DD201150A1 - Verfahren zur herstellung eines bioregulators - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Bioregulators, der industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer Differenzierung als auch in ihrem Biosynthesevermoegen fuer Anthracyclin-Antibiotica zu stimulieren vermag und daher in der pharmazeutischen Industrie bei der Produktion von Wirkstoffen von potentiellen Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer bisher unbekannten, niedermolekularen Verbindung, die auf Grund der chemischen Konstitutionsanalyse als 4,5-Dihydroxyn-decansaeure-4-lacton (L-Faktor) bezeichnet werden kann. Der zur Herstellung des Bioregulators verwendete Mikroorganismus ist die Leukaemomycin-geblockte Mutante ZIMET 4388668 der Art Streptomyces griseus. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines Bioregulators, dessen Einsatz in der Fermentationsindustrie zur Optimierung mikrobieller Leistungen, z.B. des Biosynthesevermoegens fuer Antibiotica, fuehren kann. Diese Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes ZIMET 43668 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen der Bioregulator gebildet, mit Hilfe extraktiver Verfahren aus Mycel und Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatografische Methoden gereinigt wird.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung eines Bioregulators

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Bioregulators, der industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer Differenzierung als auch in ihrem Sekundärstoffwechsel zu stimulieren vermag und daher in der pharmazeutischen und mikrobiologischen Industrie bei der Herstellung mikrobieller Wirkstoffe auf fermentativem Wege von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf die Gewinnung eines Bioregulators, der die Biosynthese krebschemotherapeutisch wirksamer Anthracyclin-Antibiotica induziert und stimuliert, unter Verwendung eines an sich bekannten Mikroorganismus bzw. seiner Mutanten und Varianten·

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Es ist bekannt, daß Mikroorganismen niedermolekulare Metabolite synthetisieren, die für das Anschalten von Differenzierungsprozessen morphologischer und biochemischer Art verantwortlich sind. Handelt es eich um artspezifiseh wirkende Verbindungen, werden diese Differenzierungsfaktoren auch Autoregulatoren genannt (Khokhlov, A.S. 1979, Abstraots Int. Sympos. Antibiotics, Weimar-GDR)* Wirken diese Paktoren über die Art hinaus,, sind Begriffe, wie Bioregulator oder "hormon-ähnliche¹¹ Substanz gebräuchlich. Die chemische Natur der Bioregulatoren ist sehr unterschiedlich. Bei Streptomyceten sind Bioregulatoren bekannt, die die Bildung von Luftmycel und Sporen sowie die Produktion von Sekumdärmetaboliten wie Antibiotiea ermög-

17.NOt 1984*971927

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lichen oder fördern· Dadurch können Bioregulatoren potentiell zur Optimierung der Antibiotica-Produktion in der mikrobiologischen Industrie eingesetzt werden. Mit unterschiedlicher Intensität untersuchte Beispiele für Bioregulatoren von Streptomyceten stellen die folgenden Verbindungen dar: Cosynthese-Faktor I aus Streptomyces aureofaciens (Miller et al., 1960. J.Amer.ohem.Soe., j82, 5002) ein nicht näher definierter Induktor der Staphylomyeinproduktion in S.virginiae (Yanagimoto et al. 1971, I.Ferment.Technol.42, 611), der Α-Faktor in Actinomyces streptomycin! (Kleiner et al., 1976. Bioorg.Khim.(Moskau), 2, 1142-47; Khokhlov et al., 1967. Dokl. Akad.Nauk SSSE, V77, 232-35; Tovarova et al., 1970. Isvest. Akad.Nauk SSSR (Ser.Biol.) 3_, 427-34; Khokhlov et al., 1973. Z.Allg.Mikrobiol., 1_2, 647-55), der C-Faktor in Streptomyces griseus (Biro et al·, 1980. Eur.J.Biochem., 103, 359-63), das Antibioticum Pamamycin in Streptomyces alboniger (Mc Gann and Pogeil, 1979. J.Antibiotics, J32i, 673-78), das Sporulatiönspigment in Streptomyces venezuelae (Scribner et al., 1973· Appl. Microbiol., ,25, 873-79) und das Methylenomycin in Streptomyces coelicolor (Kirby et al., 1975. Nature, 254, 265-67), letzteres allerdings mit inhibitorischer Wirkung auf die Luftmycelbildung. Auch bei Pilzen ist über das Vorkommen entsprechender Differenzierungs-Faktoren berichtet worden (z,B· bei Penicil— lium cyclopium; Zendem et al·, 1980» Abstract 1/19, 13_#Eesngr· PharnuGesei!schaft der DDH, leipzig, 3·-5·11.1980; luckner et alU, 1977· Secondary metabolism and cell differentiation· Springer Verlag 1977)· Wirkstoffe dieser Art werden derzeit hinsichtlich ihrer Struktur und Wirkungsweise untersucht bzw_# in bezug auf ihre Ersetzbarkeit zur Steuerung von Fermentation Prozessen und bei der Optimierung mikrobieller Leistungen, wie das Biοsynthesevermögen für Antibiotica und andere Wirkstoffe»

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines Bioregulators, der sowohl die morphologische als auch die ohemische Differenzierung von Anthracyclin-bildenden Streptomyoeten ermöglichen ,

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bzw» fördern kann. Damit wird die Palette derartiger Bioregula^ toren durch einen in seiher Konstitution neuen Wirkstoff erweitert, der für Optimierungsaufgaben der mikrobiologischen Industrie von potentiellen Nutzen ist» Der herzustellende Biore— gulator soll bei Zusatz zu Streptomyceten-Kulturen, die weder laiftmycel- und Sporenbildung durchführen noch Anthracycline zu synthetisieren vermögen, sowohl die Bifferenzierung als auch die Anthracyolin-Biosynthese anschalten und stimulieren·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren zu beschreiben, mit dessen Hilfe der Bioregulator, auch Leukaemomycinbiosynthese-induzierender Paktor (L-Faktor) genannt, aus einem Mikroorganismus durch dessen Kultivierung auf einem leicht zugänglichen Medium unter Verwendung billiger Einsatzstoffe hergestellt, mit Hilfe einer spezifisohen Methode nachgewiesen sowie mit chromatografisehen Methoden isoliert und gereinigt werden kann·

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der Mikroorganismus oder seine Mutanten und Varianten gezüchtet werden» Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Verwendung findet, ist'naoh Mutagenese aus einer Population des Leukaemomycin-Bildners, Streptomyces griseus JA 5142 (Fleck und Strauß, 1975. Z.Allg.Mikrobiol., 15., 455-503), erhalten worden. Der Bildner des L-Faktors, der nach Mutation sowohl das Differenzierungs- als auch das Anthracyclin-Biosynthesevermögen verloren hat, ist unter der Registriernummer ZIMET 43 668 in der Hinterlegungsstelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDl, 6900 Jena, Beutenbergstr. 11, hinterlegt worden· . '

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Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43 668 sowie seiner Varianten und Mutanten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw. an Glucose/Gelatine (5%ig) lyophilisierte Bäycelfragmente werden auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Myoel wird in an sioh bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰G, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können die in der Antibiotica-Industrie üblichen Einsatzstoffe verwendet werden. Die Fermentation des L-Faktor-Bildners ZIMET 43 668 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in Glasfementern sowie in V2A-Tank£ durchgeführt werden. Die Isolierung des L-Faktors wird in der Weise durchgeführt, daß er aus Mycel und Kulturfiltrat, vorzugsweise aus letzterem durch organische Lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat oder Chloroform, extrahiert wird. Abb. 1 Durch Einengen der Butylacetatextrakte von Kulturfiltraten wire ein Rohprodukt erhalten, das säulenchromatografiseh an organophilen Dextrangelen gereinigt wird, und die dabei erhaltenen aktiven Fraktionen werden an trockenes Zellulosepulver gebunden, anschließend mit Y/asser eluiert. Die wässrigen Eluate werden mit Ether extrahiert, die dabei erhaltenen Produkte werden wiederum säulenchromatografieoh über gepuffertem Kieseigel bei pH 7,0 oder dünnschichtchromatografisch auf neutralen Kieselge! schichten angereichert, anschließend werden, die gewonnenen Produkte durch präparative Gaschromatografie von allen Begleit- . komponenten befreit*

Der L-Faktor stellt bei Raumtemperatur ein leicht gelbliches Öl dar, der auf Grund der massenspektrometrischen untersuchung (Hoohauflösendes Massenspektrometer JEOL JMS-D-100, Direkteinlaßsystem, 55 ⁰C, 75 eV Elektronenstrom)

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ein Molgewicht von 186 und die Summenformel C₁₀H₁₈O₃ besitzt, (Abb. 2) M⁺: m/z 186.1253 gef. (186.1256, ber.für G₁₀H₁₈O₃). Die charakteristischen Maxima im ΙΕ-Spektrum (GOGl₃) sind: 715, 721, 740, 895, 905, 990, 1030, 1155, 1187, 1420, 1774, 3610 cm""¹.

Das Absorptions-Maximum im UV-Bereich liegt bei 279 nm (EtOH), Auf Grund der Bausteinanalyse und der nach ^C u. 'H-Kernresonanzspektrometrie erhaltenen Befunde (Abb, 2, Tab. 1 und 2) stellt der L-Faktor ein bisher noch nicht bekanntes 4,5-Dihydroxy-n-decansäure-4-lacton mit der in Abbildung 1 angegebenen Konstitutionsformel dar. Zur genaueren Charakterisierung des L-Faktors werden in Abbildung 2 das massenspektrometrische erhaltene Fragmentierungssehema sowie in Tabellen 1 und 2 die

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Zuordnungen der ^C- bzw. H-Kernresonanzsignale aufgeführt·

Der L-Faktor 4,5-Dihydroxy-n-decansäure-4-laeton zeigt auf KieseIgel-Folieη folgende Rf-Werte:

0,10 bei Laufmittelsystem Benzen:Ether = 3:1 (v/v)· 0,20 bei Laufmittelsystem Benzen:Ether =1:1 (v/v). 0,80 bei Laufmittelsystem Benzen:Aceton = 5*3 (v/v)· Verwendung von Silica-G-elplatten führen zu folgenden fif-Werten des L-Paktors:

0,50 bei Laufmittelsystem Benzen:Aceton = 8:2 (v/v). 0,17 bei Laufmittelsystem CHCl₃ :.Ether = 6:4' (v/v). Auf Zellulosefolien ergibt der L-Faktor im Laufmittelsystem H₂O einen Ef-Wert von 0,5, auf gewaschenem, neutralen Chromatografiepapier im gleichen Laufmittel Sf 0,65·

Der Nachweis der Wirkung des L-Paktors erfolgt mit Hilfe einer speziellen Methode, die sowohl die Stimulierung der Luftmycel- und Sporenbildung als auch die Leukaemomycin-Biosynthese nachzuweisen gestattet· Details der mikrobiologischen Analytik sind bei Eritt et al· (1981) beschrieben.

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Ausführungsbeispiele:

1. Mycelfragmente des Stammes ZIMBT 43 668,, der 7 Tage auf dem für Streptomyoeten üblichen Hafermehl-Agar emers angezüchtet wurde, werden als Impfmaterial für Vorzuohtkulturen in folgendem Submers-Medium eingesetzt: 0,6% Bacto-Pepton; 0,3% Hefe— extrakt; 0,05% CaCO^f !Leitungswasser ad 100%; pH 7,2; Sterilisation: 120 ⁰C, 30 Min. Die Vorzucht-Kulturen befinden sich in 100 ml-Steilbrustflasohen a 20 ml Füllung und werden 48 Std. bei 28 ⁰C auf einem Schütteltisch (180 U/min) bebrütet. Durch stufenweise Maßstabsvergrößerung wird das auf diese Weise gewoTDene Submers-Mycel zur Beimpfung von 400 1-Fermentoren mit Submers-Medium folgender Zusammensetzung verwendet: 3% Glucose; 1% Sojamehl; 0,3% NaCl; 0,3% CaCO₃, pH 6,5 nach Sterilisation (115 ⁰C, 30 Min.)· Während der Fermentation bei 25 ⁰C, die mit einer fiührgeschwindigkeit von 280 U/min und einer Luftzufuhr von 400 l/min durchgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, siliconhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. Nach 96-stündiger Permentationsdauer wird der höchste behalt an Lr-Faktor bestimmt·

2« 300 1 einer nach Beispiel 1 gewonnenen Kulturlösung des Stammes ZIMET 43 668 werden auf einen pH-Wert zwischen pH 5 bis 7 eingestellt, mit Hilfe eines Separators in Mycel und Kulturfiltrat getrennt und entsprechend dem in Abbildung 2 dargestellten Schema aufgearbeitet. Dabei führt die Extraktion des Eulturfiltrates mit 60 1 Butylacetat zu 50 1 Extrakt, der nach Neutralisieren mit NaHCO« und Einengen im Vakuum 200 g Rohprodukt des L-Faktors·

3# Die Extraktion des L-Faktors aus Emerskulturen kann aus den Myoel 12© Std. alter Kulturen erfolgen, wenn das Medium folger de Zusammensetzung besitzt:

Hafermehl 2%

Agar-Agar 1,5%

pH 7,8

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Die Bebrütung erfolgt bei 25 bis 29 ⁰C* Das Hafermehl-Agarmedium wird vor der Beimpfung mii einer eemipermeablen Cellulosefolie überdeckt· Dadurch läßt sich der Stamm ZIMET 43 668 naoh 120-stündiger Bebrütung mit Hilfe der Zellulosefolie ohne Agarbestandteile vom halbfesten Medium abheben und extrahieren· 10g des auf diese Weise gewonnenen Mycels (Feuchtgewicht) werden mit 500 ml Chloroform für 24 Std, bei Raumtemperatur extrahiert, danach wird abfiltriert und der .Mycelrückstand verworfen. Naoh Einengen des Chloroform-Extraktes im Vakuum erhält man 110 mg L-Paktor-haltiges Rohprodukt.

4. Jeweils 50 g Rohprodukt, erhalten nach Beispiel 2 und 3 aus Kulturfiltrat und Emersmyoel, werden in 200 ml Methanol gelöst und von unlöslichen Anteilen abfiltriert. Das erhaltene FiI-trat wird auf eine mit organophilen Dextrangelen, gefüllte Säule von 150 χ 8 cm (Betthöhe 80 cm) aufgegeben, die aktiven Fraktionen nach Methanol-Elution aufgefangen, vereinigt und im Vakuum eingeengt. Der dabei gewonnene Rückstand von 1 g wird in 100 ml Diethylether aufgenommen und mit 20 g trockenem Zellulosepulver für die Säulenchromatografie versetzt. Bach dem Entfernen des Ethers im Vakuum wird der Rückstand auf eine Säule von 100 χ 1,5 cm, gefüllt mit trockenem Zellulosepulver bis zu einer Betthöhe von 10 cm, aufgegeben. Anschließend wird mit 2 1 Wasser eluiert, ehe die dabei erhaltenen Eluate mit 2 1 Diethylether in 3 Portionen extrahiert, die vereinigten Etherextrakte über Wa₂SO. getrocknet und eingeengt werden· Der Rückstand von 0,5 g wird danach auf eine Säule (100 χ 1,5 cm) aufgegeben, die mit gepuffertem Kieselgel (pH 7,0; KH₂PO^) in Benzen/Ether (1:1, v/v) gefüllt ist. Nach Elution mit dem gleichen System werden entsprechend Eritt et al. (1981) die aktiven Fraktionen ausgesondert und vereinigt (Ausbeute: 75 mg)· Eine weitere Rei~ nigung des L-Faktors erfolgt durch präparat!ve Dünnschichtchromatografie an neutralen Kieselgel-Sohichten, unter Verwendung von Benzen/Ether (1:1, v/v, zweimaliger Lauf)· Aktive Fraktionen können außer ihrer biologischen Wirkung noch auf Grund gelber Fluoreszenz im UV-Licht sowie auf Grund charakteristischer

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rotvioletter Anfärbung duroh 1%iges Vanillin in konz. H₂SO^ erkannt werden· Nach Elution der aktiven Zone mit Ether werden ca. 30 mg einer zu 90# reinen Präparation des L-Faktors erhalten.

5. Die zu 90% reine Präparation des L-Faktors wird nach Beispiel 4 gewonnen und nachfolgend durch präparative Gaschromatografie völlig gereinigt. Das vorgereinigte Präparat des 1-Faktors wird von Begleitkomponenten befreit, wenn es auf einer Glassäule (150 χ 0,6 cm), gefüllt mit 2$ 07 101 auf Chromosorb W (A.W., DMCS, 80-100 mesh) bei isothermem Betrieb (120 ⁰C), in Argongasstrom chromatographiert wird. Dabei erscheint die Substanz nach einer Retentionszeit von ca. 15 Min· Unter den Begleit— komponenten des L-Faktors befindet sich mit einem Anteil von ca 5$ der eingesetzten Gesamtmenge ein biologisch in gleicher Weise aktives C-5-Isomers (Diastereomers) des L-vFaktors, das unter den o.g. Bedingungen eine kürzere Eetentionszeit (13 Min.) besitzt. (Tab. 1 und 2)

6. Die Reinigung des L-Paktors erfolgt wie im Beispiel 3 mit dem Unterschied, daß anstelle der Säulenchromatografie mit Kieselgelen die Dünnschichtchromatografie mit neutralen Kieselgel-Polien, durchgeführt wird· Dabei werden jeweils 100 mg durch Zellulosechromatografie erhaltenes Rohprodukt nach Beispiel 4 auf eine 20 χ 20 cm große Folie aufgetragen und im Laufmittelsystem Benzen/Ether (1:1, v/v) durch zweimaligen lauf im gleichen Solvens entwickelt.

Claims (6)

1. -⁹- 232491 2

   Erfindungsansprüehe

   1, Verfahren zur Herstellung eines Bioregulators, gekennzeichnet dadurch, daß der Stamm ZIMET 43 668 der Art Streptomyces griseus unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff-, Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 25 bis 37 ⁰C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, kultiviert wird und der gebildete Bioregulator aus dem ffiyoel und/oder Kulturfiltrat bei einer Acidität von pH 4 bis 7, mittels üblicher organischer Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert und mit ohromatografisehen Methoden gereinigt wird*

   2· Verfahren naoh Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß; der Bioregulator aus dem Stamm ZIMET 43 668 durch Gelchromatografie an organophilen Dextrangelen in organischen Lösungsmitteln als Eluent weiter'gereinigt und^ durch Chromatografie mit Zellulose und neutralen Kieselgelen angereichert wird·

   3. Verfahren nach Punkt 1> und 2, gekennzeichnet dadurch, daß hochreiner Bioregulator durch präparative Gasehromatografie an imprägnierten Trägern gewonnen wird.
2. 2.491

   Chemische Aufarbeitung des Bioregulators 4,5-Dihydroxy-n-Decansäure-4-lacton (L-Faktor)

   3QQ 1 Kulturlösung des Stammes ΖΙΜΕΐ 43 668 (pH 5,0) Butylacetatextrakt der KL (50 1) Rückstand nach Einengen im Vakuum (200 g) Säulenchromatografie an organophilen Dextrangelen

   Aktive Fraktionen (40 g)¹' inaktive Fraktionen Adsorption an trockenem Zellulosepulver Elution mit H₂O
   Etherextraktion

   Rückstand des Etherextrakts (2g) Säulenchromatografie (Kieselgel, KH^PO.-gepuffert

   _Λ\ P 7,0) Aktive Fraktionen (300 war'

   Präparative Dünnschichtchromatografie

   (Kieselgel-Folien, Benzen:Ether - 1:1,

   90% reiner Biore|g;ulator(110 mg) (Ausbeute: 33# bezogen auf die im Kultur-

   filtrat vorhandene Menge) Eräparative Gaschromatografie

   OY 101 auf öhromosorb W)

   Gaschromatografisch einheitlicher Bioregulator

   Auswahl der aktiven Fraktionen mit der von Eritt et al*

   (1981) beschriebenen mikrobiologischen Methode (Z. AlIg. Mikrobiol.)

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   Tabelle 1: Zuordnungen der ¹^C-K.ernresonanzsignale des Bio regulators 4,5-Dihydroxy-n-decansäure-4-lacton (!-Faktor) und der diastereomeren Nebenkomponen te (Fourier-transform-NMH-Spektrometer Varian 100/15, 26, 16 MHz, TMS als interner Standard, off-resonanoe Multiplizitäten: SrSingulett; Dt Dublett; T: Triplett; Qt Quartett

   ι ι

   Tabelle 2:

   Zuordnung der H-NMR-Signale des Bioregulators 4,5-Dihydroxy-n-decansäure-4-lacton (L-Jaktor) und einer als Begleitsubstanz in geringen Mengen vorkommenden G-5-diastereomeren Verbindung (Werte in Klammern).

   Alle Angaben bezogen auf TMS als interner Standard, CDCl₃ als Lösungsmittel, Gerät: Bruker WP 200/SY Fourier-transform Spektrometer, 200.13 MHz.

   Proton chemische Verschiebung

   (ppm)

   Kopplungskonstanten (Hz)

   C-2 H,

   C-2 H_B

   C-3 H_n
3. 2.ι

   (2.58)
4. 2.52 (2.52)
5. 2.27 (2.25)

   AB

   BC BD CD CM DX MX
6. 6.5 ( 6.5).

   Hierzu h Seiten Zeichnungen