DD215800A1 - Verfahren zur herstellung von induktoren der zytodifferenzierung - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Induktoren der Zytodifferenzierung von Streptomyceten, die industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer Differenzierung als auch in ihrem Biosynthesevermoegen fuer Antibiotika zu stimulieren vermoegen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein fermentatives Verfahren zur Herstellung eines Gemisches der Induktoren cis-2-(7'-Methyloctanol-1'-yl)-3-hydroxymethyl-Gamma-butyrolacton, cis-2-(6'-Methylheptanol-1'-yl)-3-hydroxymethyl-Gamma-butyrolacton und cis-2-(5'-Methylhexanol-1'-yl)-3-hydroxymethyl-Gamma-butyrolacton im Verhaeltnis 4:6:1 (2S, 3R-Enantiomere). Diese Substanzen unterscheiden sich von bisher bekannten Induktoren der Zytodifferenzierung durch die Stereochemie der 2,3-Substitution am Butyrolactonring und die Laenge der C2-Seitenkette. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung von Induktoren der Zytodifferenzierung, deren Einsatz in der Fermentationsindustrie zur Anpassung und Steigerung mikrobieller Leistungen von potentiellem Nutzen ist, bzw. die aufgrund ihrer Wechselwirkung mit der lebenden Zelle selbst potentielle Pharmaka darstellen. Diese Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Fermentation des Stammes Streptomyces cyaneofuscatus ZIMET 43684 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen die Induktoren gebildet und mit Hilfe extraktiver Verfahren aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend durch chromatografische Methoden gereinigt werden.
Description
Titel der Erfindung
Verfahren zur Herstellung von Induktoren der Zytodifferenzierung ,
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von In- ... duktoren der Zytodifferenzierung von Streptomyceten, die industriell bedeutsame Mikroorganismen sowohl in ihrer Differenzierung als auch in ihrer Fähigkeit zur Produktion von Anti- ' biotika zu induzieren vermögen und daher in der pharmazeutischen Industrie bei der Herstellung von mikrobiellen Wirkstoffen auf fermentativem Wege von potentiellem Nutzen sind.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Es ist bekannt,- daß Mikroorganismen endogene Effektoren produzieren, die regulatorische !Funktionen innerhalb des Grundstoff wechseis,' der Zelldifferenzierung und des Austausches genetischer Informationen erfüllen. Bei Streptomyceten vermögen lipophile Substanzen, die von einer Vielzahl von Arten produziert werden, den Differenzierungsstoffwechsel einschließlich der Antibiotikumbildung einzuschalten (KHOKHLOT et al., .. . . Z.AIlg.Mikrobiol. IJ-, 647-655, 1973; HARA u.BEPPU, J.Antibiot. UZ, 349-353, 1982; KÜSTER u.ATTABT, Z.AIlg.Mikrobiol.22,V 107-117, 1982). Hinsichtlich ihrer chemischen Natur handelt es sich 'einmal um 2-(6-Methylheptanoyl)-3-hydrosymethyl-y-butyrolacton, besonders um das -2(S).,3(S)-Isomere (ELEIJISR et al., Bioorg.Khim., 2_, 1142-1147, 1976; KLEIIiSR et al., Bioorg.Khim./
2» 421-426, 1977; MOEI, K., Tetrahedron Letters, 22, 3431-3432, 1981), zum anderen um 2(S)-(6f-Methylheptanol-1!-yl)-3(S)-hydro:xymethyly'-butyrolacton bzw. um das 2R,3S-.-Enantiomere (GRIPE et al., J.Antibiot.££, 1722-1723, 19'82) sowie um Vertreter eines änderen Strukturtyps, um 4,5-Dlhydroxy-n-decansäure-4-lactone (GBlES et al., J.Antibiot.^, 57-62, 1982). Weitere Informationen über die Strukturen ähnlich -wirksamer Effektoren aus Streptomycetenkulturen liegen bisher nicht'vor. Das biologische Herstellungsverfahren für 2-(6'-methylheptanoylO-S-hydrosymetliyl-"g-butyrolacton weist den Nachteil auf, daß reiner Stimulator nur in sehr geringen Mengen infolge aufwendiger chromatografischer iDrennoperationen erhalten werden kann (KLEISER et al., Bioorg.Khim.2, 1142-1147, 1976). Die chemische Herstellung liefert entweder das weniger aktive Hacemat (KLEISEE et al., Bioorg.Shim.2> 421-426, 1977) oder erfordert den Einsatz sterisch einheitlicher; Ausgangsstoffe (MOEI, Tetrahedron Lett.22, 3431-3432, I98I), die selbst/erst durch aufwendige Synthesen hergestellt, werden müssen«; Gegenüber der o.g, Yerbindung.weisen andere Bioregulatoren mit adäquater Wirkung wie z.B. 4,5-DihydrO2cy- ;n-decansäure-4-lacton (GRlPS et al., J.Antibiot.35, 609-614, 1982) oder trans-2-(6!-Methylheptanol-1 t-yl)-3-hydppxymethyl-4-butanolid (GRjIB1E et al., J.Antibiot .^, 1722-1723, 1982) den Nachteil der um den Faktor 20 bzw. 10 geringeren spezifischen biologischen Wirkung auf.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung dient der Herstellung eines Gemisches neuer Induktorender Zytodifferenzierung von Streptomyceten, die sowohl die morphologische als auch die chemische Differenzierung Anthracyclin- und Streptomycin-biIdender Strept omyceten einzuschalten und zu fördern vermögen« Damit wird die Palette der bekannten Vertreter mlkrobiell erzeugter Bioregulatoren von Streptomyceten durch einen in seiner Struktur neuen Wirkstoff komplex erweitert» Die erfindungsgemäß hergestellten1Induktoren sollen bei Zusatz zu Streptomycetenkulturen, die we-...der Luftmycel und Sporen noch Antibiotika vom Aminoglykosid
-3-
(Streptomycin)- oder Anthracyclin (Leukaemomycin)-typ zu synthetisieren vermögen, beides, morphologische Differenzierung land Antibiotikasynthese^ anschalten und stimulieren.
Darlegung des Wesens der Erfindung
'Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch / einfaches Verfahren zu beschreiben, mit dem ein Gemisch neuer Induktoren der Zytodifferenzierung (Bioregulatoren) aus einem Mikroorganismus durch Kultivierung auf einem leicht zugänglichen1 Medium unter Verwendung billiger Sinsatzstoffe hergestellt werden kann. '
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter, aeroben' und sterilen Kult urbe dingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der Mikroorganismus oder seine Mutanten und Varianten gezüchtet werden. Der Mikroorganismus', der nach diesem Verfahren Anwendung findet, ist StreOtoiy/ces c y ane of use at us, Stamm ZILiST 43684 (entspricht dem in Approuved Lists of Bacterial Harnes, 1980, beschriebenen S .·, cyane of use at us) Er ist unter dieser Registriernummer in der Hint er le gangs-» stelle des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11, hinterlegt worden. Die Kultivierung des Stammes S.cyaneofuscatus ZIMST 43684 erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial wird bzw. an Glueöse/Gelatine (5$ig) lyophilisierte Myzelfragmente werden auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Hährmedien geimpft, und- das entstehende Myzel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 0C und 37 0G, vorzugsweise 28 °,C, über einen Zeitraum von 2 bis 5 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Azidität kultiviert, die zu Beginn der Fermentation 'zwischen pH 6.2 und pH 7·0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7·5 und 8.3 liegt. Das ITährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquelleη sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoff- und Stickstoff quellen können die in der Antibiotikafermentation üblichen Sinsatzstcffe
verwendet werden· Die fermentation des Stammes ZIMST 43684 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, in -Glasfermentern sowie in V2A-Tanks durchgeführt werden. .. ". . .
Die Isolierung der hierbei gebildeten neuen Induktoren (Bio- ' regulatoren) als Komplex dreier strukturell ähnlicher Wirk- , stoffe wird in der Weise durchgeführt, daß sie aus dem auf pH 4 bis 5 angesäuerten Eulturf11trat des Stammes 'ZIMET 43684 durch organische Lösungsmittel, vorzugsweise Butylacetat, extrahiert werden. Ein durch Einengen des Extraktes der Kulturlösung erhalteness Rohprodukt wird'durch. Säulenchromatografie an Cellulose und durch präparative Dünnschichtchromatografie an neutralen Kieselgelschichten weiter gereinigt, wobei aktive Fraktionen aufgrund ihrer induzierenden Wirkung auf die Luf tmyce!bildung·eines Indikatorstamme s,-Streptomyces griseus ZIMET 43682, erkannt werden (ESI1TT et al., Z.Allg.Mikrobiol. 22,: 91-96, 1^82) . Durch fraktionierte Abtrennung des aktiven Prinzips mit Hilf e der präparativen Dünnschichtchromatografie an neutralen Sie se Igel schicht en unter Tfechsel-des. Solvens wird ein 1,5:1 Gemisch der beiden Induktoren 1_ und 2 erhalten, das zusätzlich geringe Anteile eines Homologen 2 -mit kürzerer Seitenkette enthält. So ergab die Messung der Verdampfungskurven (AEI MS 902, 70 eV, direct inlet, 190 0C) ein Mengen-· verhältnis. von 4:6:1 der Induktoren I^ 2 und %. . . Die in Abb. 1 dargestellten Strukturen für 1,2 und 3 wurden spektrometrische Untersuchungen 25 ISEz
durch massenspektrometrische Untersuchungen, 25 ISEz C und, 200 MHz- H 2ILiR ermittelt. Das Gemisch der Induktoren eis-2-(6 '-Methylheptanol-1 '-yl)-3-hydroxyi2eth7l~ i^-butyrolacton 1_, cis-2-(7' -Methyloctanol-1' -yl)-3-hydrox7meth.7l- ^-butyrolacton 2 und eis-2-(5f-Methylhexanol-1'-yl)-3-hy.droxTmethyl- g -buty-. rolacton 2 (2R, 3S bzw. 23, 3E-Enantiomere) stellt bei Raumtemperatur ein farbloses öl dar. ,. Für die Induktion sichtbarer Zeichen der Luftmyce!bildung und Antibiotikumproduiktion unter Verwendung der beschriebenen Testmethode. (EEITT et al., Z.AlIg.Mikrobiο 1.22.,.. 91-96, 1982; GSlPl et al., J.Antibiotics, ^4, 1385-1337, 1981; GRAS1S et al.. J.Antibiotics 22;» 609-614, 1982) werden 30 ng der natürlich im Gemisch vorkommenden, mit chromatografischen Methoden aufgrund der physikalischen Ähnlichkeit homologer Verbindungen.
nicht trennbaren Induktoren Λ_, 2 und ^ benötigt. Das EI MS Spektrum (JSOL JMS D-100, direct inlet, 75 110 0C) zeigt folgende charakteristische Fragmente; 1,: m/z 226.1541 (.1569 ber. f. C13H22O3;' M+-H2O) m/z 195.1397 (.1335 ber. f. G12H19O2; M+-H2O-
2: m/z 240.1737 (.1725 ber. f. C14H24O3; M+- H2O)
m/z 209.1553 (.1541 ber. f. G13Ii21O2; M+-H2O- CH2OH)
2,i (silanisierte Verbindung) "' -
m/z 359 (C12H22O4(TMS)2- 15)
sowie die für 1, 2 und 3 charakteristischen gemeinsamen Frag-.
mente:
m/z 171.1018 (.1021 ber. f. C9H1CO3)
m/z I45.O5I8 (.0501 ber. f. O6HqO4)-
m/z 127.0358 (.0359 ber. f. C5H7O3) . -
- m/z 116.0471 (.0473 ber. f. C5H8O3)
m/z 35.0319 (.0290 ber. f. Q4H5O2),
jl· kann., nur im Gemisch der silanisierten Effektoren durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Die 1_ und 2_ zuzuordnenden individuellen Peaks weisen annähernd gleiche Intensität auf, entsprechend einem KonzentratIonsverhältnis von 1.5:1.
Die in Abb. 1 gezeigte Konstitution und relative Stereocheniie für I1J 2 aod 2. wurden aus den Kernresonaazdaten abgeleitet:
13C ,UME-Ergebnisse (25.16 MHz, Varian 11-100/1551T) fur ±, 2 und 2.: (3 CDC13 ppm: I79.46 (C1), 48.68 (02), 38.06 (C3), 69.98 (C4), 63.38 (05) und 70.92 (01·).) sowie'für
1 (3 OBOh ppm: 3.5-36· (02»), 26.44 (03'), 27.-53 (04')," 39.19 (05·), 28.13 (C6'), 22.67 (C7f), 22.6? (C81));
2 (3 GDG13 ppm: 35-36 (C21), 26.24 (C3f), 29.83 (C41), 27.33 (C51), 39.19 (06«), 28.13 (C7f), 22.67 (C8S), 22.67 (C91) und . -
2 (3 oi,oi3 ppm. 35#76 (C2t). 23.46 (C3r'), 39.00 (C4')., ; . 28.13 (05'·), 22.67 (C6f), 22.67 (C7'K
1H HME-Daten (Bruker WP-200/Sy):
Einheitliche spektrale Charakteristika der gesamten Probe- .· mischung mit Ausnahme der Protonensignale.der aliphatischen Seitenkette: % ,
Z CDCl ppmi 2.55(H2, J23= 7.26, J26=3.81), 2.30 (H3, J343= 8.40, J34b= 6.69, J35a = 5.78, J35b= 5-96), 4.40 (H4a, -9.03), 4.08 (H4b), 3.75 (H5a,J5a5b= -10.49), 3-69 (H5b), 4.42 (H1, J.to,= 7.52), 1.46 (-CH(CH^)0), 0.87 (-CH(CH^)0).
Die 7.26 Hz für die vicinale Kopplungskonstante korrespondiert mit einer cis-Anordnung der Substituenten an 02 und C3 (SEYASTIANOFF a. PFAU, Bull.Soc.Chim. France. 1967, 4162~417Ό·
Ausführungsbeispiel ' .; . .
Die Erfindung soll durch nachfolgendes Ausführungsbeispiel näher erläutert,; jedoch nicht eingeschränkt werden.
7 Tage alte Kulturproben von Streptomyces cyaneofuscatus ZIMST 43684, die auf Eafermehlagar angezogen wurden, werden in einem Submersmedium folgender Zusammensetzung 48 Stunden bei 28 0C in 100 ml-Steilbrustflasehen (20 ml Inhalt) geschüttelt. (Hotati ons schüttler, .240 UpM): 0.6 % Bacto-Pepton, 0.3 % Hefeextrakt, 0.05 % CaCOo, Leitungswasser ad 100 %* pH 7.2, Sterilisation 1200C, 30 min). Die Fermentation in 500 1-Fermentoren . wird in einem Medium folgerider Zusammensetzung durchgeführt: 3 %. Glucose, 1 %.Sojamehl, O.3 % 2TaCl, 0.3 % CaCO3, pH'6.5. Sterilisation 120 0C, 30 min. ITach 96-stündiger Fermentation· wird die Kulturlösung auf pH 4 bis pH 5 eingestellt und über : einen Separator vom Myzel befreit. .
Die Kulturlösung (400 1) wird mit 50 1 Butylacetat extrahiert. Nach Einengen des Extraktes im Vakuum wird der Rückstand (50 g) mit'150 g Cellulosepulver für, die Säulenchromatografie vermischt, in eine Glassäule gegeben und mit 5 1 Wasser eluiert. Der wässrige Extrakt wird anschließend mit. 2 1 Ether reextrahiert. Der Rückstand des Etherextraktes (2g) wird auf neutralen Kieselgelschichten zunächst im System Benzen/Ether, 1:1, v/v durch dreimaligen Lauf des Chromatogramms entwickelt. Aktive Fraktionen mit einem Rp von ca.0.2 bis 0,3 werden mit Ether eluiert' und anschließend der Sieselgelchromatografie im System CHCI^/IeOH .(95:5» ^/y.» zweifacher Lauf) unterworfen. Aktive Fraktionen mit einem E*» von ca.0.4 werden ebenfalls mit
Ether eluiert und nochmals der KieseIgelchromatografie unter • Verwendung des Systems Diisopropylether/Essigester (9:1, v/v, sechsfacher Lauf im gleichen Solvens) unterworfen. Dabei werden 4 mg eines 6:4:1 Gemisches von reinem I-, 2 und 2 er~ halten (Rf 0.2). ;
CH20H
Me
-CH20H
Me
CH2OH
Legende . '
Strukturen,der Bestandteile des erfindungsgemäB hergestellten Iaaiiktorgejaisches (23,3S-5Onr· bzn9 die enantiomeren 2H',33-' Formen) ..··.' . .' '. ' \
Abb.1
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von Induktoren der Zytodifferenzierung auf' mikrobieHein Wege, gekennzeichnet dadurch, daß
- der ..Mikroorganismus Streptomyces cyaneof uscatus ZIiIET 43684,unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Hährmedien,. die eine Kohlenstoff-, eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer 'Temperatur von 25 0C bis 37 0O während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 5 Tagen bei einer Azidität, die.zu Beginn der !Fermentation, zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des. Prozesses zwischen pH. 7>5 und pH 3,3 liegt, kultiviert wird- und
- die hierbei gebildeten neuen, ca. im 4:6:"!-Gemisch auftretenden Induktoren . cis-2-(7M£ethyloctanol-1 r-
rolactpn, . ' '
cis-2-(6 '-Methylheptanol-1 T-
rolacton -.... . ..
und .' .' . ·".· ·' . ; ... .
cis-2-(5!-"Methylhexanol-1 !-yr)-3-h7ärox7methyl- γ-buty- : , rolacton . , .
aus dem Kulturfiltrat bei einer Azidität von pH 4 bis pH 7 mittels üblicher organischer Lösungsmittel extrahiert und nachfolgend mit an sich bekannten Methoden chromatografisch weiter gereinigt werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß
λ- die Kultivierung des Stammes ΖΙΜΞΤ 43684 in $00 1-Fermentoren bei 28 0G-mit einer Start-Azidität von pH 6,5 . -während eines-Zeitraumes von 4 Tagen erfolgt und,
- zur Auf arbeitung nach Einstellen der Kulturlösung auf pH 4 bis 3 Butylacetat als Extraktionsmit'tel eingesetzt wird. ·' '..
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25129883A DD215800A1 (de) | 1983-05-27 | 1983-05-27 | Verfahren zur herstellung von induktoren der zytodifferenzierung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD25129883A DD215800A1 (de) | 1983-05-27 | 1983-05-27 | Verfahren zur herstellung von induktoren der zytodifferenzierung |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD215800A1 true DD215800A1 (de) | 1984-11-21 |
Family
ID=5547596
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD25129883A DD215800A1 (de) | 1983-05-27 | 1983-05-27 | Verfahren zur herstellung von induktoren der zytodifferenzierung |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD215800A1 (de) |
-
1983
- 1983-05-27 DD DD25129883A patent/DD215800A1/de not_active IP Right Cessation
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