DD203071A5 - Verfahren zur herstellung von rekombinant-dna-molekuele - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines Rekombinant-DNA-Molekuels, die entsprechende DNA-Sequenzen enthalten, welche fuer mindestens ein Polypeptid, das eine immunogische oder biologische aktivit.v.HumanleukozyteN-Interferon aufweist,kodiert.Inentsprechenden Wirten eingesetzt,ermoeglicht dieses Rekombinant-DNA-Molekuel die Erzeugung u.Identifikation von Genen u.Polypeptiden u. ihre Anwendung in Mitteln gegen Viren, Tumore und Krebs.

Description

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Verfahren zur Herstellung von Rekombinant-DEFA-Moleküle

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung besieht sich auf die Herstellung von Rekorabinant-DIA-Moleküle, die entsprechende DM-Sequenzen enthalten, welche für mindestens ein Polypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweist, kodiert und ein nützliches Mittel gegen Viren, Tumoren und Krebs ist.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

In der vorliegenden Anmeldung wird die in lature, 28c, S.2421 (10· Juli I98O) veröffentlichte Interferon-Nomenklatur verwendet* Diese Nomenklatur· ersetzt die in den früheren Anmeldungen, gegenüber denen die vorliegende Anmeldung Priorität hat, angewandte« Zum Beispiel wird TF jetzt, als IPiI und-·-

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Leukozyten-Interferon jetzt als IPH^-- (Λ bezeichnet.

Bekanntlich gibt es zwei Klassen von Interferonen ( Interferone der Klasse I sind kleine säurebeständige (Glyco)-Proteine, durch die Zellen gegenüber Virusinfektionen resistent werden (A. Isaacs und J. Lindemann, "Virus Interference I. The Interferon" (Viren-Interferenz I, Das Interferon) Proc. Royal Soc. Ser. B.. 147, S. 258-267 (1957) und W. E. Stewart, II, The Interferon System. Springer Verlag (1979) (anschließend "The Interferon-System"))♦ Obwohl sie bis zu einem gewissen Grade zellapezifisch sind (The Interferon System, S· 135 — 145 sind IPITe nicht virusspezifisch. Stattdessen schützen IPUe Zellen gegenüber einem breiten Spektrum von Viren·

Human-Interferone ("HuIPlT") sind in drei Gruppen C^ , β und f eingeteilt worden. HuIPlI- C^ oder Leukozyten-Interferon wird in Leukozytenzellen des Menschen und zusammen mit geringfügigen Mengen von HuIPU- P (Pibroblast-Interferon) in Lymphoblastoidzellen erzeugt. HuIPH^--Ck ist bis zur Homogenität gereinigt und charakterisiert worden (z.B. M. Rubenste.in, u.a., "Human-Leukocyte Interferon: Production, Purification To Homogeneity And Initial Characterization" (Humanleukozyten-Interferon: Herstellung, Reinigung bis zur Homogenität und anfängliche Charakterisierung), Proc. Hat!. Sei. USA, 76, S. 640 644 (1979)).

In bezug auf die Größe.ist es heterogen, was vermutlich auf die Kohlenhydratkomponente zurückzuführen ist. Es sind zwei Komponenten beschrieben worden, eine mit einer relativen Molekülmasse von 21 000 bis 22 000 und die andere von 15 000 bis 18 000. Von der Komponente mit der geringeren relativen Molekülmasse ist berichtet worden, daß sie eine nichtglycosylierte Porm darstellt. Von der kleineren Porm von HuIPU-ist auch berichtet worden, daß sie den größten Teil oder ihre gesamte HuIPlJ- -Aktivität beibehält (Y7. E. Stewart, II u.a.,

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"Effect Of Glycosylation Inhibitors On The Production And Properties Of Human leukocyte Interferon" (Einfluß von GIycosylierungs-Inhibitoren auf die Erzeugung und die Eigenschaften von Humanleukozyten-Interferon), Virology, 97, S* 473 - 476 (1979)). Sin Teil der Aminosäuresequenz von HuIFF-—CJt. von Lymphoblastoidzellen und ihre Aminosäurezusammensetzung sind beschrieben worden (K,C. Zoon, u.a., "Amino- -TerminaL Sequence Of The Major Component Of Human Lymphoblastoid Interferon" (Aminoterminalsequenz der Hauptkomponente von Humanlymphoblastoid-Interferon), Science,' 207, S. 527-528 (1980) und M* Hunkapiller und L. Hood, persönliche Veröffentlichung (1980)). -

Es wurde auch behauptet, daß HuIPST-oC in mehreren verschiedenen Formen existiert, z.B· Britische Patentanmeldung 2*,037»29βΑ. Diese Formen scheinen sich strukturell und'physiologisch von einander zu unterscheiden* Für diese Formen von HuIFIT-Ck ist keine anerkannte Fomenklatur festgelegt worden·. Daher wird in der vorliegenden Anmeldung jede Form durch, eine Zahl nach der allgemeinen HuIFlT-C*. -Bezeichnung gekennzeichnet, d-h·. HuIIW-C*- 1 oder HuIFET-d 3.

HuIFIT- Ck kann wie viele Humanproteine polymorph sein» Daher können Zellen von bestimmten. Individuen-HuIFU-cC-Spezies innerhalb der allgemeineren HuIFEf-cC-Gruppe oder Formen innerhalb dieser Gruppe bilden, die physiologisch ähnlich, strukturell aber etwas anders als die Gruppe oder Form sind, von der sie ein Teil sind. Es können daher, obwohl die Proteinstruktur eines HuIFU-C*. im allgemeinen gut definiert sein kann, bestimmte Individuen ein HuIFIT-ck. erzeugen, das eine leichte Abwandlung davon ist, wobei diese allelische variation wahrscheinlich weniger Stark ausgeprägt ist als die Differenz zwischen den verschiedenen Formen von HuIFlT-oC,

HuIFU ist gewöhnlich in normalen oder gesunden Zellen nicht nachweisbar (The Interferon System, S. 55 - 57). Stattdes-

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sen wird das Protein infolge der Einwirkung eines IPU-Induktors auf die Zelle erzeugt.' ΙΡΪΓ-Induktoren sind im allgemeinen Viren, können aber auch Uicht-Virus-Verhalten zeigen, wie natürliche oder synthetische doppelsträngige BHA, intrazelluläre Mikroben, mikrobiologische Produkte und verschiedene chemische Mittel. Zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um Vorteile aus diesen STicht-Viren-Induktoren in der Weise zu ziehen, daß Humanzellen dadurch gegen Virusinfektionen resistent werden (S. Baron und P. Dianzani(Herausg.), Texas Reports On Biolog? And Medicine, 35 ("Texas Reports"), S. 528.- 540 (1977)). Diese Versuche waren nicht sehr erfolgreich. Dafür wird jetzt die Verwendung von exogenem HuIPIT selbst bevorzugt·

Die Interferontherapie gegen Virus-, Tumor- und Krebserkrankungen ist mit unterschiedlichen Dosismengen und unter verschiedenen Arten der Verabreichung durchgeführt worden (The Interferon System, S<» 305 - 321). Zum Beispiel würde Interferon wirksam oral durch Inokulation — intravenös, intramuskulär,intranasal,, intradermal und subkutan — und in Form von Augentropfen, Salben und Sprays verabreciht. Es wird gewöhnlich ein- bis dreimal täglich in Mengen von 10

7 bis 10 Einheiten verabreicht. Der Umfang der Therapie ist vom Patienten und dem behandelten Zustand abhängig. Zum Beispiel werden Virusinfektionen normalerweise durch tägliche Dosen oder zweimal täglich verabreichte Dosen über einen Zeitraum von mehreren Tagen bis zu zwei Wochen behandelt, und Tumore und Krebs werden gewöhnlich durch tägliche oder mehrfache tägliche Dosen über mehrere Monate oder Jahre behandelt. Die ?;irksamste Therapie muß selbstverständlich für einen bestimmten Patienten von dem behandelnden Arzt bestimmt werden, der so gut bekannte Paktoren wie Verlauf der Erkrankung, vorhergehende Therapie und die Reaktion des Patienten auf Interferon bei der Wahl einer Verabreichungsart und der Dosismenge berücksichtigen wird.

Als Antivirusmittel wurde HuIPE zur Behandlung folgender Erkrankungen verwendet: Infektionen der Atemwege (Texas-Reports, S. 486 - 496), Herpes simplex Keratitis (Texas Reports, S. 497 - 500), akuter hämorrhagischer Konjunktivitis (Texas Reports, S» 501 - 510), Tirazellen-Zoster (Texas Reports, S. 511 - 515)r 'Zytomegalovirus-Infektion (Texas Reports, S* 516 — 522) und Hepatitis B (Texas Reports,"S. 51 β 522). Siehe auch The Interferon Spatem, S. 307 - 319. Die Verwendung von IPU in größerem Umfang als Antivirusmittel mach jedoch größere Mengen- von IPU erforderlich, als bisher zur Verfügung standen.

HuIPlI hat neben seiner Antivirus-Wirkung noch andere Wirkungen* Beispielsweise wirkt es dem Koloniestimulierungsfaktor entgegen, inhibiert das Wachstum von hämopoitischen Koloniebildungszellen und stört die normale Differenzierung von Granulocyt- und Maktrophagen-Verläufen (Texas Reports, S, 343 — 349). Ss inhibiert auch Erythroid-Differentiation in DMSO-behandelten Priend-Leukämiezellen (Texas-Reports, S. - 428).- HuIPF kann auch eine Rolle bei der Regulierung der Immunreaktion spielen· Je nach der Menge und der Yerabreichungszeit hinsichtlich des. Antigens kann HuIPU-d immunopotenzierend und immunosuppressiv ija vivo und ,in vitro sein (Texas Reports, S., 357 - 369)· Außerdem konnte beobachtet werden, daß speziell sensibilisierte Lymphoziyten HuIPU-öl nach Kontakt mit Antigen erzeugen· Ein solches antigen-indu— ziertes HuIPU-cx könnte daher ein Regulator für die Immunreaktion sein und die zirkulierenden Antigenspiegel und die Expression von Zellimmunität beeinflussen (Texas'Reports, S. 370 - 374).- Es ist auch bekannt, daß HuIPU die Aktivität von. Killerl^mphozyten und die von Antikörpern abhängige, zell-mittelbare Z^totoxizität verstärken kann. (R. R. Herbermann, u.a*, "Augenmentation By Interferon Of Human latural und Antibody Dependent Cell-Mediated Gytotoxicit^'J (Durch Interferon verstärkte natürliche und von Antikörpern abhängige zell-mittelbare Ziytotoxizität bei Menschen), Uature, 277, S. 221 - 223 (1979); P. Beverle?/ und D. Knight,

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"Killing Comes Naturally " (Töten kommt natürlich), Hature, 278, S. 119 - 120 (1979); Texas Reports, S. 375 - 380). Wahrscheinlich sind beide Spe'zies an dem immunologischen Angriff auf Tumorzellen beteiligt.

Außer seiner Verwendung als Antivirusmittel bei Menschen findet HuIPIT auch potentielle Verwendung in der Antitumor- und Antikrebstherapie (The Interferon System, S. 319 - 321). Es ist jetzt bekannt, daß IPHe das Wachstum vieler Klassen von Tumoren bei vielen Tieren beeinträchtigen (The Interferon System, S» 292 - 304)» Sie scheinen wie auch andere Antitumormittel am wirksamsten zu sein, wenn sie gegen kleine Tumore angewandt werden* Die Antitumorwirkungen νση Tier-IPH sind von der Dosierung und der Zeit abhängig, sie wurden aber bei unter toxischen Mengen liegenden Konzentrationen demonstriert. Daher waren zahlreiche Untersuchungen und klinische Versuche auf die Antitumor- und Antikrebseigenschaften von IPHen gerichtet und werden in dieser Richtung fortgesetzt* Dazu gehört die Behandlung verschiedener bösartiger Erkrankungen wie Osteosarkom, akute Myeloidleukämie, multiples. Myeolom und Hodgkinsche Krankheit (Texas Reports, S.- 429 435). Außerdem-wurde kürzlich nachgewiesen, daß HuIPH lokale Tumorregression verursacht, wenn es in subkutane Tumorknoten bei an Melanom- und Brustkarzinom erkrankten Patienten , injiziert wird (T· Hemoto, u.a., "Human Interferone And Intralesional Therapy of Melanoma and Breast Carcinoma" (Humaninterferone und Intralesional-Therapie von Melanom- und Brustkarzinom), Amer. Assoc. Por Cancer Research, Abs. Hr. 994, S. 24β (1979)). Wenn auch die Ergebnisse dieser klinischen Versuche recht ermutigend sind, wurde die Anwendung von IPH gegen Tumore und Krebs' durch den Mangel an einer ausreichenden Bereitstellung von gereinigten IPH stark behindert·

Heute wird HuIPH-cC entweder von in Gewebekultur gezüchteten menschlichen Zellen oder durch von Blutspendern gesammelten Humanleukozyten erzeugt. 2,6 χ 10° IU rohes HuIP-qc sollen

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aus 800 1 gezüchteten Hamalva-Zellen gewonnen ?t?orden sein (P*J. Bridgen, u.a. supra).♦ In sehr großen Blutzentren, z.B. dem Pinnischen Rot Kreuz-Zentrum in Helsinki, Finnland,

11 "beträgt die Produktionskapazität etwa 10 IU rohes HuIPIT-järhlich. Da die Dosis praktisch 3 χ 10 IU je Patient und Tag beträgt, sind diese Quellen nicht ausreichend, um die praktisch benötigten Mengen von- HuIPU-cC zur Verfugung zu .. stellen. Daher ist die Herstellung von HuIPN-c<, mit Hilfe anderer Verfahren wünschenswert». Da die spezifische Aktivität von IPU-c* hoch ist, sie liegt in der Größenordnung von

8 " 9 4,0 χ 10 bia 10 Iü/mg, ist die- für praktische Anwendungs-,fälle gebrauchte Menge von HuIPl-CV gering.- Zum Beispiel würden 100 Gramm reines HuIPIi-cC zwischen. 3 und 30 Millionen Dosierungen ergeben.:

Kürzliche Portschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie haben es möglich gemacht, DBA-Kodierung für spezifische nicht-bakterielle eukaryotische Proteine in Bakterienzellen. einzuführen* Im allgemeinen umfaßt die Konstruktion derartiger Rekombinant-DHA-Moleküle mit DSA_T allerdings nicht durch chemische Synthese gewonnener, die Schritte, daß eine ein- strängige DUA-Kopie (cDHA) einer gereinigten Messenger-RHA (mR]3A)-Template für das verlangte Protein erzeugt wird; die cDHiL in doppelstränige DUA umgewandelt wird; die DHA mit einer passenden Stelle in einem entsprechenden Gloningvehikel zur Bildung eines Rekombinant-Moleküls verknüpft wird und ein entsprechender ?/irt mit dem Rekombinant-DUA-Molekül transformiert wird· Durch eine derartige Transformation kann der Wirt das verlangte Protein erzeugen.

Verschieden nicht-bakterielle Proteine und Gene sind in Ξ» coli unter Anwendung der Rekombinant-DEA-Technologie gewonnen Tiorden.' Dazu gehören ein Protein, das Ratten-Proinsulin-Antigendeterminanten aufweist (L. Villa-Komaroff, u.a., "A-Bacterial Clone Synthesizing Proinsulin" (Ein bakterielles Clonesynthetisierendes Proinsulin), Proc. üJTatl. Acad. Sei. USA, 75, ". 3727 - 3731 (197S)), Rattenviachstumshormon (P.H.

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Seeburg, u.a., "Synthesis of Growth Hormone By Bacteria" (Synthese von Wachstumshormon durch Bakterien), Nature, 276, S. 795 - 798 (1978), Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase (A.C.Y. Chang, u.a., "Phenotypic Expression In E. coli Of A DHA Sequence Coding For Mouse Dihydrofolate Reductase" (Phenotypische Expression einer für Häuse-Dihydrofolat-Reduktase kodierenden DHA-Sequenz), Iature, 275, S. 617 - 624 (1978), Human-Somatostatin (K* Itakura, u.a., "Expression In Eacherichia coli Of A Chemically Synthesized Gene For The Hormon Somatοstatin" (Expression eines chemisch, synthetisierten Gens für das Hormon Somatostatin in Eacherichia coli), Science, 198, S. IO56 - IO63 (1977); Europäische Patentanmeldungen 0,001.929, O.OOI.93O und 0.001.931 und verwandte Anmeldungen in anderen Ländern), und die A- und B-Polypeptidketten von Humaninsulin (D.V. Goeddel, u.a., "Expression In Escherichia coli Of Chemically Synthesized Genes For Human Insulin' (Expression von chemisch synthetisierten Genen für Humaninsulin in Escherichia coli), Proc. Hat!.. Acad. Sei« USA, 76, S.. 106 — 110 (1979) und die europäischen und verwandten Patentschriften (sopra), Antigene von Human-Hepatitis-B-Virus (C.J.Burrell, u.a.., "Expression In Escherichia coli: Of Hepatitis B Virus DHA Sequences Cloned In Plasmid pBE322" (Expression von in Plasmid pBE322 geclonten Hepatitis-Virus- -DJÜA-Sequenzen in Escherichia coli), nature, 279, S. 43 - 47 (1979) und M. Pasek u.a., "Hepatitis B Virus Genes And Their Expression In E> coli" (Hepatitis-B-Virusgene und ihre Ex- pression in E. coli), Nature, 282, S.. 575 - 579 (1979)) Humanwachstumshormon (D. V. Goeddel, u.a. "Direct Expression In Escherichia coli Of A DSA Sequence Coding For Human Growth Hormone¹' (Direkte Expression einer für Humanwachstumshormon kodierenden DliA-Sequenz in Escherichia coli) Efature, 281, S* 544 - 551 (1979)), SV40-t-Antigen (T.M. Roberts, u.a.. "Synthesis Of Simian Virus 40 t Antigen InEscfaerichia coli" (Synthese von Affenvirus 40-t-Antigen in Escherichia coli), Proc. CTati. Acad. Sei, USA, 76, S. 5596 - 56ΟΟ (1979)) und Humanfibroplast-lnterferon (HuIFiT- )(T. Taniguchi, u.a.,

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"Construction And·Identification Of A'Bacterial Plasmid Containing The. Human Fibroplast Interferon Gene Sequence" (Konstruktion und Identifikation eines Bakterienplasmids, das die Huinan-Fibroplast-Interferon-Gen-Sequenz enthält), Proc. Japan Acad., 55, Ser. 3, S. 464 - 4&9 (1979) zusammen mit einer persönlichen Veröffentlichung 1980).

Keiner dieser Rekombinant-DHA-Prozesse betrifft jedoch die Synthese von HuIPIT-cC wie es in der Erfindung der Fall ist. Mit diesem Problem, befaßt sich die Erfindung· Seine Lösung wird jedoch nicht, wie es bei den oben beschriebenen Rekombinant-DSA-Schemata der Pail war, durch die Verfügbarkeit der Sequenzinformation, die zur Erzeugung eines synthetischens • Gens . (ζ·Β, Somatostatin) erforderlich ist, oder eines Zelltyps oder Virus, der reich an einer bestimmten DSA-Sequenz ist (z«BV Hepatitis-Virus-Antigen, oder vonmREA-Spezies (z,B, Ratteninsulin), die die Herstellung und Identifikation von Bakterienclonen ermöglichen, die die verlangte Hybrid- -DlTA enthalten,·oder eines Systems, das die Auswahl von E, c0Ii- Wirten erlaubt, die das verlangte Protein ausprägen (z_eB. Mäuse-Dihydrofolat-Reduktase) erleichtert. Auch der Bericht über ein Plasmid, das eine DLTA-Sequenz enthalten soll, die von einer PoIy(A)-RIiA zu einer mRlTA hybridisiert, wobei die mRHA HuIPiT-ß -Aktivität in Oocyten erzeugt (z.B. Pibroplast-Interferon), hilft wenig. Und bei der in der Erfindung vorgeschlagenen Lösung handelt es sich nicht um den einleuchtenden Vorschlag der Forschungs-Veröffentlichung Ήτ. 13309, S-, 361 - 3&2 (1979) für die Herstellung von reiner oder im wesentlichen reiner HuIFlT-oC mRlTA vor dem Cloning des HuIPlT-cC-Gens,

Schließlich sollte man beachten, daß die Selektion einer DSTA-Sequenz oder die Konstruktion eines Rekombinant-DliA-Moleküls, das von PoIyA-RHA zu einer mRITA hybridisiert, wobei die mRBA HuIFH-Aktivität in Oocyten erzeugt, nicht ausreicht, um zu demonstrieren, daß die DHA-Sequenz oder der

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Hybrid-Insert des Rekombinant-DIA-Moleküls HuIiTT-entspricht. Stattdessen kann nur die Erzeugung eines Polypeptids, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPIT zeigt, tatsächlich demonstrieren, daß die gewählte DlTA-Sequenz oder das konstruierte Rekombinant-DHA-Molekül dem HuIPIT entspricht» Viel wichtiger ist noch, daß die DHA-Sequenz, das Rekombinant-DIA-Molekül oder mit ihnen verwandte Sequenzen erst nach dem Nachweis von HuIPIT-Aktivität zur Selektion anderer Sequenzen, die HuIPIT gemäß der Erfindung entsprechen, herangezogen werden dürfen»

Aus der vorstehenden Beschreibung wird daher deutlich, daß das Problem der Erzeugung von HuIPU-c*. mit Hilfe der Eekiombinant-DITA-Technologie ein ganz anderes ist als das der oben beschriebenen Prozesse, Hier muß eine bestimmte DHA-Sequenz mit unbekannter Struktur - die für die impression von HuIPIT-In. einem entsprechenden Wirt kodiert - in einem äußerst komplizierten Gemisch von DHA-Sequenzen gefunden und von diesem getrennt werden, damit sie bei der Herstellung von HuIPlT-verwendet werden kann» Dieses Lokalisierungs- und Trennungsproblem wird noch durch die überaus geringe Konzentration der verlangten DITA-Sequenz in dem komplizierten Gemisch und den Mangel an einer wirksamen Möglichkeit zur raschen Analyse der vielen DITA-Sequenzen des Gemischs für die Selektion und Trennung der verlangten Sequenz vergrößert·

Ziel der Erfindung:

Durch die Erfindung wird es möglich, Polypeptid(e), die eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPl^--öC aufweisen, für die Verwendung in Antivirus-, Antitiunor- und Antikrebsmitteln und -methoden zu gewinnen. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung dieser Polypeptide in Mengen und mit Hilfe von Methoden, die bisher nicht zur Verfügung standen.

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Darlegung des Wesens der Erfindung:

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß DHA-Sequenzen, die für die Expression von HuLFH-C^ in einem entsprechenden Wirt kodieren, lokalisiert und abgetrennt werden und dadurch DHA-Sequenzen, Rekombinant-DHA-Moleküle und Methoden zur Verfugung gestellt werden,, mit deren Hilfe ein Wirt transformiert wird, damit er ein Polypeptid erzeugt, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Humaleukozyten-Interferon aufweist, wobei für das Verfahren zur Herstellung des Polypeptide in dieser Anmeldung kein Patentschutz beansprucht wird*

Wie aus der folgenden Beschreibung deutlich werden wird, sind die erfindungsgemäßen DHA-Sequenzen und Recombinant- · -DHA-Moleküle in der Lage, die Erzeugung eines Polypeptides, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPET- sC aufweist, in einem entsprechenden Wirt zu bestimmen· Die Replikation dieser DHA-S.equenzen und Rekombinant- -DHA-Moleküle in einem entsprechenden Wirt ermöglicht auch die Erzeugung von für diese Polypeptide kodierenden Genen in großen Mengen. Die Molekülstruktur und die Eigenschaften dieser Polypeptide und Gene können leicht ermittelt werden» Die Polypeptide und Gene sind entweder in der im Wirt erzeugten Form oder nach entsprechender Derivatisierung oder Modifizierung für Zusammensetzungen und Methoden zum nachweis und zur Verbesserung der Herstellung dieser Produkte selbst und für die Verwendung in Antivirus-, Antitumor- und Antikrebsmitteln und -methoden von Hutzen.

Dieser Prozeß weicht daher, von den dem bisherigen Stand der Technik entsprechenden und oben genannten Prozessen insofern ab, als dieser Prozeß im Gegensatz au den genannten bisherigen Prozessen die Erzeugung und Selektion von DHA- -Sequenzen und Rekombinant-DHA-Molekülen umfaßt, die entsprechende DHA-Sequenzen enthalten, die für mindestens ein

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Polypeptide das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPET-cL aufweist, kodieren»

Aus dem Vorstehenden wird deutlich, daß ein grundlegender Aspekt der Erfindung die Schaffung einer DHA-Sequenz ist, die dadurch gekennzeichnet ist, daß 3ie für ein Polypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPlT •aufweist, kodiert und aus der Gruppe ausgewählt wurde, bestehend aus den DBA-Inserts von Z-pBR322(~Pst)/HcIP-4c, Z-pBR322 (Pst)/HcIP-2h, Z-pBR322(Pst)/HcIP-S3ö5, Z-pBR322(Pst)/HcIP-SH42, Z-pKT287(Pst)/HcIP-2h-AH6, DSA-Sequenzen, die zu einem der vorstehend genannten DHA-Inserts hybridisieren, DSA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich " natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, · verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DIA-Sequenzen oder einem der Inserts, und DSA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons aufweisen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das eine ähnliche iimnunologische oder biologische Aktivität wie ein bei Expression der Codons einer der vorstehenden DFA-Sequenzen und Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist, und daß diese Sequenzen die Herstellung von Interferon und interferonartigen. Polypeptiden in Wirten erlauben»

Ausführungsbeispiel:

In den Zeichnungen stellen dar:

Pig. 1: eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Prozesses zur Herstellung eines Gemische von Rekombinant-DITA-Molekülen, von denen einige durch eingefügte DM-Sequenzen gekennzeichnet sind, die für erfindungsgemäße Polypeptide kodieren;

J4U ό 4-13-

Pig. 2: eine schematische Darstellung des erfindungsge- ' mäßen Initial-Clon-Screening-Prozesses;

Pig, 3: eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Clon-Screening-Prozesses unter Verwendung von erfindungsgemäß herges teilten DHA-Sequenzen; .

Pig. 4: eine Hestriktionskarte eines der erfindungsgemässen Clone, wobei die absolute Position jeder Restriktionsstelle in diesem Clon nicht angegeben ist;

Pig. 8 bis 10: geben absolute Positionen dieser Restriktionsstellen an.

Pig. 5: eine schematische Darstellung des Prozesses zur Bestimmung der Orientierung eines DHA-Inserts in einem erfindungsgemäßen Rekombinant-DHA-Molekül;

Pig. 6;. die Partial-ÜTucleotid-Sequenz eines erfindungsgemäß nützlichen Cloningvehikels;

Pig. 7: die Ergebnisse einer Praktionierung mit- Sephadex G-100 von Obenstehendem, das aus einer erfindungsgemäßen Bakterienkultur hergestellt wurde;

Pig. 8 bis 10: die Hucleotid-Sequenz eines DBA-Inserts für ein erfindungsgemäßes Rekombinant-DHA-Molekül. Die Sequenz ist von dem Uucleotid, das dem PoIyG S'-Schweif folgt, bis zu dem Hueleοtid vor den PoLyA-Residuen und PoLyC 3'-Schweifen numeriert. Die nucleotide 57 - 125 stellen eine Signalsequenz dar, und die nucleotide 126 - 626 stellen das "reife" Interferon und das Terminatorcodon dar. Die Aminosäuresequenz der Signalsequenz ist über ihrer Hucleotidsequenz in Kleinbuchstaben und die

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Aminosäuresequenz des "reifen" Interferons über ihrer Nucleotidsequenz in Großbuchstaben angegeben.· Verschiedene Restriktions-Endonuclease-Srkennungsstellen in diesem Gen sind gleichfalls in den Fig· 8 bis 10. angegeben,, wobei diese Stellen absoluter lokalisiert sind als die in Fig. 4 gezeigten;

Fig. 11: ein schematischer Vergleich der Restriktionskarten zweier DIIiL-Inserts von erfindungsgemäßen Rekombinant-DHA-Holekülen;

Fig· 12 bis 16: die Hucleotidsequenzen von zwei DUA-Inserts von erfindungsgemäßen Rekombinant-DIA-Molekülen. Die Sequenzen sind von dem ÜTucleotid, das dem PoLyG 5^T-Scheif folgt, bis zu dem ETucleotid vor den PoLyA-Residuen und den PoLyC 3'-Schweifen numeriert· Die Aminosäuresequenz der Signalsequenz für jeden dieser Inserts ist über ihrer jeweiligen ilucleotidsequenz in Kleinbuchstaben und die Aminosäuresequenz des "reifen" Interferons über ihrer ETucleotidsequenz in Großbuchstaben angegeben;

Fig. 17: eine Partialrestriktionskarte von Z-pBR322(Pst)/ HcIF-206 und die zur Bestimmung der Nzcleotidse-i quenz des in Fig. 12 bis'i6 dargestellten Hif-II- -206—Fragmentes ange?;andte Sequenzierungsstrategie;

Fig. 18: Partialrestriktionskarten einer Reihe von Etybridphagen, die zu dem Hif-2h-Fragment hybridisieren;

Fig. 19: eine Partialrestriktionskarte des Sybridinserts von Z-pBR322Pst/HchrIF-35HBGC und die zur Bestimmung seiner ITucleotidsequenz angewandte Sequenzierungsstrategie ;

Ik J 4 U ό 4 .₁₅_

Fig, 20 - 23: die Hucleotidsequenz des HchrIF-35HB ς<, -Fragments ι quenzj

ments und der davon abgeleiteten Aminosäurese-

Fig. 24: Partialverknüpfungskarten für HuIPH-^C verwandte Gene. Die Pfeile bezeichnen Regionen, die mit induzierter Leukozyten-Poly(A)-RUA-Schieifen bilden. Der gestrichelte Kasten (chr-i6) bezeichnet die Sequenz, die durch Löschexperimente gestört wurde, aber durch R-Schleifen-Sinzeichnen nicht aufgedeckt wurde;

Fig. 25: eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid 08-IFlT-c^ 1;

Fig. 26: eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid LAC-AUG (oC2);

Fig. 27: die Rekonstruktion des AUG-Initiierungs-Codons und des CYS-Initials-Codons in der Konstruktion von LAG-AUG

Fig. 28: eine schematische Darstellung der Konstruktion von Plasmid C8-IPH<^,2 und der Hybridmoleküle I, II, III und 17;

Fig. 23c- 32: Darstellungen der Hucleotidsequenz und der dadurch für IFH- cC 4b kodierten Aminosäuresequenz und ihre Signalsequenz.

Zum besseren Verständnis der hier dargelegten Erfindung folgt eine ausführliche Beschreibung.

In der Beschreibung werden folgende Bezeichnungen verwende

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Uucleotid - Sine Monomereinheit von DHA oder EKA, bestehend aus einer Zuckerkomponente (Pentose), e'inem Phosphat und einer stickstoffhaltigen heterozyklischen Base. Die Base ist über den Glycosidkohlenstoff (1' Kohlenstoff der Pentose) mit der Zuckerkomponente verknüpft. Diese Kombination einer Base und eine's Zuckers wird als Nucleotid bezeichnet. Jedes Fucleotid ist durch seine Base gekennzeichnet. Die vier DUA-Basen sind Adenin ("A")₅ Guanin ("G"), Cytosin ("C") und Thymin ("T"). Die vier RITA-Basen sind A, G, C und Uracil ("ü").

DITA-Seauenz - Eine lineare Reihe von nucleotiden, die miteinander durch Phosphordiesterbindungen zwischen den 3¹ und 5'-Kohlenstoffen benachbarten Pentosen verbunden sind,

Codon -Eine DBA-Sequenz von drei Nucleotiden (ein Triplett), die durch mRHA eine Aminosäure, ein Translations-Initiierungssignal oder ein Translations-Terminationssignal kodiert. Beispielsweise kodieren die Uucleotid-Tripletts TTA, TTG, CTT, CTC, CTA und CTG für das Aminosäureleucin ("Leu"), TAGy. TAA und TGA sind Translations-Terminationssignale und ATG ist ein Translations-Initiierungssignal.

Qrientierungssystem (reading frame) - Die- Gruppierung von Codons während der Translation von mR!A in Aminosäuresequenzen. Während, der Translation muß das richtige Orientierungssy.stem beibehalten werden. Zum Beispiel kann die Sequenz GCTGGTTGTAAG in drei Orientierungssysteme oder Phasen übersetzt werden, von denen jede eine andere Aminosäuresequenz ergibt;

GCT GGT TGT AAG-AIa-GLy-Gy s-Ly s G CTG GTT GTA AG—Leu-Yal-Val C-C TGG TTG TAA G—Trp-Leu-(Stop)

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Pol.ypeptid - Eine lineare Reihe von Aminosäuren, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen denoi,-Amino-- und Carboxylgruppen benachbarter Aminosäuren verbunden sind·

Genom - Die gesamte DUA" einer Zelle oder eines Virus. Es enthält unter anderem die für die Polypeptide der Substanz kodierenden Strukturen sowie Operator-, Promotor- und Ribosombinde- und -wechselviirkungssequenzen, einschließlich Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-Sequenzen.

Strukturen - Eine DlA-Sequenz, die durch ihre Templateoder Me s senge r-RlA ("mRlA") eine Sequenz von Aminosäuren, die für ein spezifisches Polypeptid charakterisistisch sind, kodiert.

Transcription - Der Prozeß der Erzeugung von mBITA von einem Strukturgen..

Translation - Der Prozeß der Erzeugung eines Polypeptids von mRHA.

Expression - Der Prozeß, den ein Strukturgen zur Erzeugung eines PoLypeptids durchläuft·· Er ist eine Kombination von Transcription und Translation.

Plasmid - Eine nicht-chromosome, doppelsträngige DIIA-Sequenz, die ein intaktes "Replicon" aufweist, so daß sich das Plasmid in einer Wirtszelle repliziert. Wenn das Plasmid in einem einzelligen Organismus vorhanden ist, können .die Charakteristika dieses Organismus infolge der DlTA des Plasmids verändert oder transformiert werden. Zum Beispiel

transformiert ein Plasmid, welches das Gen für Tetracyclines

Resistenz (Tet¹) trägt,-eine Zelle, die vorher gegenüber Tetracyclin sensistiv war, in eine Zelle, die dagegen resistent ist. Eine durch ein Plasmid transformierte·.Zelle wird als "Transformant" bezeichnet*

Z43 40 3 4

Phage oder Bakterienphage - Bakterienviren, von denen viele aus in eine Proteinhülle oder einen Proteincoat eingekapselten DKA-Sequenzen bestehen ("Capsid").

Gloningvehikel - Ein Plasmid, eine Phagen-DUA oder andere DFA-Seque-nzeη, die sich, in einer Wirtszelle replizieren können, die durch eine oder eine geringe Anzahl von Endonuclease-Erkennungsstellen gekennzeichnet sind, an denen derartige DELl-Sequenzen in einer vorbestimmten Weise abgebrochen werden können, ohne daß sich daraus der Verlust einer wesentlichen biologischen funktion der- DlA ergibt, z. B, Replikation, Erzeugung von Coat-Proteinen oder Verlust von Promotor- oder Bindestellen, und die eine Markierungssubstanz enthalten, die sich zur Verwendung bei der Identifikation transformierter Zellen eignet, z.B. Tetracyclin-Resistenz oder Ampicillin-Resistenz, Ein Cloningvehikel wird auch oft als Vektor bezeichnet»

Cloning — Der Prozeß zur Gewinnung einer Population von Organismen oder DM-Sequenzen, die von einem derartigen Organismus oder einer derartigen Sequenz durch sexuelle Vermehrung stammen,

Rekombinant-DIA-Molekül oder Hybrid-DHA τ- Ein Molekül, bestehend aus Segmenten von RrTA von verschiedenen Genomen, die außerhalb lebender Zellen hintereinander vereinigt wurden und die Fähigkeit besitzen, einige Wirtszellen zu infizieren und darin festgehalten werden können,

Expressions-Kontroll-Sequenz - Eine Sequenz von nucleotiden, die die Expression von Strukturgenen kontrolliert und reguliert, wenn sie operativ mit diesen Genen verknüpft ist. Sie enthalten das lac-System, das trn-System, Hauptoperator- und -promotorregionen von Phage X , die Kontrollregion von fd-Goat-Protein und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die .Expression von Genen prokaryotischer und eukaryotischer Zellen und deren Viren kontrollieren.

AU 3 4 -₁₉-

In Fig· 1 wurde eine schematische Darstellung einer Ausführungsform eines Prozesses für die Herstellung eines Gemischs von Rekombinant-DiTA-Molekülen gezeigt, von denen einige durch eingefügte DHA-Sequenzen gekennzeichnet sind, die für ein Polypeptid kodieren, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukozyten-Interferon aufweist.

Darstellung von PoIy(A)-EiTA, die Humaninterferon-mRITA enthält

Humanleukozyten wurden 5 Stunden lang bei 37 ⁰C mit Sendai-Yiren induziert und extrahiert, um ein Poly(A)-RITA-Gemisch zu gewinnen, das Hiimanleukozyten-Interferon-mRSA ("HuIFlT-mRHA") enthält» Die Induktion erfolgte nach dem Cante11-7erfahreη (The Interferon System, S. 13P - 131 und darin angeführte Literatur). Das Poly(A)-EHA-Gemisch ist in Fig. 1 ohne Berücksichtigung seiner tatsächlichen Proportionen dargestellt. Induzierte Leukozyten wurden geerntet, und

10 Zellen wurden erneut in 1 1 einer Lösung suspendiert,. die 8 g ITaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Ha₂HPO₄. H₃O und 0,2 g KH₂PO₄ in 1 1 Wasser gelöst ("PBS") enthielt, und langsam unter kräftigem Rühren zu 17 1 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA ("TE-Puffer"), 2 % Hatriumdodecy!sulfat ("SDS").' in einem 50-1-Scheidetrichter gegeben. Selbst-digerierte Pronase (Calbiochem) wurde zu 200 /Ug/ml gegeben, und die Lösung wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. 10° Zählungseinheiten/Minute ("CPM") von ' ^I-Globin-mRlTA wurden als Markierungssubstanz zur Gewinnung der PoIy(A)-RlTA und zur Steuerung des mRUA-Abbaus während nachfolgender Schritte zugesetzt, 2 M Tri-HCl (pH-Wert 9) wurde in einer 1/20 des Gesamtvolumens entsprechenden Menge ("1/20 VoI") zugegeben, und das Gemisch wurde unter kräftigem Rühren 10 Minuten lang mit 15 1 redestilliertem Phenol extrahiert. Ss wurden 3 1 Chloroform augegeben, und das Gemisch wurde 5 min lang gerührt» lach 30 min zur Phasentrennung wurde die wäßrige Phase entfernt und erneut mit Phenol und Chloroform extrahiert. Die resultierende wäßrige Phase, insgesamt

19,1 1, wurde mit 60 g SDS vereinigt. Mit 1/10 YoI 3 M Uatriumacetat (pH-Wert 5,5) und 2 YoI Äthanol wurden ITucleinsäuren aus der wäßrigen Phase ausgefällt.

ITach Aufbewahrung über ITacht bei -20 C wurde das faserige Nucleinsäurepräzipitat durch Filtration durch ein Plaste-Teesieb entfernt» Dieses Material wurde anschließend mit 200 ml TME (50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mlvl FaCl, 5 mM EDTA), das 0,5 % SDS enthielt, gerührt. Es löste sich anschließend durch die Zugabe von weiteren 350 ml dieser Lösung auf. Das nichtfaserige Präzipitat wurde durch 15 min Zentrifugieren in 1-1-Sorvall-Flaschen in einer Sorvall-Zentrifuge RC-3 mit 5000 U/min gesammelt und in 350 ml TES, das 0,5 % SDS enthielt, gelöst. Die beiden TUE-Lösungen wurden zusammengenommen, dreimal mit 1 YoI Phenol, dreimal mit 1/2 YoI Äther und dreimal mit 1 YoI Äther extrahiert. Die Gewinnung von BHiL aus der wäßrigen Phase ergab insgesamt 775 mg, wie durch das Absorptionsvermögen bei 2βΟ nm gemessen wurde.

Die Isolation des Poly(A)-HETA-Gemischs wurde durch wiederholte Chargenabsorption mit Oligo(dT)-Cellulose (Typ 7, P-L Biochemicals, Inc.) erreicht. 2,7 g 01igo(dT)-Sellulose wurden zu 500 ml gegeben, d.h. etwa zur Hälfte der RHA-enthaltenen, oben beschriebenen Lösung. Nach einstündigem Rühren bei Raumtemperatur zur Herbeiführung der Adsorption der PoIy(A)-RlTA durch Oligo(dT)-Cellulose wurden die Cellulose und das Gemisch der an sie gebundenen mRKAn durch Zentrifugieren gesammelt und einmal mit 50 ml THE und ein zweites Mal mit 15 ml TlE gewaschen. Die gebundene PoIv(A)-RiIA wurde danach durch fünf aufeinanderfolgende Waschungen mit 2 ml HpO eluiert. Die Ausbeute betrug 860 >ug PoLy(A)-RlIA, wie anhand" der optischen Dichte gemessen wurde (Präparat A). Die von der ersten Adsorption überstehende RUA-Losung wurde zwei weiteren Adsorptionszyklen unterzogen, die den oben beschriebenen genau entsprachen. Die zweite und die dritte

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Adsorption ergaben βΟΟ /Ug bzw. 170 /Ug EETA, und diese wurden zusammengenommen (Präparat B).

BItA. wurde hinsichtlich HuIPH"-^ mSHA durch Injektion in Xenopus laevis Oocyten analysiert (The Interferon System, S* 93 - 95): EHA wurde "in 15 mM Tri-HGl (pH-Wert 7,5), BQ mM UaOl (ⁿTM£ Puffer") bis zu einer Konzentration von etwa 1 mg/ml gelöst. Fünfzig nl- dieser Lösung wurden in jede der 50 Oocyten injiziert. Die Oocyten wurden über !facht bei Raumtemperatur in. Barth-Substrat inkubiert (Gurdon, J. SJinbryol and Exper. Morph., 20, S. 401 - 414 (1968) und Barth, J. Embryol and Exper. Morph., 7, S. 210 - 222 (1959)). Die inkubierten Oocyten wurden anschließend abgespült und mit einer Pasteur-Pipette in einem 1,5-ml-Eppendorf-Zentrifugenglas in 0,5 ml Triglycocoll-Puffer (pH-Wert 8,9) homogenisiert* Das Gemisch wurde 2 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert, und das Obenstehende wurde abgezogen und bei -20 ⁰C zur Analyse eingefroren. Die TFE-^ Aktivität wurde mit Hilfe der ven H. Strander und K. Cantell in "Production Of Interferon By Human Leucocytes In Yitro ^i; (Herstellung von Interferon durch.Humanleukozyten in vitro), Ann. Med. Extd. Penn», 44, S. '265 - 273 (1966) beschriebenen Plaque-Analyse bestimmt. Sine Einheit IPIF-C^- reduziert Yirus-Plaques um 50 %* Die Potenz von einem IPlT- oC.-Präparat wird im. Verhältnis zum Human-Bezugs-HuIP'lT- cL 69/19 angegeben (Internationales Symposium über Standardisierung von Interferon-und Interferon-Induktoren, 1969). Alternativ wurde die Analyse auf der Basis der Reduktion des cytopathischen Effektes durchgeführt,und ζ^ar im wesentlichen wie von Έ..3+ Stewart, II und S.E. Sulkin in "Interferon Production In Hamsters Experimentally Infected With Rabies Virus" (Interferonerzeugung in experimentell mit 'Tollwutviren

infizierten Plamstern), Proc, Soc. Exu. Bio!. Med., 123, S. c50 - 653 (1966) beschrieben, nur mit dem Unterschied, daß Human-CCL-23-Zellen verwendet wurden und der Immunitätstest

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mit Mengo-Viren vorgenommen wurde. Die Oocyten-Extrakte hatten 300 IU IFSJ"-öl-Aktivität je ,ug injizierte EE^-A* Bei späteren AnaLysen dauerte die Inkubation von injizierten Oocyten 48 Stunden, und es wurde nur das Inkubationsmedium analysiert, da der größte Teil des Interferons von den Oocj/ten ausgeschieden wird· (A„ Colman und J. Morser, "Esport Of Proteins -From Oocytes Of Senopus laevis" ' (Abgabe von Proteinen aus Oocyten von Sanopus laevis). Cell, 17, S, 517 - 526 (1979 Zur ?;eiteren Reinigung- der PoIy(A)-RETA wurde ausreichend 0,5 1 Äthylendiamintetraessigsäure ("EDTA") zu dem PoIy(A),-EEA-Präparat A gegeben,, um die Konzentration auf 5 mM EDTA zu bringen.» Die resultierende Lösung wurde'zweimal mit einem gleichen Volumen von mit TIES gesättigtem Phenol und fünfmal mit einem gleichen Volumen Äther extrahiert. Sie wurde danach durch eine 0,1-ml-Säule von Bio-Rad-Cheles-100 geleitet, 90 s lang bei 100 ⁰G gehalten und auf 13 ml eines 5 bis 23 %igen Saccharosegradienten aufgebracht, der 50 mM Tri-HCL (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA,. 0,2 M ITaCl enthielt.

10 000 cpm von 5'-terminal- P-markierten DlA-Fragmenten, die durch gleichzeitige Digerierung von pBH322 mit Restriktionsenzymen Hindlll und Psti erzeugt worden waren (lew England. Biolabs),, wurden als Größenmarkierer zugesetzt. Das Zentrifugieren erfolgte bei 10 ⁰C 16 Stunden lang in einem. SW40 Rotor mit 35 000 U/min· Es wurden Fraktionen (0,6 ml) mit einem ISCO-Gradientenkollektor von 1 ml/min gesammelt. Die Fraktionen wurden wie oben beschrieben hinsichtlich. HuIFlT- cC mRUA analysiert, und ihre Position in bezug auf

die.-' P-DITA-Markierer wurde zur späteren Bezugnahme notiert. Bei anschließenden Zentrifugierungen wurden HuIFH-σί.. mRHA-haltige Fraktionen im Verhältnis zu den Markierern identifiziert» Die Fraktionen mit HuIFU-cL mREA-Aktivität enthielten 30 /Ug PoIy(A)-SEA* Sie wurden mit 2 VoI Ti\TS, das 0,5 % SDS und 0,02 % Polyvinylsulfat enthielt (bei späteren Präparaten wurden auf Polyviny!sulfat verzichtet), vermischt und auf eine 50-/Ul-01igo(dT)-Cellulosesäule aufgegeben. lach dem 7/aschen der Säule, wie oben beschrieben,, wurden

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40 /Ug des RHA-Gemischs durch 4 Waschen mit 0,6 ml steri-•lem destilliertem. Wasser eluiert. Hach der Äthanolpräzipitation wurde die HITA bis auf 1 mg/ml in 0,5 mM SDTA gelöst.

Wie oben beschrieben,., wurde eine Analyse der EalFM-oL mRHA-Aktivität mit einer Portion des PoLy(A)-RHA-Präzipitats vorgenommen· Es hatte eine spezifische Aktivität von 3^00 IU Interferon/yUg injizierte HETA* Daher wies die PoLy(A)-KSlA durch den Saccharosegradienten eine etwa 1Ofache Anreicherung in bezug auf HuIFF- oL mRHA. auf* Bei einem anschließenden ähnlichen Präparat wurde eine etwa 40fache Anreicherung erzielt». Präparat B wurde ähnlich gereinigt, und da es eine ähnliche spezifische Aktivität wie Präparat A hatte, wurden beide vereinigt.

An dieser Stelle sollte man.sich im klaren sein, daß selbst das von dem Saccharosegradienten gewonnene PoLy(A)-RHA-PrO-dukt eine sehr große Anzahl verschiedener. inRHAn enthält. Bis auf die für IFE-^, spezifische mRHA "sind die anderen mPJTAn unerwünschte Verunreinigungsstoffe (Fig* 1). Leider verhalten sich diese Verunreinigungs-HSAn während des übrigen erfindungsgemäßen Cloning-Prozesses ähnlich wie HuIFH-cC mRHA. Ihr Vorhandensein in der PoLy (A)-HSA wird daher im fertigen Präparat zu einer großen Anzahl unerwünschter Bakterienclone führen, die Gene enthalten, die für andere Polypeptide als für IFH-cC kodieren,. Diese Verunreinigung wirft komplizierte Screeningprobleme bei. der Isolierung der verlangten IFH-(^, -ELybridclone auf* Im Falle von IFH-oL wird das Screeningproblern, noch, durch den Mangel an. einer genügend gereinigten Probe von HuIFH-C^. mEHA oder HHA oder Teilen davon erschwert, die als Screening-Sonde für die Indentifikation der erwünschten Clone dienen soll. Daher ist der Screening-Prozeß für die IFH-^-Clone sehr zeitaufwendig und schwierig* Da nur von einem sehr geringen Prozentanteil IFJT-cC-Clone selbst zu erwarten ist, daß sie IFU-pt in einer biologisch aktiven Form verwirklichen, ist die Isolierung eines

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aktiven Glons mit einem Screening-Prozeß zu vergleichen, bei dem "die Nadel im Heuhaufen gesucht wird".

Zum Glück kann man die Rekombinant-DIA-Technologie zur Gewinnung einer gereinigten Probe von HuIPlT-cL mRHA oder CDMA' oder eines Teiles davon anwenden. Diese gereinigten mRSA oder cDlIA kann zum raschen Screening sehr großer Mengen von Bakterienclonen verwendet werden, so daß dadurch die Wahrscheinlichkeit der Isolierung eines Clons, der IPlI-φ in einer aktiven Porm verwirklicht, erhöht wird.

Synthese- von cDHA-Gemisch, das HuIPIT-^ cDUTA enthält..

Die mit IPÜ-oC mRSFA ange re icher te" Po Iy (A)-HBFA (Präparat A+B) wurde als Template für die Herstellung von einsträngiger Komplementär-RM. (cDHA) verwendet (Pig. 1) (siehe A. Efstratiadis,. u.a», "PuIi Length And Discrete Partial Reverse Transcripts Of Globin And Ghorion inRMAs'* (Revers-Transkripte voller Länge und in einzelnen Teilen von Globin- und Chorion-HiRiIAn), Cell, 4, S- 367 -378 (1975) und darin angeführte Literatur).. Das 800-/Ul-Reaktionsgemisch enthielt 40 mM Tri-HGl (pH-Wert 7,5), 30 mM FaCl, 5 mJÜ MgCl₂, 0,5 ml DTT (Cal-Biochem), 20 ,ug/ml Oligo(dT) 12-18 (P & L Biochemicals), 5 mM dGTP (Schwarz), dCTP (Laevosan) und dTTP (Sigma), 5 mM" ^²P-dATP (2El", spezifische Aktivität 100 000 cpm/nMol), 60 /ug/ml PoIy(A)-RUA und 280 Einheiten Vogel-ffiyeloblastosis-7irus (AM7)-Reverstranscriptase (ein Geschenk von Life Science, Inc.,. St. Petersburg, Plorida). Each einstündiger Inkubation bei 37 ⁰G wurden 0,5 M EDTA und 20 % SDS (rekristallisiert) zu 10 mM EDTA Und 0,1 % SDS gegeben. Das Gemisch wurde mid;· 1 YoI Phenol (destilliert) extrahiert). Die Phenolphase wurde mit 200 /Ul 200 mM Tri-HGl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA und 0,1 % SI)S gewaschen, und die wäßrigen Phasen wurden zusammengenommen. Diese wurden mit einem gleichen Volumen Äther (Pluka, analysenrein) extrahiert und auf einer 0,5-mI-Säule von Sephadex G—100 in TICS chromatographiert.

J 4 _

Fraktionen von 0,1 ml wurden bei 0,3 ml/min gesammelt· Radioaktivität aufweisende Fraktionen (durch Cerenkov-Strahlung gemessen) wurden zusammengenommen, und 3 M iTatriumacetat wurden zu 0,3 M gegeben· Die nucleinsäuren wurden mit 2,5 VoI Äthanol ausgefällt· ETach Aufbewahrung über !lacht bei.-20 G wuräen. die Proben zentrifugiert, und das Obenstehende wurde verworfen* Das Präzipitat wurde in 180 /Ul destilliertem Wasser gelöst und in ein silikonisiertes Sppendorf-Glas übertragen. Ss wurden 20 /ul 5 M FaOH zugesetzt,, und das Gemisch, wurde 40 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen· Es wurden 20 /Ul 5 S Ifetriumacetat, 100 /Ul destilliertes Wasser und 500 /Ul Äthanol zugegeben, lach Kühlen über lacht bei -20 ⁰C wurde das resultierende Präzipitat durch. 20 min Zentrifugieren bei 0 ⁰C mit einer Kraft,, die gleich der 10 000 fachen Schwerkraft (10 000 :tg) war, gesammelt. Die Ausbeute an einsträngiger cDHA betrug 10 /Ug·

Ss ist wiederum selbstverständlich, daß es sich bei dem oben hergestellten einsträngigen cDIIA-Produkt in Wirklichkeit um ein kompliziertes Gemisch einer großen Anzahl verschiedener cDBAn handelt, die von den entsprechenden, in dem Pol^CO-RIA-Gemisch vorhandenen mRHAn transcribiert wurden (Pig* 1), Uur sehr wenige dieser cDlIAn sind IH-T-cL verwand d»h. HuIj¹IJ- cDIAn, Sin weiterer Faktor trägt noeh zur Komplizierung des cDHA-Gemischs bei - gewöhnlich wird nicht jede mRHA-Speaies des Poly (A)-RHA-Gemischs vollständig transcribiert· Stattdessen kann der Transcriptionsprozeß bei jeder mRlA-Spezies aufhören, bevor das Ende der mRSTA erreicht ist· Es können daher die vielfältigsten cDiTA-Spezies von jeder mRITA-Spezies erzeugt werden (in Fig, 1 nicht dargestellt)· Jede Spezies wird sich in dem anschließenden Cloningprozeß mehr oder weniger ähnlich verhalten, so daß Bakterienclone erzeugt werden,, die Rekombinant-D3A-Moleküle enthalten, die nur ein Fragment des Gens für ein bestimmtes Protein aufweisen. Die Anwesenheit dieser fragmenthaItigeη Clone kompliziert den endgültigen Clon-Screeningproseß noch

mehr. ' _or

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Die Größen der einzelnen einsträngigen cDNAn wurden 'durch Elektrophorese einer kleinen Aliquote auf einem alkalischen 2 %igen Agarosegel unter Verwendung von 30 mM HaOH, 2 mM EDTA als Elektrolyten bestimmt (M· W* McDone11, u»a,, "Analysis Of Restriction fragments Of T7 DNA And Determination Of Molecular Weights By Electrophoresis Xn' Neutral And Alkaline Gels" (Analyse von Restriktionsfragmenten von T7-DNA und Bestimmung der relativen Molekülmassen durch Elektrophorese in neutralen und alkalischen Gelen), J* Mol. .Biol». 110, 3. 119 - 146 (1977)). Die ³²P-CDHA hatte eine Länge von 600 bis 1000 Nucleotiden in bezug auf einsträn-

32 gige Globin-cDNA, und P-markierte DNA-Fragmente wurden als Größenmarkierer verwendet.

Darstellung: von doppelstrsngiger cDNA ' "

Aus der einsträngigen cDNA kann doppelsträngige durch Behandlung mit DNA-Polymerase I gemacht werden (T, Maniatis,. u*a·., "Amplification And Characterization Of A β -Globin Gene Synthesized In Vitro" (Verstärkung und Charakterisierung eines in vitro synthetisierten β -Globin-Gens), Cell, S S* 163 - 182 (1976).· Die ausgefällte einsträngige cDNA von oben wurde in 200 /Ul HpO gelöst, 2 min lang auf 100 C gehalten und inkubiert in 500 ,ul 0,1 M durch Hitze, denaturiertem Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,9), 10 mM g 10 mM DTT (Calbiochenu), 1 mM von je dATP (Merck), dGTP (Schwarz) und dCTP (Laevosan), 1 mM %-dTTP (NEN, spezifische Aktivität Ί00 000 cpm/nMol) und 150 Einheiten/ml E.coli DNA-Polymerase I (Boehringer-Mannheim), Nach 6,5 h bei 15 ⁰C wurden 0,5 M EDTA und 20 % SDS zu 10 mM EDTA und 0,1 % SDS gegeben..Das Gemisch wurde anschließend mit 500 /Ul Phenol extrahiert, und die Phenolphase wurde mit 250 /Ul 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 5* EDTA ("TE-Puffer") ree:ctrahiert. Die beiden wäßrigen Phasen wurden zusammengenommen und auf einer 5-ml-Säule von Sephades G-100 unter den gleichen oben beschriebenen Bedingungen chrasatographiert. Zu 0,3 M wurde- Natriumacetat (3 M) gegeben, und 2,5 VoI

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den von Ξ« coli einschließlich col El, pCR1, pBR322 und ihre Derivate, breiteren Wirtsbereich-Plasmiden, z.B. RP4, Phagen-DlIiL,. z.B. den zahlreichen Derivaten von Phage λ , z.B. 3311 989, und Vektoren,- die von Kombinationen von Plasmieden und Phagen-DMn abgeleitet sind, wie Plasmiden, die zur Verwendung von Phagen-DITA oder anderen Espressions-Kontroll-Sequenzen modifiziert wurden, oder Hefeplasmiden wie dem 2 /U-Plasmid oder Derivaten davon. Brauchbare Wirte können Bakterienwirte wie Stämme von B. coli, z. B. E." coli EB 101, E. coli Σ2282, E. coli MRC1 und Stämme von Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus und anderen Bazillen, Hefearten und andere Fungi, Tier- und Pflanzenwirte wie Tier-(einschließlich Human—) oder Pflanzenzellen in Kultur oder andere Wirte umfassen, natürlich werden nicht alle Wirt-Vektor-Kombinationen gleich wirksam sein. Die entsprechende Selektion der T/irt-Gloningvehikel-Kombination kann von Fachleuten nach Berücksichtigung der oben erläuterten Prinzipien vorgenommen werden,, ohne vom. Geltungsbereich der Erfindung abzuweichen·

Außerdem können in jedem soezifischen Cloningvehikel verschiedene Stellen für die Insertion der doppelsträngigen DHA. ausgewählt werden* Diese Stellen werden normalerweise durch die Restriktions-Endonuclease, die diese abbricht, bezeichnet. Beispielsweise liegt in pBB.322 die Pstl-Stelle in dem Gen für β -lactamase zwischen den Hucleotid-Tripletts, die für die Aminosäure 181 und 182 dieses Proteins kodieren. Diese Stelle· wurde von Villa-Komaroff, u.a., jsujora, bei seiner Synthese von Protein, das Ratten-Proinsulin-Antigen-Determinanten aufweist, verwendet» Sine der beiden Hindll-Endonuclease-Erkennungsstellen liegt zwischen den für die Amiriosäuren 101 und 102 kodierenden Tripletts und einer der zahlreichen Tag-Stellen an dem für Aminosäure 45 von β -Lactamase in pBR322 kodierenden Triplett. In ähnlicher Weise liegen die EcoRI-Stelle und die PvuII-Stelle in diesem Plasmid außerhalb irgendeiner Codierungsregion, wobei die ScoRI-Stelle zwischen den für Resistenz gegenüber

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Äthanol wurden zum Ausfällen der DHiI eingemischt.- Insgesamt wurden 13 /Ug DHA gewonnen»

Die DM wurde mit Huclease S. behandelt, hergestellt nach der Methode von R. C. Wiegand, u»a. "Specificity Of The S^ Huclease From Aspergillus oryzal" (Spezifität der S.-Huklease von Aspergillus oryzal), J. Biol, Chem., 250, S-. 8848 8855 (1975)· Die ausgefällte DUA wurde in 250 ,ul S₁-PUffer (0,2 M HaGl), 50 mil Hatriuinacetat (pH-Wert 4,5) und 10 inM Zinksulfat) gelöst und 30 min lang-auf 37 ⁰C gehalten· 1,5 /Ul S₁-Enzym (11 Einheiten//ul) wurden zugegeben, und das {j Gemisch wurde 30 min lang bei 37 C inkubiert. SDS und SDTA wurden zu 0,1 % SDS und 5 mM' SDTA gegeben, und das Gemisch wurde mit 250 /Ul Phenol extrahiert. Die Phenolphase wurde mit 100 /Ul TE-Puffer gewaschen. Die wäßrigen Phasen wurden zusammengenommen und auf einer Säule von Sephadex G-100 (Pharmacia) in THE chromatographiert; bei 0,3 ml/min wurden 0,1-ml-Fraktionen gesammelt, und die Cerenkov-Strahlung jed&iz !Fraktion wurde bestimmt. Hach der Ausfällung mit Äthanol und Hatriumacetat wie oben wurden 8 ,ug doppelsträngige cDHA gewonnen*

Es muß wieder darauf hingewiesen werden, daß es sich bei der oben erzeugten doppelsträngigen cDHA um ein Gemisch ei^v-- ner großen Anzahl von cDHAn und Fragmenten davon handelt, von denen nur sehr, wenige HuIPH-oC.cDHÄ." oder deren Fragmente sind (Fig· 1). ......

Cloning von doüpelsträngiger DHA

Eine große Vielzahl von Wirt-Cloningvehikel-Kombinationen kann für das Cloning der wie oben beschrieben hergestellten, doppelsträngigen cDHA verwandet werden.. Zum Beispiel können nützliche Cloningvehikel aus Segmenten von Chromosomen-, Hicht-chromosomen- und synthetischen DHA-Sequenzen bestehen, wie verschiedenen bekannten Bakterienplasmiden, z.B. Plasmi-

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Tetracyclin bzw. Ampicillin kodierenden Genen liegt. Diese Stelle wurden von Itakura, u.a. sowie Goeddel, u.a. in ihren- Rekombinant-Syntheseschemata, supra, verwendet. Diese Stellen sind durch den Fachmann leicht auszumachen. Es ist natürlich, verständlich, daß ein erfindungsgemäß nützliches Cloningvehikel keine Restriktions-Endocuclease-Stelle für die Insertion des gewählten DIA^Fragmentes haben muß. Stattdessen könnte das Vehikel durch andere Maßnahmen mit dem Fragment verknüpft werden.

Der Vektor oder das· Cloningvehikel, und vor allem die darin für die Anfügung des gewählten D¥A-Fragmentes zur Bildung eines Rekombinant-DITA-Moleküls gewählte Stelle werden durch die verschiedensten Faktoren bestimmt, z.B. die Anzahl der auf ein bestimmtes Restriktionsenzym ansprechenden Stellen, die Größe des zu verwirklichenden Proteins, die Suszeptibilität des verlangten Proteins gegenüber proteolytischem Abbau durch Wirtzellenenzyme,. Kontamination des Proteins, das durch Wirtzellenproteine, die während der Reinigung schvi/er zu entfernen sind, zu verwirklichen ist, Ezpressionscharakteris.tika, wie die Lage von Initiator- und Terminator-Codons in bezug auf Vektorsequenzen, und andere, vom Fachmann erkannte Faktoren. Die Wahl eines Vektors und einer Insertionsstelle für ein bestimmtes Gen wird durcheine Ausgewogenheit dieser Faktoren bestimmt, wobei nicht alle Selektionen für einen bestimmten Fall gleich wirksam sind.

v7enn auch mehrere Methoden im Fachgebiet für die Insertion fremder DIiA in ein Cloningvehikel oder einen Vektor zur Bildung eines Rekombinant-DiIA-Moleküls bekannt sind, ist die für eine erste erfindungsgemäße Konstruktion bevorzugte LIethode die von Villa-Komaroff, u.a., supra beschriebene und in Fig. 1 gezeigte. Diese Methode ist durch Digerieren des Plasmids (vor allem von p3R322) mit dem Restriktionsenzym, das für die zur Insertion gewählte Stelle typisch ist (vor allem Psti), und Zugabe von dGMP-Schweifen zu den Termini

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durch Terminaltransferase gekennzeichnet, dGMP-Schweife werden zu den 5'-Tennini des abgebrochenen Plasmids zur Regenerierung der Pstl-Stelle hinzugefügt und ermöglichen die Verknüpfung mit einem cDUA Fragment, das die komplementären Schweife trägt» In ähnlicher 7/eise wird die doppelsträngige cDISA·durch die Zugabe von dCMP-Schweifen zu den 3'-Ter- mini verlängert, um die Verknüpfung mit dem geschweiften Plasmid zu ermöglichen» Das geschweifte Plasmid und die . cDSA werden anschließend zur Insertion der cDEA in die entsprechende Stelle des Plasmids und zur Zirkularisierung der Hybrid-DETA verstärkt (annealed), wobei der komplementäre Charakter der Schweife ihre Kohasion erlaubt (Fig» 1). Das resultierende Rekombinant-DSA-Molekül trägt, jetzt ein Gen an der gewählten Restriktionsstelle (Pig. 1).

Efatürlich eignen sich auch andere bekannte Methoden der Insertion von DIfA-Sequenzen in Cloningvehikel zur Bildung von Rekombinant-DNA-Molekülen im Rahmen der Erfindung ebenso gut» Diese umfassen zum Beispiel direkte Ligation, synthetische Linker, Sxonuclease- und Polymerase-verknüpfte Reparaturreaktionen mit anschließender Ligation oder Extension des DHA-Stranges mit DSA-PoLymerase und einer entsprechenden einsträngigen Template mit anschließender Ligation.

Ss ist natürlich zu beachten, daß die an der gewählten Stelle des Cloningvehikels eingefügten Hucleotid-Sequenzen oder das eingefügte cDITA-Fragment nucleotide umfassen können, die kein Teil des tatsächlichen Strukturgens für das verlangte Pol^peptid sind, oder daß sie nur ein Fragment des vollständigen Strukturgens für das verlangte Protein enthalten können. Auf welche Yielse die DlIA-Sequenz auch einge-'·' fügt wird, erforderlich ist dafür lediglich, daß ein transformierter 7/irt ein Polypeptid erzeugen wird, das eine biologische oder immunologische Aktivität von HuIFlT- ck hat, oder daß die DIiA-S eque η ζ selbst als Eybridisierungssonde zur Selektion von Clonen nützlich ist, die DHA-Sequenzen enthal-

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ten, die für die Erzeugung von Polypeptiden mit einer immunologischen oder biologischen Aktivität von HuIi¹E-oC brauchbar sind,. · ' . .

Das Cloningvehikel oder der das fremde Gen enthaltende "Vektor wird zur Transformation eines Wirtes verwendet, so daß der Wirt'das Protein oder einen Teil davon, für den die Hybrid-DHA-kodiert, verwirklichen kann. Die Selektion eines passenden Wirtes wird auch durch eine Reihe von Paktoren bestimmt,, die im Fachgebiet bekannt sind. Dazu gehören beispielsweise Verträglichkeit mit dem gewählten Vektor, Toxizität von durch das Hybridplasmid kodierten Proteinen, leichte Rückgewinnung des verlangten Proteins, Espressionscharakteristika, Biosicherheit und Kosten. Es muß ein Gleich gewicht zwischen diesen Faktoren unter dem Gesichtspunkt gesucht werden, daß möglicherweise nicht alle Wirte gleich wirksam für die Expression eines bestimmten Rekombinant-DHA-Moleküls sind·.

Bei der vorgestellten Synthese ist das bevorzugte Initial- ' Cloningvehikel das Bakterienplasmid pBR322 und die bevorzugte Ihitial-Restriktions-Endonuclease-Stelle darin ist die Pstl-Stelle (Fig· 1)* Das Plasmid ist ein kleines (relative Molekülmasse etwa 2,,6 Megadalton) Plasmid, das Resistenzgene gegenüber den Antibiotika Ampicillin )Amp) und Tetracyclin. (Tet) trägt». Das Plamid ist ausführlich, charakterisiert worden (F.. Bolivar, u«a., "Construction And Characterization Of Hew Cloning Vehicles II· A Multi-Purpose Cloning System" (Konstruktion und Charakterisierung neuer Cloningvehikel II* Ein Hehrzweck-Cloning-System), Gene, S. 95 - 113 (1977); J·* G- Sutcliffe, ^!lpBR322 Restriction Map Derived From The DEA Sequence: Accurate DHA Size Markers Up To 4361 nucleotide Pairs Long'¹ (pBR322 Restriktionskarte, abgeleitet von der DM-Sequenz: Genaue D HA Größenmarkierer bis zu 436.1 Hucleotid-Paare lang), nucleic Acids Research, 5, S. 2721 - 2728 (1978)). Die Insertion des DHA-Produktes in diese Stelle schafft eine große An-

^43 40 3 4-32-

zahl von Bakterienclonen, von denen jedes eines der DHJL-Ge η e oder Fragmente davon enthält, die in dem" zuvor zubereiteten DHA-Produkt vorhanden sind. Wieder werden nur einige wenige dieser Clone das Gen für IFH- oder Fragmente davon enthalten (Fig.- 1)· Der bevorzugte Wirt für das erfindungsgemäße Initial-Cloning ist Ξ» coli HB' 101. Andere Versuche wurden mit E. coli K 1776 durchgeführt, einem in der GB-PS 1.516. 458 beschriebenen Wirt, der bei der American Type Collection, Rockville Maryland, USA unter der Bezeichnung ATCC Hr* 31244 hinterlegt wurde.

1. Darstellung von Pstl-gespaltenem, dGHP-verlängertem pBR322

Plasmid pBR322' (20 ,ug) wurde mit 21 Einheiten Pstl-Endonuclease (MRE Porton Downs oder 35Tew England Biolabs) in 150 ,ul 10 mk Tri-HCl (pH-Wert 7,5), β mM MgCl₂, 50 mM ITaCl, β mM 2-Mercaptoä%hanol, 200 mg/ ,ul Rinderserumalbumin ("BSA" (Calbiochem) digeriert. Hach 2 h bei 37 ⁰C wurde das Gemisch mit 1 ToI Phenol-Chloroform (1:1) und 1 YoI Äther extrahiert und mit Äthanol ausgefällt.

Die Zugabe von homopolymeren dGMP-Schweifen (Fig. 1) durch Terminal-Desorsynucleotid-Transferase (TdT) (gereinigt nach F.J. Bullum "Deoxynucleotide Polymerizing Enzymes From Calf Thy'mus Gland" (Desoxynucleatid-Polymerisierungs-Enzyme von Kalbs-Thymusdrüse) in Methode in Enzymology, (L. Grossmann und K* Moldave, Herausg.), Academic Press, Hew York, 128, S. 591 - 611 (1968) erfolgte in einem Reaktionsvolumen von 328 ,ul, das 100 mM Hatriumaacedylat (pH-Wert 7,2), 10 mM HaH₂PO₄, 5 mM MgCl₂, 1 mM dGTP, 50 ,ug/,ul BSA und 3 bis 6 Einheiten TdT (wie oben gereinigt) je ,ug DHA enthielt. Die Inkubation dauerte 20 min bei 37 ⁰C. EDTA wurde zu 10 mM gegeben und das Gemisch wie oben extrahiert und 2. Tage lang gegen TiIE-Puff er dialysiert. -

24 3 40 3 4^:

33 2. Darstellung von dCPM-verlängerter DBTA

Doppelsträngige DlTA wurde mit dCMP-Residuen nach" Standardverfahren verlängert (z.B, Villa-Eomaroff, u.a·, aupra). 150 ng der oben beschriebenen doppeIsträngigen cDSA wurden in 8 yul -100 mM latriumcadodylat (pH-Wert 7,2), 2,5 mM CoCl₂,. 5.0 /Ug/ /Ul. BSA, 0,1'mM dCTP, das 3 bis 6 Einheiten gereinigtes TdT je yUg DSA enthielt, 8 min lang bei 27 ⁰C inkubiert und dann bei -20 ⁰C eingefroren. Wie vorher handelt es sich bei der dCMP verlängerten DKA um ein Gemisch verschiedener Spezies,, von denen nur sehr wenige IPII-ver- wandt sind .(Pig* Λ).*. - - .

3· Darstellung von mit Ca⁴"¹" behandelten E«. coli X1776

Eine einzige Kolonie von.Ε.» coIi Σ1776 wurde in 100 ml . Tryptonmedium (C-, Weissmann und W» Boll, "Reduction Of Pos- · sible Hazards In The. Preparation Of Recombinant Plasmid DUÄ." (Verminderung möglicher Gefahren bei der Herstellung von Rekombinant-Plasmid-DHA), Mature, 261, S, 428 - 429 (1976), ergänzt durch. 100 yug/ml Diaminopimelinsäure (Koch-Light Laboratories), 10' /Ug/ml STalidizin-säure (Calbiochem) und 10 g/ Tetracyclin (Achromycin , American Cyanamid) inokuliert. Die Kultur wurde bei 37 ⁰C bis zu einer scheinbaren optischen Dichte von 0,6 bei 650 nm ^)ODgCn) (gemessen mit einem Beckman Spektrop.hotometer DB) gezüchte.t und. 30 min lang in Eis abgeschreckt. Die Kultur wurde anschließend mit 4OOO U/min in einem ausschwingenden Sorvall-Rotor H4 sedimentiert, die Zellen wurden mit 50 ml 10 mM HaCl gewaschen, durch Zentrifugieren repeiletisiert und in 20 ml 100 mM GaCl₂ resuspendiert. Die Suspension wurde 30 min lang in Eis gekühlt, durch Zentrifugieren pelletiaiert und in 4 ml 100 mM GaCl₉ resuspendiert und für den Gebrauch über !facht auf Sis aufbewahrt.. E. c0Ii ΞΒ101 wurden für die Transformationen nach der Methode von M. Mandel und A. Higa "Calcium Dependent Bacteriophage DSEA Infection" (Calciumabhängige Bakteriopha-

. - 34 -

243 40 3 4-

gen-DHA-Infektion), J. Mol. Biol., 53, S. 159 - 162 (1970) hergestellt· Aliquoten (0,5 ml) wurden bei -70 ⁰C gefroren gehalten und behielten ihre Aktivität mindestens 3 Monate.

4. Verstärken von dGMP-verlängertem pBR322 und dCMP-verlängerter DITA

Die Verstärkung des geschweiften, Pstl-gespaltenen pBR322 und der geschweiften cDIIA erfolgte nach der Beschreibung von J· Van den Berg, u.a«, "Comparison Of Cloned Rabbit And Mouse $ -Globin Genes Showing Strong Evolutionary Divergence Of Two Homologous Pairs Of Introns" (Vergleich von geclonten Ratten- und Mäuse-/5 -Globingenen, die starke evolutionäre Divergenz zweier homologer Intronpaare zeigen), Fatüre, 276,

5. 37 - 44 (1978). 8 ng des dCMP- verlängerte η DHA.-Produk.tes wurden mit"22'ng dGMP-verlängertem, Patl-gespaltenein pBR322 in 50 /Ul TIE-Puffer gemischt. Die Inkubation erfolgte für 4 aufeinanderfolgende 1-h-Stufen bei 65 ⁰C, 46 ⁰C, 37'⁰C und 20 ⁰C* Es wurden 20 ,ul 100 mH Tri-HCl, (pH-Wert 7,-5), 100 mK CaCl₂,- 100 mM MgCl₂ und 50 ,ul THE-Puffer zugesetzt,, und das Gemisch wurde 20 min lang auf Sis gekühlt»

Das Produkt ist natürlich ein umfassendes Gemisch von verschiedenen Rekombinant-DUA-Molekülen und .einigen CloningvehikeIn ohne eingefügte DIiA-Sequenzen. Jedes Rekombinant-DHA-Molekül enthält jedoch ein cDITA-Segment an der Pstl-Stelle. Jedes derartige cDTTA-Segment kann ein Gen oder ein Fragment davon aufweisen., lur sehr wenige der cDHA-Segmente kodieren für IPIi oder einen Teil davon (?ig. 1). Die grössere Mehrheit kodiert für eines der anderen Proteine oder Teile davon, deren mRlIAn ein Teil der für den erfindungsgemäßen Prozeß verwendeten PoJLy(A)-DHA waren (Pig. 1).

24 3 40 3 4 -

5- Transfektion von S. coli Σ177& mit den verstärkten Hybridplasmiden

Die Transfektion von Ξ. coli Z1776 mit dem Gemisch von Rekombinant-DBA-Molekülen erfolgte nach der Beschreibung von J. Tan den Berg, a«a«« supra» P3-Behältereinrichtungen wurden für den Transfektionsprozeß und alle anschließenden Schritte verwendet, in denen die resultierenden transformierten Bakterien behandelt wurden· Die verstärkten pBR322-Rekombinant-DIA-Moleküle wurden zu 100 /Ul Ca⁺⁺-behandelten B. coli Σ1776, die- zuvor zubereitet worden waren, gegeben, und das Gemisch wurde 20 min in Sis gekühlt, 10 min lang auf 20-⁰G gehalten,, und 0,6 ml Trypton-Hedium wurden zugesetzt.. Das Gemisch wurde auf 2 wie oben vorbereiteten Tryptonmedium-Agarplatten verteilt» Der Wirkungsgrad der Transfektion betrug 3*3 ζ 10 Kolonien je ,ug verstärkte pBR322-Transfektions-DITA; ursprüngliches pBR322 ergab 3 ζ 10 Kolonien je

Da Plasmid pBR322 das Gen für Tetracyclin-Resistenz enthält, vermehren sich. Ξ«. coli Wirte,, die mit einem Plasmid, dessen Gen intakt ist, transformiert wurden, in Kulturen, die dieses Antibiotikum enthalten,_: mit Ausnahme derjenigen Bakterien,, die nicht auf diese ?/eise transformiert worden sind*· Daher ermöglicht die Vermehrung .in einer Tetracyclin enthaltenden Kultur die Selektion von Wirten, die mit einem Rekombinant-DilA-Molekül oder e.inem. rezyklisierten Yaktor transformiert wurden.

Uach. 48 h bei 37 ⁰C wurden einzelne Kulturen entnommen und in 100 /Ul Try.ptonnedium (vorbereitet wie oben) in den Vertiefungen von Mikrotiterplatten (JD^natech) suspendiert, Kach Inkubation bei 37 ⁰C über Hacht wurden 100 /al Glycerin in jede Vertiefung eingemischt. Die Platten wurden bei -20 G aufbewahrt, und es wurde eine Sammlung von 100 000 einzelnen Glonen transformierter S. coli Σ1775 zusammengestellt.

40 3 4 .

Diase 100 000 Clone enthalten eine Vielzahl von Rekombinant-DHA-Molekülen, die vollständig oder teilweise Kopien des Gemischs von mRlTAn in dem Poly (A)-RITA-Präparat von IPlT-. erzeugenden leukozyten sind (Fig· 2). Die Mehrzahl von ihnen wird nur ein einziges Rekombinant-DITA-Holekül enthalten. Hur sehr wenige dieser Rekombinant-DHA-MoIeküle sind IFlT verwandt. Daher müssen die Clone einem Screeningprozeß unterzogen werden, um die IFIT-verwandten Clone von den anderen zu trennen.

Screeningprozeß für einen HuIBIT- ώ cDITA enthaltenden Clon«

Es gibt verschiedene Möglichkeiten für das Screening von Bakterienclonen, die Humanleukozyten-Interferon-cDlTA enthalten ("HuIZd-(^cDlTA")♦ Diese umfassen beispielsweise RHA-Selektions-Hybridisierung "(Alwine,u.a., infra), Differentialhybridisierung (T*P· St· John und R. ?/. Davis, "Isolation Of Galactose-Inducible DHA-Sequences Prom Saccharcinyces Cerevisiae By. Differential Planque Filter Hybridization" (Isolierung von durch Galaktose induzierbaren DM-Sequenzen von Saccharomyces Cerevisiae durch Differential- ' Plaque-Pilterhybridisierung), Cell, 16, S. 443 - 452 (1979); Hoeijmakers, u*a* infra), Hybridisierung mit einer synthetischen Sone (B· Foyes, u.a., "Detection And Partial Sequence Analysis Of Gastrin mBITA By Using An Oligodeosynucleotid Probe" (ITachweis und Partial-Sequenz-Analyse von Magen- niBML unter Anwendung einer Oligodesoxynucleotid-Sonde), PrQC. ITatl. Acad. Sei. USA, 7β, S. 1770 - 1774 (1979)) oder Screening hinsichtlich von Clonen, die das verlangte Protein erzeugen, durch immunologische (L. Yilla-Komaroff, u«.a·, supra) oder biologische (A.C«Y. Chang, u.a.,. supra) Analysen· Es wurde die RSA-Selektions-Hybridisierung gewählt, da sie die zweckmäßigste und erfolgreichste Methode für Primär screening von Clonen ist, die IPlT- <jC cDITA enthalten ·

243 40 3 4 -

Α.. RITA-Selektions-Hybridisierungs-Analyse 1. Übersicht über die Initialanalyse

In S¹Ig* 2 ist zu sehen, daß Rekombinant-DUA von einer Kultur eines Gemischs von 512 Glonen aus der oben genannten Sammlung von Clonen (zwei Gemische von 2 in Fig. 2 gezeigten Clonen) isoliert wurde (Schritt A), Der Grund für die Wahl dieser Chargengröße wird anschließend erklärt. Die Rekombinant-DlA-Moleküle wurden gespalten, denaturiert und zu leukozyten-Poly(A)-EEFA hybridisiert, die 15¹H-so mRIA enthielt, die wie zuvor hergestellt worden war (Schritt B). Alle Rekombinant-DlA-Molekül -Poly(A)-RiEA-Hybriden wurden von der nicht hybridisierten PoLy(A)-RlA getrennt (Schritt C) · Die PoIy(A)-REFA wurde von den Hybriden zurückgewonnen und gereinigt ('Schritt D) * Die gewonnene RITA wurde hinsichtlich IPlT- dt mRIA-Aktivität! wie oben analysiert (Schritt Ξ). Wenn, und nur dann,- wenn das Gemisch von Rekombinant-DHA-Molekülen ein Rekombinant-DEfA-Molekül enthält, das eine eingefügte Fucleotid-Sequenz aufweist, die in der PoIy(A)-RIiFA unter harten Hybridisierungsbedingungen zu IFIT-mRlTA hybridisieren kann, wird die von diesem Hybrid freigesetzte mRHA die Bildung von IMF-gC, in. Oocyten herbeiführen, da von einem beliebigen anderen Rekombinant-DiTA-Molekül-Poly(A)-RSA-Hybrid freigesetzte mEETA. nicht IFU-qC verwandt ist. Wenn eine Gruppe von 512 Clonen eine positive Reaktion ergaben, wurden die Clone zu 8 Gruppen von 64 zusammengefaßt, und jede Gruppe wurde wie zuvor analysiert* Dieser Prozeß wurde fortgesetzt, bis ein einziger dieser Analyse entsprechender Clon identifiziert war,.

Es gibt keine Gewähr, daß die Rekombinant-DITA-Moleküle und der damit transformierte Bakteriencion, die auf diese weise identifiziert wurden, die vollständige IFIT-oC cDiTA-Sequenz von IFE-Qi enthalten oder gar, daß die DEA-Sequenz tatsächlich für IFIf-cC kodiert. Die Rekombinant-DITA-Moleküle wer-

Z4J4U J 4 -

den jedoch vermutlich ausgedehnte liucleotid-Sequenzen enthalten, die komplementär in bezug auf die IPxT-(X, mRlTA-Kodierungssequenz sind. Daher kann das Rekombinant-DNA-LIolekül zumindest als Quelle für eine Sonde zum raschen Screening anderer Rekombinant-DITA-Moleküle und mit ihnen transformierter Clone verwendet werden, um weitere Gruppen von Glonen zu identifizieren, die eine authentische und vollständige IPIT-d-Sucleotid-Ko die rungs sequenz enthalten können.

2» Theoretische Überlegungen

Die Bedingungen für die Hybridisierung (Schritt B) sind kritisch» Die absoluten Konzentrationen und das Verhältnis von Rekombinant-DSA-Molekül und PoLy(A)-RHiL müssen ao gewählt werden, daß dabei die Reaktionsgeschwindigkeit und die Stöchiometrie Berücksichtigung finden» Die richtige Wahl ist schwer zu treffen, da der Anteil von IFSS- et inRHA in der PoIy(A)-RlA. nicht bekannt ist, Zur Sicherung von gesteuerter und entsprechender Kinetik wurde die Hybridisierung unter Bedingungen vorgenommen, bei denen die Konzentration von DHA-Sequenzen von den Rekombinant-DBA-Molekülen höher lag als die geschätzte IFE- CC mRITA-Konzentration. In einem Gemisch von 512 möglichen verschiedenen Rekombinant-DITA-Molekülen wird eine IFE- (L verwandte DBA-Sequenz ("IPTT-ö^ R-DlIA") entweder nicht vorkommen (das ergibt eine negative Analyse), oder sie wird höchstens etwa 1/512 der Rekombinant-DITA-Moleküle ausmachen. Die Konzentration de3 Rekombinant-DlTA-MoIekül-Gemischs und daher die Konzentration der IPiT-<?CR-DITA, wenn vorhanden, kann daher bei dem Hybridisiere ungsschritt eingestellt werden,, damit ausreichende Hybridisierungsges.chwindigkeiten gewährleistet sind« Darüber hinaus muß die Menge der IPIT-oLR-ΏΈΑ in dem Reaktionsgemisch so ausreichend sein, da!3 genügend IPIT-ck mRlTA von der PoIy(A)-RITA gebunden wird, um den Nachweis von IPIT-oO nach der Injektion in Oocyten der mRiTA, die aus dem Rekoinbinant-DITA-MoIekül-PoIy(A)-RZA-Hybrid gewonnen wurde, zu ermöglichen. - 39

Für den ITachweis von IFl-(X mit Hilfe der bekannten Analysen sollte seine Konzentration 100 IU/ml oder mehr betragen· Da 0,5-ml-Aliquoten für Wiederholungsbestimmungen gebraucht werden,, sollten 50 IU in den Oocyten erzeugt werden* Die zuvor verwendete, von induzierten Leukozyten erzeugte PoIy(A)-RHA erzeugt bei der Injektion von 1 ,ug in Oocyten etwa 500 IU IFH-oC . Daher muß mindestens 0,1 ,ug PoLy-(A)-RHA injiziert werden, damit die benötigten 50 IU erzeugt werden· Modellversuche mit Kaninchen-Globin-mRHA und Kaninchen-Ä -Globin-cDiTA-Clonen haben ergeben, daß die Ge-

125

saftgewinnung von ^ I-Globin-mRHA in der OOcyte im Vergleich, zu der: dem Bybridisierungsgemisch zugesetzten

125 *f

^I-Globin-inRHA etwa 10' % betrug und die Gewinnung von

mRHA-Aktivität etwa 5 %· Daher sollten mindestens 0,1/0,5 = 2 /Ug Leukozyten-Poly (A)-RHA für die. Hybridisierungsanalyse verwendet werden·· Zur Einhaltung einer adäquaten Sicherheitsgrenze wurden 12 ,ug PoIy(A)-RHA je Analyse verwendet.

Zur Berechnung, wieviel DHA von den Rekombinant-DHA-Molekülen zur Bindung der IPH^-- ck mRHA in 12 ,ug PoIy(A)-RlTA gebraucht wird, wurde, der IFH- cC inRHA-Gehalt von PoIy(A)-RlTA ermittelt· Sin /Ug PoLy(A)-RlTA erzeugt 500 IU IF· Die

spezifische Aktivität von IFH-ck liegt zwischen 2 s 10 bis 10 lU/mg Protein» 500 IU von IFlT-(^. entsprechen daher

zwischen 500/2 χ 10⁸ = 2,5 x 10^{δ 9}

—7 5 s 10 mg (0,5 ng) Interferon

in» 500 IU von IFlT(^. entsprechen daher

zwischen 500/2 χ 10⁸ = 2,5 x 10"^δ mg (2,5 ng) und 5OO/1O⁹ = 7

Die Beziehung zwischen der in eine Oocyte injizierten Menge IFlT- cL mRHA und der erzeugten Menge IFlT-cC ist unbekannt· Im Falle von (3 -Globin-mRlTA werden etwa 30 Moleküle Protein je Molekül rnHETA je Stunde erzeugt; dieser Wert beträgt für β -Globin etwa S (J,B. Gurdon, u.a·, "Message Stability In Injected Frog Oocytes: Long Life Of Mammalian And (S -Globin Messages" (Informationsstabilität in injizier ten Frosch-OOcyten: Lange Lebensdauer von Säugetier- und

J4UJ 4 _

β -Globin-Informationen), J, Mol« Biol. 80, S. 539 - 551 (1973)).' Mnimi; man einen durchschnittlichen Wert von 20 für IFE-d* , eine relative'Molekülmasse von 18 000 für IPlI-oC und eine relative Molekülmasse von 330 000 für IFE-oL -rnBEk an, dann müßten 26 mg (18 000/330 000 ζ 20 χ 24) IFE-cL in 24 Stunden je mg injizierte TFlJ- cL mRHA erzeugt werden· Wenn

8 ?'

die spezifische Aktivität von IPlI-cL 2 χ 10 /mg (2 ι 10

ITJ/ng) beträgt, dann wird 1 ng IFE-C^mBEk 26 χ 2 χ 10² = 5,2 χ 10 IQ TFE-^ergeben. Wäre die spezifische Aktivität 10"/mg (10 IU/ng), dann betrüge die erzeugte Menge IFE-& 2,6 χ Kr IU. Da 1 ,ug Leukozyten-Poly(A)-HSA unter den oben ( ; angenommenen Bedingungen 500 IU IFE-Gt* ergibt, würde die Konzentration von IFE-& mRUA in 1 /Ug PoIy(A)-RITA zwischen 0,1 ng und 0,02 ng betragen, und der Anteil von IFE-ct> mRSA in leukozyten-Poly (A)-RlTA würde zwischen 1:10 000 und 1:50 000 liegen*-Daher enthalten 12 ,ug PoIy(A)-RlTA etwa 1,2 ng bis 0,2 ng OT-öC mEHA· · - . .

Sollte das Translationsverhältnis der IPlT- ot mRlTA in den Oocyten um eine Größenordnung niedriger sein als der Durchschnitt für Globin-mRIA, dann würde der IPlT- cO mRlA-Gehalt der PoLy(A)-RHA das Zehnfache des oben berechneten betragen oder zwischen 1:1 000 bis 1:5 000 liegen· Und 12 ,ug PoLy-(A)-RUA-würden dann 12 ng bis 2 ng IPlT- oi mEHA. enthalten. W Sollte das Translationsverhältnis der IPlT- C^ inRITA in den Oosyten dagegen um eine Größenordnung höher sein als der Durchschnitt für Globin-mRHA, dann läge der IPlT- ot mRlTA-Gehalt der PoIy(A)-RiTA um das 1Ofache niedriger als oben berechnet, oder er würde zwischen etwa 1:100 000 und 1:50 000 liegen- Und 12 ,ug PoIy(A)-RHA würden dann 0,1 ng bis 0,02 ng IPIT-cCmRliA enthalten·

Plasmid pBR322 hat 4361 b»p. (Rasenpaare)· Die vollständige cDlTA von IPlT- mRlTA würde etwa 800 bis 1000 b.p. zu pBR322 bei der Bildung von pBR322-IPlT- cDlTA bis zu einer Gesamtmenge von etwa 5200 bis 5400 b.p. addieren. Seine

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relative Molekülmasse -nirde somit etwa das 12fache (2 χ 5200/ 800) gegenüber der von U¹IT-^CmEUA alleine betragen. Um die IFE-ζΚmREA .zu binden, die nach der obigen Berechnung in den für die Analyse gebrauchten 12 ,ug PoLy(A)-RIlA vorhanden sein'muß, wird daher eine Menge von Rekombinant-DITA-Molekülen gebraucht,, die gleich der 12fachen Menge der IPU-cCmHUÄ. ist (stöchiometrische Menge).

Da der IFlT-^mRSA-Gehalt der zur Herstellung der Rekombinant-DHA-Moleküle verwendeten PoLy(A)-DIiA gegenüber der von roher PoIy(A)-RM um das 10- bis 40fache erhöht worden war,, müßte die Gruppe der 512 Clone 10- bis 40mal mehr Clone, die die verlangte Ii¹S^-- CC mREA enthalten, gaben als oben berechnet wurde.

Wenn IPI^--^mRlTA 1 Teil in 1000 der rohen PoLy(A)-RlTA ist, dann enthalten 12 ,ug PoLy(A)-RlTA 12 ng IPE^--OCmRlTA, und die stöchiometrische Menge von IPlT-«^CcDEA-Plasinid beträgt dann 144 ng* Da eine Gruppe von 512 Clonen mindestens 5 mit IPIT-oCcDEi-Inserts enthalten wird, beträgt die erforderliche Menge an gesamter Hybridplasmid-DEA .14,8 ,ug (144 x 512/5 χ 1O^-3), Wenn IPU- mREA 1 Teil in 10 000 ist, dann enthalten. 12 ,ug PoLy(A)-RlA 1,2 ng IPE^--GCmREA, und die erforderliche Menge IPlT-^cDBA-Plasmid ist dann 14,4 ng». Eine Gruppe von 512 Clonen wird 0 oder 1 IPlT-otcDHA-Insert enthalten, so daß die erforderliche Menge an gesamter Hybridplasmid-DITA 7,4 /Ug (14,4 s-512 χ 10~³) beträgt* wenn IPIi- mEEA 1 Teil in 100 000 ist, dann ist die erforderliche Menge an gesamter Hybridplasmid-DITA 0,74 /Ug (1,44 2 512 2: 10 ). Um sicherzustellen, daß die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen mit DEA-überschuß (d.h. Überschuß von Rekombinant-DSA im Verhältnis zu PoIy(A)-SITA) ablauft, wurden 20 ,ug des Gemiachs (et?;a ein 1,4 bis 30facher Überschuß) für die Analyse gewählt.

Lk J 4U J 4

Die Hybridisierung muß unter Bedingungen durchgeführt v/erden, die garantieren, (a) daß der hybridisierte Teil von PoIy(A)-RlIA. intakt und in einer biologisch aktiven Form zurückgewonnen wird, (b) daß die nicht-spezifische DlTA-mRI\FA-Assoziation verhindert wird, und (c) daß die Hybridisierungsreaktion bis zu einer Vollständigkeit von mindestens 75 % erfolgt. Diese Bedingungen können vermutlich am besten durch Hybridisierung in SO % Formamid, 0,4 M UaGl (J. Casey und Ef. Davidson, "Rates Of Formation And Thermal Stability Of HITA: DlTA And D1A:DEA Duplexes At High Concentrations Of · Formamide" (Bildungsgeschwindigkeiten und Wärmebeständigkeit von RHA:DNA und DHA:D1TA Duplexen bei hohen Konzentrationen von Formamid), nucleic Acids Res., 4, S. 1539 - 1552 (1977)) erreicht werden. In dieser Lösung kann die Hybridisierung bei etwa 40 ⁰C durchgeführt werden (und es sind nicht die. 60 bis 70 ⁰C erforderlich, wie wenn auf Formamid verzichtet τι/ird). niedrigere Temperaturen werden bevorzugt, um eine Schädigung der PoIy(A)-RlTA möglichst gering zu halten.. Ss wurde eine Hybridisierungstemperatur von 5^ ⁰C im vorliegenden Fall gewählt. Diese liegt etwa 3 ° unter der ^1/2i ^* ^^&3β^ ^und· ΪΤ· Savidson, supra) und etwa 10 - 13° unter T. /p·, (Hamaguchi & Geidushek, J, Amer. Chem. Soc, 84, S. 1329). Bei dieser Temperatur dürfte daher die Hybridisierung von Sequenzen mit weniger als etwa 87 % Homologie nicht möglich sein, da eine Abweichung von 1 % die T-i/2d um 1° senkt (T,D. Bonner, u.a., "Reduction In The Rate Of DlTA Seassociation By Sequenz Divergence" (Verringerung der Geschwindigkeit der RSA-Reassoziierung durch Sequenz-Divergenz), J. Mol. Bio!., 81, S. 123 - 135 (1973)).

Bei der vorliegenden Hybridisierung ist die Selbst-Hybridisierung von DHA kein ernsthaftes Problem, da das Gemisch der verwendeten DlTAn aus dem gleichen Vektor (pBR322) und den verschiedensten cDITA-Inserts besteht. Daher wird es sich bei den meisten DITA-Sequenzeη um Heteroduplese handeln, in denen die Inserts zur Hybridisierung zu PoIy(A)-RlTA zur Ver-

24 3 40 3 4

fügung stehen, 'fegen topologischer Begrenzungen ist es sehj unwahrscheinlich, daß komplementäre cDHA-Inserts, die Teil verschiedener Duplexe sind, sich gegenseitig beeinflussen. Auf jeden Fall "wird die DHA:DITA-Reassoziierung unter den angewandten Reaktionsbedingungen auf ein Mindestmaß beschränkt (J, Casey und IT.. Davidson, supra),

Zur Bestimmung der für eine mindestens 75 %ige Reaktion erforderliche Hybridisierungszeit wurde eine' Geschwindigkeit sgleichung zweiter Ordnung herangezogen:

In

Co -' Ro + Ro (1 - §

(1 - fr) Co So

₃^₉ k_s (Co - Ro)

worin bedeuten:

R - Molare ITucleotid-Konzentration von hybridisierter RKA Co = Molare ITucle ο tid—Konzentration von zu

hybridisierender Anfangs-DBA

"Ro = ' Molare Sucleotid-Konzentration von zu hybridisierender Anfangs-RHA k-n = Geschwindigkeitskonstante für die ΗϊϊΑ-DlIA-

Hybridisierung t = Zeit (s) -

und E_ 5 0,75" (75 % vollständige Reaktion)

^Ro k„- = 472-(Ic₀ = 1/12 k, (J. Casey und IT. David-

ü ü CL

son, supra) worin bedeuten:

k·, = Geschwindigkeitskonstante zweiter

Ordnung für DIIA unter den gewählten Hybridisierungsbedingungen

und k_d = 1,7 x 10⁵ χ L¹^² ζ IT"¹ (J.R.Hutton

und J.G*Wetmur, "Renaturation Of

— ίίϋ. —

243403 4

Bacteriophage iß X174 DHA-RlTA-Hy br id: .. SHA. Length Effect And ITucleation Rate Constant" (Renaturierung von Bakteriophage ά X174 DHA-RlTA-Hy brid: RlTA-Längeneffekt' und Gesch-windigkeitskonstante der ITucleation), J. MoI. Biol», 77, S. 495 - 500 (1973))· L = 900 (Kettenlänge in b.p.j etwa 900

sind in dem vollen TFE- oC cDHA-Insert vorhanden)

F- = 900 (Komplexität von b.p. der Hybridkette; hier beträgt die Komplexität 900,'da sich die 900 nucleotide der IPS'- C^mRHA mit den komplementären 900 nucleotiden des IMT-oC cDIA-Inserts verknüpfen)·

Co = 2,5 χ 10 (Auf der Basis einer 40 /Ul Lösung,

die die zuvor bestimmten 20 <ug der für die Analyse zu verwendenden Rekombinant-DHA-Moleküle enthält,'wieder unter der Toraussetzung, daß der IPlI- cDHA-Insert 1/12 ein.es Rekombinant-DSTA-Moleküls ist und in mindestens 1 der 512 Clone vorkommen wird, und Zuordnung von 662 als durchschnittliche relative Molekülmasse

eines DHA-Basenpaares) —Pt Ro = 8',7 x 10" (Auf der Basis einer 40 /Ul Lösun

die die zuvor bestimmten 12 /Ug der für die Analyse zu verwendenden PoLy-(A)-RIIA enthält, wieder unter der Annahme, daß die PoIy(A)-RiIA 1:10 000 Teile IFlT- d mREA enthält (den großen Überschuß von DlTA vorausgesetzt, vjird ein anderer Anteil ^enig Einfluß auf die Hybridisierungsgesc'mvindigkeit haben), und Zuordnung von 323 als durch schnittliche .relative Molekülmasse

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eines Ribonucleotids von BlU.) 3. Ausführung der Initialanalyse

Schritt A - Herstellung: und Spaltung des Rekombinant-DM-Molekül-Geinischs

Die verlangte Anzahl von Bakterienclonen wurde auf wie oben vorbereitete Tryptonmedium-Agarplatten inokuliert, indem auf sie eine Aliquote von jeder Mikrotiterquelle mit Hilfe eines mechanischen Gerätes übertragen wurde, Efach einer In-· kubation bei 37 ⁰G hatte jeder Clon zu einer Kolonie von einigen mm Durchmesser geführt. Alle Kolonien ?/urden von den Platten abgewaschen und vereinigt und ergaben ein Ino-•kulum, das zum Inokulieren von 1 1 wie oben vorbereitetem Tr.yptanmedium in einem 2-l-Srlenmeyerkolben verwendet' wurde* Die Kultur wurde bei 37 ⁰G bis zu einer' scheinbaren GDgJ-Q von etwa 0,8 (visuell, beurteilt) geschüttelt. Sin Volumen vorbereitetes Tryptonmedium und Chloramphenicol bis 170 yUg/ml wurden zu der Kultur gegeben, die weitere 16 Stunden lang bei 37 ⁰C geschüttelt wurde. Ξ3 wurden 20 ml Chloroform zugesetzt, und die Kultur wurde erneut 10 min lang bei 37 ⁰G geschüttelt, um die Bakterien zu taten (C. Weissmann und W. Boll, supra)» Die Kultur wurde von dem Chloroform dekantiert, und die Zellen wurden durch Zentrifugieren (Sorvall Rotor GS3) von 15 min Dauer mit SOOO U/min und bei 4 C geerntet. Je 1 Liter Präparat wurden etwa 1 bis 2 g Zellen gewonnen. Die Zellen wurden in 30 ml 20 mH Tri-HCl (pH-Wert 7,5) suspendiert, 20 min lang mit 500 U/min und bei 4 ⁰C zentrifugiert (Sorvall-STZ-Rotor) und in 30 ml 50 mM Tri-HGl (pH-Wert 7,5) resuspendiert. Ss wurden 0,25 YoI Lysozym-Lösung (10 mg/ml in 50 mH Tri-HCl (pH-Wert 7j5)) zugegeben, und nach dem Kühlen über einen Zeitraum von 10 min bei 0 ⁰C wurden 0,33 VoI (auf der Basis des VoI der ursprünglichen 50 mM Tri-HCl-Kultur-Suspension) 0,5 M EDTA (pH-Wert 8,0) vorsichtig ohne Schütteln eingemischt.

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Fach weiteren 10 min bei 0 ⁰C wurde 1/16 ToI (wieder auf der Basis des ursprünglichen Volumens) 2 %iges Triton X-100 zugesetzt. !lach 60 min mirde die Probe cO min lang mit 10 U/min bei 0 ⁰C in einem Sortfall-SW-Rotor zentrifugiert» Das Obenstehende wurde in ein Becherglas mit einem Magnetrührwerk übertragen,, und es wurde 3 M ITaOH unter Rühren zugegeben, bis bei 20 ⁰C ein pH-Wert von 12,5 erreicht war, wozu eine Glaselektrode und ein pH-Wertmesser von Orion Research, Modell 601, der mit Beckman-pH-10-Carbonatpuffer-Standard (ITr. 3505) standardisiert worden war, verwendet wurden· ITach 10 min Rühren bei 20 ⁰C wurde der pH-Wert auf 8,5 einge-

V_..' stellt» ITach weiterem dreiminütigem Rühren wurden 1/9 5 M- HaGl und 1 YoI Phenol (destilliert und mit 9,5 M ITaCl äquilibriert) zugegeben, und das kräftige Rühren wurde 5 min lang fortgesetzt. Die Phasen wurden durch 10 min dauerndes Zentrifugieren (GSA-Sorvall-Rotor) mit 10 000 U/min und bei 0 C getrennt· Das Obenstehende, das Form-I-DFA (zirkuläre doppelsträngige DFA) enthielt, wurde vorsichtig von der Zwischsnphase (die einsträngige DFA enthält) entfernt und dreimal mit Chloroform eztrahiert. (Phenol muß bei diesem Schritt weitgehend entfernt sein). Die Form-I-DFA-Fraktion wird diejenigen Rekombinant-DITA-Moleküle enthalten (pBR322-cDFA-Insert), die ursprünglich zum Transformieren derjenigen Wirtszellen verwendet wurden, die einen Teil der für die Analyse gewählten 512 Clone bilden«

Pankreas-RFAase A (5 mg/ml, vorgewärmt 1-0 min lang bei 85 C) wurde zu Porm-I-DFA bis zu einer Konzentration von 20 /Ug/ml gegeben und das Gemisch So min lang bei 37 ⁰C in kubiert. Es wurde 1/5 "VoI 5 M FaCl zugesetzt, und das Gemisch wurde mit 30 %igem Polyäthylenglvcol GOOO (Union Carbide, 20 min lang bei 120 ⁰C autoklavenbehandelt) auf eine Endkonzentration von 7,5 % PEG eingestellt. Fach 2 bis 1S h bei -10 ⁰C wurde das Präzipitat in einem Sorvall-SW-Rotor in 20 min mit 8000 U/min und bei 0 ⁰C gesammelt, in 0,075 M FaCl, 0,0075 M Natriumnitrat bis zu einem Absorptionsvermö-

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gen von. 20 bis 2βΟ nm gelöst und,auf 0,5 % SDS eingestell Die Lösung wurde 30 min lang bei 37 ⁰G mit 0,5 mg/ml Pronase (selbstdigeriert bei 20 mg/ml, 2 h bei 37 ⁰C) inkubiert und dreimal mit 1 YoI destilliertem Phenol und zweimal mit 1 YoI Chloroform extrahiert. Die Probe (bis zu 2 ml einer 1 mg/ml DMA-Lösung) wurde durch einen 5 bis 23 folgen. Saccharosegradienten in 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), T mM EDTA 15 h lang mit 21 000 U/min und bei 15 ⁰G unter Verwendung eines Beckman-Rotors SW 27 zentrifugiert. Es wurden Fraktionen gesammelt, und die OD^gQ würde verfolgt. DIA-haltige Fraktionen wurden zusammengenommen,- und die Dili wurde mit Hatriumacetat und Äthanol ausgefällt.. 20 bis 100 /Ug des Form-I-D3tfA-Gemischs wurden durch Zentrifugieren zurückgewonnen,

Zfjanzig /Ug gereinigte Form-I-DI\FA wurden, in 150 /Ul 1o mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 6 mM. MgCl₂, 50 ml'laCl,- β mM 2-Mercaptoäthanol, 200 ,ug/ml BSA oder Gelatine und 20 Einheiten Hindlll (New England Biolabs) digeriert* Das Hindlll-Restriktionsenzym. spaltet die Form-I-DHA an einer Stelle innerhalb der pBR322-Komponente.. (Es ist. unwahrscheinlich, daß die cDlTA-Komponente auch gespalten wird, wenn es aber der Fall ist, würde die Analyse nicht wesentlich dadurch beeinflußt werden). Nach 2 h bei 37 ⁰C wurde eine Aliquote (1 %) mit Hilfe der Elektrophorese durch, ein 1 %iges Agarosegel in 50 mM Triacetat (pH-7/ert 7,8), 2 mM EDTA 1 'h lang bei 50 mA analysiert, um festzustellen, ob die Digestion .vollständig erfolgte. War die Digestion nicht vollständig, wurde mehr Hindlll zugesetzt und die Inkubation 2 h lang weitergeführt. Wenn die Form-I-DITA vollständig zu linearen Molekülen umgewandelt worden war, wurden Pronase (Calbiochem), EDTA und SDS bis 0,5 mg/ml, 10 mM bzw. 0,5 % zugegeben. IJach 30 min bei 37 ⁰C v/urde die Lösung mit 30 /Ul Phenol-Chloro

form (1:1). extrahiert. Die organische Phase wurde mit' 50' /αϊ 20 mM Tri-HGl (pH-Wert 7,5), 1 mM EDTA gewaschen, und die zusammengenommenen wäßrigen Phasen wurden dreimal mit Äther extrahiert, durch eine 0,1-ml-Chelex-Säule filtriert, in

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R-einem in SDTA gekochten Pyres -Glas gesammelt und mit 1/1.0 YoI 3 M Eatriumacetat und 2,5 YoI Äthanol ausgefällt. ITach abstellen über Nacht bei -20 ⁰C wurde die DKA. durch Zentrifugieren gegammelt«

Schritt B - Hybridisierung der DITA mit Pο 1.7 (A)-RIfA

Ss wurden zwei Eybridisierungsgemische hergestellt· Gemisch I enthielt 4 /ul 1Ofach konzentrierten Hybridisierungspuffer (4 M FaCl), 0,1 PIPES (pH-Wert -6_r4, 1,4-Piperazindiäthansulfonsäure, Sigma), 50 mM SDTA, o,5 /Ul (etwa 5 ng ^I-Globin-mRilA (5000 cpm) und 6 yul induzierte Leukozyten-

PoIy(A)-RSA (2 /Ug/ /Ul),.. eine Menge, die ausreichte, um 6000 IU IPlT bei der Injektion in. Oocyten zu erzeugen. Gemisch II enthielt 10 /ug der Hindlll-digerierten EOrm-I-DUA von oben und 0,1 /Ug Pstl-digeriertes Z-pBR322(H3)/Rc (3 G-4,13 (ein p3R322-Derivat, daß die β -Globinsequenz in der HindIII-3teUe enthält)' )Mantei, u.a., "Rabbit f>-globin mRKA Production In Mouse L Celles Transformed With Oloned Rabbit β -globin Chromosomal DHA". (Kaninchen- ji -GlobinmRHA-Srzeugung in mit geclonter Kaninchen- $ -Globin-Chromosomen-DlTA transformierten Mäuse-L-Zellen), ITature, 281, S. 40 - 46 (1979)).- Die ¹²⁵I-Globin-mRHA in Gemisch.I und die & -Globin-DSA in Gemisch II dienen als interne positive Kontrollen für die Hybridisierungsanalyse. Beide Gemische wurden "in einem Stickstoffgasstrom getrocknet. 40 /ul 80 %iges Formamid wurden zu dem Rückstand von Gemisch II gegeben, und die Lösung- wurde 10 min lang bei 100 ⁰C denaturiert und rasch in Eis abgeschreckt. Die denaturierte Lösung wurde zum Lösen des Rückstandes"νon Gemisch I verwendet, und die resultierende Lösung wurde 4 η lang bei 56 ⁰C inkubiert.

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Schritt C - Abtrennung von hybridisierter PoLy(A)-RITA-DIIA von nicht hybridisierter PoIy(A)-RITA,

Hach der Verdünnung auf 1 ml mit kaltem 0,9 M ITaCl, 0,09 M Satriumcitrat und Formamid (100 /Sig) au '4 1Ό1% wurde die Lösung mit 0,5 ml/min durch ein Ultrafilter (Po'rengröße 0,45 /um) filtriert, wobei das filter vorher auf seine Fähigkeit hin,. ElTA-DITA-Hy bride η zurückzuhalten, geprüft worden .war, da nicht alle vom Hersteller bezogenen Filter gleich wirksam waren*.

Schritt D - Reinigung von hybridisierter PoLy(A)-RITA

Das obige Filter mit daran haftenden Poly (A) -RITA-Hy briden. irarde 10 min lang in 1 ml 0,15 M'UaGl, " 0,015 M ITatriumcitrat, 0,5 % SDS bei 37 ⁰C getaucht, mit 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 10 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ gespült und in 0,6 ml frischen Puffer gegeben. Uach der Zugabe von 5 /Ul mit Jodacetat behandelter DEAase (5mg/ml) (S.B, Zimmermann und G.. Sandeea, Anal. Biochera«. 14,, S 269 (1966); P.A. Price, u.a* "Alkylation. Of A Histidine Residue At The Active Site Of Bovine Pancreatic Deozyribonuclease" (Alkylierung eines Histidinrückstandes an der aktiven Stelle von Rinder-Pankreas-Desoxyribonuclease), J. Biol. Chem., 244, S. 924 (1969)),. wurde das Filter 10 min lang bei 37 ^QC inkubiert.

Das Filter wurde entfernt und die Lösung mit 1 YoI Phenol und 1 YoI Äther extrahiert und durch eine O,1'-ml-Chele::- Säule geleitet. 5 /Ug Träger-RSTA (gereinigte Hefe-RITA) wurden zu der Lösung gegeben, und die RITA wurde mit ITatriumacetat und Äthanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren mit 1Q 000 zg gesammelt, in 100 ml 1 mM EDTA gelöst, 90 s lang auf 100 ⁰C gehalten, und es wurden TSB und SDS zu 2 χ TEE und 0,5 % SDS zugegeben. Die RITA wurde auf einer 100-,ul Säule von Oligo(dT)-Cellulose adsorbiert,, durch vier Waschen mit 0,3 ml destilliertem Wasser

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eluiert und mit Uatriumacetat und Äthanol ausgefällt. Each 16. h bei- -20 ⁰C wurde die ausgefällte EKL durch Zentrifugieren abgetrennt und in 2 ,ul TlK-Puffer gelöst·

Schritt Ξ - Bestimmung der IM- d* mHITA-Aktivität

Die Poly(A)-BUA-Lösung von oben wurde in 40 OOcyten injiziert (etwa 50 nl je OOcyte)» Die Oocyten wurden 24 bis 48 Stunden lang bei 23 ⁰C inkubiert, homogenisiert und zentrifugiert (oder das Inkubationsmedium wurde zurückgewonnen) und, wie oben für IPIT-^i* beschrieben, analysiert*

4. Anschließende Analyse - Hybridisierung zu filter-gebundener DFA

Die meisten anschließenden Analysen eines Rekombinant-DiTA-Moleküls von einem einzigen Clon wurden mit an DBM- oder DPT-.Papier gebundener DlA durchgeführt, da die Analysenbedingungen nicht mehr kritisch waren und die Analyse zweckmäßiger ist· DPT-Papier ergab niedrigere Hintergrundwerte und wurde vorzugsweise verwendet. DBM-Papier wurde nach Beschreibung hergestellt (J.C· Alwine, u.a,, "Method For Detection Of Specific HEAs In Agarose Gels By Transfer To (' Diazobenzyl Oxymethyl-Paper And Hybridizytion With DHA Pro- - bes" (Methode zum nachweis spezifischer EUAn in Agarosegels durch übertragung auf Diazobenzyloxymethyl-Papier und Hybridisierung mit DHA-Sonden), Proc» iTatl. Acad«. Sei. USA, 14, S. 5350 - 5354 (1977)). APT-?apier wurde nach einer Verfahrensweise von B* Seed (Persönliche Veröffentlichung) hergestellt: 3ogen von Whatman-Papier 540 (20 g) wurden 16 h lang bei 20 ⁰G mit einem Gemisch von 70 ml 0,5 M ilaOH, 2 mg/ml EaBH^ und 30 ml 1,4-Butandioldiglycidyläther bewegt. Das Papier wurde anschließend in eine Lösung von 10 ml-Aminothiophenol in 40 ml Aceton übertragen und 10 h lang bewegt. Das Papier wurde gründlich mit Aceton, 0,1 Έ HGl, HgO, 0,1 IT HCl, HgO gewaschen und getrocknet, APT-Papier

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diazotiert, wie ea für die Unraandlung von ABM- zu DBM-Papier beschrieben wird (Alwine, u.a., supra).

ΒΌΑ (bis. zu 15 /Ug) wurde an 50 min diazotiertes ABM-(DBM-) oder diazotiertes APT- (DPT-) Papier gebunden, wie von J.H*J» Hoeijmakers, u.a. "The Isolation Of Plasmid Containing DIA Complementary To Messenger RITA S¹Or Variant Surface Glycoproteins Of Trypanosoma Brucei" (Die Isolierung von Plasmiden, die zu Messenger-SMA komplementäre DFA enthalten, für Väriant-Qberflächen-Glycoproteine von Trypanosoma Brucei), Gene, im Druck, 1980) beschrieben und anschließend erläutert wird·

Hybrid-Plasmid-DFA wurde mit Endonuclease-Pstl digeriert, mit 500 /Ug Pronaae je ml,. 0,5 % SDS, und 10 mM SDTA 30 min lang bei 37 ⁰C behandelt, mit Phenol und Äther extrahiert, durch, eine O,.1-ml-Chelex-Säule geleitet und mit Äthanol ausgefällt.. Die hitze-denaturierte DIIA (bis zu 5 /Ug, mit einer geringen Menge von. ^ P-DHA, zugesetzt als Tracer) wurde über Facht bei 0 ⁰C mit 1 cm DBM- oder DPT-Papier in 200 /Ul 25 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) .inkubiert. Die Filter wurden dreimal 5 min lang bei Raumtemperatur mit 50 mM,Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5), 1 %igem Glycin und dreimal mit 99 %igem rekristallisiertem Formamid gewaschen« Auf eine, weitere Inkubationszeit von 2 min mit 99 %igem Formamid bei 6-8 ⁰C folgten drei Waschen in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 6,5) bei 20 ⁰C und zwei Waschen von 10 min in 0,4 M FaOH bei 37 ⁰C Stwa 40 bis 60 % der Radioaktivität blieb auf den Filtern erhalten. Die Filter wurden 3 h lang bei 38 ⁰C in Tor-Hybridisierungsmedium A, das durch 1 %iges Glycin ergänzt worden war, wobei 330 /Ul je Filter verwendet wurden,, inkubiert. Medium A enthält 50 % Formamid, 5 x SSC, 0,04 % Polyvinylpyrrolidon, 0,04 % Ficol (Pharmacia). 0,1 % SDS, 25 /Ug PoIy(A) (P Sc L) und 100 /Ug Hefe-RFA (BDH, sechsmal mit Phenol extrahiert und aus Äthanol ausgefällt). Die Filter wurden zweimal in

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Medium A ge?;aschen und anschließend 16 h lang bei 38 C mit PoIy(A)-HITA, wie angegeben, (gewöhnlich 5 bis 8 /Ug) in Medium A unter Paraffinöl hybridisiert. Die RITA wurde wie folgt zugegeben;

Sin nasses DITA-Filter wurde abgetupft und in eine sterile Petri-Schale gelegt, 20 bis 40 /Ul der RHA-Lösung wurden auf dieses Filter pipettiert, -und'ein.-zweites Filter (entweder ein Duplikat oder eine Kontrolle) wurde oben darauf gelegt, und dieses Gebilde wurde mit einem sterilen Paraffinöl bedeckt,, Nach der Hybridisierung wurden die Filter nacheinander in Medium A (zweimal), in einer Lösung, die 1 x SSC,- 0,2 % SDS, 1mM SDTA enthielt (je dreimal 10 min lang bei 20 ⁰C), Medium A (2 h lang bei 38 ⁰C) und in 50-%igem Formamid, 5 x SSC, 0,.1 % SDS (dreimal 10 min lang bei-20 ⁰C) gewaschen» Hybridisierte RITA wurde durch einminütiges Halten bei 100 ⁰C in 200 ,ul 10 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,4), 1 mH SDTA und 0,1 % SDS eluiert. Der Sluierungsschritt wurde zweimal wiederholt, die Eluate wurden zusammengenommen, und die HHA wurde mit Äthanol nach der Zugabe von 2 /Ug Hefe—RHA (wie oben beschrieben gereinigt) ausgefällt« Das gewaschene Pellet wurde, im Vakuum getrocknet, in 3 /Ul ELpO gelöst und in Oocyten injiziert» Die IFiT-i*. -Aktivität wurde wie oben beurteilt»

5* Ergebnisse der HHA-Selektion-Hybridisierungs-Analyse

Die Analysen von 8 Gruppen von 5123Clonen (d.h. der Gruppen T, Y, j, K, ., 0, £ und'ΊΓ ) waren negativ» Die Analysen von 4 Gruppen von 512 Clonen (d.h.. der Gruppen I, c/*, 5T und X ) waren positiv, wenn auch nicht ständig* Die positiven Analysen werden in der folgenden Form wiedergegeben: IU/ml von IFU-cC, erzeugt von der von PoIy(A)-RITA-DUA-Hy¹OrId freigesetzten RIA (Analyse der Kontrollhybridisierung unter Verwendung von Z-pBR322(H3)/Rcβ G-4,13, supra); die Analysen, in denen die Versuchsergebnisse höher als die Hintergrundkontrolle sind, sind unterbewertet.

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Gruppe IU/ml

I <60 (£60); VW (< 20) ;< 110 (< 110); < 110 C£.110); < 35 C < 35)

cT 20 (< 20)

H" 21 C< 20) ; < 110 (< 110) ; .200 (< 110) X £60 (<: 60); 60 (< 20); < 110 ( £ 110); < 110 ( £110) Gruppe X wurde in 8 Untergruppen von 64 Clonen unterteilt und wie vorher hybridisiert und analysiert» Die Untergruppen führten zu folgenden, in der gleichen Form vjie oben wiedergegebenen Ergebnissen:

Untergruppe IU/ml

λ-' I £35 C<35); £ 35 (< 35)

X- II JJO (£30); £ 45 (£45)

Λ- IH .225. (£35); 21 (OO); 21 ( OO) ; 600 (£30);

£20 ( £20)

Λ- IV : ' 8£ ( £35); £ 25 (£ 25)

Λ- Υ £35 ( £35)

X- YI ·£35 Κ 35)

A- YII £35 (£ 35)

λ- YIII £35 ( £35)

Untergruppe X -III wurde in 8 Posten von 8 Clonen unterteilt und hybridisiert und analysiert:

Posten IU/ml

X- III-1 < 20 (£20);<20 (60) ; 35 (£30)

A- III-2 £35 (<35);£3O (£30); 150 (£20);

(£35); HO (60)

X- III-3 £ 25 (£ 25); £30 (£30)

λ- ΙΙΙ-4 22. (£30); £20 ( £ 20) ; £ 20 (6θ)

X- .111-5 30(?) (£35); £20 (£20); £35 (60)

A- III-6 £30 (£30); £20 (£20)

I- III-7 30 (£20)

λ- ΙΙΙ-8 / 30 (£ 20)

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Da das erste positive Ergebnis bei dem Posten λ. -±ΙΙ-4 erzielt wurde, wurden die einzelnen Kolonien dieses Postens (bezeichnet A bis H) hybridisiert und analysiert:

A-III-4-B <35^X CO5); < 20 (60) Λ-ΙΙΙ-4-G 35 (60); 60* (<35); HJ* (OD; 11^X

(OD; 20_ ( <20)

(^x Bei dieser Analyse wurde die DBM-Papier-Methode angewandt)

Somit eathält Clon A.-III-4-C ein Rekombinant-DITA-Molekiül, das IFIT- oL mRHA hybridisieren kann.

Das Rekoinbinant-DHA-Molekül in diesem Clon wird mit Z-pBR322-(Pst)/HcIF-4C ("Hif-4C")' bezeichnet und cbr es enthaltende Bakterienstamm als: E» coli Σ1776 (Z-pBR322(Pst)/HclP-4C) ("E. coli -Hif-4G"). Diese ITomenklatur besagt, daß das Rekombinant-DHA-Molekül aus Zürich (Z) stammt und das Plasmid pBR322 ist, das an der Pstl-Stelle . eine HIM- <K cDxtl ("HcIP'¹) enthält; das betreffende Rekombinant-DilA-Molekül ist dabei von Clon \ -III-4-C abgeleitet ("4(3")·

Recloning und Charakteriaierung von Z-oBR322(Pst)/Hclg-4C

Da Primärclone von transformierten Zellen gelegentlich mehr als eine Spezies von Rekombinant-DHA-Molekül enthalten (Efstratiadis,. u«a*., "The Primary Structure Of Rabbit β -globin mRUA As Determined From Cloned DEA" (Die Primärstruktur von Kaninchen- /S -Globin-mHEA nach der Bestimmung von geclonter DM),. Cell, 10, 3. 571 - 535 (1977)), wurde Hif-4C von Ξ. coli Σ1776 (Hif-4C)-Clonen isoliert und wie oben beschrieben gereinigt. Proben von Hif-4C und pBR322 'wurden mit Psti digeriert und mit Hilfe der Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarοsegel analysiert. Hif-4C ergab zwei Bänder, eines mit der Mobilität von Psrt-gespaltenem pBR322, das andere mit einer etwa 320 b.p. entsprechenden Mobilität.

U J 4

Ξ, coli HB101 wurde, wie oben beschrieben, mit- der isolierten Hif-4C transformiert. Sechs Clone von tetraoyclin-re-. sitenten transformierten Bakterien wurden gewählt, kleine Kulturen hergestellt, und üOrm-I-DHA wurde" gereinigt und mit Hilfe von IPstl-Spaltung und Agarosegel-Elektrophorese wie oben analysiert. Alle Proben zeigten Spaltungsmuster, die mit. Hif-4C identisch ?jaren. Eines dieser rec:lonten Rekombinant-DHA-Moleküle wurden als Z-pBR322(Pst)/HcIP-4C (^1!Hif-4Cⁿ) bezeichnet und für weitere Versuche verwendet. Das ^t?c" in Kleinschrift bezeichnet ein reclontes DlIA-Molekül.

Zur Bestimmung der Fähigkeit von Hif-4c und seines cDHA-Inserts, zu IFH-(XmRHA zu hybridisieren·, wurde Hif-4c (115 /Ug) bis zur Vollständigkeit mit 125 Einheiten von Pstl digeriert, mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Äthanol, wie oben beschrieben, ausgefällt» Eine Aliquote (10 /Ug) wurde 5¹-terminal markiert (um als Tracer bei nachfolgenden Schritten dienen zu können), indem sie in 100 /Ul 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5) gelöst, durch eine 0,1-ml-Chelex-IOO-Säule geleitet und 1 h lang bei 65 ⁰C mit 0,6 Einheiten alkalischer Bakterienphosphatase behandelt wurde, Zehnfach konzentriertes THS (40 /Ul) wurde zugesetzt und die Lösung dreimal mit 1 VoI Phenol und dreimal mit 1 VoI Chloroform extrahiert.. Die DHA wurde mit 2 VoI Äthanol bei -20 ⁰C über lacht ausgefällt und durch Zentrifugieren gesammelt. Zur weiteren Reinigung wurde die Probe in 0,5 ml TITA auf 0,25 ml DEAE-Cellulose (Whatman, DE52, vorgewaschen mit 2 ml 150 'mM, 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 2 mM SDTA) ("HET-Puffer") adsorbiert, mit 2 ml SET-Puffer gewaschen, mit 0,4 ml 1,5 M HaCl,. 20 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 2 mM EDTA eluiert und wie oben mit Äthanol ausgefällt. Die DHA wurde mit f-³²P-ATP (Spezifische Aktivität etwa 5000 Ci/mMol) und Polynucleotidkinase- (A.M* Masram und 77. Gilbert, "A Hew Method Por Sequencing DHAⁿ (Sine neue Methode zur Sequenzierung von DHA), Proc. Hat!. Acad. Sei. USA, 74, S. 56Ο - 564 (1977)) inkubiert und durch Chromatographie auf einer 3-nl-

24 3 40 3 4

Säzle von Sephadex-G5O in THE gereinigt. Die eluierten

32 Fraktionen wurden zusammengenommen und die ^J P-DITA mit

7 Äthanol wie oben ausgefällt; Ausbeute etwa 10 dpm.

Die uninarkierte Pstl-gespaltene Hif-4c-DSA (90 ₇ug) wur-

5 32 '

de mit 6 ζ 10 dpm der obigen P-markierten, IPsrtl-gespaltenen Hif-4c-DIIA vermischt und durch ein 2 %iges horizontales Agarosegel von 10 χ 20 χ 0,7 cm in 50 mM Triacetatpuffer (pH-Wert 7,8) unter Anwendung eines 2,5-cm-Schlit2es. der Elektrophorese unterzogen. Sin Röntgenfilm wurde auf das Gel gebracht und die Position des 320-bp-Fragmentes bestimmt«. Der das radioaktive Band enthaltende Gelstreifen (1,3 x 10 dpm) wurde herausgeschnitten,, durch Auspressen aus einer 2-ml-Plastspritze zerkleinert und über Nacht bei 4 ⁰C durch Rühren mit einer dem zehnfachen Gelvolumen entsprechenden Menge von ITET-Puffer extrahiert·- Die DiTA wurde auf einer 0,1-ml-hydro:xyapatit-3äule (vorgewaschen mit 1 ml ITET-Puffer) adsorbiert» Die Säule wurde mit 1 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) gewaschen und die DiTA mit 0,2 ml 1 H Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,5) eluiert. Das Eluat wurde mit sterilem destilliertem Wasser zehnfach verdünnt und die DSA auf DEAE adsorbiert und daraus eluiert und wie oben beschrieben mit Äthanol ausgefällt. Diese DxTA wird als "Hif-4c-i^lragment" bezeichnet. Das Eif-4c-Fragment (120 ng) wurde, wie oben beschrieben, an DPT-Papier (0,5 x 0,5 cm) gebunden. Als Kontrolle wurden 120 ng /o -Globin-cDÜTA-Pragment mit Hindlll von dem Hybridplasmid Z-pBR322(H3Ec ^G-4,13 ausgeschnitten (F. Meyer, u.a., "Transposition Of AT-linked, Cloned D3A From One Vector To Another" (Transposition von AT-verknüpfter, geclonter DlTA von einem Vektor zu eimern anderen), Experimentia, 35, S. 972 (1979); 17· Mantei, u»a*_r supra) und in ähnlicher Form behandelt. Die Hybridisierung von Duplikatfiltern zu PoLy(A)-RITA (in 20 /Ul), das Waschen der Filter und die Rückgewinnung von RITA aus den Filtern erfolgten nach obiger Beschreibung« ITach der Injektion in Oocyten konnten folgende IFIT-cO-Aktivitäten ermit-telt werden:

^43403 4-

D ITA-Fragment	Menge von • Leukozyten-^ PoIy(A)-BlTA' (/Ug)	Hybridisie- rungszeit	IPlT- öO-Aktiv i- tät(IU/ml)++ (Duplikat-Ana lyse)	100
Hif-4c	2,5	16.h	250;	1
fe. -Globin-cDlTA	2,5	16 h	4;	1000
Hif-4c	7,5	16 h	3000;	30
(h -Globin-cDlTA	. 7,5	16 h	4;	1000
Hif-4c	7,5	5 h	1000;	1
β -Globin-cDHA	• 7,5.	• 5 h	10;

dieser BSA ergab 46ΟΟ IU/ml

++ Oocyten-Obenstehendes nach 48 h Inkubation, analysiert durch Reduktion des cytopathischen Effektes 0/7.E» Stewart, II und S.E, Sulkin, supra)

Somit erhält Hif-4c einen Insert, der zu IPlT-oömRlTA hybridisieren kann«

Identifizierung von Qlonen von Ξ, coli, die zu dem Insert in Hif-4c kreuzhybridis.ierende Rekombinant-DITA-Mo le kille enthalten

Da der cDUA-Insert in dem Rekombinant-DITA-Molekül. Hif-4c nur etwa 320 b,p. hatte oder ein Drittel der geschätzten Größe von ΙΡΙΓ- mBHA auf?;ies, wurde das oben beschriebene gereinigte Hif-4c-Fragment als Sonde für die Auswahl von Bakterienclonen, die Eekombinant-DITA-Moleküle mit verwandten Hybrid-DlIA-Inserts enthalten, verwendet (Pig. 3).

Die die oben beschriebene Untergruppe

-III bildenden

64 Bakterienclone wurden auf eine ültrafilter-lvlembran (S cm Durchmesser) aufgetragen, auf eine Agarplatte (mit Diaminopimelinsäure, ITalidisinsäure und Tetracyclin 7?ie oben vorbereitet) gelegt und 24 h lang bei 37 ⁰G inkububiert. Das Filter wurde auf einen 0,75-ml-Tropfen von 0,5 H ITaOH gelegt und nach 2 bis 3 niin auf ein' Papierhandtuch zur Snt-

^43403 4 .

fernung von überschüssiger Flüssigkeit übertragen; der Schritt wurde wiederholt. Das Filter wurde unter Anwendung von 1 M Tri-HCl (pH-Wert 7,5) neutralisiert, mit 1,5 M HaGl - 0,5 πι Tri-HCl (pH-Wert 7,4) in einer ähnlichen Weise wie oben gewaschen und luftgetrocknet» Das Filter wurde in 0,3 M EaCl eingetaucht, luftgetrocknet und 2 h lang unter Yakuum auf 80 ⁰C gehalten. .

Hif-4c Pst-Fragment (30 ng) wurde'durch Sinschnitttranslation ^J P-markiert (A«.J, Jeffreys und H.A. Flavell, "The Rabbit fa-Globin Gene Contains A Large Insert In The Coding Sequence" (Das Kaninchen - $-Globin-Gen enthält einen grossen Insert in der Kodierungssequenz), Cell, 12, S. 1097 1108 (1977)), wobei Λ -³²P dATP und öC-³²P dCTP (spezifische Aktivität je 40 Ci/mMol) verwendet wurden. Das die

λ-III-Kolonien tragende'Filter wurde in 4 χ SET (SST ist 0,15 M ISTaCl, 30 mH Tri-HCl (pH-Wert 8,0), VmM SDTA), 0,1 % (Masse/Yol) Ficoll, 0,1 % PoLyvinylpyrrolidin, 0,1 Masse%/Yol BSA, 0,5 % SDS und 200 /Ug/ml denaturierter, fragmentierter Lachssamen-DHA. 7 h lang bei 68 C vor-

5 32 hybridisiert und mit 2 χ 10 cpm von P-markiertem Hif-4c-Fragment in 4 s SST, 0,02 Masse%/Yol Ficoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidin, 0,02 Masse%/Yol BSA, 0,5 % SDS und 200 denaturierter und fragmentierter Lachssamen-DITA t6 h

lang bei 68 ⁰C hybridisiert. Das Filter wurde bei Raumtemperatur mit SST - 0,5 % SDS gespült, mit 2 χ SET - 0,5 % SDS 5 h lang bei 68 C gewaschen, wobei die Lösung einmal erneuert wurde, sowie mit 3 mM Trizma-Base 4 h lang bei Raumtemperatur gewaschen, wobei die Lösung einmal erneuert wurde. Nach dem Trocknen des Filters wurde ein Röntgenfilm, auf dem Filter 80 h lang unter Verwendung eines Schirmes belichtet. Drei Kolonien ergaben eine starke positive Reaktion, und ZY/ar X -III-7D, X -III-2H und ^-III-4c, und zwei Kolonien eine schwache, und zwar A.-TIl-TE, /C-III-3D*

243403 4-

Es wurden kleine Kulturen von den Hif-4c-verwandten Clonen gebildet, Form-I-DIA ?;urde gereinigt, niiz Pstl gespalten und mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese wie oben beschrieben analysiert,. Alle Form-I-DHAn ergaben ein großes Fragment (Plasmid pBR322-Komponente) und ein kleines (Ey- " bridinsert)* Das Rekombinant-DITA-Molekül von X-III-2H gab den größten Insert frei, und zwar etwa 900 tup* Dieses Rekombinant-DITA-Molekül wurde als Z-pBR322(?st)/HcIF-2H ("Hif-2Hⁿ) bezeichnet und sein Insert als "Hif-2H-Fragment¹¹«

Hif-2H wurde auf seine Fähigkeit hin getestet, IM-6CmRIA zu binden, indem es nach obiger Beschreibung an DPT-Papier (4 /Ug/100 mm ) gebunden und zu PoIy(A)-RlTA (0,3 ,ug//Ul) 16 h lang hybridisiert und die IFlT-C^mBIlL-Aktivität bestimmt wurde:

DMA-Probe IFlT-d-Aktivitat (TuMl) ⁺

Hif-2E 250 + 50 (Mittelwert von 4 Be

stimmungen)

Z-pBR322(H3)/RcßG-4,13 30 (Mittelwert von'2 Bestimmungen)

PBR322 " 20

+ Durch Reduzierung des cytophatischen Effektes analysiert, Hif-2H wurde wie für Hif-4c beschrieben recloned und als Hif-2h bezeichnet..

In einem ?;eiteren Versuch wurde eine zusätzliche Gruppe von Ξ> coil Glonen, die Rekombinant-DJFA-Moleküle enthielten, vorbereitet, und zu dem markierten Hif-4c-Fragment hybridisierende Kolonien wurden identifiziert· Um eine hohe Ausbeute von Plasiniden mit langen cDlTA-Inserta zu garantieren, wurde ein Teil der doppelsträngigen ^J ?-markierten i*eukozyten-cDHA, die enzymatisch von Leukozyten-Poly(A)-RiTA hergestellt worden war (das gleiche.cDHA-Präparat wie oben beschrieben nach der Größe fraktioniert, indem sie durch

243403 4.

einen Saccharosedichtegradienten "zentrifugiert wurde, wobei die gleiche für das Zentrifugieren der PoLy(A)-SETA beschriebene Verfahrensweise angewandt wurde. Die Fraktionen, die die cDSA mit einer Sediinentationsgeachwindigkeit, die einein 600-b,p.-DNA-Fragment oder einem größeren entspricht, enthielten, wurden zusammengenommen, und die cDIIA wurde nach der Athanolauafällung zurückgewonnen. Die cDliA wurde mit dC&jp-Residuen verlängert, zu dGMP-verlängertem _PstI-gespaltenem pBE322 hybridisiert, und die Hybrid-DiTA wurde zur Transformation von Ξ. coli wie zuvor verwendet, nur mit . dem Unterschied, daß Ξ. coli · ΞΒ101 eingesetzt wurden. Die Bakterien wurden auf Ultrafilter mit einem Durchmesser von 8 cm verteilt, auf Tryptonmedium-Agarplatten (die 10 /Ug/ml Tetracyclin enthielten) gebracht und vermehrt, bis kleine Kolononien erschienen. Ein-Kopie-Filter wurde angefertigt, indem ein frisches feuchtes Ultrafilter auf das die Kolonie tragende Filter gedrückt, abgezogen'und mit der Oberseite nach oben auf eine Agarplatte, die 4,4 % Glycerin enthielt, gelegt und inkubiert wurde, bis kleine Kolonien erschienen. Diese Kolonien tragende Filter wurde mit einem weiteren ülzrafilter bedeckt, bei -55 ⁰G eingefroren und aufbewahrt (D. Hanahan und M, Meselaon, "A Protocol For. High Density Plasmid Screening" (Ein Protokoll für .Plasmid-Screening hoher Dichte), September 1978, persönliche Mitteilung). Es wurden achtzehn Filter, die insgesamt etwa 5000 Kolonien trugen, vorbereitet. Eine Konie jedes Filters wurde für die

32 -

Hybridisierung zu dem ^ P-markierten, Pst!-ausgeschnittenen Hif-4c-DHa-Fragment genau nach der oben erfolgten Beschreibung verwendet. Etwa 185 positive Kolonien wurden auf einem Autoradiogramm identifiziert, auf Ultrafiltern recloned und erneut durch Hybridisierung identifiziert, 95 Clone, die as stärksten auf die Hybridisierung reagierten, wurden als Z-p3R322(Pat)/HcIF-SlTI bis 33Γ95 bezeichnet und zu weiteren Untersuchungen verwendet.

243403 4

Vorausgesetzt, daß Hif-2h die Fähigkeit hat, ein eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPIT aufweisendes PoIypeptid zu erzeugen (infra), dann ist selbstverständlich klar, daß dieses Hif-2h und andere damit verwandte DlIA-S equenze η, z.B. Hif-4c, für diese Methode des Clon-Screening und ebenso gur für andere Clone eingesetzt werden kann,, die DHA-Sequenzen enthalten, die aus der Rekombinant-DHA-Technologie, Synthese, natürlichen Quellen oder einer Kombination davon stammen, oder für Clone, die DlTA-Sequenzen enthalten, die mit einer der obigen DSA-Sequenzen durch Mutation, einschließlich einfacher und mehrfacher, Basensubstitutionen, Insertionen, Inversionen oder Deletionen verwandt sind, um andere DHA-Sequenzen und Clone auszuwählen, die gleichfalls für HuIPlT kodieren. Daher liegen derartige DITA-Sequenzen und ihre Identifizierung auch im Rahmen der Erfindung (z.B· infra)» Es ist ebenfalls selbstverstädnlich, daß DHA-Sequenzen, die durch die obigen DM-Sequenzen nicht ausgewählt wurden, die jedoch infolge ihrer Anordnung von nucleotiden bei Expression für die Polypeptide kodieren, die durch die Expression .der obigen DlIA-Sequenzeη kodiert wurden, auch im Rahmen der Erfindung liegen. . .

Weitere Charakterisierung von Hif-2h-DlA-insert

Wie oben beschrieben, enthält das Rekombinant-DFA-Molekül Hif-2h einen Insert von etwa 900 b.p. und hj/bridisiert zu Humanieukozyten-Interferon-mRjJA. Ss wurden die folgenden zusätzlichen Charakteristik^ bestimmt.

1. Hybrid-arretierte Translation

Wenn mRHA zu einer geclonten, komplementären cDHA hybridisiert wird, wird die Translation dar mRlTA inhibiert, doch durch Wärmedenaturierung des Hybrids wird translatierbare mRItfA freigesetzt (3.M. Paterson, u.a., "Structural Gene

— cd —

243403 4 -

identification And Mapping B:/ DMA-mRITA Hybrid-Arrested CeIl-Pree Translation" (Struktur-Gen-Identifizierung und Einordnung durch DITA-mRBA hybrid-arretierte zellfreie Translation), Prpc. Hatj. Ac ad. Sei, USA, 74, S. 4370 - 4374 (1977)). 2,2 /Ug Pstl-gespaltenes Hif-2h, und als Kontrolle 2 /Ug HindIII-gespaltenes Z-pBR322(H3)/Rc |S G-4,13 ("Rc ßG") wurden in 10 /Ul 80 Yolfo/lol entionisiertem Formamid - 20 mM PIPSS-Puffer (pH-Wert 6,4) 10 min lang bei. 80 ⁰C denaturiert. Die Lösung wurde in ein Eppendorf-Gläs gegeben, in das Leukozyten Pol:/(A)-RiIA (5 /Ug), HaCl (4 /UMol) und 3DTA (10 nMol) eingefüllt worden waren.. Das Gemisch wurde unter einer Paraffinschicht 7 h lang"auf 48 ⁰C gehalten, gekühlt und mit 200 /Ul HoO'verdünnt· Die beiden Proben wurden in gleiche Teile geteilt, und je eine wurde 30 a lang auf 1.00 ⁰C gehalten· Die EFuc Ie in säur ai wurden mit Äthanol ausgefällt, in 3 /Ul HpO gelöst und in bezug auf TFli-chmRlIA-Aktivitat in Oocyten wie oben analysiert· . .

Le-PoIy(A)-

DHA RITA-Einsatz Behandlung ΙΈΈ-Φ (IU/ml)^;

Hif-2h (1.1 /Ug) 2,5 /Ug

Hif-2h (1·1 /Ug) 2,5 /Ug

Rc G (1 /Ug). 2,5 /Ug

PlC G (1 /Ug) 2,5 /Ug

Eif-2h (0.5 /Ug) 1 /Ug

hybridisiert	400
hybridisiert und denaturiert	.2000
hybridisiert	3000
hybridisiert und denaturiert	3000
keine	2000
keine	3000
keine	2000

+ Das Oocytenmedium wurde nach 48 h mit Hilfe der Methode zur Inhibition des cytopathischen Effektes analysiert.

Daher inhibierte Hif-2h, wenn es mit PoIy(A)-RITA hybridisiert wurde, die Translation der IPIiT-<% mRxTA in der PoIy(A)-RiTA; nach Denaturierung des Hybrids war die IZüT-oCmRITA wieder translatierbar. Dieser Yersuch bestätigt, daß Hif-2h Sequenzen- enthalt, die in bezug auf I?5T-cCmRJiA komplementär sind.

24 3 40 3 4-63-

2. Analyse, durch Restriktions-Enzym-Spaltung und Bestimmung von ITucleotid/Aminosäure-Sequenzen und. Restriktionskarte.- .

Es wurden Digerierungen von Hif-2h mit verschiedenen Restriktionsenzymen. (Uew England Biolab) durchgeführt und die resultierenden Produkte mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Die untersrichenen Fragmente sind nicht jeweils in pBR322 und Hif-2h vorhanden.

Restriktionsenzym

Fragmentgrößen

Hif-2

pBR322

Pstl EcoRI BgUI EcoRI + BgIII EcoRI + Pstl

BsdI

Mb oll

+ 20, 4361 1426, 3820

336, 496O

209, 676,-748 3"STi

921, 587, 540, 504 457,. 434, 2 s 231,

+14 Fragmente 200 bp

1616» 884 und andere

	4361	3611
	4361	540,
nicht		457,
		267,
	gespalten
	4361
	748,.
	587,	ermittelt
	504,
434,
234
+14 Fragmente
200 bp
nicht

Obwohl hier intern konsistent, wird die absolute Größe dieser Fragmente am besten unter Bezugnahme auf Fig. 8-10 angegeben.

⁺⁺⁺ Von Sutcliffe (supra)

32

Außerdem wurde 5'-terminal P-markiertes PstT-gespaltenes Hif-2h mit verschiedenen Restriktionsenz:;nien gespalten, und die Größen der radioaktiven Fragmente, die von dem cDlTA-Insert in diesem Rekombinant-DUA-Molekül abgeleitet wurden, wurden bestimmt:

243403 4-

32 J-

Restriktionsenzrym P-Fragmente'

EcoRI 676, 209

HindIII keine Spaltung

799, 86

keine Spaltung keine Spaltung . keine Spaltung 210, 62 545, 340

⁺ Obwohl hier intern konsistent, wird die absolute Größe ('"'Ι dieser Fragmente am besten unter Bezugnahme auf Fig» 3-10 angegeben.

Aus diesen Daten wurde eine Restriktionskarte von Hif-2h angefertigt (Fig.. 4). Die Karte ist hinsichtlich der absoluten lage der Stellen nicht endgültig und ist möglicherweise in bezug-auf MboII-St'ellen innerhalb des Inserts unvollständig» Sur die am dichtesten an des Insert liegenden Stele Ieη sind innerhalb der pBR322-Komponente angegeben. Der Pfeil gibt die Orientierung des IFF- DHA-Kodierungsstranges an.

Obwohl die tatsächliche Struktur des Hif-2h-Fragmentes oder ^!._, anderer Inserts in erfindungsgemäßen Clonen oder der Aminosäure-Sequenz oder Struktur der davon kodierten Polypeptide vom Fachmann nicht gebraucht werden, um die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung zu verwirklichen und anzuwenden, wurden die obigen Daten und die Restriktionskarte in die ursprüngliche Anmeldung als die beste zur Verfugung stehende Information über die Struktur des Fragmentes zum Zeitpunkt der Einreichung der ursprünglichen Anmeldung aufgenommen. "He zu erwarten war (supra, S. 9, Zeilen 27 - 29), sind die Angaben und die Restriktionskarte des Hif-2h-Fragmentes unter Anwendung allgemein bekannter Techniken der JSucleotid-Sequenzierung und der Restriktionsanal^se seitdem verbessert worden. Zun Beispiel A.II. Mazam

^43403 4".

und ¥* Gilbert, "A !Tew Method For Sequencing DM'¹ (Sine neue Methode zur Sequenzierung von DITA), Proc. Hat!. Acad. Sei« USA, 74, S* 5&0 - 5^4 (1977). Plasmid-DEA wurde nach Methode B hergestellt (H.M, Wilkie, u.a., "Hybrid Plasmids Containing An Active Thymidine Kinase Gene Of Herpes Simples: Virus I" (Eybridplasmide, die ein aktives Thymidin-Kinase-Gen von Herpes Simplex Virus I enthalten), Nucleic Acids Research, 7, S, 859 - 877 (1979)) und durch verschiedene Restriktionsenzyme im wesentlichen nach der Empfehlung des Herstellers eingeschränkt, nur daß das Rinderserumalbumin in den. Snzympuffern durch 200 /Ug/ml Gelatine ersetzt wurde. (EcoRI war ein Geschenk von W. BoIl, Bspl von A. Kiss, und andere Enzyme wurden von ITew England Biolabs bezogen),

Eingeschränkte DSA (20 /Ug) wurde mit Phenol extrahiert, mit Äthanol auggefällt, in 0,05 M. Tri-HCl (pH-Wert 8) gelöst und über eine kleine Säule von Ghelex-100 geleitet,. Pragmente mit abschließenden oder 5'-überhängenden Enden wurden durch Behandlung mit 0,2 Einheiten alkalischer Kalbs-Intestinalphosphatase. (Boehringer) je pMol DlIA-5 '-Enden in 200 /al 0,05 M Tri-HDl (pH-Wert 8) über cO min bei 37 ⁰C dephosphoryliert» Das Enzym wurde durch, einstündiges Halten bei 65 C inaktiviert. 5¹Ur .DlTA-Pr agme nt e mit 3 ^r-überhängendeη Enden wurde alkalische Bakterienphosphatase (Worthington) wie beschrieben benutzt (A.M.. Masam und ^T,7. Gilbert, supra) , nur wurde eine Inkubationszeit von 30 min bei 65 ⁰C gewählt. Die dephosphorylierte DHA wurde durch Adsorption an DEAE-Cellulose und Eluierung daraus gereinigt (7. Muller u.a. "Site-Directed Mutagenesis IU DlTA; Generation Of Point Mutations In Cloned—B-Gl.obin Complementary DlTA At The Positions Corresponding To Amino Acids 121-123" (Stellen-gerichtete Mutagenese bei der DlTA:Erzeugung von Spitzenmutationen in geclonter B-Globin-Komplernentär-DITA an den den Aminosäuren 121-123 entsprechenden Stellen), J. Mol« Biol., 124, S. 343 - 358 (1978)) oder der Polyacrylanidgel-Elektrophorese .bei Bedarf unterzogen (siehe unten). Aus einem PoIy-

243 40 3 4-

acrylamid- (oder Agarose)-Gel in 0,15 M NaCl, 0,05 M Tri-HCl (pH-Wert 8) zurückgewonnene Fragmente wurden auf einer 0,1-ml-Hydroxyapatit (Biorad HTP)-Säule adsorbeirt, viermal mit 1 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer -(pH-Wert 7) gewaschen und mit .0,3 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7) eluiert. Die Lösung wurde zehnfach verdünnt und die DiIA auf DEAE-CeI-lulose adsorbiert und wie beschrieben zurückgewonnen (W. Muller, u,a·, suOra) «

Bach der Athanolpräzipitation wurde die DHA 5'-terminal mit £~y -^ Pj⁷ATP (12 - 34 ,uCi je pMol DlTA 5'-Enden) und ^lv- Polynucleotidkinase (ITew England Biolabs oder P-L Biochemicals Ine») im wesentlichen nach der Beschreibung von A,M. Haxam und W, Cilbert, supra, markiert, nur wurde die DiTA vor - der Kinasereaktion nicht denaturiert· Spezifische Aktivitäten von 1 - T, 5 /uCi £~^ ^fJ-Phosphat je. pMol DlTA 5'-Enden wurden gewonnen.

Zur Sequenzierung wurden markierte Fragmente mit einem zweiten Restriktionsenzym gespalten und die Produkte durch Elektrophorese durch ein 5 jSiges Polyacrylamidgel in Triborat-EDTA-Puffer getrennt. Die verlangten Fragmente wurden von dem Gel extrahiert und gereinigt (Muller, u,a., supra). ./ " Die verschiedenen Fragmente für die Sequenzierung wurden wie folgt, zubereitet (die Zahl gibt die nominelle Fragmentkettenlänge in Basenpaaren an, die markierte Stelle ist durch ein Sternchen gekennzeichnet):

(1) Spaltung von Hif-2h mit BsjpI, Isolierung von BstoI-BsoI-232' und Bsη 1-3sρI-949 durch 5-iu-Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Loening's Puffer (U.E, Loening "The Fraction Of High Molecular Weight Ribonucleic Acid B:/ Polyacrylamid Gel Electrophoreseⁿ (Die Fraktion von Ribonucleinsäure mit hoher relativer Llolekülmasse durch Polyaerylamid-Gel-Elektrophoreae), J. Biochem,, S. 102 (1967)); .

24 3 40 3 4 -

(2) Spaltung von Hif-2h mit Bspl, Markierung, Spaltung mit P_-StI, Isolierung von 3spI⁺ -PstI-83 und Bsi3 ⁺-PstI-827:

(3) Spaltung von Hif-2h. mit BgJ.II, Markierung, Spaltung

mit PstI, Isolierung von Βε:1Π⁺-Ρ3Ϊΐ-336 und BgIII⁺ -Psti-570;

(4) Spaltung von Hif-2h mit M^-OpII, Markierung, Digerierung mit „Pstl und Hindll (zur Abspaltung eines störenden 350 bp p3B322-Fragmentes), Isolierung von MboII⁺ -BstI-519 und Mbo H⁺-PSt-3 51 ;

(5) Spaltung von Hif-2h mit ScoRI. Markierung, Spaltung mit Pstl». Isolierung von Sc_oRI⁺+Pst 1-708 und EcoRI⁺-PstI-198;

(6) Spaltung von Hif-2h mit Pstl, Markierung, Spaltung mit BgIII, Isolierung von PstI⁺-B£lII-57O und PstO⁺-BglII-336;

(7) Spaltung von Hif-2h mit Avail, Markierung, Spaltung mit Pstl und BgJLII, Isolierung von AvaII~-Ps11-186 und A⁺-BgJ. LL-147;

(8) Spaltung von Hif-2h mit PvuII, Markierung, Spaltungmit Pstl und 3gJ.II, Isolierung von PvuII"^r-PstI-48c«

Die !Fragmente wurden gemäß der Methode von A,M, Maocam und. W.- Gilbert, sunra,. mit den in Protokollen, die von den gleichen Verfassern im September 1978 vorgelegt wurden, beschriebenen Modifikationen abgebaut. Die Produkte -nur de η auf 12 %igen Pol^acr^lamidgelen. mit den Abmessungen 0,1 :: 25 s 36 cm (Acr:/lamid/Biacrvlamid = 18/1) in 50 mil Triborat, 1 mM EDTA tpH-Wert 8,3) in Versuchen, von 2,8,18 und 26 h bei 900 V mit einem nachfolgenden Versuch von 6 ta bei 700 V fraktioniert» Die besten Ergebnisse wurden ersielt, ^enn die Gele 2 bis 3 Tage vor der Verwendung bei Raumtemperatur gehalten wurden»

243 40 3 4

jede Dehnung des cDHA-Inserts wurde von b eiden Strängen sequenziert, und jede Restriktionsstelle, die als markierter Terminus diente, vrarde unter Verwendung eines sie überspannenden Pragmentes sequenziert. Die auf diese Weise ge- ?;onnene Hucleotidsequenz ist in den Pig. 8 bis 10 wiedergegeben. Wie zu erwarten war, sind die Positionen der verschiedenen Restriktionsstellen in diesem Insert absoluter lokalisiert als die durch die Restriktionsenzzymspaltung allein bestimmten und in Pig. 4 angegebenen.

In den Pig· S bis 10 wird der heropolrymere Teil de*s Inserts von 23G-Residuen an dem 5'-Ende und durch 7A Residuen (die wahrscheinlich den Poly (A)-Terminus der mRHA reflektieren) gefolgt von 150 Residuen am 3'-Terminus flankiert. Zur Bezugnahme ist der Insert von dem ersten, dem dG-Schweif folgenden Hucleotid bis zum letzten Hucleotid vor den PoIyA-Residuen numeriert. Sin ATG-Intiierungs-Triplet in Position 57-59 und ein TAA-Terminations-Triplett an Position 624-626 definieren ein nicht durch Honsens-Codons unterbrochenes Orientierungssystem.: Die beiden anderen Orientierungssysteme in dieser Region des Inserts enthalten 18 bzw* 12 Honsens-Codons. Darüber hinaus befinden sich die einzigen anderen Sequenzen, d.h. in verschiedenen Orientierungssystemen, die von einem ATG oder GTiG und einem Terminationssignal flankiert sind, die für ein Polypeptid von 25 Aminosäuren oder mehr kodieren, zwischen den Nucleotiden 226 und 304, 640 und 778 bzw. 683 und 743. Daher enthält die Region zwischen den nucleotiden 57 und 62β höchstwahrscheinlich die Hucleotidsequenz des Hif-2h-Pragnentes, die für ein P0I7-peptid kodiert, das eine biologische oder immunologische Aktivität von IPH- gemäß der Erfindung aufweist. Man sollte sich jedoch darüber im klaren sein, daß von PoIyA-RHA mit Hilfe der üblichen Methoden geclonter cDHA (A. Efstratiadis, u.a., supra) 5-'Terminal-HueIe0tide fehlen und sie sogar künstliche Sequenzen enthalten kann (R.I. Richards, u.a., "Molecular Cloning And Sequence Analysis

243403 4 -

Of Adult Chicken B-Globin cDEi" (Molekülcloning und Sequenzanalyse von B-Globin-cDHA erwachsener Kücken) Hueleic Acids Research, 7, S. 1137 - 114-6 (1979)). Ss ist daher nicht sicher, ob das an den nucleotiden 57 - 59 liegende ATG tat-, sächlich das erste ATG authentischer mRiTA ist. 5¹Ur die Zwecke der folgenden Beschreibung wird jedoch angenommen, daß das ATG an den nucleotiden 57 - 59 das erste ATG authentischer mBEL·. ist»

Vergleicht man das durch diese Region des Inserts kodierte Polypeptid mit jener Sequenz von 35 Amino-Tenninal-Aminosäuren von authentischem Humanlymphoblastoid-Interferon —SerAspLeuProGlnThrHisSerLeuGlyAsnArgAlaLeuIleLeuleuAlaGln-MetGlyArglleSerleuPheSerCysLeuLysAspArgHisAsp—, bestimmt von K.C. Zoon u.a., sup'ra und M. Junkapiller und L. Hood, supra* so hat es dön Anschein, als ob "das gewählte Orientierungssystem richtig ist und die nucleotide 57 - 124 für eine Signalsequenz kodieren können, die der· für das "reife" Polypeptid kodierenden Hucleotidsequenz vorausgeht, weil die Übereinstimmung der veröffentlichten Sequenz mit der bestimmten Sequenz (von der 24. Aminosäure an aufwärts) eine ausgedehnte Koinzidenz zeigt (d.h. 2c von 35 Aminosäuren).

In eukaryotischen mRHAn ist das erste AUG-Triplett von dem 5'-Terminus im allgemeinen die Initiierungsstelle für die Proteinsynthese (H* Kozak, "How Do Sukaryotic Ribosomes Select Initiation Regions in Messenger RHA" (Wie wählen eukaryotische Ribosomen-Initiierungsregionen in Messenger-BITA), Cell, 15, S. 1109 - 1125 (1978)). Das Codon in dem Hif-2hj?ragment, das der ersten Aminosäure von Lymphoblastoid-Interferon entspricht, ist 22 Codons- vom ersten AUG (und 14 Codons vom zweiten) entfernt, was darauf hindeutet, daß der für Interferon kodierenden Sequenz eine Sequenz vorausgehen kann, die ein Signalpepticl von 23 (oder weniger wahrscheinlich 15) Aminosäuren bestimmt. Die längere der mutmaßlichen Signalsequenzen enthält eine ununterbrochene

U O 4 _7n

Serie von 11 hydrophoben Aminosäuren (und die kürzere -eine von S hydrophoben Aminosäuren). Die Ansammlung Hydrophober Residuen ist für Signalsequenzen charakteristisch (siehe B.D. Davis und P.C.Tai, "The Mechanism Of Protein Secretion Across Membranes" (Der Mechanismus der Proteinsegregation an Membranen), ülature, 283, S. 433 - 438 (1980)).

Die offensichtlich "reifein¹¹ LEW- cC-Polypeptid entsprechende. iTucleotidsequenz umfaßt 498 Nucleotide, die für 166 Aminosäuren kodieren. Angenommen, es findet keine CarbozyterminaLrUinsetzung statt, dann beträgt die relative Molekülmasse von Interferon-Polypeptid 19388» Die Grundzusammensetzung der Kodierungssequenz beträgt 50 % QO· Die Codonanwendung innerhalb der Interferon-Kodierungssequenz steht in vertretbarer Übereinstimmung mit der für Säugetier-mRIAn im allgemeinen zusammengestellten (R· Grant harn, u.,a. "Godon Catalog Usage And 'The Genome Hypothesis¹¹ (Codonkataloganvjendung und die Genom-Hypothese), ITucleic Acids Research, 8, S. 49 - 62 (1980)). Alle beobachteten Abweichungen könnte man der geringen erfaßten Anzahl zuschreiben.

Die Struktur des in i?ig<* 3-10 für das Hif-2h-Fragment . gezeigten Polypeptids berücksichtigt natürlich keinerlei Modifikationen des Polypeptids, die durch seine Wechsel- -wirkung mit in vivo Enzymen, z.3. Glycosolation, hervorgerufen werden* Daher sollte man beachten, daß diese Struktur möglicherweise nicht mit in vivo erzeugtem IS¹IT- cL übereinstimmt, daß sie .jedoch sehr ähnliche, vjenn nicht identische biologische und immunologische Eigenschaften hat,.Diese Strul tür schließt auch keineswegs die-Wahrscheinlichkeit aus, daß andere Modifikationen ^T.?ie Mutationen, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen oder chemische Derivatisierung dieser Struktur nicht Verbindungen erzeugen bürden, die IPU-öl-Aktivität aufweisen.

- 71 -

^43403 4-

3. Bestimmung des Plus-Stranges der eingefügten IFlT-^-cDEA

Der DEA-Strang, der die gleiche Sequenz wie die mREA hat, wird als Plus-Strang bezeichnet und sein Komplement als 'Minus-Strang, Der Plus-Strang des IFE^icDEA-Inserts wurde wie in Hg, 5 dargestellt identifiziert, Hif-2h-DEA wurde mit dem Reatriktionsenzym BgIII gespalten, die Termini mit

^J P-Phosphat markiert (wie oben für Pstl-gespaltene Termini beschrieben), und die DEA mit Pstl digeriert, Lim längere (545 b.p. (570 b,.p, wie in der oben erläuterten verfeinerten Analyse bestimmt)) und kürzere 340 b_?p. (336 b.p, wie in der oben erläuterten verfeinerten Analyse bestimmt) radioaktive Fragmente zu erhalten» Diese Fragmente wurden denaturiert und zu PoLy(A)-EUA von induzierten Leukozyten in 80 %igem Formamid, 0,4 M EaGl hybridisiert, d.h, unter Bedingungen, bei denen keine DEA-DEA-Reassoziierung erfolgt (supra). Die Nucleinsäuren wurden mit Fuclease Sl digeriert, die alle einsträngigen nucleinsäuren abbaut, vor" allem die

32

nicht-hybridisierte P-DEA, und die Produkte wurden in einem Polyacrylamidgel getrennt (R*!¹. Weaver und C. Weissmann, "Mapping Of REA By A Modification Of The Berk-Sharp Procedure" (Kartierung von REA durch eine Modifizierung des Berk-Sharp-Verfahrens), Hueleic Acids Research, 7, S, 1175 1193 (1979)). Ein Autoradiogramm zeigte, daß nur das kürzere Eucleotid-Fragment hybridisiert und durch die PoLy(A)-RlIA-geschützt worden- war, wobei der 5'-markierte kürzere Eucleotidstrang als der Minus-Strang identifiziert wurde. Die Orientierung des Plus-Stranges entspricht daher der Darstellung in Fig. 4 und Fig. 5 (rechte Seite).

4. Demonstration, daß PoLy(A)-REA von nicht-induzierten Humanleukozyten nicht zu Hif-2h-DEA hybridisiert

5s wurde ein dem im vorhergehenden' Abschnitt beschriebenen identisches Experiment durchgeführt, jedoch stammte die

3403 4

-72 -

PoLy (A)-RSfA von nicht-induzierten Humanleukozyten, die nach dem gleichen Verfahren wie im Falle der Sendai-Virus-induzierten Leukozyten hergestellt worden waren. Ss wurde keine nachweisbare Menge von.markierter DIfA geschützt. Im Vergleich mit den Ergebnissen des vorhergehenden Abschnitts enthält die PoIy(A)-RITA von nicht-induzierten Zellen weniger, als etwa 1/20 der Menge mRlA, die zu Hif-2h hybridisierbar ist, als die von induzierten Zellen stammende PoIy-(A)-RSA.

Synthese eines. Polypeutids mit Interferon-Aktivität durch B» coli, das mit Z-pBR322(Pst)/HcIff-4c verwandte Rekombi-η an t-DSFA-Mo lekül enthält

Die Pstl-Stelle von pBR322 liegt innerhalb des β -Lactamase (Penicillinase),-Gens. Daher kann, wenn ein kodierendes DITA-Segment (z.B. eine cDSEA, die das gesamte oder einen Teil.eines Gens enthält) in die Position in der richtigen Orientierung und dem richtigen Orientierungssystem eingesetzt wird, ein verschmolzenes Protein resultieren. Das Protein würde aus dem Ainin-Terminal-Anteil von ρ -Lactamase und der anschließenden Aminosäuresequenz, für die die eingefügte DUA-Sequenz kodiert, bestehen (L, Villa-Komaroff, u.a., supra). 7/enn das eingefügte DiTA-Segment eine DITA-' Sequenz umfaßt, die ihr eingenes Initiierungssignal enthält, und eine Sequenz hat, die ihr mit einem Terminationssignal in Phase mit der ο -Lactamase-Sequenz vorausgeht, können Termination und Re-Initiierung beim zweiten Initiierungssignal erfolgen, und es kann ein nicht-verschmolzenes, aktives Protein entstehen (A.C.Y. Chang, u.a., sunra). Um sucherzustellen, daß der mit Hif-4c verwandte DHA-Insert zur Expression innerhalb des β -Lactamase Gens in das richtige Orientierungssystem eingefügt wurde, wurde eine Gruppe von Derivaten von pBR322, und zwar pK!T273, ?KT280 und pKT287 (hergestellt von K. Talmadge, persönliche Veröffentlichung, 1979) verwendet. Jedes dieser Derivate weist eine Pstl-Stelle auf, die so angeordnet ist, daß

4 .

ein in dieser Stelle gebundener DiTA-insert in einem anderen Orientierungssystem "von einem Insert- an der Pstl-Stelle der anderen Derivate der Gruppe liegen wird (Pig. c). Daher gestattet die Gruppe die Insertion von DUA in das /S-Lactamase-Gen in allen drei Orientierungssystemen. Der Ps_tl-abgeschnittene Insert von Hif-2h wurde, wie für das Fragment Hif-4c beschrieben, hergestellt. Das Hif-2h Pst^-Pragment (10 ng) wurde mit P_stl-gespaltenem pBR322, pKT279, ρΚΤ 280 oder pKT287 (10 ng in jedem Fall( in 20 /al 10 mM Tri-HCl (pH-Wert. 7,5), β mM MgOl₉, 100 mM. ITaQl,- β nH /5 -Mercaptoäthanol., 200 ,/Ug/ml Gelatine und 0,1 · 2ώΙ ATP vermischt und 16 h lang bei 10. ⁰C mit. 0,1 Einheiten T.-DiIA-Ligase (lew England Biolabs) inkubiert. Die resultierenden Rekcmbinant-DiTA-Moleküle.werden als Z-pBR322(Pst)/EcIP-2h, Z-pKT279(Pst)/HcIF-2h, Z-pKT280(Pst)/HcIP-2h und Z-pKT287(Pst)/HcIP-2h bezeichnet. E. coli HB101 wurde mit jeden dieser Rekombinant-DiTA-Moleküle transformiert, und· transformierte Kolonien wurden wie zuvor beschrieben auf Tetracyclin enthaltenden Agar-Platten ausgewählt. Da gegenüber Tetracyclin resistente Clone von transformierten Bakterien auch den rezyklisierten Vektor enthalten können, wurden Bakterienkolonien von jeder Gruppe auf Ultrafiltern gezüchtet, und zu

P-markierten Hif-4c-Pragment hybridisierende Kolonien

wurden wie oben beschrieben identifiziert und ausgewählt. Diese Stämme wurden wie folgt bezeichnet:

E. coli HB101 (Z-pBR322(Pst)/HcIP-2h-AEl) bis (-AH3);

E. coli ΞΒ101 (Z-pKT279(Pst)/HcIP-2h-AHl) bis (-AHB);

E. coli HB1Q1 (Z-pKT280(Pst)/HcIP-2h-AHl) bis (-AH3);

E. coli HB101 (Z-pKT2S7(Pst)/HcIP-2h-AHl) bis (-AE3);

Extrakte von einigen der oben genannten Stämme sowie einiger der Stämme Z-p3R322(Pst)/HcIP-SlTI bis 95 wurden auf ijjW-öC-Aktivität hin getestet. Bakterien wurden in Trypton-Medium bis zur stationären Phase gezüchtet, geerntet, mit 1/20 ToI (bezogen auf das YoI der Kultur) 50 rnM Tri-HCl

243403 4 -

(pH-Wert 8), 30 mM ITaGl gewaschen und eingefroren. ITach dem Auftauen wurden die Zellen wieder in dem unten angegebenen Volumen des vorhergehenden Puffers suspendiert, und Lysoz^m wurde bis 1 mg/ml zugesetzt. ITach SO min bei 0 ⁰C wurden die Suspensionen eingefroren (in einem Bad von Äthanol und Trockeneis) und fünfmal (bei 37 G) aufgetaut und 10 min lang mit 12 000 U/min in einem Sorvall-Rotor GSA zentrifugiert. In einigen Fällen wurde ein Teil der überstehenden Flüssigkeit (S30) weiter mit 100 000 zg in einem Spinco Rotor _r Typ 65j zentrifugiert, und die überstehenden Flüssigkeiten (S100) wurden zurückgewonnen. Diese überstehenden wurden auf IPlT-Ck-Aktivität hin durch eine Analyse hinsichtlich der Reduktion des cytopathischen Effektes ausgesondert (Bsp. 1). Die eine positive Reaktion in Beispiel 1 zeigenden Kolonien wurden erneut-analysiert, sowie auch. 49 Clone von der oben beschriebenen Gruppe Z-p3R322/HcIF-SlT-1 bis SIT-95 in einer geringeren Verdünnung (Bsp. 2)»

Herkunft des Extraktes:

Ξ. coli HB 101 ν transformiert durch:

Z-pBR322(?st)/HcIF-2h Z-pBR322(Pst)/HcIF-2hAH-1 bis 3 Z-pET279(Pst)/HcIF-2h-AH-1 bis 7 Ζ-ΌΚΙ279(Pst)/HcIF-2h-AH-8 Z-pET280(Pst)/HcIp-2h-AH-2,β,7 Ζ-ρΚΤ28Ό(Pst)/HcIF-2h-AH-1,3,4,5 Z-pKT287(Pst)/HcIF-2h-AH-1,2,3,4,

5,8

Ζ-ΌΚΤ287(Pst)/HcIF-2h-AH-6,7

IFlT- C*/-Aktivi-

Präparat	tat (lU/ml)
S30	?
S30	9
330	9
S30	positiv
330	9
330	positiv
330	9
330	oositiv

243403 4 -

O ei ο	0v-Aktivi- (IU/ml)
	300 300 300
neg..	.( < 10)
neg.	(Oo)

Herkunft des Extraktes:

Ξ« coli HB 101, transformiert durch:

Bsp.2 "*" - Präparat

Z-pKT279/HcIP-2h-ÄH-8 S30 und S100 Z-pKT28O/HcIP-2h-ÄH-1,3,4,5 S30 und S100 Z-pKT237/HcIP-2h-AH-6 u, 7 S30 und S100 Z-PBR322 (Pst) /Hc IZ-SlT-4, 5,

7,9,10,11,13,

Z-pBR322(Pst)5^>i§lä^t-S]ir-18 bis 22, 24,25,27 30 bis 34

Z-PBE322 (Pst) /Hc IP-SlT-38 bis 41, 43 bis 48 S30 neg. ( < 10)

Z-p3E322 (Pst)/HcIP-SlT-

1 bis 3,6,3,

12,17,23,26 S30

Z-pBR322(Pst)/HcIP-28,29,

36,37,49 S30

Z-pBH322 (Ps t) /Hc IP-SlT-

35,42 S30

⁺Bsp· 1: 3ei 1:150 endgültiger "Verdünnung analysierte E; trakte.

^⁺BSp. 2: Bei 1:6 endgültiger Verdünnung analysierte Extrakte ..

Einige der aktiveren Erzeuger von oben wurden ausführlicher untersucht* Es wurden Kulturen bis zur späten Lophase (scheinbare ODg₁-Q etvja 0,9)⁺ gezüchtet und die Zellen wie oben in 1/50 des Kulturvolumens lysiert« Es wurden die folgenden Aktivitäten ermittelt, wobei Ζ-ρΒΗ322(Pst)/HcIP-SlT32 als negative Kontrolle verwendet wurde:.

24 3 40 3 4 -

Herkunft des Extrakte;

ΙΡϊΤ-<*. Aktivität⁴^ E> coli EB 101, transformiert durch: (Iü/ml)

. . (Dupl.-Ana-Pr äp ar at l:/se)

Z~pKT279(Pst)/HcIP-2h-AH8 S30, S100 . 100; 300

Z-pET280(Pst/HcI5^l-2h-AH3 S30, S100 1000; 1000 '

Z-pKT287(Pst)/HcIP-2b-AH6 S30, S100 200; 200

Z-pBR322(Pst)/HcIP-SlT35 S30, S100 1000; 1000

Z-pBH322(Pat)/HcIP-SSr42 S30, S100 300; 100

Z-pBR322(Pst)/HcI5¹-S¥32 S30, S100 0; 0

⁺ Dreitausend Liter oder größere Kulturen von ΣΕΈ-cL können ohne Verlust von IPIT-Aktivität gezüchtet werden.

⁺⁺ Es ist zu beachten, daß die oben genannte'Expression die Interfero-n-Erzeugung durch Gene unter Steuerung der Penicillinase-Espressions-Kontroll-Sequenz widerspiegeln kanr

Es sei vermerkt, daß das tatsächlich durch diese Stämme erzeugte Protein strukturell nicht analysiert worden ist, um zu bestimmen, ob es mit Aminosäuren, die mit IPiT nicht verwandt sind, verschmolzen oder mit der gesamten oder einem Teil der. Signalsequenz von IPIT erzeugt worden ist. Jedoch welches Protein auch erzeugt wurde, es zeigt eine immunologische oder biologische Aktivität von IPIT. Daher wird das Protein als nützlich bezeichnet. Besonders wichtig ist es, daß die Aktivität des Proteins zeigt, daß es sich, bei der dafür kodierenden DITA-Sequenz um eine mit HuIPlT-oL verwandte DrTA-Sequenz handelt. Bs liegt daher im Bereich des Fachgebietes, dis DNA-Sequenz nach der Liier erfolgten Demonstration zur Wahl anderer, gleicher HuIPIT-06 verwandter DiTA-Sequenzen zu verwenden und die Grundlage für andere Konstruktionen zu schaffen, die reifes Interferon oder andere Varianten davon verwirklichen oder die Ausbeute an den betreffenden verwirklichten Protein verbessern.

243403 4 -

⁷I -

Die Erzeugungsmenge eines Proteins wird durch zwei Hauptfaktoren bestimmt:. Die Anzahl von Kopien seines Gens innerhalb der Zelle und den Wirkungsgrad, mit dem die Transcription und- Translation dieser Genkopien erfolgt. Der Wirkungsgrad der Transcription und der Translation (die zusammen die Expression darstellen) ist seinerseits von Hucleotid sequenzen abhängig, die normalerweise vor der verlangten Kodierungssequenz sitzen. Diese Uucleotidsequenzen oder Sxpressionskontrollsequenzen definieren unter anderem die Stel le, an der RlTA-Po Ivmer as e zur Initiierung der Transcription wirksam ist (die Promotorsequenz) und an der sich Ribοsomea zur Initiierung der Translation binden und mit der mSHA (dem Transcriptionsprodukt) in Wechselwirkung treten. Ficht alle derartigen Expressionskontrollsequenzen funktionieren mit dem gleichen Wirkungsgrad. Es empfiehlt sich daher, die spezifischen Kodierungssequenzen für das verlangte Protein von ihren benachbarten Sucleotidsequenzen zu trennen und sie stattdessen mit anderen bekannten Expressionskontrollsequenzen zu verschmelzen,, so daß höhere Expressionsgrade möglich sind,- Wenn das erfolgt ist, kann das neu gebildete DITA-Pragment in ein Multikopie—Plasmid oder ein Bakteriophagenderiva eingefügt werden, um die Anzahl von Genkopien innerhalb der Zelle zu erhöhen und dadurch die Ausbeute an ausgeprägtem Protein weiter zu verbessern*

Es können verschiedene Expressionskontrollsequenzen wie oben beschrieben verwendet werden.Diese umfassen die Operator-, Promotor- und Ribosombinde- und Wechselwirkungssequenzen (einschließlich von Sequenzen wie die Shine-Dalgarno-3equenzen) des'Lactose-Operon von E. coli ("das Iac System"), die entsprechenden Sequenzen'des Tryptophan-Svnthetase-S:/-stems von S. coli ("das trp System"), die Hauptoperator—

-r und 0^P₁-,

Jj ϊί il

und -promotorregionen von Phage X^ (0-P-r und 0^P₁-, ), die

Kontrollregion des Phagen fd Coat-Proteins oder andere Sequenzen, die-die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und deren Viren steuern. Zur 7er-

40 3 .4-

Besserung der. Erzeugung eines bestimmten Polypeptids in einem angemessenen Wirt, kann das für jenes Polypeptid .kodierende Gen dah.er "/ie vorher erzeugt werden und von einem dieses enthaltenden Rekombinant-DFA-Molekül entfernt werden und wieder in ein Rekombinant-DIA Molekül dichter an seine frühere Expressionskontrollsequenz eingesetzt oder un ter die Kontrolle einer der obigen Expressionskontrollsequenzen gestellt werden. Derartige Methoden sind im Fachgebiet bekannt.

Weitere Erhöhungen der Zellausbeute der verlangten Produkte hängen von einer Erhöhung der Anzahl von Genen ab, die in der Zelle verwendet werden können« Für die Erläuterungszwecke wird das dadurch erreicht, daß in der eben beschriebenen Weise erzeugte Rekombinant-DSA-Molekül in die gemäßigte Bacteriophage ^ (SM989) eingesetzt werden, airreinfachsten durch Digerieren des Plasmids mit einem Restrik— tionsenzym, um ein lineares Molekül zu erhalten, das dann mit einem eingeschränkten Phagen ^-Cloningvehikel (s«.B· des Typs, der von JLE. Murray, u»a· beschrieben wurde "Lamfedoid Phage That Simplify The Recovery Of in Vitro Recombinsnts" (Lambdaartige Phaben, die die Gewinnung von in vitro Rekombinanten erleichtern), Molec, g;en. Genet», 150, S. 53 5-1 (1977) und ϊΤ»Ε· Murray, u.a», "Molecular Cloning Of The DNA Ligase Gene Prom Bacteriophage T4^!} (Molekülcloning dea DiJA-Ligase-Gens von Bakteriophage T4), J, Mol. Biol. 132, S. 493 - 505 (1979) und dem durch Inkubation mit DITA-Ligase erzeugten Rekombinant-DITA-Molekül vermischt wird« Die verlangte Rekombinant-Phage wird dann wie vorher selektiert und zur Iysogenisierung eines Wirtsstammes von Ξ« coli verwendet.

Besonders nützliche y^-Gloningvehikel enthalten sine temperaturempfindlich^ Mutation in dem Repressionsgen C₁I und suppressible Mutationen in Gen £>, deren Produkt für die Lysis der Wirtszelle wichtig ist, und Gen E, dessen Produkt

243 40 3 -4*-

das Haaptcapsidprotein des Virus ist. Mit diesem S:/stem werden die Lysogenen Zellen bei 32 ⁰C gezüchtet und dann auf 45 ⁰C erhitzt, um die Sxcission der Prophage zu induzieren. Längeres Züchten bei 37 G führt zu hohen Erzeugungsinengen des Proteins, das innerhalb der Zellen zurückgehalten wird, da diese nicht in der normalen Weise durch Phagengenprodukte lysiert werden, und da der Phagengeninsert nicht eingekapselt ist, bleibt er für weitere Transcriptionen verfügbar. Durch künstliche Lysis' der Zellen wird dann das erwünschte Produkt in hoher Ausbeute freigesetzt.

Bei einem früheren Bemühen, die Ausbeute an Polypeptid, das eine biologische oder immunologische Aktivität von Humanleukozyten- Interferon aufweist und von Wirten erzeugt wurde, die mit Z-pBR322(Pst)/HcIP-S135 nach den oben beschriebenen Verfahren transformiert wurden, wurde eine Restriktionskarte des DUA-Inserts in dem Hybrid bestimmt. Diese Kartierung ergab, daß Hif-SiT35 im Vergleich zu Hif-2h eine Pstl-Stelle, die das 3'-Ende der Sequenz flankiert, fehlte, daß ein Teil der Signals equenz. fehlte (bis zu und einschließlich Codon 7), und die AvaII-Steile in der Signalsequenz durch eine BspI-Stelle ersetzt .worden war. Daher ist Hif-S!T35 vermutlich eine polymorphe oder allelische Variante von Hif-2ku

Das Plasmid Hif-SH35 wurde mit Pstl geöffnet, und der resultierende DSEA-Strang wurde an beiden Enden unter Anwendung · von Standardverfahren zurückgezogen und das MC-Alu-Fragment (infra) darin eingefügt und das Plasmid wieder geschlossen. Es wurde.die tatsächliche Struktur des als Z-pBR322-(Pst)/HcLP-51135-AHL6 identifizierten modifizierten Plasmids und die Aminosäuresequenz am Aminoterminalende des in Ξ.. coli erzeugten Proteins bestimmt. Die ilucleotidsequenz dieser Konstruktion ergibt, daß das LAG-Alu-Fragment eine Aminosäure von der ersten Aminosäure von LFlI-oi.1(SH35) entfernt angefügt worden war.- Die Aminosäuresequenz des Aminoterminalabschnittes des in E. coli ausgeprägten Proteins erbrachte,

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daß ein verschmolzenes Protein mit sechs zur IPJT- oC 1 (S1T35)-Sequenz verschmolzenen Aminosäuren erzeugt, worden, war. Jedoch erzeugen-mit dem modifizierten Plasmid transformierte Wirte etwa lOOmal mehr PoLypeptid, das eine biologische oder immunologische Aktivität von Humanleukosyten-Interferon aufweist, im "vergleich zu mit unmodifiziertem Z-p3E322(Pst)/ HcIP-SlI35 transformierten Wirten.

In Pig. 25 wird ein anderer Versuch zur Verbesserung der Ausbeute von PoLypeptid, das eine immunologische oder biologische Aktivität von Humanleukoz^ten-Interferon z.eigt und durch mit Z-pBH322(Pst)/HcIP-SIT35 (S1T35 in Pig· 25) transformierte Wirte erzeugt wurde, dargestellt,. Das Hybridplasmid wurde unter Anwendung von Standardverfahren mit Bsp! (einem Geschenk von Dr* Kiss) gespalten. !lach Wärmeemtaktivierung (65 G, 30 min) des Restriktionsenzvms wurde das Gemisch auf 50 mM Tr i-HCl (pH-Wert 8) eingestellt und erhitzt (37 ⁰C, 30 min)

Nach der Extraktion mit Phenol und iither wurde das größte, icDITA-Pragment auf Tiefteinperatur-Gelierungs-Agarose (0,8 %) isoliert, und Hindlll-Linker wurden angefügt. Das modifizierte Pragment wurde dann mit HindIII-gespaltenem Plasmid HS-p3R322 (Eco)/lacüV5-150 (^IJIAG-150ⁿ)⁺ (einem'Geschenk von W

Schaller) durch Verschmelzen der fragmenthältigen Gelstücke (etwa 20 /Ul jeweils) bei 65 ⁰C, Kühlen auf 37 ⁰C und Zugabe von 20 U T4 DitA-Ligase je /Ul vereinigt. Nach ΐβ h bei 15 ⁰G erfolgte die Ligation in dem erstarrten Gel (H* Lehrach, persönliche Mitteilung 1,980). Ein Zehntel Volumen 100 mit Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM CaCl₂, 100 mil IiIgCl₉ wurden zu der Probe gegeben, und diese wurde 5 min lang auf 65 C gehalten und auf 37 C abgekühlt. Die Proben wurden anschließend zum Transformieren von mit Ca' behandelten E, coIi HB101 ver-

Dieses Plasmid enthält das lac-Promotor HaeIII-202 bp-Pragment (W.Gilbert, u„a«, "Lactose Operator Sequences And The Action Of Lac Repressor" (Laktose-Operatorsequenzen und die Wirkung von Lac-Repressor) in Protein Li^and Interactions, H., Sund und G. Blauer, Eerausg" (Berlin, 77alter de Griuyter^ S. 193 - 202 und K* Backinan, u.a., ^:'Hacimizing Gene Eirpression On A Plasmid Using Recombination In Vitro (Maximierun^ der GenesTDression an einem Plasmid unter Anwendung von Rekombination in vitro)_,_Cell, 13, S. 65 - 71 (1978), flankiert von einem ^coxLL-idnker an seinem 3'-Ende.

24 3 40 3 4

wendet, "bei O ⁰C 20 min lang inkubiert, 1 min lang auf 42 ⁰G erhitzt und 10 min lang auf 20 ⁰C gehalten. Nach der Zugabe von 1 Mol Tryptonmedium wurden die Proben oO min lang bei 37 G inkubiert und auf Ampicillin enthaltenden Agarplatten ausgebreitet» Plasmid-DHA wurde v?ie vorher von diesen Kulturen abgetrennt, und das Hybridplasmid, das den IFIT-cL 1-Insert mit seinem das IAC-Fragment berührenden 5^f-Snde enthält, durch Restriktionsanalyse identifiziert. Das Plasmid wurde anschließend mit EcoRI unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gespalten und mit Ssonuclease BAL-31 (Ο,Οβ ü/ml, 2 bis 4 min bei 30 ⁰C) digeriert, um den überhängenden EcοRI-Sehtfeif des IAC-Fragmentes zu entfernen und das $ -Galactosidase-Kodierungssegment zu verkürzen»

Um zugewährleisten, daß das behandelte Plasmid die vollständige IFlT-ö6"1-Kodierungssequenz enthielt, v7urde das Plasmid dann mit BgIII"unter Anwendung herkömmlicher "/erfahren gespalten, wie vorher behandelt, und das größte Fragment vmrde auf Agarosegel (0,3 %) abgetrennt. Dieses Fragment V7urde dann mit einem BspI-Bjg;_lII-Fragment von Z-p3R322(Pst)/HclF-81Ϊ35'kombiniert und das resultierende Hybridplasmid zum 'Iransformieren von Ξ. coli HB101 wie vorher verwendet. Die transformierten Kolonien wurden einem Screeningprozeß in bezug auf LFIT-Aktivität unterzogen, und ein Clon mit einem hohen Grad an IFI-Aktivität wurde ausgewählt. Dieser Clon wurde als Ξ. coli ΞΒ101 (CB-IPIm-(λ 1) bezeichnet und sein Hybridplasmid als 08-im-oL 1.

Die DSA-Sequenz-Analyse von C8-IFl;T-o61 ergab, daß die dem Initiator-Triplett folgende Kodierungssequens die ersten sieben Aminosäuren von ß> -rGalactosidase, einen durch Fusion erzeugten Pro-Residue, Aminosäuren 16 bis 23 der ΙΡϊΤ-cC1--Signalsequenz und die IFlT-C^I (31735)-Sequenz bestimmte. Ξ. coli Hinizellenatämme (D3410), die mit Hybridplasmid C8-IFü-c6i transformiert wurden, erzeugen etv;a 50 Millionen Einheiten IFIT je Liter oder etwa 25OOmal mehr Polypeptid,

243 40 3 4-

das eine immunologische oder biologische Aktivität von HuIPlT aufweist, im Vergleich zu mit unmodifiziertem Z-pBR322(Pst)/Hif-SET35 transfonnierten Minizellen« Aminosäuresequenzierung des durch Plasmid CS-IPlT-C^ 1 erzeugten PoIypep.tids bestätigt, daß es sich bei dein Produkt um ein verschmolzenes Protein mit sieben Aminosäuren von iS -Galactosid· ase, einer durch die Fusion erzeugten Aminosäure und den Aminosäuren 16 bis 23 der mit IPiT- cdi verschmolzenen IPlT-co Signalsequenz handelt.

Weitere Beispiele verschiedener Konstruktionen zur Terbesserung der Proteinausbeuten gemäß der Erfindung werden in Verbindung mit anderen Formen von IFiT-O¹C diskutiert (infra). Eigenschaften von Interferon-Aktivität, erzeugt durch mit Hybridülasiniden transformierten g. coli

1. Sensibilität von TFH-<& -Aktivität gegenüber Trypsin

50- /Ul-Proben von authentischem Hu IFIT-<# (spezifische Aktivität 1,2 χ 10° U/mg; 50 U) und die oben beschriebenen SIOO-Extrakte. von E, coli ΞΒ1Ο1 (Z-pK2287(?st)/HcIF-2h-ΑΗβ) (ⁿHif-287-6-Extrakteⁿ) (200 U/ml, 10 U) und 5. coli HB101 (Z-p3H322(Pst)/HcIP-SlT35) (^IiHif-35-3:ctrakte^TI). (1000 U/min;. 50 U) wurden mit verschiedenen Trypsin-LIengen 30 min lang bei 37 ⁰C, ?;ie unten angegeben, inkubiert. Da die S100-E:ctrakte einen hohen Proteingehalt haben, nährend es bei dem HuIFH-<?C nicht der Pail ist, wurde ein Gemisch von HuIFIT-O^ und dem Sontrcll-S100-S:ctrakt Hif-32 parallel getestet:

243403 4

lT-öt Aktiv i-

& Präparat Trypsin ( /μμ) tat (Einheiten)

ΊΤ-oC(5OEinheitenin 50 /Ul Hii-32 S1OO-Extrakt) ⁷O 50

0,1 ' 50

1 ' 50

10 5

50 - 0

Hif-287-β S-lOO-Estrakt O 15

(10 Einheiten) 0,1 15

' 1 5

10 1

"50 O

Daher ist das IPSi-oCder Extrakte gegenüber Trypsin empfindlich und somit ein Protein.

Hif-35 3100-Eztrakt (50 Einheiten) 0 30

0,1 20

1 . 20

10 2

50 0

2* Verhalten bei der Chromatographie auf Serenades: G-IQQ

Der Extrakt Hif-35 (1 ml) und der 3100-Extrakt von E. coIi HB101 (Z-p3S322(Pst)/HcIF-Slö2) (^rHif-32-E:rtrakte^il) wurden auf einer 32-ml-Säule von Sephades G-TOO bei 4 ⁰C in einem 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,4) chromatographiert. Cytochrom c (0,2 mg) wurde als interner Markierer zugegeben* Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 2 ml/h, und es wurden 1,O-ral-Fraktionen gesammelt« Es wurden das Adsorptionsvermögen bei 230 nm und 405 nm (Cytochrom c) und die IPIT-06-Aktivität bestimmt. Wie aus Fig. 7 hervorgeht, wurde die IFiT-cC-Aktivität von Hif-35-Extrakten vor Cytochrom c mit einem k^-Wert von etwa 0,45 eluiert. Daher lag die scheinbare relative Molekülmasse der Substanz zwischen .etwa 20 000 und 30 00O⁺, in den Fraktionen von Kontrolleztrakt Hif-32 wurde keine Aktivität nachgewiesen.

^T Die durch rlucleotid—Sequenzierung und unter der Annahme, daß keine Carboxyterminalumsetzung erfolgt, ermittelte relative Molekülmasse beträgt 19 3S3.

243403 4 -

H-

3. Inhibition der Inte rf eron-Aktivität von Hif-35 und Hif-28,7-Q durch Antikörper gegen Humanleukozyten-Interferon

HuIPlT-<*/(spezifische Aktivität, 1,2 s 10° IU/mg) und die Hif-35/Hif-287-6-3xtrakte wurden mit verschiedenen Verdünnungen von Schaf-Antiserum gegen HuIPET-^(Herst.·K. Ganteil, 24. Februar 1976, spezifische Aktivität 450 000 Sinne iten/ral) in 100 /Ul Modifiziertem Eagles Medium (MEM) mit 10 % Kalbsserum 30 min lang bei 37 ⁰C inkubiert, und 45 /Ul wurden auf IPIT-CC -Aktivität hin mit PIiIf e der Analyse der Reduktion des c?/topathischen Effektes untersucht.. (Der Antikörper selbst verursachte keinen cr/topathischen Effekt):

IPlT- Präparat Anti-iieukozr/ten- Rest (Einheiten) Interferon-Antikör- IPIT-<^Aktivi-

per (Einheiten) tat (IU).

TFE-cb 4 η \ O 5 .

0,18 0,5

9 0,1

0,1

Hif-35-Extrakt 0 15

0,18 15 9 0,1

450 0,1

Hif-287-6-Eztrakte 0,13 15

9 0,1

450 0,1

kein 0 ' 0,1

450 0,1

um zu zeigen, daß die Wirkung des Antikörpers nicht auf

einen unspezifischen Effekt zurückzuführen V7ar, nie pro-

teolytischen Abbau, wurde ein ähnlicher Versuch mit dem Mäuse-Interferon-Svsten durchgeführt:

24 3 40 3 4

4500	100
90	100
18	100

iFIT-Präparat Anti-Leukozyten iFIT-Aktivität

(Einheiten) Interferon-Anti- (Einheiten/ml)

körner (Einhei- Mäuse-System

ten"/ml)

Mäuse-Präparat (100 Einheiten)

Somit inhibieren gegen HuJ-FIT- CC gerichtete Antikörper speziell die IFIT-c</-Aktivität von Polypeptiden, die in mit verschiedenen Rekombinant-DITA-Molekülen transformierten E. coli erzeugt wurden, die die HcIP-2h-DSA-Sequenz enthalten. Die scheinbar geringere Affinität des Antikörpers gegenüber dem in Ξ» coIi erzeugten IFE-oL kann strukturelle Unterschiede zwischen dem letzteren und dem natürlichen HuZE¹ST-C^ widerspiegeln, z.B. das Fehlen der Garbohydrat-Komponente, Vorhandensein .von Signalsequenz oder Fusion mit einem Teil, der $ -Lactamase-Sequenz.

4· Verringerte Aktivität von Hif-35 und Hif-287-6-S^trakten bei Mäusezellen

Human-CCL23-Zellen oder Mäuse-L929-Zellen wurden mit E, coIi-Zbrtrakten behandelt, HuIFIT-cc (Herst. Iw Cantell, spezifische Aktivität 1,2 s 10 Einheiten/mg) oder Mäuse-IF (IT.I«H·-Standard) wurde mit Viren zusammengebracht (Mengo-Viren bei Humanzellen und VSV im Falle von Mäusezellen), und die IFlT-^ - Aktivität wurde durch die Analyse der Reduktion des cr/topathischen Effektes bestimmt:

'Zugabe. IFU-Aktivität (Einheiten/ml

Mäuse-Interferon (120 Einheiten/ml) Hif-Extrakte

Hif-287-£-Estrakte

HuIFIT-uC(100 Einheiten/ml) HuIFiT-öC( 1000 Einheiten/ml)

Human -S?/ s t em	Mäuse-System
	120-
100	13
10Qg	120
	/T.
300	40
100	A "T
1000	40

A U 3 A - se -

Diese Ergebnisse zeigen, daß Kif-35- und Hif-2S7-6-Estrakte eine Schutzvjirkung bei Humanzellen ausüben und nur eine geringe Wirkung ('^•10 %) bei Mäusezellen zeigen, wie es typisch für Human.-Interferon ist*

5· -Wirkung auf einige Zellfunktioaen

Extrakte von E, coli HB101 (Z-pBR322 (Pst)/Hif-S!T35-AHL6) 7/urden mit'authentischen IPIf hinsichtlich ihrer Wirkung · auf einige Zellfunktionen verglichen. Das von E. coli ge- ' wonnene IPlT-ot zeigte die folgenden Eigenschaften von natürlichem IS¹E-OU: (1) es verstärkt die natürliche Abtötungsaktivität von Humanlymphozyten; (2) es verstärkt antikörperabhängige zell-mittelbare Cytotoxizität; (3) es unterdrückt antigen- und mitogeninduzierte Leukozytenmigrationsinhibition; und (4) es inhibiert die Vermehrung von IPiT-sensitiven Burkitt-Lymphoma-Zellen. Diese Eigenschaften sind Anzeichen für Aktivität des von E. coli synthetisiertem IPS'-öd gegenüber Humantumoren und Humankrebs.

6. Aktivität von.IPIT-oC ohne Aminoterminalsequenzen

ΣΞΊΊ-cL ohne Aminoterminalsequenzen vvurde gleichfalls in E. coli erzeugt, und von ihm -;urde nachgewiesen, da3 es mit IPIT-Aktivität übereinstimmende Aktivität zeigt.

-o

Zur Konstruktion des entsprechenden Rekombinant-DITA-Moleküls ?;urde Plasmid HIf-2h (supra) teilweise mit EcoRI und BamHI digeriert, und das die IPIT- cL I-Kodierungsseqüens enthaltende Fragment wurde auf Agarosegel abgetrennt und mit der Hicht-IPIT-cL 1-Iiodierungssequenz kombiniert, die von einer EcoRI/BamHI-Restriktion von Plasmid Hif-S2T35 gewonnen ^T5urde,. aas keine Pstl-Stelle neben dem 3'-Ende des Hybridinserts enthält, v;ie es bei Hif-2h der Pail ist (suura). Das resultierende Plasmid -"jurde der Restriktion mit Pstl/3gll zur Entfernung eines Abschnittes des Amino terminalteiles der IPIT- oL 1-Kodierungsseauenz unterzogen.

243 40 3

Eingesetat an seine- Stelle wurde eine Reihe von IPIT- φ 1-Praginenten,. die durch Digerieren von Plasmid Hif-2h mit PyüII, Behandlung mit Be-l-Exonuclease, Anfügen von Pstl-Linkern und Restriktion mit BgIII hergestellt worden waren. Die resultierenden Plasmide enthielten somit eine Reihe von IFH-ot IKodierungssequenzen, denen verschiedene Abschnitte ihrer Aminoterminalsequenzen- fehlten. Eines davon (Plasmid 2H-M8) wurde mit PstI digeriert und seine "ITucleetidsequenz bestimmt.' Die Sequenzierung ergab, daß das Plasmid 2H-M8 verschiedene nucleotide zwischen der Pat-Stel-Ie und dem ersten Codon (GYS) von IS¹IT- 1 enthielt. Daher wurde das Ps_tl-digerierte Plasmid 2H-M8 mit T4-Pol:/nuclease/ dATP, 31 Exonuclease behandelt und mit Sail digeriert. Durch diese Verfahrensweise entstand eine Reihe von Fragmenten, deren IFIT»cC 1-Kodierungssequenzen Abschnitte ihres Aminote rminalendes fehlten» Diese Fragmente wurden, danach LAC-Kontrolle unterstellt, indem sie operativ mit einem GUA-LAC-Fragment verknüpft wurden, das von Plasmid Lac3V8 durch Digerierung mit EcoRI,. Behandlung mit E:ronuc lease S1 und Digerieren mit Sail gewonnen worden war. Die resultierende Reihe von Plasmiden hatte daher IPlT-cC 1-Kodierungssequenzen, denen verschiedene Abschnitte ihrer Aminoterminalende η fehlten, die in Gegenzeigerrichtung über ein AUG an einem den IAC-Promotor enthaltenden Fragment angefügt waren.

Einige dieser Plasmide wurden sequenziert. Eines begann an der fünften Aminosäure von IFlT- c&> 1 und eines an der zehnten Aminosäure von IFU-pC 1.In E. coli Minizellen (DS41O) erzeugten diese beiden Plasmide Polypeptide, die IPIT-Aktivität aufwiesen. Daher ist nicht das gesamte IPlT-1-Protein für IFU-Aktivitst erforderlich.

lerne tifiKiatio	η von Cloneη	ν ο η	E.	coli,	Q2.e	rieh ο	mbi	nan	Insert
Llolsküle enth	alten, deren	DlTA	—Ins	e j2 j s	SCh?/	ach ζ	u d	em	j_ g η 5 —
in Hif—4c kre	uzh:ybridisieren	und	sine	ande	re Re	.—1 -j- —.1 O j ,

haben als das Hii-^h-Fra"nen'

243403 4

Der Vergleich der ersten 35 Aminosäuren von authentischem Lymphoblastoid-Interferon (Zoon, u.a., suiora, und M.. Hunka-. piller und L. Hoo.d, supra) mit der von Hif-2h-S¹ragment abgeleiteten Sequenz ergibt 9 Unterschiede. In allen Pällen konnten die Godons für die unterschiedlichen Aminosäuren durch Ξίη-Basen-Veränderungen in Besiehung gebracht werden. Die Aminosäurezusammensetzungen, die direkt für authentisches Lymphoblastoid-Interferon einerseits bestimmt und andererseits von der Sequenz des Hif-2h-Pragments abgeleitet wurden, zeigen auch hinsichtlich ihres Gehaltes an Gl;/, Pro, Cys und Met ganz erhebliche Unterschiede. Diese Unterschiede sind viel zu groß, als daß sie einfach durch PoIymorphismus erklärt werden könnten. Sie reflektieren stattdessen höchstwahrscheinlich das Vorhandensein von mindestens zwei nicht-allelischen Genen, da der Grad der Divergenz der beiden Proteine (26 % ]?ehlanpassung) ähnlich dem ist zwischen beispielsweise Hunah- und Schaf-B-Globin (23. % Sehlanpassung).-Daher wurden die Glone, die schwache Hybridisier ung zu Fragment Hif-4c zeigten und früher identifiziert worden waren (sunra), untersucht, und es wurde ein Clon Ξ. coIi ΞΒ1Ο1 (Z-p3R322(Pst)/ΗοΙ3·-ΙΙ-2Ο6) identifiziert.

. Das Hybridplasmid 2-pBR322 (Pat)/HcU-II-206 (¹¹Hc 12-11-2Oc'¹) dieses Glons und sein DFA-Insert ⁿEif-II-2O6-Fragment" hybridisieren schwach zu Hif-4c- und Hif-2h-Fragment, Mit Plasmid Hif-II-206 transformierte Ξ. coli erzeugen Polypeptide, die eine biologische oder immunologische Aktivität von HuIS¹IT-oC aufweisen. Das Hif-II-20c-?ragment hat eine Restriktionskarte, die sich von der für das Hif-2h-Pragment bestimmten unterscheidet. Ein Vergleich der beiden Restriktionskarten ist in Eig, 11 enthalten. Auch hier konnte die absolute Lage der Restriktionsstellen in dem Hif-II-2O6-i?ragment nicht durch Restriktionskartierung 'alleine bestimmt werden. Die Sequenzierung der ITucleotidse-· quenz dieses Inserts erlaubt jedoch unter Anwendung der oben "beschriebenen- Standardverfahren eine absolutere Be-

Ü43.403 A. ._β9.

Stimmung dieser Stellen, infolge der Unterschiede in der Restriktionskarte des Hif-II-2O6-Fragmentes im Vergleich zu dem Hif-2h-Fragment wird dagegen klar, daß die Interferongene der beiden Inserts unterschiedliche ITucleotidsequenzen haben.

In den Fig. 12 bis To werden die ITucleotidsequenzen der eingefügten DHA-Sequenz¹ — Eif-lI-2O6-Fragment — von KuI-tur-HcIF-G und die eingefügte DlFA-Se quenz — Hif-2h-Fragment — von KuItur-HcIP-S (infra), die kürzlich bestimmt wurden, und die entsprechenden Aminosäure Sequenzen von durch diese Hucleotidsequenzen dafür kodierten Proteinen gezeigt. Die Uucleotid-Sequenz des Hif-II-2O6-Pragmentes — das Psti-Fragment (790 bp) der Plasmid-DEA, daa unter iinwen&ung der Verfahrensweise von Methode B nach der Beschreibung von II.M. Wilkie,. u.a. Hucl. Acids Res., 7,

5. 859 - 877 (1979) von Kultur HcIF-G isoliert worden war — wurde unter Anwendung des Standardverfahrens von A„Μ* Ma:;ain und W. Gilbert, supra, bestimmt· Die angewandte Sequenzierungsstrategie ist in Fig.. 17 gezeigt«.

Eingeschnürte DlTA (gewöhnlich etwa 10 /ag) wurde 5'-terminal wie von IT. Mantel u.a.., Gene, 10. 3. 1 - 10 (1980) beschrieben, markiert. Markierte Fragmente wurden mit einem zweiten Restriktionsenziym gespalten, die Produkte wurden durch Elektrophorese durch ein 5 i&ige.s Pol^acr^lamidgel in Tribcrat-EDTA-Puffer (A.C. Peacock und C.T/.Dingman, Bioch.,

6, 3.. 1318'- 1827 (1967))' getrennt, aus dem Gel extrahiert und nach der Beschreibung von wV Muller, u.a., J. Liol. Bio!., 124, S. 343 - 358 (1978) gereinigt.

Für Fig. 17 wurden die verschiedenen Fragmente für die Sequenzierung wie folgt vorbereitet:

25 und 2c — Spaltung von Hif-II-20c mit Pstl, LIar 1:1 erung, Spaltung mit BgIII, Isolierung eines Pstl^-Bglll-Fragnentas (257 bp) (^!125ⁿ) und eines Pstl^-Bs-llI-Frag-mentes (279 bp) («26»);

243403 4

21, 22 und 23 — Spaltung von Hif-II-206 mit PvuII, Mar kierung, Spaltung mit BgIII, Isolierung eines PvUlI⁺ -Bg Fragmentes (88 bp) ("21"), eines PvuII⁺ -BglII-Fragme ηte a (176 bp) ("22") und eines PvuI⁺-BgJ.II-Fragmentes (214 bp) ("23");

11, 12, 13 und 14 — Spaltung von Hif-II-206 mit BgIII, Markierung, Spaltung mit Pstl, Isolierung eines BgIII -PstI-Fragmentes (279 bp) ("14"), und eines komigrigierenden Gemischs eines BgIII⁺ -Pstl-Fragmentes und eines BgIII⁺ -BgIlI⁺- Fragmentes» Spaltung des Gemischs mit PvuII und Isolierung eines BgIII⁺ -Pstl-Fragmentes (275 bp) ("13"), eines BgIII⁺ PvuII-Fragmentes (17c bp) ("12") und eines BgIlI'-PvuII-Fragmentes (88 bp) ("11")..

27L, 27U, 41, 43,- 44 und 45 - Spaltung von Hif-II-206 mit Hinfl, Markierung, Isolierung von Vorläufer-Fragmenten: Kinfl⁺ -Hinfl⁺ (113 bp) ("27P"), Hinfl⁺ -Hinfl⁺(146 bp) ("=_P"), Hinfl⁺-Hinfl⁺ (159 bp) ("3OP"), Hinfl⁺-HinfI⁺ (397 bp) ("31P") und Hinfl⁺-Hinfl⁺(1522 bp) ("32P"). Spaltung von 28P mit HbοII und Isolierung eines Fragmentes HinfI⁺-MboII (112 bp) (HV¹). Spaltung von 3OP mit Mb ο II und Isolierung eines Fragmentes Hi η Γ' -lab ο II (126 bp) ("43"). Spaltung von. 31P mit Pstl und "Isolierung eines Fragmentes Kinfl⁺-Pstl (151 bp) ("44"). Spaltung von 32P mit Pstl und Isolierung eines Fragmentes HinfI⁺-Psti (139 bp) ("45")· Strangtrennung von 27P zur Gewinnung von .zwei Strängen ("27U" und ^;t27L^fi).

Alle Segmente bis auf 27U und 271 wurden an beiden Strängen und über die Restriktionsstellen, die als Ausgangspunkt für die Sequenzierung dienten, mit Ausnahme der Bglll-Stel-Ie an Position 185, sequenziert»

^:ic; λ "ΐ :-\ £i T"ⁿ TT" ^> "**'"" "ΐ O "^ Γ* Ή ^Λ"ί λ -ι fin -^n-^ r\ *ΐ α % ο ~ί r\ οι ν\ T νη r~! ώ τί -f- C? '"Λ/·"! τ Δτι-ηη

243403 4

für ein interferonartiges Protein kodiert, das eine Aminosäure weniger hat als das Hif-2h-Pragment (Aminosäure 44 (Asp), die in Hif-2h vorhanden ist, fehlt in Hif-lI-2O6). Darüber hinaus sind 10 % der ITucleotid-Positionen und 1? % der abgeleiteten Aminosäureresiduen der beiden !Fragmente unterschiedlich. . .

Wenn man außerdem einen Vergleich mit den 35 für den Aminoterminus von Lymphohlastoid-Interferon.bestimmten Aminosäuren vornimmt (K...C* Zoon, u.a._} Science, 207, S. 527 528 (1980)), so kodiert der Insert Eif-206 für ein Protein, das in 5 Residuen von den von Zoon u.a. supra, bestimmten 35 Aminosäureresiduen abdeicht. Daher muß es mindestens drei verschiedene IPIT-Gene des Leukozyten-Typs Gs£ -ϊ:/ρ) geben — Iiif-2h-Pragnent, -Eif-II-206-Pragment und'.das für Zoons ΙΡΪΓ kodierende Gen.-In Übereinstimmung mit der kürzlich für-Interferon vorgeschlagenen Nomenklatur 7/erden anschließend die durch diese Gene kodierten Proteine ~?ie folgt identifiziert:

IgIT-Gen-Ursprung

Hif-2h

Hif-II-206 .

IPlT von Lymphoblastoidzellen (Zoon, u,a*, sunra)

Die Unterschiede zwischen IPlT- σέ.1 und IPlT-ob2 werden auch durch ihre variierenden Aktivitäten bei Human-GGL23- und Rinderembr.7o-lTieren-(BSxv)-Zellen verdeutlicht:

Extrakt Relative IPIT-Aktivität"

CCI23 3ΕΙΪ Verhältni

Prote	in
IPlT-	λι
IPIT-.	oij 2
IPIT- <	* 3

Hif-II-206 (IPST-ot.2) 1,7 1,0 1,7:1

Hif-S1T35'^H' (IPIT-oCD 0,05 1,0 1:20

24 3 40 3 4

Daher ist die Aktivität von IMT-ού 1 bei Humanzellen etwa 30mal schwächer als die von IZtT-oL2. Doch sind beide etwa gleich aktiv bei Rinderzellen. Daher können IU¹ITe neben ihrer Anwendung als Mittel gegen Viren, Tumors oder Krebs bei Menschen auchgwertvoll für die Behandlung dieser Erkrankungen bei Rindern sein. Beispielsweise könnten Präparate von HuIMT-c£ in einer üblichen "/eise (supra) zur Behandlung von 5¹HDY und anderen allgemein bekannten Virusinfektionen von Rindern verwendet v/erden. Das gilt vor allein für IPlT-oC 1, da seine Aktivität in Rinderzellen etwa I stärker ist als seine Aktivität in Eumanzellen.

Wegen der verbesserten Ausbeute, die bei IMT-cC 1 mit Konstruktions-C8 (supra) erzielt wurde, wurde eine ähnliche Konstruktion für IPIT-<^2 vorgenommen. Z-pBR322(?st)/Iiif-II-2O6 wurde vollständig mit'Bsnl und teilweise mit PvuII (bei P1) .(Pig. 28) gespalten, und das 867bp-Pragme:at wurde aus β %igem PoIyacrylamidge1 isoliert. Dieses Fragment wurde danach mit einem 2590-bp-PvuII-Pragment von CS-IjM- oL 1 vereinigt"¹". Das resultierende Hybridplasmid wurde zum Transformieren von Ξ. coli Ξ3 101 verwendet, und die Clone wurden auf ΙΡϊΤ-Aktivität hin ausgesondert. Ein eine hohe Aktivität

*; «co Ii HB101, die das Hybridplasmid enthielten, wurden in Tryptonmedium unter Schütteln bis zu einer CDr^₀ von etwa 1 bis 2 vermehrt« Die Zellen wurden geerntei? gewogen, erneut in 1/100 oder 1/20 des ursprünglichen Kulturvolumens suspendiert und nach der Lysozym-Gefrier-Tau-Methode lysiert (8. ITagata, u.a, , Ilature, 284, 3. 3-VS - 320 (1980). Die 8-30 Obenstehenden wurden 'durch CPe-Reduktionsanalyse in Hikrotiterplatten getestet, extrakte von Kontrollzellen waren negativ (<1 I.U./ml), Human-CCL23-Zellen und Rinder-Smbryo-lIieren-(BSK)-Zeileη (PLOW) wurden in MEM-10 % Petalkalbsserum gezüchtet. Die Einwirkung der IPH-ha.ltigen Extrakte dauerte 24 n. Die Zellen wurden mit einer entsprechenden Verdünnung von Mengovirus zusammengebracht und 24 h später gefärbt. Werte wurden visuell in bezug auf das teilweise gereinigte Leukozyten-IPIT (Präparat PIP, ein Geschenk von K. Cantell) mit bekanntem Titer geschätzt. Dieses Präparat war etwa £_^ 3nal so aktiv bei Humanzellen im Gegensatz zu Rinderzellen '' Der Vergleich der Restriktionskarten von Hif-3IT35 und Hif-2h könnte ergeben, da3 sie polymcrphe Varianten voneinander sind (supra)«

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aufweisender Glon wurde gewählt und als E. coli HB101 (CS-IPH-oC2) bezeichne

t.

DKA-Sequenzierung von Hybridplasmid GS-IPlT-^2 ergab, daß es wie' C8-IJ¹JT-cL\ eine dem Initiator-Triplett folgende Kodierungssequenz hatte, die die ersten sieben Aminosäuren von |2> -Galactosidase bestimmte, einen Pro-Redidue, der durch die Fusion erzeugt wurde, sowie die Aminosäuren 1o bis 23 der IFlT-oC 2-Signalsequenz. Daher kann möglicherweise wieder ein Ii¹IT-d» 2 enthaltendes verschmolzenes Protein ausgeprägt werden.

Mit diesem Plasmid transformierte Minizellen ergaben 100 bis 200 Millionen Einheiten je 1 IPlT oder 20 000 bis 40 000-fach höhere Ausbeuten von IiW-^.2 als Minizellen, die mit unmodifiziertem Z-pBR322(Pst)/Hif-II-2O6 transformiert wurden·

Sin Vergleich der relativen Ausbeuten an CS-IPIT^ 1 (--^5O χ 10° Einheiten/liter) und C8-IFIm-<* 2 (·—Ί00 bis 200 Millionen Einheiten je Liter) ist zunächst überraschend, da von IPxT-oC2 nachgewiesen wurde, daß es etwa 30mal aktiver als IPIT-cpC 1 bei Humanzellen ist (supra). Eine quantitative Analyse der Menge der beiden Proteine, die durch mit den beiden C8-Plasmiden transformierte Minizellen erzeugt wurden, ergab jedoch, daß in CQ-IFE-ci'\ etwa 5 bis cmal mehr Protein als in G8-IPH-(jc2 erzeugt worden war. Daher waren die auf der Grundlage von IPIT-Aktivität gemessenen Ausbeuten durch die viel größere Menge von im Falle von CS-IFEf-c^ 1 erzeugtem Protein verfälscht.

In Pig· 2β wird eine andere Konstruktion bei einem Versuch, die Ausbeute an IFE-^2 au erhöhen, dargestellt. Zunächst wurde ein Espre.ssionsplasmid, das das LAG Alu-Fragment enthielt, durch Restriktion des bekannten lac-Promotors mit AIuI hergestellt, und das Fragment wie (für einen Terminus)

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in Fig» 27 gezeigt mit acoRI-iiinkern (hergestellt durch gemeinschaftliche Forschung) verlängert. Das verlängerte · Fragment wurde anschließend in pBR322 an der 3coRI-Stelle eingefügt, und ein kleines EcoRI-ScoRI-Fragmen t aus der Konstruktion ausgeschlossen· Das resultierende Plasmid, in Fig. 26 mit 404 bezeichnet, wurde mit Hindlll und PvuII für die Insertion des IF2Tt?i2 enthaltenden Fragmentes gespalten. Dieses IFIT- <£ 2-Fragment wurde durch teilweise Sau3A-Restriktion von Z-pBR322)/HcIF-II-206 ("206" in Fig. 26), Ausdehnung des 5au3A-Fragmentes mit Hindlll-Linkern (Fig. 27) und Spaltung mit Bspl hergestellt. ITach der Insertion dieses Fragmentes in das HindII-?vuII-gespaltene Plasmid 404 wurde das resultierende Plasmid der Restriktion mit Hindlll und EcoRi unterzogen, mit S1-Huclease behandelt, um den LAC-Promotor näher an das IFlT-cx^ 2-Gen heranzubringen, und religiert. Bei dieser als Plasmid LAC-AUG(c£ 2) identifizierten Konstruktion steht die IFJT-oC 2-DEA-Sequenz unter der Kontrolle des LAC-Promotors* Außerdem folgt die IFlT-2-Sequenz unmittelbar dem Initiierungs-AUG-Codon dieses Promotors (siehe Fig. 27). Daher wird zumindest ein Teil des durch diese Plasmide erzeugten IFITs reifes IFET sein, z.B. IFlT ohne irgendwelche Aminosäuren von der Signalsequenz. In Minizellen betrug die Ausbeute von mit Plasmid LAC-AUG(c& 2) gewonnenem IFlT-o^ 5 bis 10 Millionen Einheiten je Liter.

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Eine andere, auf ähnlichen Verknüpfungsprinzipien beruhende TFIT-oC 2-Konstruktion wurde ebenfalls hergestellt« Hierbei wurde die Penicillinase-Expressions-Kontrollsequenz von pBR322 über ein AUG-Initiator-Codon mit dem IM- oL 2-Gen von Hif-II-2O6 verbunden·⁴" Dieses Plasmid, das bei der Transformation von Wirtszellen als β -IaC-AUG(^ 2). bezeichnet wurde, ermöglicht die Erzeugung von IPET- C^ 2 ohne Fusion mit anderen Proteinsequenzen· In Minizellen sind Ausbeuten von 50 bis 100 Millionen Einheiten je Liter erreicht worden. Dieses Plasmid ist das zur Verwendung in Übereinstimmung mit der Erfindung am ineisten bevorzugten Plasmid· Es wird auch für die Anwendung mit den anderen hier offenbarten IJ¹IT-(^-Genen bevorzugt. Der erfindungsgemäß bevorzugte Wirt ist E. coil DS410 (ara azide TonA Iac 7 Tss min a min b gal Λ XgI Schritt )· Dieser Stamm wurde zusammen mit einem Beispiel des bevorzugten Plasmids (5 -lac-AUGCcC 2) als HcIF-K hinterlegt«

Andere Konstruktionen unter Verwendung verschiedener Promotorsequenzen, Ribοsombindungssteilen, Shine-Dalgarno-Sequenzen und DIA-Sequenzen zwischen, dem Promotor und dem AUG-Initiator-Codon und unter Verwendung verschiedener hier beschriebener ΙΡΙΓ-06·-Gene können gleichfalls unter Heran-

Diese Konstruktion könnte am wirksamsten durch Partialdigerierung von p3R322 mit IvIbοII, Behandlung mit S1,- Anfügen von EcoRI-Linkern wie zuvor und Wiedereinsetzen des Fragmentes in die EcoRI-Stelle von pBR322 und Ausschließen einer EcoRI-Stelle hergestellt werden. Das resultierende Plasmid (" (J₃ -lac-AUG-Plasmid") könnte dann mit einem S1-behandelten (milden) Hindlll-Linker-Bspl-Pragment von 20β, das oben beschrieben wurde, kombiniert werden· ITach der Spaltung mit EcoRI und Behandlung mit S1 und Phosphatase wird das Expressionsplasmid /S-lac-AUG(cO2) isoliert. Konstruktionen mit anderen Genen könnten in einer ähnlichen Weise vorgenommen ?;erden, indem einfach das konstruierte /3 -lac-AüG-Plasmid für die Insertion anderer Gene oder Konstruktionen verwendet wird, oder noch besser, indem die Sau3A-5telle in Plasmid β -lac-AUGCci 2) selbst herangezogen wird.

243403 k.

Ziehung ähnlicher Methoden und Prinzipien konstruiert werden. Diese Konstruktionen sind natürlich durch die Erfindung mit erfaßt und liegen innerhalb ihres Geltungsbereichs. Hybrid-Moleküle von IM-/gCi und TM-cL 2

Es ist eine Anzahl von Hybridmolekülen von IIW-06I und TFE-0L2 konstruiert worden. Überraschenderweise haben diese Hybridkonstruktionen quantitativ unterschiedliche Eigenschaf ten und Aktivitäten im Vergleich mit ihren Stammformen oder ISTJ-o4 2*

In Pig. 28 wird eine schematische Darstellung der Konstruktion von vier dieser Hybridmoleküle gezeigt. Der Einfachheit halber sind diese Hybridmoleküle als Plasmide I, H, III und 17 bezeichnet. Bei diesen Konstruktionen wurden Digerierungenmit Restriktionsenzymen (von Biolabs bezogen, mit Ausnahme von Bspl, einem Geschenk von Dr. Kiss) im wesentlichen nach den Empfehlungen der Lieferanten durchgeführt. Partial-DUA-Spaltungen wurden mit verringerten Enzym mengen vorgenommen. ITach Wärmeinaktivierung (65 C, 30 min) des Restriktionsenzyms wurden die Proben auf 50 mM Tri-HCl (pH-Wert 8) eingestellt, und wenn erforderlich, wurde alkalische Kalbs-Indestinalphosphatase (Boehringen) (1 VoI je /Ug DSA) zugesetzt. ITach 30 min bei 37 ⁰G wurden die Proben mit Phenol und Äther extrahiert. In den meisten Fällen wurden die DHA-Fragmente auf Tieftemperatur-Gelier-Agarose (0,8 %) abgetrennt. Mir die Ligation wurde das Gelstückchen (etwa 20 /Ul jeweils) enthaltende fragment bei 6'5 ⁰C geschmolzen, auf 37 ⁰C .gekühlt, und es wurden 20 U 14-DITA-Ligase je ,ul zugegeben. Das Gemisch wurde 16 h lang bei 15 ⁰ gehalten, und die Ligation erfolgte in dem verfestigten Gel (H. Lebrach, persönliche Mitteilung, 19SO)..Ein Zehntel Volumen von 100 mM Tri-HCl (pH-Wert 7,5), 100 mM GaCl₀, 100 mM MgCIp wurde zugesetzt, die Probe 5 ΐπίη lang auf 65 ⁰C gehalten und auf 37 ° abgekühlt. Die Proben würden

—2 anschließend zu mit' Ca' -behandelten Minizellsn gegeben,

4 _₉₇_

20 min lang bei 0 ⁰C inkubiert, 1' min lang auf 42 ⁰G und 10 min lang auf 20 ⁰C gehalten, und 1 ml Iryptonmedium wurde zugegeben. Säen einer Inkubationszeit von βθ min bei 37 ⁰C wurden die Kulturen auf die entsprechenden Anti-.biotika enthaltende Agarplatten verteilt. Alle diese Plasmide wurden durch Hucleotid-Sequenzanalyse an der Verbindungsstelle an der Verbindungsstelle in der IFF-Sequenz charakterisiert*.

Hybridmolekül I, ein o6-1(PvuII) <pc -2-Hybrid, wurde durch teilweise Spaltung von C8-IFIF-£01 (supra) (08-oC1 in Pig... 28) mit Pvull konstruiert, depfrosphoryliert, gespalten mit Psti und das Pstl-PuvII(Po)-1346-bp-Fragment wurde isoliert» Dieses Fragment wurde mit einem 2135-bp-Pst(a)-PvuII(Pq)-Fragment vereinigt, das durch vollständige Spal-, tung von C8-IFiT-pl 2 (supra) (C8- 2 in Fig. 28) mit PvuII und teilweise Spaltung mit Pstl hergestellt ?jorden war.

Eybridmolekül, II, ein al -1(BgIII) pL -2-Hybrid, wurde durch Spaltung von Eybridmolekül I mit 3^111 hergestellt« Sfach der Dephosphorylierung wurde das große BgIIT Fragment isoliert und mit dem kleinen BgIlI-Fragment von G8-IF5T- cL 2 vereinigt·· ¥ach. dem Cloning wurde das Hybridplasmid, das das kleine BgIII-Fragment in der richtigen Orientierung aufwies, durch Eestrikti0nsa.nal.7se charakterisiert.

Hybridmolekül III, ein cL -2-(PvuII)ol-i-Hybrid, viurde durch 'teilweise Spaltung von CS-IFlT-o^ 1 mit PvuII , Dephosphorylierung, Spaltung mit Aval und Isolierung der 1o86-bp-PTuII(P₂)-Aval- und 3233-OP-PvUlI(P₁)-Aval-Fragmente konstruiert. Diese Fragmente wurden anschließend mit dam 300-¹Dp-PvUlI(P₁)-PvuII(P₂-Fragment von HcIP-II-206 (_sup_ra) (SIT206 in Fig.. 28) vereinigt, und das das kleine PvuII-Fragment enthaltende Plasmid wurde durch Analysieren von transformierten Ξ. coli Stämmen auf IFlT-φ -Aktivität hin identifiziert.

243403 4

Hybridmolekül xV, elnoC-2(Bp;ll±l) pC -i-Hr/brid, wurde durch Spaltung von C8-IPlT- qL 1 mit B^lII und Aval konstruiert, und das 177S-bp~Fraginent wurde isoliert. Dieses Fragmen wurde anschließend mit dem 3543-bp-BgJ.II-Aval-Fragment von Hybridmolekül III vereinigt.

Die biologischen Aktivitäten der verschiedenen I-nterferonspezies in bezug zueinander wurden gleichfalls bestimmt. Kulturen von mit den verschiedenen Plasmiden transformierten Minizellen (D34-1O) wurden gezüchtet und die Bakterien durch. Zentrifugieren geerntet, mit PBS gewaschen, in PBS suspendiert (etwa 1/20 des Originalvolumens), 60 min lang bei 0 ⁰C mit 1 mg/ml Lysozyin, 10 mM SDTA inkubiert, viermal gefrostet-aufgetaut, durch fünfmaliges Hindurchleiten durcheine Spritze geschert und durch Zentrifugieren gespalten·

Die Aktivitäten bei"Human-, Mäuse-, Meerschweinchen- und Rinderzellen waren wie folgt: ' .

Protein-Quelle Human(PS4)

Relative IFI-Aktivität

	C" c.	1.	Rinder	(BEK)	Mäuse(I)	Meerschwein chen
C8-IF1T-	Cr* 1	0,03	1		0,01.	0,03
08-IS1ET-	I	0,001	1		0,3	0,03
Hybrid	II -	0,001	1	ο,	003-0,008	0,003-0,01
Hybrid	III	1	1		0,001	0,01
Hybrid	17	0,1	1		1	0,3
Hybrid		1		2	0,1 -0,005

Negative Kontrolle —

Überraschenderweise haben alle diese Interferone etwa die gleiche Aktivität bei Rinderzellen, jedoch haben IFlT-c^ 1 und die beiden Hybrid-IFlTe (I und II), die die Aminoterminalkomponente von IFlT-(Xi haben, etwa eine um das 10- bis

- 99

3 4

100Ofache geringere Aktivität bei Humanzellen als und die beiden Hybrid-IFlTe (III. und IY), die die Aininoter minalkomponente von TFE-d2 aufweisen, Ss ist noch auffälliger, daß die beiden Hybrid-IFiTe (I und II) mit dem Aminoterminalteil von IFIT~oCi eine um mehr als das Zehnfache geringere Aktivität bei Humanzellen haben als IFU-<^ selbst.. Jedoch eine der Hybriden (iii) mit"dem Aminoterminalteil von IFlT- cL 2 hat etwa die gleiche Aktivität bei Humanzellen wie IPIT-^ 2» Identifikation von Chromosomgenen in bezug auf

Eine Sammlung von Hybridphagen, die von Fragmenten von Human-Fötus-Chromosomen-DM. stammten, die durch teilweise Spaltung mit Haelll und AIuI erzeugt und mit EcoRI-Linkern zu λ Charon-4A-Armen vereinigt worden waren, wurde von R.M. Lawn,, u.a., Cell, 15, S. 1157 - 1174 (1978) hergestellt. Diese Gen-Bank wurde einem ^fJin situ" Screening-Yerfahren unterzogen (W.D. Benton und H.W. Davis, Science, 196,. S., 180 - 182 (1977); T. Maniatis, u.a., Cell, 15,

S. 687 - 701 (1978).), wobei als Sonde der von pBR322(Pst)/

Hif-2h abgeschnittene P-markierte IPIT- oL icDFA-Insert verwendet wurde. Durch, wiederholte Plaque-Reinigung wurden sechz.ehn positive Hybridisierungs-Phagencione von 240 000 Plaque isoliert (T. Maniatis, u.a., süpra). Zehn der Hybrid-Phagen-DlIA-Präparate wurden· mit Hind.HI, Tasi, Hhal, BamHJ, EcoRI bzw« BgIII gespalten, und die durch Elektrophorese auf einem Agarosegel getrennten Fragmente wurden auf eine Millipore-Membran übertragen (E..M.Southern, J, Mol. Biol., 98,. S. 503 - 517 (1975)) und mit dem ³²P-markierten Hif-2h-cDlTA-Insert hybridisiert. In Fig. 18 sind die Ergebnisse in Form von Partialrestriktionskarten und verschiedenen Tabellen zusammengestellt. Wie dort gezeigt wird, wurden für jedes Hybrid-Phagen-DITA-Präparat mindestens einige charakteristische Restriktionsstellen festgelegt und die Region(en), die zu der IPSf-^1-Gen-Sonde hybridisieren, dargeste.llt (schwarzer Pfeil)"¹".

Die schattierte Fläche bei chr-i6 in Fig. 18 und 24 stellt eine Sequenz dar_? die scr aber kein R-Loopmg zeig-

eine Sequenz dar_? die schwach zu Hif-2h-cDrTA hybridisiert, aber kein R-Loopmg zeigt.

243403 4 -

Aus den Fig. 18 und 24 ist zu entnehmen, daß die Clone ehr-3 und chr-26 DETA-Segmente darstellen können, die über einen großen Teil ihrer Länge überlappen, da sie mehrere BcoRI- und Hind.HI-Fragmente gemeinsam aufweisen. Außerdem können der Hybridisierungsabsehnitt von chr-1 und einer der Hybridisierungsabschnitte von chr-10 die gleichen sein, weil die Hindlll-Hindlll- und EcoRI-EcoRI-Fragmente, die mit der Hif-2H-Sonde hybridisieren, die gleiche Länge haben (3,2 kb bzw» 0,95 kb). Es hat auch den Anschein, als ob der "rechte" Hybridisierungsabschnitt von chr-16 (in ! ig» 18 mit "r" markiert) mit dem Hybridisierungsabschnitt von cbr-35» obwohl er in der anderen Richtung orientiert ist, insofern identisch sein könnte, als jeder der beiden Clone ein 1,4"OBgIII-Bglll-Pragment und ein 2kbEcοRl-Fragment ergibt, die mit der Hif-2h-cDHA-Sonde hybridisieren. Wahrscheinlich überlappen deswegen die chr-16- und chr-35-Inserts,

Man könnte daher annehmen, daß die 13 Hybridisierungsabschnitte der 11 Hybrid-Chromosomen-DlilAn in weniger als 10 verschiedenen Klassen liegen —chr-1, chr-3, chr-12, chr-13, chr-i6 (links, in Pig. 18 als'"1"markiert), chr-26, chr-30, chr-35, ehr-19 und ehr-27.

In Fig. 24 werden die Überlappung von chr-1, chr-3, chr-10 und chr-26 und die von chr-16 und chr-35 gezeigt.

Die obigen Angaben lassen vermuten, daß das Genom eines bestimmten Menschen nicht weniger als 10 verschiedene DHA-Sequenzen,. die zu Hif-2h kreuzhybridisieren, enthält. Diese Schlußfolgerung wird durch die Tatsache erhärtet, daß der Abschnitt von Sequenzen mit Hif-2h-verwandtem Fragment, das in der Clonbank nachgewiesen wurde, etwa 1:16 QOO beträgt.

iiimmt man einen Wert von 3 s: 10^ bp für das Humangenom Haploid an, dann ist der erwartete Wert für eine einzige mit einer durchschnittlichen D17A-Fragment-Größe

Z43403 4-

von 16 kb (dem durchschnittlichen Wert der untersuchten Clone) etwa 1:190 000. Daher ist die Häufigkeit von Hif-2h-ver¥ >andten Fragmenten 12 mal größer als für ein einziges Gen erwartet.

Bei einem Vergleich dieser Angaben, zu dem Lawn, u.a., (supra) ein Screening von 300 000 Plaques von der glei- . chen Gen-Bank mit einer ,6 -Globin-cDIIA-Sonde vornahmen, wurden nur 2 positive Clone identifiziert — wobei der erwartete Wert·1,6:300 000 war. Daher können 10 bis 15 einzelne Chromosomen-DHA-Segmente in dem Humangenom vorhanden sein, die zu dem Hif-2h-Fragment oder IF5~,?C, 1 cDlTA kreuzhybridisieren*

Weitere Charakterisierung von Hif-chr35

Uur zur Erläuterung wurde die Hybridisierungssequenz von chr-35 ("Hif-chr 35") weiter charakterisiert. Es soll damit gesagt sein, daß die Hybridisierungsabschnitte der zuvor beschriebenen Chromosomen-Hybridphagen in ähnlicher Weise charakterisiert und behandelt werden könnten, ohne daß vom Geltungsbereich der Erfindung abgewichen würde..

Der Hybridisierungsabschnitt von chr-35 ("Hif-chr35") (und das rechte Segment von Hif-chrio,, mit dem es höchstwahrscheinlich identisch, ist, supra) ist der einzige hybridisierende Ohromosomen-DHA-Abschnitt mit einer BgIII-SteHe. Da IFU-oC 1 und IFTT-c£2-cDlTAn1 bzw. 2 Bglll-Stellen innerhalb ihrer Kodierungssequenz haben, ist es wahrscheinlich, daß Hif-chr35 ein Gegenstück zu einem der beiden vorher geclonten Interferon-Gene ist. Die starke Hybridisierung von Hif-chr 35· zu dem 3'-terminal Hif-2h-cD5TA-Fragment (das nur die 3'-^icht-Kodierungsregion enthält) im Vergleich mit der schwächeren Hybridisierung der anderen der Chromosomen-DUAn zu dieser Sonde,, bestätigt eine mögliche Übereinstimmung von Hif-chr35 und Hif-2h (F, Eafatos, u.a.,

- 102 -

24 3 40 3

Pr pc. Fatl. Acad. Sei. USA, 74, S. 56I8 - 5β22 (1977)).

Zur weiteren Analyse des Hif-chr35-i?raginentes wurde ein Hindll-BamHI-Fragment von chr35 abgetrennt. Dieses Fragment (3,4 kb) enthält den Hybridisierungsabschnitt ("Hifchr35") von chr-35. Dieses Fragment ?/urde in die P_-StI-Steile von pBR322 subgeclont, wofür das allgemein bekannte dC-dG-Tailing-Yerfahren (1. Villa-Koinaroff, u.a., supra) angewandt wurde und E. coli HB101 mit dem resultierenden Rekombinant-DHA-Molekül unter Anwendung allgemein bekannter Verfahren transformiert wurden (z.B. S. ITagata, u«a·, Fature 284, S. 316 - 320 (1980)).

Clone dieser Transformanten wurden durch in situ Kolonie-

32

hybridisierung mit dem ^J P-Markierten Hif-2h-Fragment (supra) einem Screening untersogen (D. Hanahan und M. Heselson, Gene, 10, S. 63 - 67 (1980)) und Plasinid DlTA — Z-pBR-322(Pst)/HehrIF-35HB "HchrIF-35HB^fl — war die von den positiven Glonen abgetrennte (ST.M.Wilkie, u.a., Nucleic Acids Res., 7, S, 859 - 877 (1979), Methode B). Die Orientierung des Hybridinserts "HchrIF-35HB-Fragment" in dein Plasinid in bezug auf das ß -Lactamase-Gen von pBR322 wurde durch ScjoEI-Spaltung und Bemessen der resultierenden Fragmente bestimmt. Der Insert, der so orientiert wurde, daß er mit dem von & -Lactamase übereinstimmte, wurde mit ca bezeichnet und die entgegengesetzte Orientierung mi (h

Kulturen dieser positiven Clone wurden bis zu einer scheinbaren OD^r-Q = 0,8 vermehrt und die Bakterien'geerntet und mit Hilfe der Lysoz:/m-Gefrier-Tau-Methode, die bei S. Hagata, u.a. supra, beschrieben wird, lysiert. Sieben der 10 untersuchten Clone zeigten IJH-et* -Aktivitäten von 75 bis 500 Sinheiten/g Zellen (Analyse der Reduktion des cyto pathischen Effektes)..

40 3 4-

Der DIA-Insert eines dieser sieben IFU-erzeugenden Clone — E. coli HB1O1 (Z-pBr322 (Pst(/KchrIF-35HB ) — wurde weiter durch Restriktionsnalyse und Uucleotidsequenzbestimmung charakterisiert. Plasmid-DNA·(HchrIF-35HB ) wurde von dem Clon wie oben beschrieben hergestellt, und die Restriktionsstellen wurden durch. Smith-Birnstiel-Kartierung bestimmt (-H.0. Smith und M. L. Birnstiel, Hucl. Acids, Res«, 3, S.. 2387 - 2398' (1976)): HchrIF-35HB wurde mit ScoRI digeriert, an den 5'-Termini markiert und mit BgIII digeriert (und mit Pstl, um das unerwünschte Fragment von etwa 1 kb zu spalten)·. .Die 1,04 kb EooRI-BglJI (3^fproximal) und die O,96kb EcoSI-Bfflll (5^f proximal) Fragmente wurden durch Agarosegel-Elektrophorese nach der Beschreibung von A.C, Peacock und C*¥. Dingmarr, Biochemistry, 6, S, 1818 - 1827 (1967) isoliert. Beide Fragmente wurden teilweise mit Hinfl, Bspl, bzw· Wo ο II gespalten und die Produkte auf einem 1 %igen Agarosegel in Triacetat-Puffer (pH-Wert 7,8), der 1 /Ug/ml Athidiumbromid enthielt, getrennt, l^Iach dem Färben wurden die radioaktiven Bänder durch Autoradiographie betrachtet. Die B_-StUI- und HgIAI-Steilen wurden ähnlich an dem T,04 kb (3^fproximal) Fragment bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse sind in Fig· 19 zu sehen..

Für die Bestimmung der Uucleotidsequenz wurde HchrIF-35HB mit verschiedenen Restriktionsens:;men gespalten, die Produkte wurden durch. Elektrophorese durch ein 5 %igss PoIyacrylamidgel in Triborat-EDTA-Puifer (A.C. Peacock und C.7. Dingman, supra) getrennt und von dem Gel extrahiert und, wie von W, Muller,' u.a., J> Mol. Biol., 124, S. 343 - 353 (1978) beschrieben, gereini

igt.

Die' angewandte Sequenzierungsstrategie ist in Fig. 19 wiedergegeben und wird wie folgt beschrieben:

- 104 -

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1 und 2 — Spaltung von HchrIF-35HBc£mit BgIII, Markierung, Spaltung mit EcoRI und ?stl und Isolierung eines BgIII⁺- EcoRI-Fragmentes (680 bp)· (¹M") und eines BgIIl⁺ -EcoRI-Fragmentes (360 bp) ("2");

3 und 4 — Spaltung von HchrIF-35HB^- mit Ec_-ORI, Markierung, Spaltung mit Bspl und Isolierung eines ECORI⁺-Bs ₁ Ol-Fragmentes (680 bp) ("3") und eines Ec_oRI⁺B_s_dI-Fragment es (880 bp) ("4");

5, 6, 7 und 8 — Spaltung von HchrIF-35HBc^ mit Mil, Markierung, Spaltung mit BgIII und EcoRI und Isolierung von ?vuII⁺-EcoRI-Fragment (780 bp j ("5")γ eines PvuII⁺ -BgIII- -Fragmentes (215 bp) ("6")_y eines PvuII⁺-BglII-Fragmentes (90 bp) ("7") und eines PvuII⁺-EcoRI-Fragmentes (290 bp) ("8");

9 und. 10 — Spaltung von Hchr-35HBcL mit EcoRI, Isolierung durch Elektrophorese mit 1 %igem Agarosegel in Triborat-SDTA-Puffer eines 1300-bO-EcoRI-EcoRI-Fragmentes, weitere Spaltung mit Hinfl und Isolierung eines HinfI-Hinf!-Fragmentes (450 bp) und eines HinfI-HinfI-Fragmentes (180 bp). Markierung des größeren HinfI-Hinf!-Fragmentes und Spaltung mit MbοII ermöglichte die Isolierung eines Hinfl -HboII-Fragmentes (190 bp) ("9")r Markierung des kürzeren Hinfl-Hinfl-Fragmentes und Spaltung mit Avail ermöglichte die Isolierung eines HinfI⁺-AvaII-Fragmentes (150 bp) ("10");

11 — Spaltung von üchrIF-35H3'5^<i'mit MboII, Markierung, Spaltung mit BgIII Uj (465 bp) ("11");

tung mit BgIII und Isolierung eines HboII⁺ -BglII-Fragmentes

12, 13 und 14 — Spaltung von HchrIF-35HB<^ mit Bspl und Bg ₁ III, Isolierung durch Agarose-Elektrophorese, wie oben, eines 1200-bp-BsOl-BglII-FragEentes und (a) Spaltung mit HgiAI, Markierung, Spaltung mit MboII und Isolierung·eines

ö4U j A

HgiAI⁺-rfooII-gragaentes (300 bp) ("12") und eines H Mboll-Fragmentes (3^0 bp) ("13"), .oder (b) Spaltung mi Bstill, Markierung, Spaltung mit EcoRI und Isolierung eines B_st!O:⁺-Sc£RI-Pragnientes (380 bp) ("14")*

Die verschiedenen Fragmente wurden mit Hilfe der Masarn-Gilbert-Methode (supra) sequenziert. Alle Fragmente wurden an beiden Strängen und über den Restriktionsstellen, die als Ursprung für die Sequenzierung dienten,- sequenziert.

Ein Vergleich, der Hucleotidsequenz der Kodierungsregion von HchrIF-35HB und der von Hif-2h (Kodierungsregion) (Fig. 8 bis 10 im Vergleich zu Fig. 20 bis 23) ergibt, daß sie identisch sind* Vor allem überrascht, daß es keine Anzeichen für das Vorhandensein von Introns innerhalb der Kodierungssequenz des HchrIF-35HBo6-Fragmentes, d.h. zwischen der Hinfl-Stelle in der 5*-Nicht-Kodierungsregion und der ScoRI-Stelle in der 3'-Hicht-Kodierungsregion, gibt. So konnte kein Intron in der reifer IFIT-c^ mRHA entsprechenden Chromosomsequenz nachgewiesen werden,⁷

?/eitere Charakterisierung von Hif-chr 26 und Hif-chr 3

Die Gene enthaltenden Segmente von chr-3 und chr-26, die aufgrund von Heteroduples-AnaLyse identisch zu sein scheinen, aber sich in mindestens einer BgIII-Restriktionssteile unterscheiden, wurden mit Hilfe der lucleotidsequenzierung untersucht. Ss wurden fünf ITucleotid-Differenzen in 725 Basenpaaren gefunden. Uur zwei davon treten in den Kodierungssequenzen auf. Da nicht nur die Gene, sondern mindestens 35.5 ihnen vorausgehende Kbρ und 6,0 folgende Kbρ einen perfekten Heteroduplex bildeten und infolge der verhältnismäßig geringen Sequenzdivergenz, die nur 2 Aminosäureveränderungen umfaßt, sieht es so aus, als ob Hif-chr3 und Hif-chr26 allelische Formen des gleichen Gens wären. Diese werden als IFlT- eL 4a (Hif-chr3) und IFlT-064b (Hif-chr26)

J4U J 4-106-

bezeichnet. Die Uucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von IFlT-.c>C4b, die durch herkömmliche, oben beschriebene Sequenzierungstechniken bestimmt wurden, sind in den Fig· 29 bis 32 wiedergegeben.

Ein Vergleich der Fig. 29 bis 32 mit den Fig. 8 bis 10, 12 bis 16 und 20 bis 23 ergibt, daß die durch jede dieser Sequenzen kodierten Proteine voneinander in etwa 15 % ihrer Residuen abzeichen,. Diese Divergenz ist typisch für Produkte von nicht-allelischen Genen, die sich vor 20 bis 90 Millionen Jahren auseinander entwickelt haben.

Expression von Hif-chr35 ia Mäusezellen

Plasmid Z-pBR322(Pst)/HchrIF-35HBo£ (supra) wurde als Quelle eines Hif-chr35-5¹ragmentes für die Expression in Mäusezellen verwendet* Das Plasmid wurde der Restriktion mit Pstl unterzogen und mit 5'-Exonuclease behandelt, um die 5'-dG-Schweife zu entfernen. Dieses Fragment wurde dann in ein 5^f-dG-geschweiftes Kp_nI-Fragment eines Plasmids eingesetzt, das durch Vereinigen der BamHI-BamHI-Fragmente von pBR322 und PoLynoma-DITA hergestellt norden war. Der resultierende Vektor wurde zum Transformieren von Mäuse-3T3-Zellen unter Anwendung der Calciumphosphat-Technik verwendet (IT, Mantel, u.a., Nature, 281, S. 40 - 4-S (1979)). Diese transformierten Zellen werden der Einfachheit halber als Mäuse-3™3 (PoLynoma-Hif-chr35) bezeichnet. Each 20 bis 40 Stunden ergaben Analysen eine Τ&Έ-Φ -Aktivität von 300 Einheiten/ml IFH-c6 bei Hunanzellen und etwa 3000 Einheiten/ml IFI\f-c«6 bei Rinderzellen.

Man sollte aber beachten, daß bei den in den Fig. 8 bis 10, 12 bis 16, 20 bis 23 und 29 bis 32 dargestellten ITucleotidsequenzen keinerlei Modifikationen in bezug auf die ITucleotidsequenzen berücksichtigt sind, wie z.B. nutation, einschließlich einfacher oder multipler, Basensubstitutionen,

- 107 ·

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Insertionen, Inversionen oder Deletionen, die bereits erfolgt sein können oder die anschließend angewandt werden könnten. Außerdem ist bei der Sequenz auch die mögliche Substitution anderer Codone nicht berücksichtigt worden, die für die gleiche Aminosäure kodieren wie das'in diesen Fig. dargestellte Cocon. Daher sollte man beachten, daß solche modifizierten Sequenzen als Kode für Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von TFE-oL aufweisen, auch im Rahmen der Erfindung liegen.

Außerdem ist zu beachten, daß die in den Pig. 8 bis 10, 12 bis 16, 20 bis 23 und 29 bis 32 dargestellten Aminosäuresequenzen keinerlei Modifikationen zu den Polypeptiden berücksichtigen, die durch deren Wechselwirkung mit in vivo oder in vitro Mitteln, z.B. in vivo Gylcosolationsenzymen, hervorgerufen'wurden· Daher ist verstädnlich, daß Fragmente und Derivate dieser Polypeptide, die eine immunologische oder biologische Aktivität von IFiT-oC aufweisen, ebenfalls im Geltungsbereich der Erfindung liegen.

Erzeugung von Polypeptiden, die eine immunologische oder biologische Aktivität von Interferon in Bakterienwirten aufweisen

Da durch die Analyse der Reduktion des cytopathischen Effektes (W.E· Stewart II und S.E. Sulkin, S. E. Proc. Soc. Bsp. Biol. Med«., 123, S. 650 - 653 (1966)) winzige Mengen von IFF-— weniger als ein aktives Molekül je Bakterienzelle — nachgewiesen werden können, wurden mit den zuvor beschriebenen, zehn Hybrid--^t-Phagen infizierte Lysate von E« coli EB10T auf das Vorhandensein von IFlT hin untersucht. Sieben der elf Phagen (alle bis auf chr-10, chr-12, chr-19 und chr-27) ergaben Lysate, die von 3 bis 50 Einheiten/ml reichende IFIT-Aktivität enthielten. Lm Falle von chr-10 und chr-12 prägten die hybridisierenden (zu Hif-2h) Hindlll-Hindlll oder EcoRI-EcoRI-Fragirtente, die in die Pstl-Stelle

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^43 40 3 4-

von pBR322₅ wie oben beschrieben, subgeclont waren, IETT-Aktivität in S. coli aus. Da man annimmt, daß E. coli nicht in der Lage sind, inRSTA aufzuspalten (0. Mercereau-Puijalon . und 0. Kourilsky, Eature, 279, S. 647 - 6-49 (1979)), enthalten diese IPIT- - Chromosoinengene sehr wahrscheinlich keine Introns in ihrer Kodierungsregion,

Abschließende Schlußfolgerungen

Ss wurde eine Gruppe von Rekombinant-DITA-Molekülen isoliert, die cDSA enthielten, die von PoLy(A)-RITA von mit Sendai-Viren behandelten (induzierten) Humanleukozyten hergestellt worden war, von denen Vertreter die folgenden Eigenschaften haben:

(1) Sie hybridisieren zu PoIy(A)-RHA von induzierten, aber nicht von nicht-induzierten Humanleukozyten;

(2) Sie hybridisieren zu IZDT-06mRITA, wie aufgrund ihrer Eähigkeit, diese RITA aus einem Gemisch von RITAn zu selektieren, und ihrer Fähigkeit, (reversibel) die Translation von Interferon-mRlTA in der Hybrid-arretierten Translationsanalyse zu inhibieren, gezeigt wird.

(3) 5. coli, die verschiedene Glieder der Gruppe enthalten,

erzeugen eine Verbindung mit den folgenden Eigenschaften:

a) Sie ist gegenüber Trypsin sensitiv;

b) sie weist IPIT-06 -Aktivität in einem Humanzellensyatem und nur leichte Aktivität in einem Mäusezeliensystem auf;

c) sie hat eine relative Molekülmasse zwischen 20 000 und 30 000 (19 388 auf der Basis der ITucleotidsequenzierung der Eig.. 8 bis 1.0) ;

d) ääe IJH—etj-Aktivität wird spezifisch durch Antikörper gegen Humanleukozyten-Interferon inhibiert.

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Z434

(4) Die DITA-inserts der erfindungsgemäßen Hybridplasmide sind neben ihrer Fähigkeit zur Selektion von IFE-oL mRIA aus einem Gemisch von RH^-An in der Lage, IFE-oC DNA aus einem aus verschiedenen Quellen stammenden Gemisch, einschließlich CDl^-An, und von Hybrid-Phagen-Genbänken von Chromosomen-DE^-A auszuwählen.

'(;5) Ss gibt eine Anzahl verschiedener Chromosomengene für IPII-06.. Es ist unerwartet, daß diesen Genen Introns fehlen und sie die direkte Expression von Interferon und interferonartigen Polypeptiden in entsprechenden Wirten ermöglichen.

(5) Mindestens drei der lucleotidsequenzen der DITA-Inserts dieser Rekombinant-DHA-Moleküle sind verschieden und deuten auf das Vorhandensein von mindestens drei nicht-allelischen Genen für IYE-qL hin*

(7) Die durch diese drei ITucleotidsequenzen kodierten Proteine unterscheiden sich von den 35 Aminosäuren, die von authentischen Lymphoblastoid-Interferon bestimmt wurden..

(8) Hybridproteine,, die für verschiedene Kombinationen von IFE-qL-Gensegmenten hergestellt wurden, zeigen quantitativ andere Eigenschaften als Jedes andere.oder ihre Stammformen und Proteine mit zusätzlichen Aminosäuren, die mit ΙΙ'Ή-cL verschmolzen sind, oder Proteine, die IFIl-^/ enthalten, ohne daß ein Teil ihrer Aninoterminalsequenz ZFI'T-Aktivität aufweist.

Diese Eigenschaften demonstrieren, daß die erfin-dung3gemäß beschriebenen Rekombinant-DlTA-Moleküle mindestens einen Teil der Kodierungssequenz für Humanleukozyten-Interferon enthalten und daß einige dieser Plasmide in Ξ. coli zur Expression eines Polypeptids mit einer immunologischen oder bio-· logischen Aktivität von.Humanleukozyten.-Interferon führen,

— ι

24 3 40 3 4-

Es dürfte auch klar sein, daß die hier offenbarten Polypep tide fragmentiert, modifiziert oder derivatisiert werden können, wie es auf dem Fachgebiet der Proteine allgemein bekannt ist, ohne daß vom Inhalt oder der Offenbarung der Erfindung abgewichen wird.

Mikroorganismen und nach den hier beschriebenen Prozessen hergestellte Rekcmbinant-DITA-Moleküle sind durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Gcttingen, Westdeutschland, am 7. Januar 1980 hinterlegt und als HcIS-A bis E identifiziert wurden:

A: E. coli HB1O1 (Z-pBR322(Pst(/HcISM

B: E. coli HB1O1 (Z-pBR322(Pst)/HcIP-2h)

C: E. coli ΞΒ1Ο1 (Z-pBR322(Pst)/HcIP-SlT35)

D: E. coli ΞΒ1Ο1 (Z-pBR322( Pst)"/HcIP-SI^)

^3: E. coli HBI01 (Z-pKö3287(?st)/HcIP-2h-AH6)

Diese Kulturen erhielten die Zugangsnummerη DSM 1699 bis 1703. Außerdem sind Mikroorganismen und durch die hier beschriebenen Prozesse hergestellte Rekombinant-DrTA-Moleküle in der Kulturensammlung der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 27. März 1980 hinterlegt und als HicIP-G bis H identifiziert und mit den' A¹ICC-Zugangsnummern 3/633 bzw· 3/634 versehen worden:

G: E, coli HB101 (Z-pBR322(?st)/HcIP-II-2O6) H: E> coli HB101 (Z-p3R322(Pst)/Hcip-SIT35-AHL6)

Andere durch die hier beschriebenen Prozesse hergestellte Mikroorganismen sind durch Kulturen vertreten, die in der Kulturensammlung der Deutschen Smmlung von Mikroorganismen in Göttingen, Westdeutschland, am 1. Oktober 1980 hinterlegt und als HchrIP-A bis J identifiziert und mit den Zugangsnummern DSM. 1914 - 1923 versehen wurden:

- 111 -

A. subgeclontes Hindlll-Pragment von Chr 3 in Ξ« coIi HB1O1;

B. subgeclontes EcoRI-Fragment von ehr 12 in Ξ, coli HB101;

C. Subgeclontes HindIII-Fragment von ehr 12 in Ξ. coli HB1O1 ;

D« subgeclontes Sc_-ORI-Fragment von ehr 13 in E, coli HB101 ; E. subgeclontes EcoRI-Fragment von ohr 23 in E. coli H3101 ; F». subgeclontes Hindlll-Fragment von ehr 23 in E. coli HB101; G_# subgeclontes EcoRI-Fragment von ehr 26 in E. coli EB101; Η» subgeclontes HindIII-Fragment von chr 26 in E. coli HB101; I* subgeclontes Hindlll/BanHI-Fragment von chr 35 in Ξ« coli

HB101; J* subgeclontes BamHI-Fragment von chr 35 in E, coli HB101

Schließlich werden nach den beschriebenen Prozessen hergestellte Mikroorganismen durch Kulturen vertreten, die in der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 15· Dezember 1980 hinterlegt und als HehrIF-K bis HehrIF-Q- und HcIF-I bis HcIF-K identifiziert und mit den ATTC-Zugangsnummern

31760 HehrIF-K

31761 HehrIF-L

31762 HchrIF-M

31763 HchrIF-H

31764 HchrIF-0

31765 HchrIF-F

31766 HehrIF-Q

31767 HcIF-I 31768HcIF-J 31769 HcIF-K versehen wurden.

K„ subgeclontes· Tac-Tae-Fragment von chr 23 in E. coli H3101; L* subgeclontes BgIII-Bßlll-Fragment von chr 101 in E, coli

M* subgeclontes Hindlll-Hindlll-Fragment von chr 1Or in 'B, coli HB101;

- 112 -

24 3 40 3 4.₁₁₂.

IT.. subgeclontes Bglll-Bglll-Fragment von ehr 26 in B. col;

KB1O1 ; O. subgeclontes HindJII-Hinälll-Fragment von ehr 30 in

E. coli HB1O1; P·. subgeclontes Bg]₁II-TaC-Fragment von ehr 13 in S, coli

HB101; Q» subgeclontes BgIII-Tac-Fragment von ehr 1 β in E, coli

HB10W

HcIF-I: 5. coli DS41O (CS-IFüT-^2)

HcIF-J: Ξ. coli DS410 (IAC-AUG (oi 2)

HcIF-K: E. coli DS41O ( £ -Lac-AUG

Wenn auch oben eine Reihe von Ausführungsformen der Erfindung vorgelegt worden sind_r so ist klar, daß die Grundkonstruktion verändert werden kann, um andere Ausführungsformen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Prozesse und Zusammensetzungen zu schaffen. Daher ist vorgesehen, daß der Geltungsbereich der Erfindung durch die angefügten Ansprüche und weniger durch die spezifischen Ausführungsformen, die oben anhand von Beispielen erläutert wurden, festgelegt wird.

Claims (6)

1. /4 3 4 U 3 4

   Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Herstellung eines Rekombinant-DHA-Moleküls gekennzeichnet duroh den Schritt, daß in ein CIoningvehikel eine DHA-Sequenz eingefügt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den DHA-Inserts von Z-pBR322(Pst)/HcIF-Ac, Z-pBR322(Pst)/HcIP-2h, Z~pBR322- , (Pst)/HcIF-SJT35, Z-pBR322(Pst)/HcIF-SH42, Z-pKT287(Pst)/ HcI5¹-2h-AH6, DlIA-Sequenzeη, die zu einem der vorstehen-' den DHA-Inserts hybridisieren, DHA-Sequenzeη, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halbsynthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DHA-Sequenzen oder Inserts, und DHA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons umfassen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das eine ähnliche Immunologische. oder biologische Aktivität wie ein bei Expression der Godons einer der vorstehenden DiIA-Sequenzeη oder Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist,
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zu dem DHA-Insert hybridisierende DHA-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den DHA-Inserts von Z-pBR322(Pst);/HcI?-II-2O6 oder Z-pBR322-(Pst)/HcIF-Slö5-AHL6, DIA-Sequenzen, die au einem der vorstehenden DEA-Inserts hybridisieren» DHA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb-synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DHA-Sequenzen oder Inserts, und DHA-Sequenzen, die Sequenzen von Godons umfassen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das eine ähnliche immunologische

   40 3 4

   -ζ-

   oder biologische Aktivität wie ein bei Sirpression der Codons einer der vorstehenden DiJA-Sequenzen und Inserts dafür kodiertes Polypeptid aufweist.

   Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die zu dein DHA-Insert hybridisierende DM-Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hif-chrl, Hif-chr3, Hif-chr12, Hif-chr13, Hif-chri6-l, Hif-chr26, Hif-chr3O, Hif-chr35> D¥A-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DH^-A-Sequenz hybridisieren, DFA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend, einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb-synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DITA-Sequenzen, und DTTA-Sequenzen, die Sequenzen von Godons umfassen, die bei Expression für eine Polypeptid kodieren, das eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität wie ein bei Expression einer der vorstehenden DIIA-Se quenz en dafür kodiertes Polypeptid

   aufweis
3. 4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, / daß die zu dem DITA-Insert hybridisierende DlTA-S equenz

   ³¹¹^e,

   ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Hif-chrl9, Hif-chr27, DiTA-Sequenzen, gleich aus welcher Quelle stammend,- einschließlich natürlicher, synthetischer oder halb synthetischer Quellen, verwandt durch Mutation, einschließlich einfacher oder mehrfacher, Basensubstitutionen, Deletionen, Insertionen und Inversionen mit einer der vorstehenden DHA-Sequenzen, und DITA-Sequenzen, die Sequenzen von Codons umfassen, die bei Expression für ein Polypeptid kodieren, das eine ähnliche immunologische oder biologische Aktivität nie ein bei Expression einer der vorstehenden DEA-Sequenzen dafür kodiertes Polysestid aufweist.

   24 3 40 3 4 -

   _ /11 ö -
4. 5. Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die DM-Sequenz aus der Sequenzen der Formel:

   atggcctccccctttgctttjctgatggtcctggtggtgctcagctccaiigtcaag / ctgctctctgggctgtcatctccctgagacccacaccctggataiicaggaggacctt gatgctcctggcacaiiatgagcagaatctctccttcctgctgtctgatggacagaca tgactttggatttccccaggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctccagc CATGTCTGTCGTCCATGAGCTGATCCAGGAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGA TTCATGTGCTGCTTGGGATGAGGACGTGCTAGACAAATTCTGGACCGAACTGTACCA CCAGCTGAATGACTTGGAACCCTGTGTGATGCAGGAGGAGAGGGTGGGAGAAiICTCC CCTGATGMTGCGGACTCCATCTTGGCTGTGAAGAAATAGTTCCGAAGAATCACTCT CTATGTGACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTGAGAGGAGAAiIT CATG-AGATCCTCTGTTTATCAACAAAGTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAiIGGAATAA TGTGATCTGCCTGAGACCCACAGGCTGGATAACAGGAGGACGTTGATGCTCCTGGGA GAAATGAGCAGAATGTCTGCTTCCTCCTGTGTGATGGACAGAGATGACTTTGGATTT CGCGAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTGCAGAAGGCTCCAC-CCATCTGTGTGCTC . CATGAGGTGATCGAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACiLlAAGATTGATCTGGTCCT tgggatgaggagctcgtagacaaattgtgcacggaactctaccagcagctgaatgac ttggaagcctgtgtgatgcaggaggagagggtgggagaaactcccctgatgaatgcg gactccatcttggctgtgaagaaatacttccgaagaatcagtctctatctgacagag AAGAAATAGAGCCCTTGTGC GTGGGAGGTTGTGAGAGGAGAAATGATGAGATC CCTC TCTTTATCilAGAAACTTGCAAGAAAGATTAAGGAGGAAGGAATAA und Fragmente und Derivate davon umfassenden Gruppe ausgewählt ist, 'wffl-bei die Fragmente und Derivate für Polypeptide kodieren, die eine immunologische oder biologische' Aktivität von IFiT-di aufweisen.
5. 6.. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die DMA-Sequenz aus der DiTA-Seguenzen der Formel:

   TTAGTGGTGGCGGTCGTGGTGGTCAGCTGGAAGTCAAGaTGGTSTGTGG-GCTaTGAT GTGCGTGAAACCCACAGCGTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTCGCACAGATG AGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTGCCCAG GAGGAGTTTGGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTGCATGAGAIG ATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGGACAAAGGACTCATCTGGTGCTTGGGATGAG AGCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTACCAGGAGCTGAATGACCTGGAAGCC

   243403 4 -

   TGTGTGATAGAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTGCGGTGATGAAGGAGGACTCCAx¹T CTGGCTGTGAGGAAATACTTCCiUilGAATCACTCTCTATCTGAilAGAGAAG/uUTAC agcccttgtgcctgggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtca acaaacttgcaagaaagtttaagaagtaaggaatga tgtgatctgcctcaiuccc acagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacagatgaggagaatctctc ttttctcctgcttgaaggacagacatgactttggatttccccaggacgagtttggca accagttcgaaaaggctgaaaccatccctgtcctccatgagatgatccagcagatct tcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctgcttgggatgagaccctcctagaca aattctagactgaactctaccagcagctgiutgacctggaagcctgtgtgatacagg gggtgggggtgacagagactcccctgatgaaggaggactccattctggctgtgagga aatacttccaaagaatcactctctatctcaaagagaagaiutacagcccttgtgcct gggaggttgtcagagcagaaatcatgagatctttttctttgtcaacaaacttgcmg AAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA und Fragmente und Derivate davon
   'umfassenden Gruppe ausgewählt ist, wobei die Fragmente
   und Derivate für Polypeptide kodieren, die eine immunologische oder biologische Aktivität von IPIT- oL> aufweisen.
6. 7. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet
   dadurch, daß die DlTA-Sequenz aus der DITA-Sequenzen der
   Formel:

   atggccctgtcgttttgtttactgatggccgtgctgctgctcagctaciuatccatc tgttctctgggctgtgatctccctcagacccacagcctgggtaataggaggacgttg atactgctccaaciuatgggaagaatctctcatttctcctgcgtgaaggacagacat gatttc ggattc gc c caggaggagtttgatggc gaccagttc cagaagac tgaagcc atctctgtgctccatgagatgatccaccagagcttcaatctgttcaggacagaggac tcatctgctgcttgggaacagagcctcctagaiuaaittttggagtgaactttacgag caactgaatgacgtggaagcatgtgtgatacaggaggttggggtggaagagagtggg GTGATG-UTGTGGACTCGATCGTGGCTGTGAGCUAATACTTCGiUAGAATCACTCTT TATCTAACAGAGAGAAGAAATACAGGCCTTGTGGCTGGGAGGTTGTAAAAAAGATTA aggaggaaggattga, tgtgatgtggctgagaccgacaggctgggtaataggagga cgttgatactgctgcaagaaatgggaagaatgtctcatttctgctgcctgaaggaca gagatsatttcegatsccgggjlggagga^^

   Λ_κ.1ίθν/Λ± LiILi J.LrJL WL/ IL-^^.--J.U--r^U*i_ LTi-XUu-IUOi--Lt--L/ο - iu;ju!j 1L/ χ ^.Li-xvjUc-.uii-U

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   Cn-¹PP'' '' pmp .', λ mn .; ppnr!p λ "nr \ m pm pm ρ ^Λ rn ' ·~ .' r-H ' /""prnrnppnprnpp ' 'ρ η '.. L/.t-LtLu-s-uL/ JLt-T-I-J.'vj-iwLi j. vrLr^j-r-'uL»ΛΧ Lrx Lr^. LT---X--u-iU^lj«uLr 1luLruLriLtLt^--.--^-!^--- r' ", rnp ;. .·, mn mn π \ η mc π < γρ.,-· nrrtn ρ ιππιτί'¹ ' ρρ λ · ι m ' ,'tmmprt - ·. η '. · mp '

   243403-4-*-

   ' CTCTTTATGTAACAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTGAGAGGAG AAATGATGAGATCGCTCTGGTTTTCAACAAACTTGGAAAAAAGATTAAGGAGGAAGG xiTTGA und Fragmente und Derivate davon umfassenden Gruppe ausgewählt ist,, wobei die Fragmente und Derivate für Polypeptide kodieren, die eine immunologische oder biologische Aktivität von IEEF- oL aufweisen.

   8,: Verfahren nach einem der vorstehenden Punkte, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt, daß in das Cloningvehikel eine Expressions-Kontroll-Sequenz eingefügt wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend ein lac-S;y stern, ein /5 -lac-System, ein trio-System, Hauptoperator- und Promotorregionen von Phage \ , die Kontrollregion von fd-Goat-Protein, und andere die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotisctier Zellen und deren Viren steuernde Sequenzen, wobei die Eizpressions-Kontroll-Sequenz so in das Cloningvehikel eingefügt wird, daß sie die Expression der DüTA—Sequenz steuert und reguliert.

   .9. Verfahren nach Punkt 8, insoweit er von Punkt 5 oder S abhängig ist, gekennzeichnet dadurch, daß das erzeugte DHA-MoIekül aus der GQ-IFE-cL 1, C3-ΙΈΈ-oL 2, LAC-AUG-( 2) und |V -lac-AUG( 2) umfassenden Gruppe ausgewählt ist.

   Hierzu 31 Blatt Darstellung