DD201606A5 - Verfahren zur herstellung fermentierter alkoholprodukte - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von gaerungsalkoholischen Produkten, wie Bier, Wein, Aethanol. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten

Description

2 3 2 kl 8 5 ^BerlirT*^den

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Verfahren zur Herstellung von gärungsalkoholischen Produkten Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung alkoholischer Produkte durch Gärung, beispielsweise Bier und Wein> die sich durch einen niedrigen Diacetylgehalt auszeichnen und durch Gärung eines Kohlehydrate enthaltenden Substrates mit Mikroorganismen erhalten werden»

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Wenn Kohlehydrate enthaltende Substratej wie Malz oder Traubensaft-y mit Hefe oder anderen Mikroorganismen gegoren werden*: findet neben der alkoholischen Gärung eine Reihe von- Prozessen statt, die zur Bildung unerwünschter Nebenprodukte führen können* Ein Beispiel ist die Bildung von Diacetyl:,' das bereits in sehr geringen Konzentrationen einen starken und unangenehmen Geruch hat» Alkoholische Getränke wie Bier oder Wein können dadurch ein unerwünschtes Aroma oder einen unangenehmen Geschmack aufweisen», wenn der Diacetylgehalt bestimmte Grenzen beträchtlich überschreitet'; die im Falle des Biers bei etwa 0,1 ppm liegen*.

Die Diacetylbildung ist weiterhin bei der industriellen Herstellung von Ethanol von Nachteil·, da es schwierig ist* Diacetyl durch Destillationvon Ethanol abzutrennen. Ein spezielles Problem entsteht bei der Herstellung von absolutem Ethanol bei der Entwässerung durch azeotrope Destillation mit Benzen* Während der azeotropen Destillation

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sammelt sich das Diacetyl in eier Benzenphase> so ciaS Gemische von Diacetyl und Benzen entstehen-, die die Rückge~ winnung des zur azeotropen Destillation verwendeten Benzens erschweren*

Das übliche Verfahren zum Brauen von Bier besteht in der Gärung von Malz rait einer geeigneten Hefeart,, z* B* Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces carlsöergensis» Die Gärung wird üblicherweise in zwei Stufen durchgeführt,, nämlich in der Hauptgärung mit einer Dauer von gewöhnlich 7 bis 10 Tagen und in der Sekundärgärung - ein sogenannter Reifeprozeß - ,: die von 3 bis 12 Wochen dauern kann, Während der Hauptgärung werden die meisten Kohlehydrate im Malz zu Ethanol und Kohlendioxid umgesetzt» Die Reife wird bei einer niedrigen Temperatur in Gegenwart einer kleinen, zurückgebliebenen Menge Hefe durchgeführt* Der Zweck der Reife besteht u«, a« darin, unerwünschte hochmolekulare Verbindungen abzuscheiden und Diacetyl, Pentandion-2,,3-,: -^- -Acetolactat und ^-Acsto-^-hydroxybutyrat zu Verbindungen wie Diolen umzusetzen, die Geschmack und Aroma nicht beeinflussen, Z» B. beeinflußt Butandiol, das Endprodukt aer Umsetzung von <^ -Acetolactat und Diacetyl im Bier, Geschmack und Aroma nicht bei Konzentrationen unter 500 mg pro Liter»

Die enzymatischen und chemischen Reaktionen^ die für den Diacetylgehalt im Bier wichtig sind* werden im folgenden Schema dargestellt:

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H C-C=O

H,C-C-OH 3 ι

COOH

(öi.-Acetolactat) (6Ϊ

(5)

(7)

COOH

(βί-Keto-ß-hydroxyisovalerat)

H_C-C-OH

H-C-OH COOH

(S)

ί λ H., C-C-H

± H-C-NH,

COOH

(e^ß-Dihydroxy- (Valin) isovalerat)

H^C-C=O 3

(Diacetyl)

(Acetoin)

H-C-C-OH /_Oti4._e„ οi—

3 ι (Butan—2 -,^*

H₃C-C-OH diol) H .

Die Vorstufe des Diacetyls,^-Acetolactat, wird in der gärenden Hefe durch die enzymkatalysierte Kondensation von Pyruvat und dem Thiaminpyrophosphat des Acetaldehyds gebildet und ist eine Zwischenstufe bei der Biosynthese der Aminosäure Valin, & -Acetolactat kann jedoch auch durch oxydative Decarboxylierung spontan abgebaut werden und ergibt dabei Diacetyl ^Reaktion {1)3 * das in der Folge durch die Reduktasen in den Hefezellen?>^: die ira Bierreifeprozeß anwesend sind'* weiter reduziert wird*ii Die Decarboxylierung des ^c-Acetolactats ist eine temperaturabhängige Reaktion, die bei niedrigen Temperaturen relativ langsam abläuft:,.

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während die nachfolgende Umsetzung des Diacetyls zu Acetoin und Butan-2-,3~diol relativ schnell abläuft. Die Folge davon ist, daß der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Entfernung vonet-Acetolactat und Diacetyl aus dem Bier die Decarboxylierung der Diacetylvorstufe ist# Analog ist der geschwindigkeitsbestimraende Schritt bei der Entfernung von Pentan^-2-,3—dion und ei-Aceto- ^-Hydroxy— butyrat die spontane Decarboxylierung der Pentan-2,3-dion-Vorstufe_#

Um eine maximale Abscheidung hochmolekularer Stoffe und ein Bier zufriedenstellender Qualität zu erhalten,: sollte die Reife bei einer Temperatur so niedrig wie möglich erfolgen, z» 8* bei etwa O ⁰C*. Bei dieser Temperatur kann es mehrere Monate dauern, bevor das Acetolactat vollständig entfernt ist und das entstandene Diacetyl durch die Hefe reduziert wurde» Die Reifezeit kann jedoch verkürzt werden, wenn man das Verfahren bei höherer Temperatur durchführt, z, B*. eine oder zwei Wochen bei 10 Cj eine oder zwei Wochen bei 5 °C und eine oder· zwei Wochen bei -1 C, Ein solches Verfahren beschleunigt die Umsetzung von Acetolactat in Diacetyl»

In Verbindung mit beschleunigten Bierbrauverfahren wurde vorgeschlagen/ den Abbau des Acetolactats und des «<-Aceto~s< -hydroxybutyrats durch kurzes Erwärmen des Biers auf 60 ⁰C oder 80 ⁰C zu beschleunigen-, siehe 0_# Inst, Brew», 79> (1973), S» 43-44» Bei diesen Temperaturen kann die Reaktion (1) im Verlaufe von 4 bis 15 Minuten im wesentlichen beendet sein* Durch ein derartig drastisches Verfahren werden jedoch Aroma und Geschmack bis zu einem gewissen Grade nachteilig beeinflußt» Außerdem ist diese thermische Behandlung für die üblichen Bierbrauverfahren nicht geeignet¹, und darüber hinaus ist es aufwendig und ökonomisch nach-

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teilig, große Mengen an Bier zwischen der Hauptgärung und der Reife zu erwärmen und wieder abzukühlen»; da außerdem noch die gesamte Hefe vor der Erwärmung.entfernt werden muß und nach der thermischen Behandlung und dem Abkühlen frische Hefe zuzugeben ist'»: um Diacetyl in Butandiol umzusetzen*

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten»; einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens zur Herstellung von gärungsalkoholischen Produkten mit niedrigem Diacetylgehalr,: wie Bier oder Wein*

Darlegung, des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Enzyme zum Abbau von Acetolactat einzusetzen*

Die vorliegende Erfindung hat die Entdeckung zur Grundlage, daß man den langsamen Abbau des Acetolactats zu Diacetyl,. Reaktion (1) im Schema·:* vermeiden kann, wenn man Enzyme zum Abbau des Acetolactats einsetzt« Zu diesem Zweck kann im Prinzip jedes Enzym verwendet werden» das eine Umwandlung des Acetolactats bewirkt* Ein geeignetes Beispiel ist die Decarboxylierung von Acetolactat zu Acetoin-ί, Reaktion (4) im oben genannten Schema. Andere Beispiele sind die Umwandlung von Acetolactat in •56-Keto—ß—hydroxy— isovalerat durch eine Isomerase-Reaktion (6) oder die Umwandlung von Acetolactat- in o<,ß—Dihydroxy— isovalerat durch eine Reduktoisomerase-Reaktion (5). Die Reaktionsprodukte beider Reaktionen sind Vorstufen der Aminosäure Valin»

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Das erfindungsgemäße Verfahren wird folglich charakterisiert durch die Behandlung eines Substrates mit einem Enzym, das Acetolactat umwandeln kann, während oder nach einer Gärung* Ein Beispiel für ein geeignetes Enzym für dieses Verfahren ist Acetolactat-Decarboxylase^ die aus dem Mikroorganismus Aerobacter aerogenes gewonnen werden kann* Dieses Enzym wird von E, üuni in T. Biol* Chem* 1957 (1952). S* 715-734 beschrieben* Es war jedoch nicht vorauszusehen^ daß das Enzym mit Vorteil in Gärungsprozessen . verwendet werden kann-, z* B₁, bei der Gärung von Malz, beim Brauen von Bier mit einem niedrigen Diacetylgehalt* In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Acetolactat enzymatisch zu Acetoin decarboxyliert und dadurch die Bildung des stark riechenden und unerwünschten Diacetyls aus Acetolactat vermieden* Analog wird in anderen Ausführungsformen der Erfindung der Abbau von oC-Acetolactat zu Diacetyl durch Umsetzung der Diacetylvorstufe durch Acetolactat-Reduktoisonserasen oder -isomerasen (Reaktionen 5 und 6} vermieden* Das Verfahren kann in Verbindung mit dem üblichen Brauen von Bier ausgeführt werden» Z* B* kann Acetolactat-De— carboxylase während der Hauptgärung oder während des Reifeprozesses zugegeben werden* Die Verwendung dieses Enzyms bedeutet eine wesentliche Verkürzung des Reifeprozesses, da Acetolactat schnell zum vergärbaren Acetoin decarboxyliert wird,, ohne daß dabei Diacetyl gebildet wird» Entsprechend einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Enzym während des Reifeprozesses zugegeben, wobei die Bildung des Acetolactats nach der Hauptgärung im wesentlichen beendet ist»--Wenn es erwünscht ist, kann das Enzym jedoch auch vor oder während der Hauptgärung zugesetzt werden*\da · dann der pH-Wert höher ist als während des Reifeprozesses*

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Anstatt das Enzym in freiem Zustand zu verwenden» kann es in immobilisierter Form verwendet werden« Das immobilisierte Enzym wird dem Malz während oder nach der Gärung zugesetzt. Das immobilisierte Enzym kann auch in eine Säule gegeben werden, durch die das gärende Malz oder das Bier hindurchgeleitet werden«. Das Enzym kann getrennt immobilisiert werden oder es können gemeinsam immobilisierte Hefezellen und Acetolactat-Decarboxylase verwendet werden» Durch die Verwendung von immobilisiertem Enzym kann das Bier beschleunigt in einem kontinuierlichen Verfahren gebraut werden, da die Biergärung dadurch ausgeführt werden kann,- daß man Mälz durch Säulen hindurchleitet«" die immobilisierte Hefe und immobilisierte Enzyme enthalten, vorteilhaft in gemeinsam immobilisierter Form« In dem Fall werden die Hauptgärung und der Reifeprozeß zu einer kontinuierlichen Umwandlung des Malzes zu fertigem Bier vereinigt j. wobei die Kapazität von dem Volumen und den Durchmessern der Säulen abhängen* Ein solches.Verfahren spart Arbeit ein und reduziert die Investitionen für die Produkt.ionsanlägen*

Das erfindungsgeraäSe Verfahren kann nicht nur in Verbindung mit dem Brauen von Bier angewendet werden, sondern ist ebenfalls vorteilhaft zur Herstellung von Wein geeignet* wobei insbesondere eine Verkürzung des Reifeprozesses und eine Vereinfachung des Verfahrens erzielt werden* Von besonderem Interesse ist in diesem Zusammenhang die Verwendung der Acetolactate umwandelnden Enzyme bei der sogenannten Apf el sau re-Milch sau re^-Gä rung. Diese Umsetzung* die durch ..,Mikroorganismen der Arten Leuconostoc", Lactobazillus oder Pediococcus bewirkt wird, wird nach der Hauptgärung von_Wein durchgeführt; um den pH-Wert des Produktes zu erhöhen und seine biologische Stabilität zu

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steigern ebenso wie den Geschmack des Weines zu entwickeln» Weiterhin ist es sehr wünschenswert* die Gärung durchzuführen^ da dadurch ein schnelles Abfüllen auf Flaschen ermöglicht und damit der Geldumlauf der Keltereien beträchtlich verbessert wird* Unglücklicherweise kann dieses Verfahren zu einem schlechten Geschmack wegen des Diacetyis führen-, dessen Bildung durch die Verwendung der Acetolactat umwandelnden Enzyme vermindert werden kann* Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft bei der industriellen Herstellung von Ethanol angewendet werden, da die Gärungsprodukte ohne oder praktisch ohne einen Gehalt an Diacetyl erhalten werden,; so daß die Destillation vereinfacht wird, insbesondere im Falle der azeotropen Destillation zur Herstellung von absolutem Ethanol, d. h* reinem, wasserfreien Ethanol·

Wie bereits ausgeführt'", kann· in dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Acetolactat-Decarboxylase verwendet werden, die z, B* aus Aerobacter aerogenes isoliert worden ist* oedoch können auch Acetolactat umwandelnde Enzyme von anderen Quellen verwendet werden, z* B, Arten von Bacillus, Enterobacter, Klebsiella^ LeuconostoCj. Serratia und Streptococcus und einige Arten von Actinomycetes und Pilzen» Geeignete Acetolactat-Reduktoisomerasen und —Isomerasen können aus Bakterien isoliert werden,, z» B* Arten von E, coli oder Aerobacter aerogenes, oder aus Neurospora crassa, Hefen, Salmonella oder Pflanzen* Da die in Frage stehenden Enzyme solche des Aminosäuren—Stoffwechsels sind^' ist zu erwarten-, daß sie in nahezu allen lebenden Zellen auftreten*

Da alkoholische Gärungen oftmals bei pH-Werten im Bereich von 4 bis 5 ablaufen und viele der leicht zugänglichen Acetolactat-Decarboxylasen von fdkroorganismen höchste

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Stabilität und Aktivität bei pH-Werten oberhalb 5 aufweisen, besteht ein geeignetes erfindungsgemäßes Verfahren darinv Acetolactat-Deearboxylase in einer chemisch modifizierten Form zu verwenden» um eine hohe Stabilität und/oder optimale Aktivität in einem pH-Bereich zwischen 4 und 5 zu erhalten» Eine derartige Modifizierung kann man z.. 3* erreichen wie in Biochem. 11., (1972, No* 22«

Ausfuhrunqsbeispiel

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden durch einige Beispiele erläutert»

Beispiel 1

Diskontinuierliche Gärung und schnelle Reife von Bier unter Verwendung von Acetolactat-Qecarboxylase

1 Liter sterile Bierwürze mit einem Stamrawürzegehalt von 10,7 P wird mit Brauhefe (Saccharorayces carlsbergensis) in einer Menge von 20 χ 10 Zellen pro ml versetzt. NaCh 6 Tagen bei 10 C ist die Hauptgärung beendet, die Verdünnung (klarer Extrakt) wurde zu 2>Q Ρ gemessen* Der Gehalt an freiem und gebundenem Diacetyl (d, h, Diacetyl aus oC -Acetolactat) im Bier wurde zu O;12 bzw* 0,71 ppm gemessen (siehe A_- D. Haukeli und S, Lie, Journal of the Institute of Brewing 7J_* (1971), S* 538). Das Bier wurde dann von der abgeschiedenen Hefe dekantiert und mit 100 ml "Kreuzen" abgemischt, d, h. mit einem schnell gärenden -Bier» das aus Bierwürze-, die mit Hefe versetzt worden war/ 48 Stunden vorher hergestellt worden war» Weiterhin wurden 25 mg Acetolactat-Deearboxylase zu—

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gesetzt* die entsprechend European Journal .of Biochemistry 14"; (1970) 133 aus Aerobacter aerogenes isoliert worden war* Nach 24stündigem Stehen bei 10 ⁰C zum Zwecke der Nachgärung und Reife war der Gehalt an freiem und gebundenem Diacetyl im Bier 0,05 bzw* 0,10 ppm» Das Bier wurde dann auf -1 ⁰C abgekühlt und weitere 2 Tage bei dieser Temperatur stehengelassen. Das fertige Bier wurde danach filtriert*

Beispiel 2 Kontinuierliche Gärung und schnelle Reife von Bier

350 g Brauhefe (Saccharorayces carlsbergensis)V die durch Zentrifugieren isoliert worden war, wurden in 350 ml einer 3/oigen sterilen Lösung von Natriumalginat suspendiert» Das Gemisch wurde zu 10 1 steriler 0,1 M CaClp-Lösung zugetropft,, um Calciumanginat zu gelatinieren» Dabei bilden sich kugelförniige,i. Hefe enthaltende Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 3 ram,

Diese wurden 12 Stunden bei 4 C in der Calciumchloridlösung stehengelassen und dann in eine Säule mit einem Durchmesser von 19 cm und einer Höhe von 5 cm gefüllt. Sterile Bierwürze wurde bei 10 C durch diesen Reaktor gepumpt mit einer Geschwindigkeit von 0,15 1 pro Stunde* Der Stammwürzegehalt beträgt 10,7⁰P, Die Verdünnung im Eluat des Reaktors wurde mit 2,1⁰P bestimmt_# Durch Gas— Chromatographie wurde der Gehalt an freiem und gebundenem Diacetyl zu ö,15 ppm bzw* 2j21 ppm bestimmt» Zu einem Liter Bier aus dem Reaktor wurden 25 mg Acetolactat-Decarboxylase, die wie in Beispiel 1 hergestellt wurde,¹ zugegeben. Das Bier wurde 24 Stunden bei 10 C stehengelassen und danach durch einen weiteren- Reaktor mit immobilisierter Hefe ge-

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leitet rait einer solchen Geschwindigkeit^ daß die Verweilzeit 5 Stunden betrug« Der Gehalt an freiem und gebundenem Diacetyl betrug danach 0,05 bzw* OyIO ppm« Daraufhin wurde die Temperatur auf -1 C gesenkt, und nach zweitägigem Stehen bei dieser Temperatur wurde das fertige Bier vom Niederschlag abgegossen und abschließend filtriert»

Beispiel 3

Diskontinuierliche Gärung und schnelle Reife von Bier unter Verwendung von Acetolactat-Raduktoisomerase

1 Liter sterile Bierwürze wurde mit Saccharomyces carlsbergensis wie in Beispiel 1 gegoren» Nach der Hauptgärung von 6 Tagen wurde der Gehalt an freiem und gebundenem Diacetyl im Bier bestimmt und 0,10 bzw» 0·,.51 ppm gefunden*.Das Bier wurde danach vom Hefeniederschlag dekantiert und 100 ml "Kreuzen" wie in Beispiel 1 zugegeben» Dazu wurden 100 mg einer o£-Acetolactat-Redukto— isomerase aus E_# coli, wie sie von Η, £» Utnbarger und E«, D. Eyring in Oournal of Biological Chemistry 255V S. 1425-1432 beschrieben wird* gegeben, Das Bier wurde · dann weitere 24 Stunden bei 10 C stehengelassen. Danach betrug der Gehalt an freiem und gebundenem Diacetyl 0,03 ppm bzw* Q>;09 ppm» Das Bier wurde danach auf -1 C abgekühlt _t: weitere 2 Tage bei dieser Temperatur stehengelassen und das fertige Bier danach filtriert*

Claims (11)

Q Λ / Π Ο Q 3.12.1981

1, Verfahren zur Herstellung von gärungsalkoholischen Produkten mit niedrigem Diacetylgehalt durch Gärung eines
Kohlenhydrate enthaltenden Substrates mit Mikroorganismen; gekennzeichnet dadurch* daß das gärende oder gegorene Substrat mit einem Acetolactat umwandelnden
Enzym während oder nach der Gärung behandelt wird»

2» Verfahren nach Punkt I₁ gekennzeichnet dadurch* daß das Acetolactat umwandelnde Enzym eine Acetolactat-Decarboxylase ist.

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3« Verfahren nach Punkt 2-, gekennzeichnet dadurch, daß eine aus dem Mikroorganismus Aerobacter aerogenes gewonnene
Acetolactat—Decarboxylase verwendet wird.

4* Verfahren nach Punkt l_t gekennzeichnet dadurch, daß das Acetolactat umwandelnde Enzym eine Isomerase ist.

5· Verfahren nach Punkt 1γ gekennzeichnet dadurch, daß das Acetolactat umwandelnde Enzym eine Redukto-Iso'raerase ist»

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6» Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5» bei dem das
Substrat einer Hauptgärung und einem Reifeprozeß unterworfen wird» gekennzeichnet dadurch, daß die Behandlung mit dem Acetolactat umwandelnden Enzym während des Reifeprozesses durchgeführt wird*

7_# Verfahren nach Punkt 6v gekennzeichnet dadurch,, daß das Substrat Bierwürze ist.

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8» Verfahren nach Punkt 6 zur Herstellung von Wein>_; gekennzeichnet dadurch,: daß der Reifeprozeß eine Apfelsäure—Milchsäure-Gärung darstellt, und daß während seiner Dauer die Behandlung mit dem Acetolactat umwandelnden Enzym erfolgt«

9* Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3$, gekennzeichnet dadurch,; daß das Acetolactat umwandelnde Enzym in immobilisierter Form verwendet wird*

10» Verfahren nach Punkt 9y gekennzeichnet dadurch,, daß das Enzym in einer gemeinsam mit Hefe immobilisierten Form verwendet wird,

11, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurchy daß Acetolactat-üecarboxylase in chemisch modifizierter Form verwendet wird, um hohe Stabilität und/oder optimale Aktivität in einem pH-Bereich zwischen 4 und zu erzielen*