DD200472A1 - Verfahren zur differenzierten selektion von effektoren mittels autotropherzellsuspensionen oren mittels autotropher zellsuspensionen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung ''Verfahren zur differenzierten Selektion von Effektoren mittels autotropher Zellsuspensionen'' dient der Suche nach Pflanzenschutzmitteln und nach Effektoren biologischer Prozesse. Sie verfolgt das Ziel, moeglichst in einem Arbeitsgang die Ergebnisse von Tests mit autotrophen Zellsuspensionen auszuwerten und dabei primaere Photosyntheseeffektoren von primaer nichtphotosynthetischen Effektoren zu trennen. Die Erfindung basiert auf einem Auswertungsverfahren, das die optischen Eigenschaften substanzbehandelter autotropher Zellsuspensionen oder Organismensuspensionen nutzt und deren substanzinitiierte Variation mit Hilfe der Spektralkolorimetrie, der Spektralphotometrie oder der Nephelometrie bei 2 bis n verschiedenen Wellenlaengenbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich erfasst und vergleichend betrachtet. Das Verfahren wird an 7 Zeichnungen erlaeutert.
Description
2 3 U 8 Ä 7
mittels autotropher Selisuspensionen
Pflansenschutzaiittelf orschung, Suche nach Regulatoren biologischer Prozesse, Naturstoffchemie
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bekannt, daß der Sinfluß chemischer Substanzen auf biologische Prozesse auf vielfältige Weise geprüft werden kann« Als Indikatoren lassen sich auch Zellsuspensionen autotroph kultivierter einzelliger Grünalgen nutzen. Die dabei zu praktizierende Methodik legt das Patent "Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen", WP ^f'rZ^-f f fest. Verfährt man danach, so lassen sich aus einer Stichprobe von Chemikalien diejenigen selektieren, die den fundamentalen Prozeß des autotrophen Zellwachstums,, die Photosynthese, unmittelbar oder mittelbar beeinträchtigen oder fördern. Substanzen, die die Photosynthe'se nicht beeinflussen, aber dennoch biochemisch wirksam sind, lassen sich auf die genannte Weise nicht definieren. Sie werden notwendigerweise als biochemisch unwirksam eingestuft» Solche Substanzen müssen dann in einer Kette nachfolgender Tests spezifischer Zielstellung auf entsprechend spezifischen Effekt geprüft
23U84 7
werden, so zum Beispiel potentielle Atmungshsmmer in einem Heterotrophtest, Effektoren des iiukleinsaurehaushalts in einem IJukleinsäure-Test. Demnach ist es also unumgänglich, alle im "Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen" geprüften und für unwirksam befundenen Chemikalien einem erneuten Prüfungsgang zu unterwerfeno Auch die al3 "biochemisch wirksam" eingestuften Substanzen bilden hinsichtlich ihrer Wirkungsv/eise keine einheitliche Gruppe, Sie können die Photosynthese unmittelbar beeinflus- ' sen, also als primäre Photosyntheseeffektoren wirken« I2s ist aber auch nicht auszuschließen, daJ3 sie nur mittelbar bzw* im Ergebnis ihrer Metabolisierung den PhotosyntheseprozeS tangieren, während sie ihre Hauptwirkung in anderen Stoffwechselbereichen manifestieren, Daraus ergibt sich der Wunsch nach einem Verfahren, das zwar ebenfalls auf Suspensionskulturen einzeiliger Grünalgen beruht, dessen Auswertungsmodus ,-jedoch neben der Selektion primärer Photosyntheseeffektoren auch die Charakterisierung primär nichtphotosynthetischer Effektoren in'einem Arbeitsgang erlaubt.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung verfolgt das Siel, für Tests mit autotrophen Suspensionskulturen einzelliger Grünalgen einen Auswertungsmodus vorzuschlagen, der in einem Arbeitsgang die Selektion primärer Photosyntheseeffektoren und primär nichtphotosynthetischer Effektoren ermöglicht.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe.zugrunde, mittels eines speziellen Auswertungsverfahrens die in Anwendung des "Verfahrens zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen" selektierten Effektoren in einem geschlossenen Arbeitsgang als primäre
31484 7 3
.fhotosynthese effekt or en bzw· primär nichtphotosynthetische Effektoren au charakterisieren, sie also au. differenzieren, und gleichzeitig den Nachweis zu führen, ob sich unter den als biochemisch unwirksam eingestuften Substanzen Effektoren anderer StoffWechselbereiche befinden. Das geschieht, indem man zunächst grundsätzlich so verfährt, wie es das "Verfahren zur Selektion biochemisch wirksamer Substanzen*1 empfiehlt, also definierte Mengen chemischer Verbindungen' mit autotroph kultivierten Seilsuspensionen einzelliger
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tetj so· daß sie auf der Grundlage des sich vollziehenden Photosyntheseprozesses wachsen und sich entwickeln^ Zu festgelegten. Zeitpunkten werden dann Proben und Vergieichskulturen oder Anteile von beiden parallel, oder in definierter Folge mittels spektral analytischer Verfahren bei z?/ei oder
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ultravioletten Spektrums untersucht und die dabei gewonnenen Srgebnisse vergleichenden Betrachtungen unterzogen.
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1, Ausführungsbeispiel
Autotroph kultivierte Zellsuspensionen einzelliger Grünalgen der Species Chlorella vulgaris var. vulgaris, Stsjis 30HM u* BOSS'S 1972/1 in einer Susüensionsdichte von
G ' 3 7 s 10 Zellen/ciir werden mit verschieden konzentrierten wässrigen Lösungen der zu prüfenden Substanz A beimpft und zusammen mit unbehandelten Kontrollen bei 37 O belichtet und belüftet, so dal3 alle erforderlichen Voraussetzungen für die Photosynthese gegeben sind. Deshalb wachsen und entwickeln sich die in nährlösung suspendierten Zellen in den unbehandelten Vergleichskulturen normal
231484 7
In den nit Chemikalien versetzten Proben sind Wachstum und Entwicklung mehr oder weniger beeinflußt, wenn verschiedene Substanzkonzentrationen den Photosyntheseprozeß
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den Figuren 1 und 2 zu entnehmen, Figur 1 enthalt die dekadischen Logarithmen der Extinktionsmessungen bei 680 nm für die unbehandelte Kontrolle 1 und die mit abgestuften Konzentrationen der Substanz A versetzten Proben 2, 3, 5j S5 die zu den Zeitpunkten vorgenommen wurden, Pigur 2 die ent sprechenden Ergebnisse solcher Sxtinktionsniessungen bei 750 mru Sin Vergleich der auf diese Weise parallel, also in einem Arbeitsgang gewonnenen Wirkbilder zeigt trotz unterschiedlicher Spektralbereiche weitgehende und prinzipielle Üb er einst ium ung im 7/irkungs verlauf. Dias 7/ird besonders deutlich .bei einer Zusammenfassung beider yvirkbilder in Form einer Auftragung der Logarithmen der Extinktionen bei 680 nm und 750 nm gegeneinander in Figur 3 oder in Form einer Auftragung der Q-Werte = S^q0/ Ξγ,-Q in Abhängigkeit der Sinwirkzeit in Figur 7, Kurve Aus diesen vergleichenden Betrachtungen Iäi3t sich der Schluß ziehen, dai3 Substanz A auf jeden Fall biochemisch aktiv ist, wobei sich ihre Wirkung offensichtlich im PhotosyntheseprozeB manifestiert. La der Effekt sich jedoch erst nach Stunden und dann deutlich, v/iderspiegelt, ist Substanz A entweder ein primärer Photosyntheseinhibitor» der nur allmählich die Membranenbarriere überwindet, oder ein unspezifischer Inhibitor, dessen allgemein destruktive Wirkung schließlich auch den rhotosyntheseproseß beeinflußt·
Ausführungsbeispiel
Mit Substanz B wird wie im 1. Ausführungsaeispiel verfahren Allerdings werden 9 unterschiedliche Konzentrationen von (2 - 10) getestet und mit der unbehandelten Kontrolle 1 ver
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glichen. Die Auswertung des Tests erfolgt wiederum bei zwei verschiedenen Wellenlängen, bei 680- mn und bei 750 mn· Figur 4 informiert über die Ergebnisse der Sxtinktionsmessungen bei 680 nnu 2. Stunden lang lassen sich keine signifikanten Abweichungen zwischen der behandelten Proben 2-10 und der Kontrolle 1 feststellen. Danach-ist ein konzentrationsabhängiger Hemmeffekt nachweisbar, der bis zum Ende des Versuchs erhalten bleibt» Ganz anders ist das Bild bei Sichtung der Extinktionsmessungen bei 750 mn* Hier übersteigen die Sstinktionswerte der behandelten Proben sogar die Kontroilwerte, was zu der Annahme berechtigt, daß das Sellwachstum der mit Substanz B behandelten Proben gegenüber der Kontrolle gefordert wir dt, Erst nach 4 Stunden stimmen die Extinktionswerte behandelter und unbehandeiter Proben wieder weitgehend üoerein» Dieser Zustand bleibt für weitere 2 Stunden erhalten« Danach erst erweisen sich die Proben 4-10 auch bei dieser Wellenlänge als merklich gehemmt,
Vergleichen wir die Aussagen der Figuren 4 und 5 für die Substanz B mit denen der Figuren 1 und 2 für die Substanz A1 so wird deutlich, daß die Auswertung solcher Tests bei verschiedenen Wellenlängen für die die Sict inkt ionsmes sung en bei 680 und 750 nm lediglich eine mögliche Kombination von vielen darstellenf in einem Arbeitsgang zu sehr differenzierten Aussagen hinsichtlich der Wirkung beider Substanzen führen kann« Besonders deutlich zeigen sich diesbezügliche Unterschiede bei Korrelation der dekadischen Logarithmen dar Ext inktionswerte zueinander in Figur 3 bzw, 6 bzw» bei Auftragen- der Q-Werte, Q = 2Apn/E,~,..,-,, in Abhängigkeit von
der Wirkdauer. Sieser Q-Wert ist im Falle der. Substanz B bis zu 50% kleiner als z, 3. der Q-Wert unbehandeiter Chlorella-Kulturen· Daraus ergibt sich bei streng standardisierten Chlorella-Kulturen die Möglichkeit, die an behandelten Proben gemessenen Q-Werte mit standardisierten Werten zu vergleichen, also ohne unbehandelte Kontrolle arbeiten und an ihrer Stelle sogar Eichtabeilen nutzen zu können.
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3, Äusführungsbeispiel
Von einer neu synthetisierten organischen Verbindung C, über deren biologischen Wirkeigenschaften noch nichts bekannt ist, wird wie in Figur 7 im Bereich zwischen den .Kurven 4 und. 10 dargestellt, durch gleichseitige Wachstumsmessungen bei 680 mn und 750 mn bzw, χ und y nm ein abweichender Q-Wert gefunden» Deshalb 7/erden von dieser Substanz C die Tvirkspektren aufgenommen. In der nachfolgenden Auswertung bei der die Wirkspektren und andere Daten der Substanz C mit entsprechenden Wirkspektren bzw. Daten bekannter Substanzen, von denen gute Kenntnisse über empirische bzw» halbempirische Zusammenhange zwischen gezeigten Wirkspektren und spezifischen Wirkeigenschaften bzw. Wirkmechanismen vorliegen, mit Hilfe der elektrischen Datenverarbeitung verglichen werden, zeigen sich gute Übereinstimmungen zwischen den Substanzen B und G. Daraufhin wird die Substanz C in Analogie zu 3 als ein potentieller Mitoseheimner eingestuft. In nachfolgenden SpezialUntersuchungen, wie dem autotrophen Vermehrungstest auf der Basis synchroner Flüasigkeitskultüren von Chlorella vulgaris und anderer Tests werden die spezifische Wirkung auf die Zellteilung durch Substanz C bestätigt,,
Claims (2)
1» Verfahren zur Selektion von Effektoren mittels autotropher Zeilsuspensionen, dadurch gekennzeichnet, daß die optischen Eigenschaften substanzbehandelter autotropher Zellsuspensionen oder Organisinensuspensionen genutzt werden, um mittels substanzinitiierter Variation der optischen Eigenschaften solcher Suspensionen die Effektoren in primäre und sekundäre Photosyntheseeffektoren sowie in photosynthesensutrale Effektoren differenzieren zu können,
2, Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet,. daß als autotrophe Zellsuspensionen oder Organisinensuspensionen alle suspendierbaren autotrophen Bakterien., Blaualgen und Grünalgen verwendet werden können3
3ο Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, da3 die optischen Eigenschaften der Zellsuspensionen mittels Spektralkolorimetrie, Spektralphotometrie oder Nephelometrie bei 2 bis η verschiedenen Wellenlängenbereichen oder ganzen Spektralbereichen im infraroten, sichtbaren oder ultravioletten Spektralbereich analysiert werdenβ
Hierzu.JL..$8iten Zeichnungen
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