwindigkeit der

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Hefen von/u. = 0,28 h erreicht und bei- einer Kultivierung von Hefen ohne Zusatz wachstumsfördernder Substanzen nur eine Wachstumsgeschwindigkeit von /u .= 0,03 'h erreichte Der Kultivierungsprozei3 verläuft stabil und es ist keine Nachimpfung bzw© externe Zugabe von Wuchsstoffen erforderlich und es verringert sich somit der bei bekannten' Verfahren erforderliche Aufwand« In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert«

Erlenmeyerkolben (500 ml Passungsvermögen) mit Belüftungsschikanen werden mit 100 ml einer mineralischen Nährlösung nach Reader beschickt und sterilisi-erte Der pH-Wert wird auf 4j2 eingestellte Nach Zugabe von 15 g/l eines technischen n~Alkangemisch.es erfolgt das Beimpfen.mit der Hefe Lodderomyces elongisporus_? Stamm IMST H 128 (0,1- g/l HTS) und dem Stamm xB 27 -ZEMET B (0_S02 g/l BTS), Nach einer Kultivierungszeit von 24 h auf einer Schüttelmaschine bei 30 C wird eine Hefebiomassekonzentration von 6,4 oo« 6j8 g/l erreicht«, Längere Kultivierung führt zu keiner signifikanten Erhöhung des Wertes«, Die Wachs-

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tumsgeschwindigkeit beträgt 0,32 h ₅

-·5 - 223

Beispiel 2 '

Es wird wie im Beispiel 1 verfahren» Anstelle des ausgewählten Bakteri ens t amines wird Hefeextrakt (DIFCO yeast extract) zu 0,2 % hinzugefügt« Nach den im Beispiel 1 angegebenen Kultivierungsbedingungen wird eine Hefebiomassekonzentration von 4,4 «·« 4,6 g/l und eine Wachstumsgeschwindigkeit von 0,28 h*~ erreicht*

Beispiel 3

Es wird wie im Beispiel 1 verfahren« Die Kulturlösung TO erhält jedoch weder Hefeextrakt noch einen der ausgewählten Bakterienstämme«· Die nach den im Beispiel 1 angegebenen Kultivierungsbedingungen erzielte Biomassekonzentration beträgt 0,15 ···· 0,20 g/l, die Wachstumsgeschwindigkeit 0,03 h"*¹ _e

15. Beispiel 4 . '

In einem großtechnischen Rührfermentor mit einem Fassungsvermögen von 250 m bei einem Arbeitsvolumen'von 90 t wird in einem einstufigen kontinuierlichen Verfahren der Hefestamm Lodderomyces elongisporus IMET H 128 auf einer Erdöldestillat-Fraktion mit dem Siedebereich 220 bis 35O⁰C kultiviert· Der Paraffingehalt im Destillat beträgt 17,2 Masse-%o Die Rührleistung beträgt 200 kW, die Luft-

3 menge 66OO m /h. Die Zusammensetzung des IJährmediums,

3 bezogen auf 1 in , ist folgende:

Erdöldestillat · 120 kg

Phosphorsäure (75 %) ' 540 ml

Kaliumchlorid 570 g

Magnesiumsulfat 25P g

Eisenchlorid 15 g

Mangansulfat 16 g

Zinksulfat . " 16 g

Kupfersulfat . 1,8g

- 6 - £ £ ö I Ö Z

Zur Verbesserung des Stoffübergangsverhaltens wird dem Prozeß ein Hilfsstoff vom Charakter eines Propylenoxid-Äthylenoxid-Addukts in einer Konzentration von 65Ο mg/1 wäßrigen Kulturmediums zugesetzt« Der pH-Wert wird mit konzentrierter Ammoniaklösung *ge- _regelt. Der pH-Wert beträgt 4,1 - 0,1 und die Fermenta-r tionstemperatur 33 C - 1 %_e Beimpft wird mit einer Suspension des Stammes Lodderomyces-elongisporus IMET H in einer Menge, daß die Biomassekonzentration bei 1 bis 2 kg/m liegte Gleichzeitig wird eine Suspension, die die Bakterienstämme xB 21 - ZIMET B und xB 27 - ZIMBT B zu gleichen Anteilen enthält, zugegeben« Die An-

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fangskonzentration liegt bei 10 bis 10 Bakterienzellen/ ml« Die Verweilzeit beträgt 4 Stunden_c Der Fermentorauslauf wird in einem geeigneten Aufrahmgefäß von ca« 60 % des wäßrigen Kulturmediums getrennt« Die Biomassesuspension wird durch Separation zweistufig bei unterschiedlichen Bedingungen entölt und entwässert, wobei Hefe-. trockensubstanzkonzentrationen im Bereich von 10 bis 24 % erreicht v/erden*

Die abgetrennten wäßrigen Kulturmedien aus der Aufrähmungs- und der Separatorstufe werden in unterschiedlichen Graden, vorzugsweise zwischen 20 und 60 % des gesamten Prozeßwassers, kontinuierlich in den Permentor zurückgeführte Bei einer kontinuierlichen Züchtung über einen längeren Zeitraum und bei einer Rückführung von 60 % des wäßrigen Kulturmediums beträgt die Anzahl der Bakterien 10 bis 10 Zellen/ml Kulturmedium« Im kontinuierlich zurückgeführten wäßrigen Medium sind folgende Arten und Mengen von Stoffwechsel- und Lyseprodukten enthalten:

- Fettsäuren ' ca· 150 bis 200 mg/1 Prozeßwasser

- Polysaccharide . 900 bis 1500 mg/1 Glukose/1

- Nukleinsäuren 300 bis 850 mg/1

- Eiweißverbindungen 250 bis 65Ο mg Ή /1

orgo

-7.- 22 3 13 2

Beim Züchtungsprozeß beträgt die Produktivität· 3,8 kg t/h_e Der Produkt ions st arnra verhält sich unter den gewählten Bedingungen sehr stabil, ein Nachimpfen, der Kultur mit frischer Hefe ist nicht erforderlich« Die Biomassesusρension wird in einem Sprühtrockner getrocknet, mit einem selektiven Extraktionsmittelgemisch von Lipiden und von nichtbiogenen' Bestandteilen befreit«, Der Rohproteingehalt der gewonnenen Hefe beträgt 65 %> der Restkohlenwasserstoffgehalt 0,1%,

Beispiel 5

V -.In einem Rührfermentor von 30 1 wird der Hefestamm

Lodderomyces elongisporus IMET H 128 bei einem pH-Wert . . von 4,2, einer Temperatur von 32 bis 34⁰Q und einer Luftzufuhr von 3,6 l/l*min gezüchtet* Als Substrat dient ein n-Alkangemisch der Kettenlänge Gq bis CL., vorzugsweise C.p bis C₁O aus einem Erdöl der Erdölleitung • "Freundschaft", Die Siedelage der zugrunde gelegten Destillatfraktion beträgt 230 bis 36O⁰G, Der Laboratoriumsrührfermentor wird mit dem Hefestamm in einer wäßrigen Suspension der Konzentration von 1 bis 2 g/kg angeimpft· Außerdem enthält die Suspension den Bakterienstamm xB 21 - ZIMET B in einer Anfangskonzentration von 10 bis 10 Bakterienzellen/ml« Das Verfahren wird mit einer Verweilzeit von 5 h durchgeführt« Die Menge an n-Alkangemisch im Kulturmedium beträgt 3,6 Masse-%·

Das'wäßrige, anorganische. Nährmedium enthält in Form von NH₄OH, H₃PO₄, KCl und Sulfaten:

N 25OÖ mg Zn ' 8 mg

P₂O₅ 1400 mg Mn 8 mg

K 65O mg Gu 1,2 mg

Mg 55 mg H₂O auf 1 1

Pe . 10 mg

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: . — O —

Der Energieeintrag beträgt 10 W/kg.Fermentorinhalt«, Die Hefetrockensubstanzkonzentration beträgt 14 bis 17 g/1? • die Produktivität 3,0 kg/t,*h und die Ausnutzung der n-Alkane 95 %·

Die Aufkonzentrierung des Fermentorauslaufes'erfolgt über eine sogenannte Aufrahmrinne, wobei ein Wasserabscheidegrad von 70'% erreicht wird* Das abgetrennte Prozeßwasser wird ohne Sterilisation in den Fermentationsprozeß kontinuierlich zurückgeführt«, Hierbei zeigt sich in Abhängigkeit vom Rückführungsgrad und von der Dauer des Prozesses eine stabile Ausschüttung von Stoffwechsel- und Lyseprodukten und entsprechende Bakterienentwicklung _e Die Stabilität und Aktivität der Produktionskultür ist dadurch gewährleistet« Ein Nachimpfen des'Hefe st amines entfällt, Nach einer konventionellen Aufarbeitung der Biomassesuspension v/ird eine Biomasse mit einem Rohproteingehalt von 60 % und einem Kohlenwasserstoffgehalt von 0,1% erhalten»

Claims

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Erf indungsanspruch. '

1* Verfahren zur Gewinnung mikrobieller Biomassen durch kontinuierliche Kultivierung von Hefen im ungeschützten Prozeß auf der Basis flüssiger Kohlenwasserstoffe als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle "in .Gegenwart eines freien Sauerstoff aufweisenden Gases, dadurch gekennzeichnet,-daß die Hefen simultan mit den Bakterienstämmen xB 21 - ZIIvIET B und/oder xB 27 - ZIMET B kultiviert werden. ' .
2. Verfahren nach Punkt.1, dadurch gekennzeichnet, daß die simultan zum Produktionsstamm kultivierten Bakterien mit der wäßrigen Phase in den Eermentations- prozeß zurückgeführt und somit auf dem wirksamen Konzentrationsniveau gehalten werden«

3o Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der bakteriellen. Simultankultur durch zeitweilige Änderung des. pH-Wertes im Fermentationsmedium geregelt wirde