DD202045A5

DD202045A5 - Verfahren zum klonieren einer deoxynucleotidsequenz

Info

Publication number: DD202045A5
Application number: DD80234741A
Authority: DD
Inventors: John D Baxter; Howard M Goodman; Joseph A Martial; Robert A Hallewell
Original assignee: Univ California
Priority date: 1979-06-01
Filing date: 1980-06-02
Publication date: 1983-08-24
Also published as: KR860001515B1; KR830002871A; DE3066256D1; IE801137L; IE50378B1; DD202046A5; ES492044A0; PH21531A; BG41134A3; CA1194432A; AR248049A1; DD154022A5; PT71323A; GR68404B; JPH0630582B2; PL224664A1; RO79982B; ES499045A0; FI801743A7; AU5892680A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Klonierungsverfahren einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Pre-Wachstumshormon codiert. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von menschlichem Wachstumshormon fuer therapeutische Zwecke. Das Verfahren laeuft ueber die Stufen: Isolieren von mRNS aus Hypophysengewebe, Synthesieren von cDNS aus mRNS, Umsetzen von cDNS mit einem linearen DNS-Molekuel, Transformieren mikrobieller Wirtszellen mit den Reaktionsprodukten, Isolieren der Kolonien einer transformierten Zelle; und ist gekennzeichnet dadurch, dass die mRNS-Quelle menschliches Hypophysengewebe ist u. eine menschliches Pre-Wachstumshormon codierende Deoxynucleotidsequenz durch die charakteristische Laenge der Schnittprodukte, die man nach Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease erhaelt, festgestellt wird.

Description

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** ' 22.9.1981

' Ausscheidungsanmeldung APC12N/221 521(57 593 12)

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Verfahren zum Klonieren einer Deoxynix&eotidsequenz Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Klonierungsverfahren einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Pre-'fachstumshormon codiert. Das erhaltene klonierte Gen ist bei der Herstellung von menschlichem Wachstumshormon.für therapeutische Zwecke einsetzbar.

Bekannte technische Lösungen

Wachstumshormon wird prinzipiell durch den Hypophysen-vorderlappen produziert. Das Hormon wird normalerweise über die gesamte Lebenszeit produziert, die höchsten Mengen .jedoch während der Kindheit. Obgleich der Herstellungsmechanismus noch nicht im Detail verstanden wird, ist das Wachstumshormon dafür bekannt, Glukose und den Fettstoffwechsel zu beeinflussen und die Proteinsynthese zu beschleunigen.

Es sind eine Vielzahl von klinischen Störungen bekannt, die mit dem Wachstumshormonmangel einhergehen. Schwerwiegende Fälle von Zwergwuchs sind überall mit menschlichem Wachstumshormon behandelt worden, das aus Leichen isoliert wurde. Da die meisten Wachstumshormone von Nicht-Primaten beim Menschen nicht wirksam sind, gibt es keine alternative Quelle. Die Materialmenge ist sehr gering, und die'¹ Isolierung

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und Reinigung ist umfangreich und kostspielig.-Pro Jahr und Patient werden die Kosten auf ca. 5 000,00 U# geschätzt. Die Behandlung des Wachstumshormonmangels wurde daher auf die schwerwiegenden Fälle "beschränkt» Für mehr als 1000 neue Patienten im Jahr ist eine Behandlung erforderlich. Wenn eine ausreichende Menge an Hormon zu annehmbaren Kosten erhältlich wäre, könnten zusätzlich schätzungsweise 10 000 Patienten mit weniger schweren Wachstumsmangelerscheinungen oder mit irgendwelchen ande- \_J ren Wachstumsproblemen "behandelt werden.

Zusätzlich ist durch Experimente belegt, daß menschliches Wachstumshormon für die Behandlung von Magen-Darm-Blutungen, für^Knochenbruch- und Wundheilprozesse sowie Knochenstoff weehselkrankheiten nützlich ist.

Das Wachstumshormon ist ein Protein. Die durch konventionelle "Verfahren bestimmte Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Die chemische Synthese dieser Sequenz von 191 Aminosäuren ist durch die bekannten Techniken nicht durchführbar. In der Hypophyse wird das auslösende biosynthetische Prot ) dukt als Pre-Wachstumshormon bezeichnet und enthält zusatz-

lieh zu der in Tabelle 1 aufgeführten Sequenz eine Sequenz mit 26 Aminosäuren, die als Signalpeptid bezeichnet wird und am Aminoterminalende angesetzt ist. Die Signalpeptidsequenz ist:

-26 -20 -15

IH^Met-Ala-Thr-Gly-Ser-Arg-Thr-Ser-Leu-Leu-Leu-Ala-Phe-Gly-

-10 -5 -1

' keu-Leu-Cys-Leu-Pro-Trp-Leu-Gln-Glu-Ala-Val-Pro.

Das Signalpeptid mit 26 Aminosäuren hat die Aufgabe, durch Verleihen der Fähigkeit in die Zellenmembran einzudringen und.sie zu durchdringen, die Abscheidung des Proteins aus

λ 7

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der Zelle, in der es synthetisiert wurde, zu ermöglichen (siehe Blobel, G. et al. J. Gell- Biol. 67,- 835 (197?).)

Verschiedene Stufen von Signalpeptiden sind dafür "bekannt, daß sie eucaryotische Proteine durch die Membranbarrieren hindurch transportieren. In einem zellfreien System wurde ein spezifisches Spalt "beobachtet, das die Peptidbindung zwischen dem Signalpeptid und dem aktiven Protein in Verbindung mit dem Passieren der Zellmembran hydrolysiert (siehe Blobel, G. et al., Proc. Nat. Acad. Ca. USA 75, 361 (1978).

Portschritte der Biochemie und bei der DNS-Eekombinationstechnologie in jüngster Zeit haben es ermöglicht, die Synthese spezifischer Proteine unter kontrollierten Bedingungen durchzuführen, unabhängig von einem höheren Organismus, aus dem sie sonst normalerweise isoliert wurden. Derartige biochemische synthetische Verfahren benutzen Enzyme und subzellulare Komponenten-des proteinsynthetisierenden Mechanismus lebender Zellen, entweder in vitro, in zellfreien Systemen oder in vivo, in Mikroorganismen. In jedem Fall ist das Schlüsselelement das Vorhandensein einer Desoxyribonukleinsäure (DNS) mit spezifischer Sequenz, die die notwendigen Informationen zur Spezifizierung der gewünschten Aminosäuresequenz enthält. Eine solche spezifische DNS wird hier als Gen bezeichnet.Das codierte Verhältnis, womit eine Desoxynucleotidsequenz zur Spezifizierung der Aminosäuresequenz eines Proteins eingesetzt wird, ist weiter unten beschrieben und wirkt nach den grundsätzlichen Prinzipien, die das gesamte bekannte Reich der lebenden Organismen erfassen.

Ein kloniert.es Gen kann eingesetzt werden, um die Aminosäuresequenz von Proteinen zu spezifizieren, die in iijvitro Systemen synthetisiert worden sind. DNS-gerichtete protein

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synthetisierende Systeme sind aus dem Stand der Technik "bereits "bekannt, siehe z.B. Zubay, G., Ann. Eev. Genetics 2, 267 (1973). Zusätzlich kann eine Einzel st rang-MTS dazu geführt werden, daß sie als Messenger-BNS in vitro wirkt, was zu einer originalgetreuen Übertragung der DNS-Sequenz führt (Salas, J. et al., J. Biol. Chem. 243, 1012 (1968). Andere Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, können mit den oben genannten Verfahren kom-"biniert werden, um die Ausbeuten zu erhöhen.

J Weiterentwicklungen hei der DNS-Rekombinationstechnologie haben es ermöglicht, spezifische Gene oder Teile davon aus höheren Organismen zu isolieren, z.B. vom Mensehen und anderen Säugetieren, und die Gene oder Genfragmente auf einen Mikroorganismus zu übertragen, wie z."B. Bakterien oder Hefe. Das transferierte Gen wird repliziert und vermehrt wie sich der transformierte Mikroorganismus repliziert Als ein Ergebnis kann der transformierte Mikroorganismus die Fähigkeit erhalten, ein beliebiges Protein, Gen oder Fragment zu verschlüsseln, ob es ein Enzym, ein Hormon, ein Antigen, ein Antikörper oder ein Teil davon ist. Der Mikroorganismus vererbt diese Fähigkeit an seine Nachkommenschaft, so daß die Übertragung tatsächlich zu einem neuen Stamm mit der beschriebenen Fähigkeit führt, siehe beispielsweise Ullrich, A. et al., Science 196, 1313 (1977) und Seeburg, P.H., et al., Nature 270, 486 (1977). Sine Grundvoraussetzung, die die.Anwendung dieser Technologie für die Praxis erlaubt, ist die, daß die DNS aller lebenden Organismen, von Mikroben bis zum Menschen, chemisch ähnlich ist und aus den gleichen vier Nucleotiden besteht. Die wesentlichen Unterschiede bestehen in den Sequenzen dieser Nucleotide in dem polymeren DNS-Molekül. Die Nucleotidsequenzen werden dazu eingesetzt, die Aminosäuresequenzen des dem Organismus -angehörenden Proteins zu spezifizieren. Obgleich die meisten Proteine verschiedener

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Organismen voneinander abweichen, ist das Codierungsverhältnis zwischen Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz für alle. Organismen grundsätzlich gleich. Beispielsweise findet man die gleiche Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz von HGH in menschlichen Hypophysezellen codiert, "bei der Übertragung auf einen Mikroorganismus als Codierung für die gleiche Aminosäuresequenz. Hierin benutzte Abkürzungen sind in Tabelle-2 aufgeführt. Die CοdierungsbeZiehungen zwischen der Nucleotidsequenz in der DNS und der Aminosäuresequenz im Protein sind insgesamt als der in Tabelle 3 aufgeführte genetische Code bekannt.

Pur die vorliegenden Zwecke ist die Tatsache ein wesentliches Merkmal des Codes, daß jede Aminosäure durch eine Trinucleotidsequenz spezifiziert wird, bekannt auch als ein Nucleotid-Triplet. Die Phosphodiesterbindungen, die die benachbarten Triplets miteinander verbinden, sind chemisch von allen anderen internucleotiden Bindungen in. der DUS nicht unterscheidbar.. Daher kann die Nucleotidsequenz nicht als Code für eine einzige Aminosäuresequenz gelesen werden ohne zusätzliche Informationen zur Bestimmung des Ableserahmens (reading frame). Letzteres ist der Begriüf, der verwendet wird, um die Gruppierung von Triplets zu bezeichnen, die bei der Decodierung der genetischen Botschaft durch die Zelle eingesetzt werden.

Eine Reihe von DNS-Rekombinationstechniken weaen zwei Klassen von Verbindungen an, Transfervektoren und Restriktionsenzyme, was diskutiert wird. Ein Transfervektor ist ein DNS-Molekül, das unter anderem die genetische Information enthält, die seine eigene Replikation sichert, wenn es auf ein Wirts-Mikroorganismusstamm übertragen wird. Beispiele von Transfervektoren, die üblicherweise in der bakteriellen Genetik eingesetzt werden, sind Plasmide und die

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DNS bestimmter Bakteriophagen . Obgleich Plasmide als Transfervektoren für die hier vorliegende Erfindung verwendet wurden, können selbstverständlich auch andere Arten von Transfervektoren eingesetzt werden.

Plasmid ist der benutzte Begriff für eine selbständig replizierende DNS-Einheit, die in einer mikrobiellen Zelle gefunden werden kann_f anders als das Genom der Wirtszelle selb st .-E in Plasmid ist nicht genetisch mit' dem Chromosom der Wirtszelle verbunden. Plasmid DNS existieren als Doppelstrang-Ringstrukturen im allgemeinen in der Größenordnung einiger Millionen DaItons Molekulargewicht, obgleich

einige größer als 10 Daltons an Molekulargewicht sind. Sie repräsentieren üblicherweise nur einen kleinen Prozentsatz der Gesamt-DNS der Zelle. Die Transfervektor-DNS ist üblicherweise von der Wirtszellen-DNS infolge der erheblichen Größendifferenz zwischen beiden abtrennbar. Die Transfervektoren tragen die genetische Information, die sie in die Lage versetzen, sich innerhalb der Wirtszelle zu replizieren, in den meisten Fällen unabhängig von der Rate der Wirtszellteilung. Einige Plasmide haben die Eigenschaft, daß ihre Replikationsrate d¹¹¹"⁰^ &en Forscher mit Hilfe von Variationen in den Wachstumsbedingungen gesteuert werden kann. Plasmid-DNS existiert als ein geschlossener Ring. Der Ring kann allerdings durch entsprechende Techniken geöffnet werden, ein Fragment einer heterologen DNS eingesetzt,' und der Ring wieder geschlossen werden, um so ein vergrößertes Molekül zu bilden, das das eingefügte DNS-Segment mit enthält. Bakteriophagen-DNS kann ein Segment einer heterologen DNS aufnehmen, das anstelle einzelner nicht-essentieller Phagen-Gene eingesetzt wurde. Der Transfervektor dient jedenfalls als Träger oder als Vektor für ein eingesetztes Fragment einer heterologen DNS.

Der Transfer wird über ein Verfahren realisiert, das als Transformation bekannt ist. Während der Transformation

yt i?y3

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nehmen die mit der_Plasmid-DNS vermischten Bakterienzellen die gesamten Plasmidmoleküle in die Zellen auf. Obgleich der Verfahrensahlauf unklar bleibt^ ist es mit Hilfe empirisch gefundener Behandlungsmethoden mSglich, den Anteil von Bakterienzellen zu maximieren, die in der lage sind, Plasmid-DNS aufzunehmen und folglich transformiert werden.

Wenn einmal eine Zelle ein Plasmid aufgenommen hat, wird letzteres in der Zelle repliziert, und das replizierte Plasmid wird hei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. In den Nucleotidsequenzen der Plasmid-DHTS enthaltene genetische Informationen können prinzipiell in den Wirtszellen ihren ^Ausdruck" finden. Es ist charakteristisch, daß eine transformierte Wirtszelle durch ihre erworbenen Merkmale bestimmt wird, die durch das Plasmid getragen werden, wie z.B. Widerstandsfähigkeit gegen bestimmte Antibiotika. Verschiedene Plasmide sind durch unterschiedliche Fähigkeiten oder die Kombination von Fähigkeiten bestimmbar_?* in der sie enthalten sind. Irgendein gegebenes Plasmid kann quantitativ hergestellt werden durch Wachstum einer reinen. Zellkultur, die das Plasmid enthält und anschließendes Isolieren der Plasmid-DNS.

Restriktionsendonucleasen sind hydrolytische Enzyme, die in der Lage sind, katalytisch die DNS-Moleküle lagespezifisch zu zerschneiden. Der Angriffsort der Restriktionsendonuelease ist durch die Exist enz einer spezifischen Nucleotidsequenz bestimmt. Eine solche Sequenz wird als Erkennungssequenz

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oder -stelle (recognition site) für die Restriktionsendonuclease bezeichnet. Es wurden Restriktionsendonucleasen aus einer Vielzahl von Quellen isoliert und durch Begriffe charakterisiert, die aus der Nucleotidsequenz ihrer Erkennungsstelle resultieren. Einige Restriktionsendonucleasen hydrolysieren Phosphodiesterbindungen an beiden Strängen an dem gleichen Punkt unter Bildung von glatten Enden (blunt ends).

+) die sie der Wirtszelle übertragen

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Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, abgetrennt durch einige Nucleotide voneinander., unter Bildung von freien einzelsträngigen Regionen an jedem Ende des zerschnittenen Moleküls. Solche einzelsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und können "benutzt werden, die hydrolysierte DNS wieder einzubinden. Da einige DNS, die zur Spaltung durch ein.= derartiges Enzym neigen, die gleiche Erkennungssequenz enthalten müssen, werden die gleichen kohäsiven Enden hergestellt, so daß es möglich ist, heterologe DNS—Sequenzen, die mit Restriktionsendonuclease behandelt worden sind, mit anderen, ähnlich behandelten Sequenzen zu verbinden, siehe Roberts, R.J., Crit. Rev. Biochem. 4, 123 (1976).

Restriktionsstellen sind relativ selten, jedoch hat sich die generelle Einsetzbarkeit von Restriktionsendonuclease wesentlich durch die Synthese von doppelsträngigen Oligonucleotiden erweitert, die die Restriktionsstellensequenz tragen. Daher kann praktisch irgendein Segment der DNS an irgendein anderes Segment einfach durch Befestigung des entsprechenden Restriktionsoligonucleotids an den Enden des Moleküls angekoppelt werden. Anschließend, wird das Produkt einer hydrolytischen Einwirkung der entsprechenden Restriktionsendonuclease unterworfen, wobei die erforderlichen kohäsiven Enden entstehen., siehe. Heyneker, H.L., et al., Nature 263, 748 (1976) und Scheller, R.H. et al., Science 196, 177 (1977). Ein wesentliches Merkmal der Verteilung der Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen ist die Tatsache, daß sie zufällig im Hinblick auf den Ableserahmen verteilt sind. Dementsprechend kann die Spaltung durch die Restriktionsendonuclease zwischen benachbarten Codons eintreten, oder sie kann innerhalb eines Codons erfolgen. Allgemeinere Methoden für die DNS-Spaltung oder für die End-Sequenzmodifikation sind verfügbar. Eine Vielzahl von unspezifischen Endonucleasen kann eingesetzt werden, um die DNS zufällig zu spalten, wie das weiter unten ausgeführt wird.

j -τ ,-.ι η\; j η η π ~- O ίϊ Ci -~

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Die Bndsequenzen können durch das Hervorbringen von Oligonucleotidbegrensungen'mit dA an einem Ende und dT am anderen oder mit dG und dC modifiziert werden, wodurch Restriktionsstellen ohne die Notwendigkeit für spezifische Yerbindungssequenzen ausgebildet werden, wenn die Enden verbunden werden·

Der Begriff "Ausdruck" (expression) wird in Erkenntnis der Tatsache verwendet, daß ein Organismus selten, wenn überhaupt, alle seine genetisch vorhandenen Fähigkeiten zu irgendeiner gegebenen Zeit einsetzt. Gerade in relativ einfachen Organismen, wie Bakterien, werden viele Proteine nicht synthetisiert, die die Zelle in der lage ist zu Γ synthetisieren, obgleich sie unter entsprechenden Umweltbedingungen synthetisiert werden können. Wenn das Protein— produkt, das durch ein gegebenes Gen codiert ist, durch den Organismus synthetisiert worden ist, hat ias Gen seinen "Ausdruck" gefunden. Wenn das Proteinprodukt nicht hergestellt wird, hat das Gen seinen "Ausdruck" nicht gefunden.. Normalerweise wird der "Ausdruck" der Gene in S. coli reguliert, wie das weiter unten allgemein beschrieben wird, in derartiger Weise, daß Proteine; deren Funktion in einer gegebenen Umgebung nicht nützlich ist, auch nicht synthetisiert werden, und die StoffWechselenergie konserviert wird. ....

Die Mittel, mit denen der Gen"ausdruck" in E.coli gesteuert wird, beherrscht man als Resultat extensiver Studien während der letzten zwanzig Jahre, siehe allgemein Hayes, W., The Genetics of Bacteria and their Viruses, 2. Aufl., John Wiley & Sons, Inc., New York (1968) und Watson, J.D., The Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., Benjamin, Menlo Park, Kalifornien (1976). Diese Studien haben gezeigt, daß verschiedene Gene, üblicherweise solche, die zum Codieren von Proteinen dement sprechende Tätigkeiten in der Zelle ausführen, in kontinuierlichen Sequenzen vereinigt gefunden werden. Die Vereinigung wird als Oparon bezeichnet. Alle Gene in dem Operon werden in der gleichen

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Richtung kopiert, beginnend mit den Codons, die die N-terminale Aminosäure des ersten Proteins in der Sequenz codiert und bis zum C-terminalen Ende des"letzten Proteins in dem Operon. Am .Anfang des Operons, unmittelbar am N-terminalen Aminosäurecodon,. gibt es einen Bereich der DNS, der als Steuerbereich bezeichnet wird und eine Vielzahl von Steuerelementen enthält, einschließlich des Operators,-des Promotors und-Sequenzen für die ribosomalen Verbindungsstellen. Die Aufgabe dieser Stellen ist es, den "Ausdruck" solcher Gene unter ihrer Steuerung zu gestatten, die für die Erfordernisse des Organismus verantwortlich sind. Zum Beispiel werden solche Gene, die Enzyme codieren, die ausschließlich für die Verwertung von Lactose erforderlich sind, normalerweise nicht in beträchtlichem Maße "ausgedrückt", bevor nicht Lactose oder eines seiner Analoge tatsächlich in dem Medium vorhanden ist. Die Punktionen des Steuerungsbereiches müssen für den "Ausdruck" vorhanden , sein, um.die Initiierung des Kopierens (transcription) und des Übertragens (translation) zu veranlassen. Der "Ausdruck" des ersten Gens in der Sequenz wird in Gang gesetzt durch das Initiieren des Kopierens und des Übertragens an der Position, die die N—t.erminale Aminosäure des ersten Proteins des Operons codiert. Der "Ausdruck" jedes Gens abwärts von diesem Punkt wird im weiteren Verlaufe ebenfalls initiiert, zumindest bis ein Endsignal oder ein anderes Operon mit seinem eigenen Steuerungsbereich erreicht ist, der so verschlüsselt ist, daß er auf andere Umweltfaktoren reagiert. Von diesem allgemeinen Schema gibt es im Detail eine Vielzahl von Varia'tionen, wobei der wesentliche Pakt der ist, daß ein Gen, das in einem Procaryoten wie S. coli "ausgedrückt" Wirt, im Hinblick auf einen Steuerungsbereich mit Kopierinitiationfunktionen und Übertragungsinitiatorfunktionen genau angeordnet sein muß.

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Es wurde gezeigt, daß Gene, die normalerweise nicht Teile eines gegebenen Operons sind, in das Operon eingesetzt und von ihm gesteuert werden können. Die klassische Darstellung erfolgte durch Jacob, F., et al. J. Mol. Biol. 13, 704 (1965). In diesem Experiment wurden enzymcodierende Gene, die in eine Purinbiosynthese einbezogene Enzyme codieren, auf einen Bereich übertragen, der durch das Lactoseoperon gesteuert wurde. Es wurde dann beobachtet, daß der "Ausdruck" des Purinbiosynthese-Enzyms in Abwesenheit von Lactose oder eines lactoseanalogen unterdruck wurde und auf Umwelteinflüsse, die normalerweise seinen '''Ausdruck" hervorrufen, nicht wieder erfolgte.

Zusätzlich zu dem Operatorbereich, der die Initiierung der Kopierung des Gens in Abwärtsrichtung reguliert, existieren bekanntermaßen Codons, die als Stop-Signal wirken und das C-terminale Ende eine gegebenen Proteins anzeigen (Siehe Tabelle 2). Derartige Codons sind als Terminalsignale und ebenfalls als "Unsinn"-(nonsense)codons bekannt, da sie eine Aminosäure nicht normal codieren. Die Herausnahme eines Terminalsignals zwischen strukturellen Genen eines Operons führt zu einem fusionierten Gen, was zur Synthese eines chimeren Proteins führen kann, das aus zwei Aminosäuresequenzen besteht, die durch benachbarte Gene codiert und durch^ine Peptidbindung verbunden sind. Derartige cbimere Gene werden synthetisiert, wenn Gene fusioniert werden, was durch Benzer, S. und Champe,S. P., Proc. Nat.Acad.,Sci.USA 48 , 114 (1962) demonstriert wurde.

Ein gegebenes Gen wurde isoliert, gereinigt und in einen Transfervektor eingesetzt. Das ganze Verfahren, das als Klonieren des Gens bezeichnet wird, führt zu einer wesentlichen Quantität, Das klonierte Gen wird in einen geeigneten Mikroorganismus übertragen, worin sich das Gen so repliziert, wie sich der Mikroorganismus fortpflanzt, und aus dem das Gen durch übliche Mittel zurückisoliert werden kann. Dadurch

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entsteht eine sich kontinuierlich erneuernde Quelle von Genen für weitere Manipulationen, Modifikationen und Übertragungen auf andere Vektoren oder Orte innerhalb des gleichen Vektors. '

Einen "Ausdruck" erhält man durch Übertragen des klonierten Gens bei genauer Orientierung und mit Hilfe eines "Ableserahmens¹¹ in einen Steuerungsbereich derart, daß das Ablesen durch das procaroytische Gen zu einer Synthese eines chimeren Proteins führt, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch das klonierte Gen codiert ist. Eine Vielzahl von Protein-Schneidetechniken kann zur Zerschneidung des chimeren Proteins an einem gewünschten Punkt' eingesetzt werden, so daß die gewünschte Aminosälresequenz freigesetzt wird, die dann auf übliche Weise gereinigt wird. Techniken für den Aufbau eines "Ausdrucks"-Tranfervektors mit dem klonierten Gen in genauer Nebeneinanderstellung mit einem Steuerungsbereich sind beschrieben worden von Polisky, B., et al., Proc.Nat. Acad.Sci. USA 7J3, 3900 (1976); Itakura, K., et al., Science 1.98 , 1056 (1977); Villa-Komaroff, L., et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 75, 3727 (1978); Mercereau-Puijalon, 0., et al., Nature 275, 505 (1978); Chang, A. C.Y., et al., Nature 275, 617 (1978) und in der US-Patentanmeldung Nr. 933 035 von Kutter, et al., wobei die hier mit eingeschlossene genannte Anmeldung durch Hinweise gekennzeichnet ist.

Insgesamt erfordert ein Verfahren zur Herstellung eines Säugetierproteins, wie menschliches Pre-Y/achstumshormon, mit Hilfe der DNS-Bekombinanttechnik das Klonieren eines Säugetier-Gens. Einmal kloniert, kann das'Gen in bestimmten Mengen produziert werden, unter Einsatz chemischer oder enzymatischer Mittel modifiziert und auf ein "Ausdrucks"-Plasmid übertragen werden. Das klonierte Gen ist ebenso für die Isolierung damit in Beziehung stehender Gene geeignet, oder, wenn ein Fragment kloniert worden ist, für die Isolierung des gesamten Gens unter Einsatz des klonierten

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Gens als Hybridisierungs"fühler". Weiterhin ist das klo- . nierte Gen bei der Prüfung der Identität oder der Homologie von unabhängigen Isolaten des gleichen oder mit diesem in Verbindung stehender Gene durch Hybridisierung nützlich. Wegen der Natur des genetischen Codes wird das klonierte -Gen-, wenn es in den genauen "Ableserahmen"^: übertragen ist, die Produktion nur auf die Aminosäuresequenz ausrichten, für die es codiert ist und auf keine andere«

Das klonierte Gen für menschliches Pre-Waehstumshormon ist für eine Vielzahl von Yerfahrennützlich. Die Transponierung auf einen "Ausdrucks"-Transfervektor erlaubt die Synthese von Pre-Wachstumshormonen durch einen Wirts-Mikroorganismus, übertragen mit dem Yektor, der das klonierte Gen trägt. Das Wachstum des transformierten Wirts führt zu einer Synthese des Pre-Wachstumshormons als Teil' eines chimeren Proteins. Wenn der procaroytische Teil des chimeren Proteins der Signalteil eines ausgeschiedenen; oder anderweitig abgesonderten Wirtsproteins ist, kann die Ausscheidung oder Absonderung erfolgen, wodurch die Stabilität wesentlich vergrößert und die Reinigung des Pre-Wachstumshormonchimeren erleichtert wird. Zusätzlich wird, wenn der procaroytische Teil kurz ist, die Absonderung von dem procaroytischen Y/irt durch die Pre-Sequenz selbst erleichtert, wenn die Pre-Sequenz in dem procaroytischen Wirt so wirkt, wie sie es in der eucaroytischen Zelle tut. Das klonierte Gen ist weiterhin bei Hybridisierungstechniken für die Isolöacung genetischen Materials mit partieller Sequenzhomologie nützlich. Die Wachstumshormon-Gene anderer Säugetierspecies sind in dieser Weise isolierbar, da, abgesehen von ihrem Mangel an physiologischer Kreuzaktivität, für die effektive Hybridisierung eine ausreichende Sequenz ähnlich vorkommt. Die Wachstumshormone verschiedener tierischer Species sind für landwirtschaftliche und Veterinäre Zwecke einsetzbar. Das Wachstumshormongen eines individuellen menschlichen Patienten

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ist durch die Hybridisierungstechnik isolierbar zwecks Analyse und Behandlung einer spezifischen Wachstumsstörung.

Das klonierte Pre-Wachstumshormon-Gen kann in einer Vielzahl von Verfahren für die Herstellung von Pre-Wachsturnshormon verwendet werden. Pre-Wachstumshormone selbst sind nützlich, da sie durch bekannte enzymatisch^ und chemische Verfahren in Wachstumshormone selbst umgewandelt werden können. Beispielsweise kann die Pre-Sequenz durch ein gangbares enzymatisches Verfahren entfernt werden, wie das von Blobel, G. weiter oben spezifisch für die Entfernung von Signalpeptiden beschrieben wurde.

Ziel der Erfindung

Es ist Ziel der Erfindung, menschliches Wachstumshormon für therapeutische Zwecke zu entwickeln.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die A-ufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Klonieren einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Pre-Wachsturnshormon codiert, bereitzustellen.

Die-,Struktur der klonierten cDNS wurde durch ETucleotid-Sequenzanalyse nachgewiesen·

Die Originalquelle des genetischen Materials ist menschliches Tumorgewebe aus der Hypophyse, das operativ gewonnen wurde. Vorzugsweise wird das genetische Material aus den Zellen eines menschlichen Individuums isoliert und eine spezielle erfindungsgemäße Technik angewandt, das Gen aus dem menschlichen Tumor zu klonieren.

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Aus den Zellen wurde Messenger-RUS isoliert und partiell durch Chromatographie und Sedimentation gereinigt. Aktive Fraktionen wurden identifiziert durch ihre Fähigkeit, die Synthese eines Proteins von ca. 200 Aminosäuren in einem zellfreien Synthesesystem zu leiten, was durch Gel-Elektrophorese bewiesen werden konnte.

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B-. · *4 ISu der isolierten Messenger-BNS (cDNS) wurde DNS unter Verwendung einer Umkehr-Transkriptase in zwei Beak- ·. tionszyklen synthetisiert, um zu einer doppelsträngigen cDNS .zu gelangen, wie das im Detail weiter unten "beschrieben wird. Das heterogene._Eeaktionsprodukt, bestehend aus Ümkehr-Transkriptase und Doppelstrang-DNS wurde naoh länge duroh Gel-Elektrophorese fraktioniert. JHir die weiteren Untersuchungen wurde der Bereich der DNS-Wanderung ausgewählt, der bei etwa 800 Basenpaaren in der Länge lag. Der Hauptteil der cDNS mit 800 Basenpaaren wurde für das Codieren des Wachstumshormons eingesetzt, indem er mit den Restriktionsendonucleasen PvuII und BgIII getrennt behandelt - wurde. Es ist bekannt, daß PvuII Wachstumshormon cDNS zerschneidet, wobei man ein ca. 495-Basenpaarfragment erhält. Von BgIII ist bekannt, daß es eine Schnittstelle innerhalb dieses fragments hat. Nach der Zerschneidung und Fraktionierung der erwarteten Teile erhält man die Charakteristik der Wachstumshormon-cDNS.

Die nicht zerschnittene, heterogene, doppelsträngigecDNS von annähernd 800 Basenpaaren Länge wurde behandelt, um spezifische Verbinder— öligonucleotide^*- Sequenzen an jedem Ende zu erzeugen, um den Einsatz an einer Stelle gleicher Bestriktionsspezifität einem Transfervektor^ zu erleichtern.

Zum Elonieren wurde ein Transf.ervektor ausgewählt, der eine gute Selektivität und stabile'Eeplikationseigenschaften aufwies. Die behandelte 800-Basenpaar-cDNS wurde unter Verwendung allgemein üblicher Techniken in einen Transfervektor an einer vorbestimmten Stelle der Vektor-DNS eingesetzt, um einen Eekombinant-Transfervektor zu bilden.Wirt-Mikroorganismuszellen wurden mit dem Bekombinantvektor transformiert. Entsprechend den Kriterien für den Einsatz an der vorherbestimmten Stelle wurden Transformierungsmittel ausgewählt.

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Einzelne Kolonien, jede von einer einzeln transformierten Mikroorganismuszelle herrührend, wurden aufgenommen und in individuellen Kulturen wachsen gelassen, um die Seplikation der Rekombinant-Transfervektor-DNS-Klone zu ermöglichen. Dann wurde die Transfervektor-DNS isoliert und über Platten-Gel-Elektrophoresereihen laufen gelassen, um Transfer-Vektoren korrekter Größe herauszusuchen und Defekte sowie Fehlstellen zu eliminieren.

V,; Die Kolonien, die die Rekombinant-Transfervektor-DNS von

entsprechender Größe lieferten, ließ man in größeren ( Einzelkulturen wachsen, um die Transfervektör-DNS zu isolieren und die DNS der Restriktions-Snzymanalyse auszusetzen. „Die in den Transfervektor eingesetzte DNS kann für jedes Klon identifiziert werden durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym, das für die Zerschneidung an der Einsatzstelle verwendet wird, sowie durch die Enzyme PvuII und Bg 1,11, mit denen die Wachstuiashormon-cDNS ein Fragment von charakteristischer Größe ergibt. Ein ELon, das alle Erfordernisse zufriedenstellend erfüllt, wurde für die genaue Identifizierung der Nucieotidsequenz des klonierten Pre-Wachstumshormonsgens ausgewählt und für die Übertragung auf ein entsprechendes "Ausdrucks"-Plasmid.

Wachstumshormon wird bei normalen Individuen ausschließlich im Hypophysenvorderlappen synthetisiert. Im Prinzip konnte das Gen für das Wachstum shormon aus Gewebe isoliert werden. Allerdings gibt es im menschlichen Wachstumshormongen Zwischensequenzen, die in der normalen eucaroytischen Umgebung kopiert und dann aus dem Prozeß ausgeschleust werden, um die "reife" mRNS ohne Zwischensequenzen zu ergeben. Eine Desoxynucleotidsequenz, die in eine procaroytische Zelle, wie ein Bakterium, übetragbar ist, kann solche Zwischensequenzen nicht enthalten, da man von procaroytischen Zellen erwartet, daß sie solche Sequenzen

um; jn on * Q < >.( > f< λ -·

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übertragen und so zu einem Anwachsen an unerwünschtem Proteinprodukt^rführen. Als praktisches Erfordernis muß - ^- daher die Desoxynucleotidsequenz von der Messenger-RITS abgeleitet werden, die aus aktiv das Wachstumshormon synthetisierenden Zellen isoliert wird.

-Die Haupt züge fü-r das Elonieren einer eDNS, die ein gegebenes Protein codiert, ausgehend von der eurocaroytischen Messenger-EliS, wurde von Ullrich, A., weiter oben, und Seeburg, P.H., et al., ebenfalls weiter oben schon zitiert, beschrieben. Kurz zusammengefaßt besteht das Verfahren aus folgenden Schritten: 1) Isolieren der polyadenylierten BUS, im wesentlichen nicht abgebaut, aus differenzierten Zellen oder Gewebe, die das gewünschte Protein produzieren, 2) Synthese eines DNS-Stranges, komplementär in Basen-Sequenzen zur isolierten SIiS unter Verwendung von Umkehr—Transkriptase und Erhalten eines BIiS-DNS-Hybrids, 3) selektiver Abbau des BÜS-Teiles des Hybrids unter Zurückbleiben einer einzelsträngigen cDNS, 4) Synthese der zu der einzelsträngigen cDIfS komplementären DNS zwecks Ausbildung einer doppelsträngigen cDNS, 5) Fraktionieren der doppelsträngigen cDNS, um Moleküle in der gewünschten Größenordnung anzureichern, 6) Herstellung eines ausgewählten Transfervektors für die Einpflanzung der cDHS, 7) kovalentes Verbinden der cDItfS mit dem Transfervektor unter Verwendung von DNS-Ligase, um zu einem Bekombinant-Transfervektor zu gelangen und 8) Beplikation des gewünsch- ' ten Bekombinant-Transfervektors durch Transformation, Selektion und Wachstum eines geeigneten Wirts-Mikroorganismus-Stammes.

Hypophysenzellen können entweder aus menschlichen Hypophysenlappen erhalten werden durch transphenoidale ^!^ypo physektomie oder aus einer,in Kultur aufgezogenen menschlichen Hypophysen-Tumorzelle. Die aus einer der beiden Quellen

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isolierte RNS'wird partiell gereinigt, um die Endausbeute zu--erhöhen"und- als Schablone für die Kopierung in die cDNS eingesetzt. Die Partiaireinigung kann eine Sedimentation in einem Saccharosegradienten sein, um die entweder zu kleine oder zu große UNS zu entfernen. Zusätzlich kann eine Keinigung~durch~Chromatografie über SligodT-Zellulose erfolgen, um die polyadenylierte RNS zu isolieren, die die Hauptform der Messenger-RNS in eurocaroytischen Zellen darstellt.

Partiell gereinigte Messenger-MS kann als Schablone für den Aufbau von cDNS unter Verwendung des Enzyms Umkehr-Transkriptase,verwendet werden^ Die Bildung von doppel— strängiger cDNS unter.Verwendung von Umkehr—Transkriptase in Verbindung mit Sl Iluklease und bekannter Trenntechnik wurde bereits vorher beschrieben, (siehe Ullrich, A. et al. Sciene 196, 1313 (1977) und Seeburg, "-P.H. et al., Nature 270, 486 (1977).) Das resultierende cDNS-Produkt ist in der Länge heterodispers. Wenn die Nucleotidsequenz· der zu klonierenden cDNS bekannt oder innerhalb vernünftiger wahrscheinlicher Grenzen vorhersehbar ist, und wenn die Restriktionsstellen ziemlich dicht an Anfang und Ende des zu klonierenden Gens angeordnet werden können, sind geeignete Restriktionsenzyme einsetzbar, um das gewünschte cDNS-Produkt in homogener Länge und getrennt von Verunreinigungen unterschiedlicher Sequenzen wiederzugeben. Es ist klar, daß eine derartige Nucleotidsequenzinformation für Gene wie menschliches Pre—WachstumshormJtfnicht brauchbar ist, die vorher nicht isoliert und gereinigt worden sind, ausgenommen sind gewisse Ausnahme- und Zufallsumstände. Daher müssen alle späteren Schritte generell mit dem heterogenen cDNS-Produkt durchgeführt werden.

Hinreichende Informationen hinsichtlich des Teils der Nucleotidsequenz der menschlichen Wachstumshorrii-cDNS sind

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aus bekannten Daten der US-Patentanmeldung Ser.Nr. 897 von Goodmann et al. zu entnehmen, um die Identifikation der Unterfragmente der Pre-Y/aehstumsliorinon-Gens au ermöglicheηj wie das weiter oben beschrieben wurde. Wegen der bekannten Anzahl von Aminosäuren in menschlichem Wachstumshormon, wurde die ungefähre länge der erwünschten cDNS auf 800 Basenpaare geschätzt. Bei doppelsträngiger cDNS , deren Gel-Elektrophorese-Beweglichkeit etwa 800 Basenpaaren entspricht, wurde gefunden, daß sie nach der Spaltung mit den Restriktionsenzymen PvuII und BgtiI vorwiegend Wachstumshormon'--codierende Sequenzen enthält. Die Übertragung von cDNS auf einen DNS-Transfervektor kann an irgendeiner zufälligen Stelle auf den Vektor erfolgen, bewirkt durch ejLnen einzelnen Endonuclease-Stoß, verbunden mit der Anknüpfung der cDNS durch DNS-ligasekatalysiertes Verbinden der glätten Enden. (Sgaramelle, V. et al, Proc. Nat.Acad.Sci. USA _57, 1468 (1970). Die Selektion wird da durch wesentlich vereinfacht, und die Ausbeuten werden erhöht durch Verwendung einer spezifischen Einsatzstelle, deren Anordnung im Transfervektor bekannt ist sowie durch die Behandlung der eDNS zur Erhöhung der Einsatzspezifität. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Plasmiä-Transfervektor mit einer einzelnen Restriktionsstelle verwendet, die mit einem Markierungs-Gen versehen ist. Die ringförmige Plasmid-DNS wird mit der entsprechenden Restriktions-Endonuclease zerschnitten. Das Verbinden der Enden der cDNS mit den Enden der offenen Plasmid-DNS führt zur BiId¹OiIg eines Rekornbinant-Plasmids mit derjan der Restriktionsstelle eingesetzten cDNS, das Markierungs-Gen wirkungsvoll unterbrechend und dadurch zum Verlust der Punktion des Markierungs-Gens. Beispielsweise enthält das Plasmid pBR322 eine einzige HindIII-Restriktionssteile, die in dem Beschleuniger. des Gens für die Tetracyclinresistenz angeordnet ist.

+) ringförmigen '

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E. coli -Zellen, die durch pBR322 transformiert wurden, ,sind in der Lage,in der Gegenwart von 20/ug/ml Tetracyclin im Wachstumsraeuium zu wachsen und sich zu teilen. Im Gegensatz dazu werden nicht-transformierte Zellen unter gleichen Bedingungen abgetötet. Die durch Rekombinant pBE322 transformierten Zellen, iMe einen._5insatz an der HindIII- SteHs

enthalten, sind nicht in der Lage, in der Gegenwart von 20yug/ml Tetracyclin zu wachsen und sich zu teilen. Das Plasmid pBE322 trägt auch ein Gen, das die Ampicillinre-. sistenz' verleiht. Die-Verbindung dieser beiden genetischen - Kennzeichen ermöglicht die Selektion von transformierten Zellen aus nicht—transformierten durch Wachstum der ersteren'in Gegenwart von Ampicillin und Selektion der derart ~~ transformierten durch Nicht-Bekombinant-pBB322 aus Bekombinant-pBE322 durch Wachstum nur der ersteren in Gegenwart von Tetracyclin.

Die Einsatzspezifität und die Ausbeute an HindiH-SchnittpBE322 wird noch erhöht, wenn Hin_dIII-Verbindungsoligonucleotide an den Enden der heterogenen cDNS angesetzt werden, siehe Scheller, E.H., et al., weiter oben zitiert. Weiterhin werden Nebenreaktionen bei der Bildung des Eekombinant-Transfervektors, wie Eingschluß ohne Einsatz der cDNS oder Dimerisierung, wesentlich durch Vorbehandlung der Enden der Eestriktionsschnitt-Transfervektor-DNS vermindert, und zwar durch Entfernung der 5'-Terminal-Phosphatgruppen. Das wird von Shine in der gleichfalls anhängigen US-Patentanmeldung Ser.Nr. 898 887 beschrieben. In Kombination eingesetzt, ermöglichen die beschriebenen Techniken eine absolute und relative Ausbeuteerhöhung an gewünschten Rekombinant-Transfervektoren.

Bei früheren Klonierungsstudien wurde die cDNS aus Messenger-ENS synthetisiert, die aus vereinigten Zellextrakten verschiedener Individuen herrührte. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, ein kloniertes Gen von einem einzigen Individuum

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zu erhalten. Die Technik verbindet Verringerungen der Größe und des Reaktionsvolumens miteinander., bemüht sich-darum, das Bndprodukt nicht zu zerstören und die Träger-DNS zu eliminieren. Letzterer Vorteil verbessert überraschenderweise die Gesamtausbeute und den Wirkungsgrad der verschiedenen, in diesem Verfahren benutzten enzymkataly-

-sierten'Raktiönen. Die Messenger-RNS wird aus einzelnen"'

Hypophysentumoren nach den entsprechend beschriebenen Verfahren isoliert (Seeburg, et al., weiter oben zitiert). Die Säulenchromatografie-Schritte können in schmalen Glasröhrchen mit herabgezogener Spitze, zum Beispiel in PasteurPipetten durchgeführt werden. Die Reinigung zur Proteinentfernung kann nach irgendeiner der geeigneten Phasentrenntechniken durchgeführt werden, wie die Phenolextraktion, vorzugsweise durch Extraktion mit chloroformgesättigtem Phenol. Die Konzentrierung der Nucleinsäuren durch Fällung mit Alkohol bei niederen Temperaturen, Vorzugsweise durch Äthanolfällung bei - 7O⁰G, kann vollständig erfolgen. Sowohl die Extraktion als auch die Fällung können in einem einzigen Röhrchen ausgeführt werden, vorzugsweise in einem konischen Plastik-Zentrifugenröhrchen von ein bis ζγ/ei ml Gesamtvolumen.

Auch Enzymreaktionen wie die Behandlung mit Umkehr-Transkriptase können in dem gleichen kleinen Reaktionsrohrchen durchgeführt werden. Synthesegrad- und-umfang an einzelsträngiger und doppelsträngiger cDNS werden im allgemeinen durch Einbeziehung eines radioaktiv markierten Atoms in die entstandene cDKA. bestimmt. Ein geeignetes Isotop ist £~ P_7. an der alpha-Position eines der Vorläufer des Fucleosidtriphosphats, zum Beispiel oZ/-- P-dCTP. Die radioaktive Markierung gestattet außerdem eine entsprechende Beobachtung des cDUS-Produktes während des Durchgangs durch die Säulen und auf dem Elektrophorese-Gel. Wo es erforderlich ist,

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eine ganze Reihe von Säulenchromatografie-Fraktionen zu "beobachten, beispielsweise nach der Chromatrografie "bei der Entfernung nichtreagierter Ausgangsprodukte von der Reaktion mit UmkehrTranskriptase, ist am zweckmäßigsten eine Radioassay durchzuführen, wobei das Eeaktionsprodukt nicht zerstört wird. In dem vorliegenden Verfahren werden die Fraktionen, die in den kleinen Plastik-Röhrchen, wie oben beschrieben, gesammelt werden, dicht verschlossen· Die Röhrchen werden dann in Scintilfetionsampullen ohne Scintillationsflüssigkeit gesteckt. Die sich ergebende -Cerenkov-Strahlung kann mit dem entsprechenden Instrumentarium gemessen werden.

Arbeitsweisen mit kleinen DNS-Mengen werden üblicherweise mit Träger-DNS durchgeführt, die dem GLemisch zugegeben werden. Grundlage für die Verwendung von Träger-DNS ist die Verbesserung der Rückgewinnung von gewünschter DNS, die durch unspezifische Adsorption an den Behälterwänden zurückgehalten wird oder wo durch Mangel bei der DNS-Fällung und dergleichen Verluste auftreten. Angemessene DNS-Ausbeuten werden in Abwesenheit von der hinzugesetzten Träger-DNS erhalten, die selbst bei Nanogramm-Mengen an DNS erhältlich sind. Das Weglassen von Träger-DNS bringt zwei entscheidende Vorteile im vorliegenden Verfahren. Erstens ist keine unspezifische DNS vorhanden, die zu unspezifischen Reaktionsprodukten bei den enzymkatalysierten Reaktionen führen könnte. Zweitens ist keine verunreinigende DNS vorhanden, die zu unspezifi— sehen Rekombinant-Transfervektbren führen könnte.

Unter kombinierter Verwendung der beschriebenen Techniken ist es möglich, die Desoxynucleotidsequenz zu klonieren, die menschliches Pre-Wachstumshormon aus der gypophyse eines einzelnen menschlichen Patienten codiert.

Ausführung sbeigsiel

In den folgenden Beispielen werden die Isolierungs- und

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Reinigungsverfahren detailliert beschrieben. Die Identitätsprüfung des klonierten Gens erfolgt durch Uucleotid-Sequenzanalyse.

Beispiel 1

Verfahren zum Klonieren eines Gens, das menschliches Pre-Wachstumshormon aus dem Gewebe eines einzelnen Individuums codiert.

Die Hypophysen von sechs menschlichen Patienten mit Hypophysentumoren vmrden durch transphenoidale Hypophysektomie entfernt, eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Im folgenden Verfahren wurde jede Hypophyse getrennt behandelt, alle sechs wurden jedoch gleichzeitig aufgearbeitet. Die Drüsen wurden aufgetaut und in 4 M Guanidinthiocyanat, das auf pH 5,0 abgepuffertes 1 M Mercaptoäthanol enthält, bei 4° C homogenisiert. Jedes Homogenisat wurde mit 1,2 ml 5,7 M CsC£, enthaltend 10 mifi ADTE, überschichtet und 18 Stunden bei 37 000 U/min in einem SY/ 50,1 Rotor einer Beckmann Ultrazentrifuge bei 15° C zentrifugiert. Dabei setzte sich die PJSS am Boden'des Röhrchens ab. Die v/eitere Reinigung der Messenger-RNS unter Verwendung einer Oligo-dT-Cellulosesäule wurde im wesentlichen durchgeführt, wie es bei Ullrich, A., et al. und Seeburg, P.H., et al., beide weiter oben zitiert, beschrieben wurde. Die biologische Aktivität der 'partiell gereinigten Messenger-RKS wurde mittels ihrer Fähigkeit gemessen- den Einschluß

/—35 -7 von / S_/-Methionin in das Wachstumshormon zu lenken, in einem zellfreien Proteinsynthesesystem aus Weizenkeimen. Die experimentellen Bedingungen für den Test wurden im wesentlichen von Martial, J.H., et al., Proc.Sfat .Acad. Sei. USA 74, 1816 (1977) beschrieben.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines solchen Tests. Die radioaktiven Proteinprodukte'wurden durch Gel-Elektrophorese

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auf 12,5 % Polyacryl ami d-Gel_, das 0,1$ Natriumdodecylsutfat enthielt, 4 Stunden "bei 20 mA fraktioniert. Die ^ radioaktiven Proteinbanden wurden durch Autoradiografie bestimmt. Band (a) zeigt £~ Cj7-iaarkierte Markierungsproteine des lakteriophagen T4, die als Größenmarkierer -eingesetzt-wurden. Die Banden-i-6- zeigen die Übertragungsprodufete der oligo-dT-zellulosegereinigten Messenger-RNS der einzelnen Tumore. Es kann daraus entnommen werden₅ daß bei den Tumoren. 1-5 das Pre-Wachstumshormon den Hauptbestandteil des-zellfreien synthetischen Produktes darstellt.

Die RNS-Chargen, die am meisten mit dem Wachstumshormon zellfrei übertragener Aktivität angereichert waren (Beispiel in den Banden 2, 4 und 5), wurden gesammelt und als Schablone für- die Synthese der doppelsträngigen cDNS eingesetzt. Alle Reaktionsschritte wurden in 1,5 ml fassenden Plastik-Zentrifugenröhrchen durchgeführt. Die erste Umkehr- ' transkriptase-katalytiseSe Reaktion., die zu einem RNS-DNS-Hybrid führt, wurde in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 68 /ul der RNS-Charge mit etwa 13/ug RNS darin enthielt, sowie Yogel-Myeloblastosisvirus—Umkehrtranskriptase, 4 iil des unverdünnten Präparats, wie es vom Office of Program Recources and Logistic, Tiral Cancer Program, Viral Oncology, Division of Cancer Cause and Prevention, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland geliefert wird und 32/ul eines Reaktionsgemisches, das 10 u.1 "Umkehr-Transkriptasepuffer" (0,5 M Tris-HCS pH 8,3; 1 mM ADTE; 70 mH MgCl₂; 200 mM ECt,), 1 yul 2-Kercaptoäthanol 1M, 5 /Ul oligo-dT 1 yug/ml, jeweils 5 /il dATP, dGTP und TTP (20 mM Yorratslösung), 1 /al dCTP 20 mM Vorratslösung enthielt und ungefähr 2 χ 10 cpm (Zählstöße pro Minute)^ -/~³²P_7-dCTP, direkt aufgelöst in dem Reaktionsgemisch.

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Die Reaktion wurde unter Bedingungen ausgeführt, die im wesentlichen--von Seeburg, P.H. et al·, weiter oben zi- - tiertj "beschrieben worden sind. Das Inkubationsgemisch wurde mit chloroformgesättigtem Phenol im gleichen Reaktionsrohr chen extrahiert, mit Äthanol gefällt, die Röhrchen dann bei -70°- C-für-wenigstens 15 Minuten stehen gelassen und anschließend zentrifugiert.

Das gefällte RIiS-DNS-Hybrid wurde in 0,1 Ii NaOH, 125 /al 5 mM ÄDTE gelöst öund bei 68° C für eine halbe Stunde inkubiert, um die selektive alkalische Hydrolyse der RNS zu ermöglichen. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine kleine Sephadex G 50—Säule in einer Pasteurpipette gegeben und mit einer Pufferlösung aus 10 mM Tris (pH 7,5) und 0,5 mM ÄDTE eluiert. Die radioaktive einzelsträngige DNS wurde in einer einzigen 2-Tropfen-]?raktion zurückgewonnen und in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Die Frasktionsröhrchen wurden verschlossen, in Scintillationsampullen gesteckt und in einem Flüssigkeits-Scintillationszähler zwecks Bestimmung der Cerenko^-Strahlung gezählt.

Die Synthese der doppelsträngigen cDNS aus dem einzelsträngigen cDNS-Produkt der vorher beschriebenen Reaktionschritte wurde über eine Umkehr-Transkriptase katalysierte Reaktion durchgeführt. Die Reaktion wurde mit einem Gesamtvolumen von 51 fil, durchgeführt. Diese enthielten 30 μΐ an einzelsträngiger DNS-Lösung, 3,5 /ul Enzymlösung und 17,5 /al eines Reaktionsgemisches folgender Zusammensetzung: 96" ^uI Wasser, 60 pi Umkehr-Transkriptase-Puffer, 6 μΐ 1M 2-Mercaptoäthanol, 15 jul 20 mM dATP,15 μΐ 2OmM dGTP, 15 ,ul 2OmM TTP, 3 μΐ 2OmM dCTP, etwa.6x10⁸ Zählstöße pro Minute^ cC - /~³²P_7-dCTP, direkt aufgelöst in dem Reaktionsgemisch. Die Reaktion ließ man 90 Minuten bei 47° C vonstatten gehen. Nach der Beendi-, gung wurde das Protein durch Extraktion und Sephadex G-50-Chromatografie entfernt, wie weiter oben beschrieben und anschließend erfolgt die ebenfalls beschriebene Äthanolfällung.

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Zur Bestätigung der Tatsache, daß cDNA, die das "Wachstumshormon codiert, ein zahlreich vorkommender Teil in der Charge war, wurde ein Teil der doppelsträngigen cDNS-Charge mit Restriktions-Endonuclease gespalten und durch Polyacrylamid (4,5 #)-Gel-Elektrophor£se analysiert (I¹Ig. 2) Die Streifen (o) und (k) der Fig. 2 zeigen die Banden der radioaktivemarkierten Bakteriophagen-fd-DNS, gespalten durch die Endonuclease Hpa II, Streifen (c) und Haelll, Streifen (k). Die Streifen (a) und (ti) zeigen die ungespaltene doppelsträngige cDNS. Die Streifen (d) "bis Q) zeigen die DNS, gespalten durch: Streifen (d) PstI plus BGlII; Streifen (e) PvuII» Streifen (f) PvuII plus BgSrII; Streifen (g) Hinf plus Sma I; Streifen (h) Hae_II^; Streifen (i) PvuII und Streifen (j) Haelll.

Die "beobachteten Banden waren die erwarteten der cDNS, komplementär zu menschlicher Wachstumshormon-mBiJS, "basierend auf der Struktur eines vorherklonierten 550 Basenpaar-Fragmentes menschlichen Wachstumshormons, das in der US-Patentanmeldung Ser.Hr. 897 710,. auf die "bereits Bezug genommen wurde, "beschrieben wurde. Diese Daten "bestätigen die Tatsache, daß die vorherrschende cDNS tatsächlich komplementär zu menschlicher Y/achstumshormon-Messenger-EIiS ist.

Die resultierende doppelsträngige cDNS wurde mit Sl-Nuclease "behandelt (wie das im wesentlichen von Ullrich, A. et al. "beschrieben wurde, der bereits weiter oben zitiiert wurde), um die "haarnadel"-förinige Struktur in dem ungepaarten Krümmungsbereich zu spalten. Wie bereits bei den vorigen Schritten folgte der Enzymbehandlung die Extraktion, Chromatografie und Fällung. Die unpaarigen Enden wurden mittels einer DNS-Polymerase I katalysierten Reaktion ver- ' vollständigt. Das Reaktionsgemisch von 20yul Gesamtvolumen enthielt 60 mM Tris-HCL, pH 7,5; 8 mM MgCl₂; 10 mM 2-Mercaptoäthanol;. 1 mM ATP; jeweils 200 «M dATP, dTTP, dGTP

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und dCTP. Das Gemisch wurde mit einerEinheit E. coli , DNS-Polymerase I bei- 10° G für 10 Minuten inkubiert₅ υ τη exonuclecLytisch irgendwelche 3'-"hervorstehenden" (protruding) Enden zu entfernen und etwaige 5'-"hervorstehenden" Enden mit den komplementären Sequenzen aufzufüllen. Die Reaktion sollte zu cDNS-Molekülen mit "glatten" Enden führen.

Yerbindungs-Oligonucleotide, die für die Hindlll-RestriktionsstellensecLuenz spezifisch sind, wurden durch Liga- · tion der glatten Enden an die cDNS angefügt. Das erfolgte unter Verwendung von DNS-Ligase, wie es von Seeburg, P.H., ' et al., weiter oben zitiert, beschrieben wurde. Das Plasmid pBR322, Bolivar, ¥, et al., Gene 2, 95 (1977), wurde als Transfervektor aus den weiter oben beschriebenen Beweggründen gewählt. Die Einsatz- und Screening-Techniken sind von Ullrich, A., et al., weiter oben zitiert'^ beschrieben worden. Ampicillin-resistente Kolonien wurden aufgenommen und auf Platten mit Ampicillin und Tetracyclin übertragen. Es wurden für die weiteren Untersuchungen solche Kolonien ausgewählt, die Ampicillin-resistent jedoch Tetracyclin-empfindlich waren. Defekte Einsätze, einschließlich Fehlstellen und Verdoppelungen wurden mit Hilfe von Platten-Gel-Elektrophorese-Durchläufen der mit Hindillbehandelten Plasmid-DNS bestimmt, die aus Kulturen isoliert wurde, die aus einer einzigen Kolonie transformierter Zellen gewachsen waren und wie oben beschrieben ausgewählt worden sind. Derartige Defekte waren mit Hilfe der Größe der Hindlll-Fragmente leicht bestimmbar. Die klonierte DlTS wurde als menschli-ches Pre—Wachstumshormon codierend bestimmt, nachdem sie durch Hindlll-Digestion vom Transfer-Yektor entfernt worden war und weiterer Behandlung mit den Restriktionsenzymen PvuII und BgIII unterworfen wurde. Die abgetrennte cDNS und die Restriktionsfragmente wurden durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, wobei die DNS durch

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Fluoreszensfärbung mit Äthylbromid_:bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind aus Pig. 3 zu entnehmen, wobei die größeren I)ITS-Fragmente näher am oberen Teil der Pig. angeordnet sind. Streifen (a) ist ein vorher kloniertes SSO-Basenpaar-Fragment menschlicher Wachstumshormon-DNS, beschrieben in US-Anmeldung Ser.Nr. 897 710. Streifen (b) ist die 800-Basenpaar-DNS menschlichen Pre-Wachstumshormons des vorliegenden Beispiels. Die Streifen (c) und (e) sind Beispiele für das 500-Basenpaarfragment, das mit PvuII und BgIII entsprechend gespalten wurde. Die Streifen (d) und (f) sind Beispiele für die 800-Basenpaar-Pre-Wachstumshormon-DNS, die entsprechend mit PvuII und BgIII gespalten wurde. Die Spaltung durch PvuII führt in beiden Fällen zu !Fragmenten ähnlicher Größe, wie das auch we^en der bekannten Anordnung einer PvuII-Stelle nahe am Ende des 500-Basenpaar-Fragmentes erwartet v/erden konnte. Die Spaltung van BgIII führt zu größeren Fragmenten mit der 800-Basenpaar-DIiS als mit dem 550-Basenpaar-Fragment, wie das ebenfalls zu erwarten war. Diese gefundenen Ergebnisse stimmen mit der Identifikation des klonierten 800-Basenpaar-Fragments überein, wie es in menschlichem Wachstumshormon-Gensequenzen enthalten ist. Die klonierte DNS, die als cHGHBOO bezeichnet wurde, wählte man für die Sequenzanalyse aus.

Beispiel 2

Nucleotid-Sequenzanalyse von' cHGH800

Die Nucleotidsequenz von cHGH800 wurde mit Hilfe der Methode von Maxam und Gilbert, Proc.lTat .Acad.Sci. USA 74, 560 (1977) bestimmt sowie mit der von Sänger, F. et al., Proc.Uat.acad.Sci. USA 74 5463 (1977). Das Ergebnis ist aus Tabelle 4 zu entnehmen. Das klonierte Gen enthält die gesamte Sequenz, "die menschliches Pre-Y/achstumshorison

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codiert, einschließlich eines 29-Basenpaar-Bereiches am 5'-Ende, wahrscheinlich nicht übertragen (untranslated), sowie einen nicht übertragenen Bereich von 108 Basenpaaren am 3'-Bnde (mit Ausnahme des PoIy-A Stückes). (Die 5'y und 3'-Enden sind gekennzeichnet durch Bezugnahmen auf den Strang der cDNS, der in der Sequenz mit der Wachstums— hormon-Messenger-BNS korrespondiert). Einige Ungewißheit bleibt in der Pre-Sequenz nahe am Beginn der Wachstumshormonsequenz. Es ist außerdem festzustellen₅ daß die Nucleotidsequenz der Tabelle 4 eine Aminosäuresequenz für das Wachstumshormon ergibt, die leicht von der veröffentlichten Sequenz differiert. Die Aminosäuresequenz, die durch die Hucleotid-Sequenzanalyse störend beeinflußt wird, nähert sich mehr der korrekten an. Die Abweichungen treten bei charakteristischen Aminosäurepaaren auf, wie GIn oder GIu, die weniger leicht durch direktes Aminosäuresequentieren als durch Nucleotidsequentieren charakterisiert werden können. Weiterhin macht die TTucleotid-Sequenzanalyse den Zugang zu vorher nicht zu erhaltenden Informationen möglich, zum Beispiel die wahrscheinliche Aminosäuresequenz der Wachstuiushornion-Pre-Sequenz.

Beispiel 3

Aufbau des Pla^mids ptrpED50-HGH

Ein als ptrp_ED5-1 bezeichnetes Plasraid, Searle Res.Lab.; High Wycombe, Bucks, England,, wurde modifiziert, um den Einsatz und den "Ausdruck" der klonierten Pre-Wachstusashormon-cDNS zu ermöglichen.Das Plasmid ptrpED5-1 wurde aus dem HindIII-Fragment des E.coli-Tryptöphan(trp)operons abgeleitet, übertragen vom BakteriophagenjlptrjpE, beschrie-

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"ben von Hopkins, A.S. et al., J. Mol. Biol. 107, 549 (1976), und eingesetzt an der Hindlll-Stelle von pBR322, Bolivar, F..et al., Gene 2, 95 (1977).

Das Plasmid ptrpED5-1 wurde mit HindiII gespalten und mit dem Kenow-Fragment der DNS-Polymerase I behandelt, um die einzelsträngigen 5'-Enden zu paaren (Seeburg, P.H. et al, weiter oben zitiert). Dekanucleotid-HJ_ndIII-Verbinder wurden an die Plasmid-DNS angefügt. Dann v/urden die kohä- -siven Enden durch Hinlll herausgebildet, und die Plasmid-DNS wurde durch Sephadex G-100-Ghromatografie isoliert. Das ringförmige Plasmid wurde mit Hilfe von T4-DNS—Ligase regeneriert und dazu verwendet, den PJR-I ?Stamm von E.coli zu transformieren. Das Klone enthaltende Plasmid ptrpED50 wurde durch Selektion nach Ampicillinresistenz isoliert.

Klonierte menschliche Pre-Wachstumshormon-DNS (cHGH800, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben), wurde an der Hindlll-Stelle von ptrpED50 eingesetzt. Der Rekombinant-Transfervektor wurde benutzt, um E.coli C1776 zu transformieren. Die Transformanten wurden von Ampicillin enthaltenden Platten ausgewählt. Die aus verschiedenen Klonen isolierte Plasmid-DNS wurde für-die korrekte Orientierung des Einsatzes durch Spaltung mit BamHI und Pstl getestet. Die korrekte Orientierung, so daß Codons des Pre-Wachstumshormons in Phase von denen des trp-Qperons gelesen werden können, ist aus der asymmetrischen Anordnung der Pst-I— Stelle ersichtlich, was zu einem 700-Basenpaar-Pragment führt. Eine nicht richtige Orientierung führt zu einem 290-Basenpaar-JPragment. Plasmide mit korrekter Orientierung, als ptrpED5Q-HGH bezeichnet, wurden dann in E.coli trpOEvl transformiert.

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Beispiel 4

"Ausdruck" des menschlichen Wachstumshormons

In dem Plasmid ptrpED5Q-HGH erfolgt der "Ausdruck¹¹ der trpE- und trpD-Gene unter Tryptophan-Steuerung, so daß die Spiegel an Proteinprodukten, die durch diese Gene codiert werden, von einem Basisspiegel durch die Anwesenheit einer induzierenden Verbindung wie ß-^Indolylacrylsäure angehoben werden. Man erwartet, daß die Induktion von S.coli trpOEvl/ptrpED5Q-HGH zu einem Ansteigen der Produktion des trpE-Gen-Produkts und des trpD-Pre-"Wachstumshormon—Fusionsproteins führt. Das letztere umfaßt einen Teil des NHp-Terminalstücke-s, das trpD-Gen-Produkt, verbunden mit dem menschlichen Pre-Wachstumshormon.

Eine Kultur von E.coli trp0Evl/ptrpED50-HGH wurde mit ß-Indolylacrylsäure induziert und 3, ml-Proben davon impulsmarkiert mit 2 /iCi C-markierten Aminosäuren für eine konstante Zeit bei verschiedenen Intervallen nach der Induktion. Proben von null bis vier Stunden induzierter Kulturen wurden immungefällt unter Verwendung von Pormaldehyd-behandeltem Staphylococcus aureus, um Antigen-Antikörper-Komplexe zu sammeln, wie es von Martial, J.A. et al., Proc. Nat.Acad.Sci. USA 74, 1816 (.1977) beschrieben wurde. Die Proteine wurden aufgelöst und fraktioniert durch Elektrophorese in Natrium-Bodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen. Die Ergebnisse sind aus Pig. 4 zu entnehmen.

Streifen (a) enthält C-markierte Proteine aus mit Bakteriophagen T4 infizierten E .coli-Zellen, die als GrÖ'ßenmarkierungsmittel benutzt v/urden. Die breiteren Streifen (b) bis (g) zeigen impulsmarkierte Proteine bei null, 0,5, 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Induktion. Der breitere Streifen (h) zeigt die immungefällten Proteine von 4 Stunden

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induzierten Kulturen, mit Antiserum gegen menschliches Wachstumshormon.

Der "breitere Streifen (i) zeigt die Immunfällung.der vier Stunden induzierten, impulsmarleierten Proteine mit nichtimmunem Serum. Oer "breitere Streifen Q) zeigt die Immunfällung von impulsmarkierten, nicht-induzierten Proteinen. Die oberen und unteren Pfeile zeigen ent sprechend die Anordnungen der trpE— und- der erwarteten trpD-HGH-Pusionsproteine. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Molekulargewichte x10 der Markierungsproteine an.

Die Ergebnisse zeigen das Auftreten von trpD-HGH-Protein nach Induktion und seine spezifische Fällung durch Antiserum menschlichen Wachstumshormons. Es tritt auch eine bestimmte Menge von immungefälltem trpE—Protein auf. Da die trpE— und trpD-Proteine normalerweise in einem Komplex assoziiert sind, scheint es so zu sein , daß eine Assoziierung zwischen dem trpD—HGH-ifusionsprotein und dem' trpE-Protein eintritt, wobei der trpD-Teil des Fusions- proteins davon nicht berührt wird. Jedenfalls wird der "Ausdruck" des klonierten menschlichen Pre-Wachstumshormon Gens in S.coli klar bewiesen.

Die Erfindung wurde zwar mit bestimmten Ausführungsformen beschrieben. Es sollte jedoch klar sein, daß weitere Modifikationen, Variierungen, Verwendungen oder Adaptionen der vorliegenden Erfindung einschließlich des folgenden Erfindungsanspruchs mit erfaßt werden.

μ n\;

i jnon ^QtU⁷. kfS

Tabelle 1

1 10

N^-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-

* 20

Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-

30 " 40 " "

Glu-Glu-Phe-Glu-Glu-Aia-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-

50 Ser-Phe-Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Tlir-Ser-Leu-Cys-Phe-Ser-Glu-

60 70

Ser-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-Gln-Gln-Lys-

80 Ser- Asn-Leu-Gln- Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-

90 Ser-Try-Leu-Glu-Pro-Val-Glu-Phe-Leu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-

100 100

Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-Gly-Ala-Ser-Asn-Ser-Asp-Val-Tyr-Asp-

120 Leu-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-

130 ' 140

Arg-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-Lys-

150 Gln-Thr-Tyr-S er-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-S er-His-Asn-Asp-Asp-

160 Ala-Leu-Ieu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr-Cys-Phe-Arg-Lys-

170 180

Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe-Leu^-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-

190 191 Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-COOH.

Tabelle 2

DNS=Desoxyribonuceinsäure RUS=Ribonucleinsäure cDlS-vervollständigte DNS

(enzymatiscli synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz) inßNS=Mess enger RNS dATP=Desoxyadenosintriphosphat dGTP=DeS oxyguanosintriphosphat dCTP=Desoxycytidintriphosphat

A-Adenin T-Thymin G-Guanin C-Cytosin U-Uracil

ATP-Adenosintriphosphat TTP-Thymidintriphosphat ÄDTE-Athylendiainintetraessigsäure

*f /

Tabelle 3

Genetischer Code	Ph eny 1 a 1 an in (Ph e)	TTK	Histidin (His)	CAK
Leucin (Leu)	XTY	Glutamin (GIn)	CAJ
Isoleucin (lie)	ATM .	Asparagin (Asn)	AAK
Methionin (Met)	ATG	Lysin (Lys)	AAJ
Valin (VaI)	GTL	Asparaginsäure (Asp)	GAK
Serin (Ser)	QRS	Glutaminsäure (GIu)	GAJ
Prolin (Pro)	CCL	Cystein(Cys)	TGK
Threonin (Thr)	ACL	Tryptophan (Try)	TGG
Alanin (AIa)	GCL	Arginin (Arg)	WGZ
Tyrosin (Tyr)	TAK	Glycin (GIy)	GGL
Terminals ignal	TAJ
Terminalsignal	TGA
	Schlüssel: Jedes Dreibuchstaben-Desoxynucleotid-Triplet

korrespondiert mit einem Trinucleotid der mRNS mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Alle hier aufgeführten DNS-Sequenzen sind solche des Stranges, deren Sequenz mit der Sequenz der mRNS korrespondiert, mit Thymin anstelle von Uracil. Die Buchstaben -stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Desoxynucleotidsequenz bilden.

W = C oder A,-wenn Z A oder G W=C wenn Z C oder T ist Z = A, G, C oder T wenn W C : Z=A oder G wenn W A ist QR = TC wenn SA, G_-, C oder ' QR = AG _;wenn S T oder C ist S=A, G₅ C oder T wenn QR T L = A, T,. C oder G M = A-, C oder T

A	= Adenin	C	wenn	Y A	oder G	X T	ist
G	= Guanin					QR	AG ist
T	= Thymin	Y		C oder T	ist
X	= T oder				oder T wenn
	ist
X	= C wenn	G		wenn
Y	= A, G, C	C	wenn
	X C ist	G
Y	= A oder	C
S	= T oder
J	= A oder
K	= T oder

Tabelle 4

Übertragung von cHGH 800

-26 -20

met ala thr gly ser arg thr ser leu leu leu ala phe GG A: C CUG UGG ACA GCU CAC CUA GCU GCA AUG GCU ACA GGC UCC CGG ACG UCC CUG CUC CUG GCU UUU

-10 1 10

gly leu leu cys leu pro trp leu gin glu ala val pro phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe

GGC CUG CUC UGC CUG CCC UGG CUU CAA GAG GCA GUG CCU UUC CCA ACC AUU CCC UUA UCC AGG CUU UUU

20 30

asp asn ala met leu arg ala his arg leu his gin leu ala phe asp thr tyr gin glu phe glu glu

GAC AAC GCU AUG CUC CGC GCC CAU CGU CUG CAC CAG CUG GCC UUU GAC ACC UAC CAG GAG UUU GAA GAA

40 . 50

ala tyr ile pro lys glu gin lys tyr ser phe leu gin asn pro gin thr ser leu cys phe ser glu

GCC UAU AUC CCA AAG GAA CAG AAG UAU UCA UUC CUG CAG AAC CCC CAG ACCUCC CUC UGU UUC UCA GAG

60 70

ser ile pro thr pro ser asn arg glu glu thr gin gin lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser

UCU AUU CCG ACA CCC UCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA UCC AAC CUA GAG CUG CUC CGC AUC UCC

80 90 100

leu leu leu ile gin ser trp leu glu pro val gin phe leu arg ser val phe ala asn ser leu val

CUG CUG CUC AUC CAG UCG UGG CUG GAG CCC GUG CAG UUC CUC AGG AGU GUC UUC GCC AAC AGC CUG GUG

110 120

tyr gly ala ser asp ser asn val tyr asp leu leu lys asp leu glu glu gly ile gin thr leu met

UAC GGC GCC UCU GAC AGC AAC GUC UAU GAC CUC CUA AAG GAC CUA GAG GAA GGC AUC CAA ACG CUG AUG

-P <<	O -P O ir- φ ρ	CUG
ft O OQ <=! cdO	ft O co << co O	ο JH <;
CDO	CQ O	τ- Φ O
*ftp	H-S;	C- ftp
CQ O	MO Jh O	ο >>ο Cr\H O τ- MO
00V JlQS	Φ O ftp	CQ P
-ρ ρ	CQ O up	ODV
Is	H	HO . MO
η <; MO	do φ ρ HO	do 600
O CQ O	dO ΦΡ HO	HO COP
Φ O ftp	HO MO	non JlQS
Φ O •H<i	O in O	MO CdO
MO	CQ <ζ	CQ O OtD
HO MO	CQO	βθ MO
Ii	do Φ P HO	OHO CO COP τ- >Ο
MO ¹ cdO	Φ P H O	Φ O •Η-*!
O O kO ftO	•cd-=t! HO cdO	600 coo
ΦΟ CQ <!j	ftO CQ <$ cdO	do Φ P HO
HO MO	ftp cn <aj cdO	Φ O ftp
O ftp ΓΛ CQ ·=Ί τ- cdO	äo CQ <ή	5η«;
	CQ O	do
Γη <4 MO	^o	6OO
do Φ p HO	LO Φ O τ- rap	HO cdP
MO JhO	M	CQ O
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O, O

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O P

O O O

2. Verfahren nach Punkt Ί, gekennzeichnet dadurch, daß menschliches'Pre-Wachstumshormon codierende mRITS aus einem.^;-individuellen menschlichen Hypophysenvorderlappen extrahiert wird.

Claims

234741 2

22.9.1981

Ausscheidungsanmeldg. aus APC12ST/221 521(57 593 1!

59: 823 12

Erfindungsanspruch
1. Verfahren zum Klonieren einer Deoxynucleotidsequenz, die menschliches Pre-Wachstumshormon codiert, unter Durchführung folgender Schritte: Isolierung von mRJTS aus Hypophysengewebe;- Synthetisieren von.cDWS aus der mRUS, wobei die cDlS ein Gemisch von Deoxynucleotid-Sequenzen einschließlich einer das menschliche Wachstumshormon . codierenden Desoxynucleotid-Sequenz darstellt;-Umsetzen der.cDNS mit einem linearen DNS-Molekül, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym hergestellt wurde; Transformieren der mikrobiellen Wirtszellen mit den Reaktionsprodukten; Isolieren der gewachsenen mikrobiellen Kolonien einer einzelnen transformierten Zelle und Peststellen des Vorhandenseins einer das menschliche Pre-Wachstumshormon codierenden Desoxynucleotid-Sequenz in zumindest einer dieser Kolonien, gekennzeichnet dadurch, daß die mRNS-Quelle menschliches Hypophysengewebe ist: und eine menschliches Pre-Wachstumshormon codierende Deoxynucleotidsequenz durch^vdie charakteristische Länge der Schnittprodukte, die man nach der Behandlung mit einer Restriktionsendonuclease erhält, festgestellt wird·