DD202046A5

DD202046A5 - Verfahren zur herstellung eines chimeren proteins

Info

Publication number: DD202046A5
Application number: DD80234739A
Authority: DD
Inventors: John D Baxter; Howard M Goodman; Joseph A Martial; Robert A Hallewell
Original assignee: Univ California
Priority date: 1979-06-01
Filing date: 1980-06-02
Publication date: 1983-08-24
Also published as: KR860001515B1; KR830002871A; DD202045A5; DE3066256D1; IE801137L; IE50378B1; ES492044A0; PH21531A; BG41134A3; CA1194432A; AR248049A1; DD154022A5; PT71323A; GR68404B; JPH0630582B2; PL224664A1; RO79982B; ES499045A0; FI801743A7; AU5892680A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren eines chimeren Proteins mit der Aminosaeuresequenz menschlichen Pre-Wachstumshormons als C-Terminalsequenz und eines Teiles eines procaryotischen Proteins als N-Terminalsequenz. Ziel der Erfindung ist es, die bekannten Verfahren zur Herstellung menschlichen Pre-Wachstumshormons zu verbessern, um menschliches Wachstumshormon in ausreichenden Mengen fuer pharmazeutische Zwecke bereitstellen zu koennen. Erfindungsgemaess wird der fuer das Transformieren mittels Mikroorganismus erforderliche Expressions-Transfervektor durch Umsetzen einer menschliches Pre-Wachstumshormon codierenden Deoxynucleotid-sequenz mit einem DNS-Molekuel hergestellt, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym entstanden ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren eines chimeren Proteins mit der Aminosäure-Sequenz menschlichen Pre-Wachstumshormons als C-Terminalsequenz. und eines Teiles eines procaryotischen Proteins als IT-Terminalsequenz. Die Erfindung ist bei. der Herstellung von menschlichem Wachstumshormon für therapeutische Zwecke einsetzbar.

Bekannte technische Lösungen

Wachstumshormon wird prinzipiell durch den Hypophysenvorder lappen produziert. Das Hormon wird normalerweise über die gesamte Lebenszeit produziert, die höchsten Mengen jedoch während der Kindheit. Obgleich der Herstellungsmechanismus noch nicht im Detail verstanden wird, ist das Wachstumshormon dafür bekannt, Glukose und den Fettstoffwechsel zu beeinflussen und die Proteinsynthese zu beschleunigen.

Es sind eine Vielzahl von klinischen Störungen bekannt, die mit dem Wachstumshormonmangel einhergehen. Schwerwiegende Fälle von Zwergwuchs sind überall mit menschlichem Wachstumshormon behandelt worden, das aus Leichen isoliert wurde. Da die meisten Wachstumshormone von Üicht-Primaten beim Menschen nicht wirksam sind, gibt es keine alternative . Quelle. Die Materialmenge ist sehr gering, und die Isolierung

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und Reinigung ist umfangreich und kostspielig. Pro Jahr und Patient werden die Kosten auf ca. 5 000,00 U^ geschätzt. Die Behandlung,des Wachstumshormonmangels wurde daher auf die schwerwiegenden Fälle beschränkt. Für mehr als -1000 neue Patienten im Jahr ist eine Behandlung erforderlich. Wenn eine ausreichende Menge an Hormon zu annehmbaren Kosten erhältlich wäre, könnten zusätzlich schätzungsweise 10 000 Patienten mit weniger schweren Wachstumsmangelerscheinungen oder mit irgendwelchen anderen Waehstumsproblemen behandelt werden.

Zusätzlich ist durch Experimente belegt, daß menschliches Wachstumshormon für die Behandlung von Magen-^arm-Blutungen, für Knochenbruch- und Wundheilprozesse sowie Knochenstoffwechselkrankheiten nützlich ist.

Das Wachstumshormon ist ein .Protein. Die durch konventionelle Verfahren bestimate Aminosäuresequenz des menschlichen Wachstumshormons ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Die chemische Synthese dieser Sequenz von 191 Aminosäuren ist durch die bekannten Techniken nicht durchführbar. In der Hypophyse wird das auslösende biosynthetische Produkt als Pre-Wachstumshormon bezeichnet und enthält zusätzlich zu der in Tabelle 1 aufgeführten Sequenz eine Sequenz mit 26 Aminosäuren,.die als Signalpeptid bezeichnet wird und am Aminoterminalende angesetzt ist. Die Signalpeptid- ,-?

sequenz ist:

-26 -20 -15

STH₂-Met-Ala-Thr-Gly-Ser-Arg-Thr-Ser-Ieu-Leu-Leu-Ala-Phe-Gly-

-10 -5-1

Leu-Leu-Cys-Leu-Pro-Trp-Leu-Gln-Glu-Ala-Val-Pro.

Das Signalpeptid mit 26 Aminosäuren hat die Aufgabe, durch Verleihen der Fähigkeit in die Zellenmembran einzudringen ' und sie zu durchdringen, die Abscheidung des Proteins aus

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der Zelle, in der es synthetisiert wurde,- zu ermöglichen (siehe Blobel, G. et al. J. Cell. Biol. „67, 835 (1975).)

Verschiedene Stufen von Signalpeptiden sind dafür bekannt, daß sie eucaryotische Proteine durch die Membranbarrieren hindurch transportieren. In einem zellfreien System wurde ein spezifisches Spalt beobachtet, das die Peptidbindung zwischen dem Signalpeptid und dem aktiven Protein in Verbindung"mit dem Passieren der Zellmembran hydrolysiert (siehe Blobel, G. et al., Proc. Nat. Acad. Ca. USA J75, 361 (1978).

Fortschritte der Biochemie und bei der DIiS-Eekombinationstechnologie in jüngster Zeit haben es ermöglicht, die Synthese spezifischer Proteine unter kontrollierten Bedingungen durchzuführen, unabhängig von einem höheren Organismus, aus dem sie sonst normalerweise isoliert wurden. Derartige biochemische synthetische Verfahren benutzen Enzyme und subzellulare Komponenten des proteinsynthetisierenden Mechanismus lebender Zellen, entweder- in vitro, in zellfreien Systemen oder in vivo, in Mikroorganismen. In jedem Pail ist das Schlüsselelement das Vorhandensein einer Desoxyribonukleinsäure (DNS) mit spezifischer Sequenz, die die notwendigen Informationen zur Spezifizierung der gewünschten Aminosäuresequenz enthält. Eine solche spezifische DITS wird hier als Gen bezeichnet.Das codierte Verhältnis, womit eine Desoxynucleotidsequenz zur Spezifizierung der Aminosäuresequenz eines Proteins eingesetzt wird, ist weiter unten beschrieben und wirkt nach den grundsätzlichen Prinzipien, die das gesamte bekannte Eeich der lebenden Organismen erfassen.

Ein kloniertes Gen kann eingesetzt werden, um die Aminosäuresequenz von Proteinen zu spezifizieren, die in ir^vitro Systemen synthetisiert worden sind. DNS-gerichtete protein

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synthetisierende Systeme sind aus dem Stand der Technik bereits bekannt, siehe z.B. Zubay,"G., Ann. Rev. Genetics 2, 267 (1973). Zusätzlich kann eine Einzelstrang-DNS " dazu geführt werden, daß sie als Messenger-RNS in vitro wirkt, was zu einer originalgetreuen Übertragung der DNS-Sequenz führt (Salasj J. et al., J. Biol. Chem. 243, 1012 (1968). Andere Techniken, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, können mit den o"ben genannten Verfahren kombiniert werden, um die Ausbeuten zu erhöhen.

Weiterentwicklungen "bei der DNS-Eekombinationstechnologie haben es ermöglicht, spezifische G-ene oder Teile davon aus höheren Organismen zu isolieren, z.B. vom Menschen und anderen Säugetieren, und die Gene oder Genfragmente auf einen Mikroorganismus zu übertragen, wie z.B. Bakterien oder Hefe. Das transferierte Gen wird repliziert und vermehrt wie sich der transformierte Mikroorganismus repliziert. Als ein Ergebnis kann der transformierte Mikroorganismus die Fähigkeit erhalten, ein "beliebiges Protein, Gen oder Fragment zu verschlüsseln, ob es ein Enzym,'ein Hormon, ein Antigen, ein Antikörper oder ein Teil davon ist. Der Mikroorganismus vererbt diese Fähigkeit an seine Nachkommenschaft, so daß die Übertragung tatsächlich zu einem neuen Stamm mit der beschriebenen Fähigkeit führt, siehe beispielsweise Ullrich, A. et al., Science 196, 1313 (1977) und Seeburg, P.H., et al., Nature _270, 486 (1977). Eine Grundvoraussetzung, die die. Anwendung dieser Technologie für die Praxis erlaubt, ist die, daß die DNS aller lebenden Organismen, von Mikroben bis zum Menschen, chemisch ähnlich ist und aus den gleichen vier Nucleotiden besteht. Die wesentlichen Unterschiede bestehen in den Sequenzen dieser Nucleotide in dem polymeren DNS-Molekül. Die Nucleotidsequenzen werden dazu eingesetzt, die Aminosäuresequenzen des dem Organismus angehörenden Proteins zu spezifizieren. Obgleich die meisten Proteine verschiedener

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.Organismen voneinander abweichen, ist das Codierungsverhältnis zwischen Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz für alle. Organismen grundsätzlich gleich. Beispielsweise findet man die gleiche Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz von HG-H in menschlichen Hypophysezellen codiert, bei der Übertragung auf einen Mikroorganismus als Codierung für die gleiche Aminosäuresequenz. Hierin benutzte Abkürzungen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Codierungsbeziehungen zwischen der Nucleotidsequenz in der DNS und der Aminosäuresequenz im Protein sind insgesamt als der in Tabelle 3 aufgeführte genetische Code bekannt.

Pur die vorliegenden Zwecke ist die Tatsache ein wesentliches Merkmal des Codes, daß jede Aminosäure durch eine Trinucleotidsequenz spezifiziert wird, bekannt auch als ein Nudelt id—Triplet. Die Phosphodiesterbindungen, die die benachbarten Triplets miteinander verbinden, sind chemisch von allen anderen internucleotiden Bindungen in der DNS nicht unterschäidbar. Daher kann die Nucleotidsequenz nicht als Code für eine einzige Aminosäuresequenz gelesen werden ohne zusätzliche Informationen zur Bestimmung des Ableserahmens (reading frame). Letzteres ist der Begriff, der verwendet wird, um die Gruppierung von Triplets zu bezeichnen, die bei der Decodierung der genetischen Botschaft durch die Zelle eingesetzt werden.

Eine Reihe von DNS-Rekombinationsteehniken weaen zwei Klassen von Verbindungen an, Transfervektoren und Restriktionsenzyme, was diskutiert wird. Ein Transfervektor ist ein DNS-Molekül, das unter anderem die genetische Information enthält, die seine eigene Replikation sichert, wenn es auf ein Wirts-Mikroorganismusstamm übertragen wird. Beispiele von Transfervektoren, die üblicherweise in der bakteriellen Genetik eingesetzt werden, sind Plasmide und die

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DNS bestimmter Bakteriophagen . Obgleich Plasmide als Transfervektoren für die hier vorliegende Erfindung verwendet wurden, können selbstverständlich auch andere Arten von Transfervektoren eingesetzt werden.

Plasmid ist der benutzte Begriff für eine selbständig replizierende DlTS-Binheit, die in einer mikrobiellen Zelle gefunden werden kann_f anders als das Genom der Wirtszelle selbst. Ein Plasmid ist nicht genetisch mit dem Chromosom der Wirtszelle verbunden. Plasmid DNS existieren als Doppelstrang-Ringstrukturen im allgemeinen in der Größenordnung einiger Millionen DaItons Molekulargewicht, obgleich einige größer als 10 Daltons an Molekulargewicht sind. Sie repräsentieren üblicherweise nur einen kleinen Prozentsatz der Gesamt-DNS der Zelle. Die Transfervektor-DNS ist üblicherweise von der Wirtszellen~DNS infolge der erheblichen G-rößend'ifferenz zwischen beiden abtrennbar. Die Transfervektoren tragen die genetische Information, die sie in die Lage versetzen, sich 'innerhalb der Wirtszelle zu replizieren, in den meisten Fällen unabhängig von der Rate der Wirtszellteilung. Einige Plasmide haben die Eigenschaft, daß ihre Replikationsrate du·¹"⁰*^{1 aen} Forscher mit Hilfe von Variationen in den Wachstumsbedingungen gesteuert werden kann. Plasmid-DNS existiert als ein geschlossener Ring. Der Ring kann allerdings durch entsprechende Techniken geöffnet werden, ein Fragment einer heterologen DNS eingesetzt, und der Ring wieder geschlossen werden, um so ein vergrößertes Molekül zu bilden, das das eingefügte DNS-Segment mit enthält, Bakteriophagen-DNS kann ein Segment einer heterologen DNS aufnehmen, das anstelle einzelner nicht-essentieller Phagen-Gene eingesetzt wurde. Der Transfervektor dient jedenfalls als Träger oder als Vektor für ein eingesetztes Fragment einer heterologen DNS.

Der Transfer wird über ein Verfahren realisiert, das als Transformation bekannt ist. Wahrend der Transformation

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nehmen die mit der Plasmid-DNS.vermischten Bakterienzellen die gesamten Plasmidmoleküle in die Zellen auf. Obgleich der Verfahrensablauf unklar bleibt, ist es mit Hilfe " empirisch gefundener Behandlungsmethoden möglich, den Anteil von Bakterienzellen zu maximieren, die in der lage sind, Plasmid-DNS aufzunehmen und folglich transformiert werden«

Wenn einmal eine Zelle ein Plasmid aufgenommen hat, wird letzteres in der Zelle repliziert^ und das replizierte Plasmid wird bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben. In den Nucleotidsequenzen der Plasmid-DNS enthaltene genetische Informationen können prinzipiell in den Wirtszellen ihren ^Ausdruck" finden. Es ist charakteristisch, daß eine transformierte Wirtszelle durch ihre erworbenen Merkmale bestimmt wird, die durch das Plasmid getragen werden, wie z.B. Widerstandsfähigkeit gegen bestimmte Antibiotika. Verschiedene Plasmide- sind durch unterschiedliche Fähigkeiten oder die Kombination von Fähigkeiten bestimmbar_?* in der sie enthalten sind. Irgendein gegebenes Plasmid kann quantitativ hergestellt werden durch Wachstum einer reinen Zellkultur, die das Plasmid enthält und anschließendes Isolieren der Plasmid-DNS.

Restriktionsendonucleasen sind hydrolytische Enzyme, die in der Lage sind, katalytisch die DNS-Moleküle lagespezifisch zu zerschneiden. Der Angriffsort der Restriktionsendonuclease .ist durch die Exist enz einer spezifischen Nucleotidsequenz bestimmt, line solche Sequenz wird als Erkennungssequenz oder -stelle (recognition site) für die Restriktionsendonuclease bezeichnet. Es wurden Restriktionsendonucleasen aus einer Vielzahl von Quellen isoliert und durch Begriffe charakterisiert, die aus der Nucleotidsequenz ihrer Erkennungsstelle, resultie-en. Einige Restriktionsendonucleasen hydrolysieren Phosphodiesterbindungen an beiden Strängen an dem gleichen Punkt unter Bildung von glatten Enden (blunt ends).

+) die sie der Wirtszelle übertragen

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Andere katalysieren die Hydrolyse von Bindungen, abgetrennt durch einige Nucleotide voneinander, unter Bildung von freien einzelsträngigen Eegionen an federn Ende des zerschnittenen Moleküls. Solche einzelsträngigen Enden sind selbst-komplementär, daher kohäsiv, und können benutzt werden, die hydrolysierte DNS wieder einzubinden. Da einige DNS, die zur Spaltung durch ein_derartiges Enzym neigen, die gleiche Erkennungssequenz enthalten müssen, werden die gleichen kohäsiven Enden hergestellt, so daß es möglich ist, heterologe DNS-Sequenzen, die mit Restriktionsendonuclease behandelt worden sind, mit anderen, ähnlich behandelten Sequenzen zu verbinden, siehe Roberts, E.J., Crit. Rev. Biochem." 4, 123 (1976).

Restriktionsstellen sind relativ selten, jedoch hat* sich die generelle Einsetzbarkeit von Restriktionsendonuclease wesentlich durch die Synthese von doppelsträngigen Oligo— nucleotiden erweitert, die die Restriktionsstellensequenz tragen. Daher kann praktisch irgendein Segment der DNS an irgendein anderes Segment einfach durch Befestigung des entsprechenden Restriktionsoligonucleotids an den Enden des Moleküls angekoppelt werden. Anschließend wird das Produkt einer hydrolytischen Einwirkung der entsprechenden Restriktionsendonuclease unterworfen, wobei die erforderlichen kohäsiven Enden entstehen., siehe Heyneker, H.L., et al., Nature 263, 748 (1976) und Scheller, R.H. et al., Science 196, 177 (1977). Ein wesentliches Merkmal der Verteilung der Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen ist die Tatsachedaß sie /zufällig im Hinblick auf den Ableserahmen verteilt sind. Dementsprechend kann die Spaltung "durch.die Restriktionsendonuclease zwischen benachbarten Codons eintreten, oder sie kann innerhalb eines Codons erfolgen. Allgemeinere Methoden für die DNS-Spaltung oder für die Endsequenzmodifikation sind verfügbar. Eine Vielzahl von unspezifischen Endonucleasen kann eingesetzt werden, um die DNS zufällig zu spalten, wie das weiter unten ausgeführt wird.

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Die Endsequenzen können durch das Hervorbringen von Oligo-r nucleotidbegrenzungen mit dA an einem Ende und dT am anderen oder mit dG- und dC modifiziert werden, wodurch Restriktionsstellen ohne die Notwendigkeit für spezifische Verbindungssequenzen ausgebildet werden, wenn die Enden verbunden werden.

Der Begriff "Ausdruck" (expression) wird in Erkenntnis der Tatsache verwendet, daß ein Organismus selten, wenn überhaupt, alle seine genetisch vorhandenen Fähigkeiten zu irgendeiner gegebenen Zeit einsetzt. Gerade in relativ einfachen Organismen, wie Bakterien, werden viele Proteine nicht synthetisiert, die die Zelle in der Lage ist zu ' synthetisieren, obgleich sie unter entsprechenden Umweltbedingungen synthetisiert werden können. Wenn das Protein— produkt, das durch ein gegebenes Gen codiert ist, durch den Organismus synthetisiert worden ist, hat das Gen seinen "Ausdruck" gefunden. Wenn das Proteinprodukt nicht hergestellt wird, hat das Gen seinen "Ausdruck" nicht gefunden. Normalerweise wird der "Ausdruck" der Gene in S. coli reguliert, wie das weiter unten allgemein beschrieben wird, in derartiger Weise, daß Proteine^ deren Punktion in einer gegebenen Umgebung nicht nützlich ist, auch nicht synthetisiert werden, und' die Stoffwechselenergie konserviert wird. -..

Die Mittel, mit denen der Gen"ausdruck" in E.coli gesteuert wird, beherrscht man als Resultat extensiver Studien während der letzten zwanzig Jahre, siehe allgemein Hayes, W., The Genetics of Bacteria and their Viruses, 2. Aufl., John Wiley & Sons, Inc., New York (1968) und Watson, J.D., The Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., Benjamin, Menlp Park, Kalifornien (1976). Diese Studien haben gezeigt, daß verschiedene Gene, üblicherweise solche, die zum Codieren von Proteinen dement sprechende Tätigkeiten in der Zelle ausführen, in kontinuierlichen Sequenzen vereinigt gefunden werden. Die Vereinigung wird als Operon bezeichnet.. Alle Gene in dem Operon werden in· der gleichen

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Richtung kopiert, beginnend mit den Codons, die die N-terminale Aminosäure des ersten Proteins in der Sequenz codiert und bis zum C-terminalen Ende des"letzten Proteins in dem Operon. Am Anfang des Operons, unmittelbar am N-terminalen Aminosäurecodon,. gibt es einen Bereich der DNS, der.als Steuerbereich bezeichnet wird und eine Vielzahl von Steuerelementen enthält, einschließlich des Operators, des Promotors und Sequenzen für die ribosomalen Verbindungsstellen. Die Aufgabe dieser Stellen ist es, den "Ausdruck" solcher Gene unter ihrer Steuerung zu gestatten, die für die Erfordernisse des Organismus verantwortlich sind. Zum Beispiel werden solche Gene, die Enzyme codieren, die ausschließlich für die Verwertung von Lactose erforderlich sind, normalerweise nicht in beträchtlichem Maße "ausgedrückt", bevor nicht Lactose oder eines seiner Analoge tatsächlich in dem Medium vorhanden ist. Die Punktionen des Steuerungsbereiches müssen für den "Ausdruck" vorhanden .sein, um die Initiierung des Kopierens (transeript-ion) unddes Übertragens (translation) zu veranlassen. Der "Ausdruck" des ersten Gens in der Sequenz wird in Gang gesetzt durch das Initiieren des Kopierens und des Übertragens an der Position, die die IT-terminale Aminosäure des ersten Proteins des Operons codiert. Der "Ausdruck" jedes Gens abwärts von diesem Punkt wird im weiteren Verlaufe ebenfalls initiiert, zumindest bis ein Endsignal oder ein anderes Operon mit seinem eigenen Steuerungsbereich erreicht ist, der so verschlüsselt ist, daß er auf andere Umweltfaktoren reagiert. Von diesem allgemeinen Schema gibt es im Detail eine Vielzahl von Variationen, wobei der wesentliche Pakt der ist, daß ein Gen, das in einem Procaryoten wie E. coli "ausgedrückt" wird, im Hinblick auf einen Steuerungsbereich mit Kopierinitiationfunktionen und Übertragungsinitiatorfunktionen genau angeordnet sein muß.

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Es wurde gezeigt, daß Gene, die normalerweise nicht Teile eines gegebenen Operons sind, in das Operon eingesetzt und von ihm gesteuert werden können. Die klassische Darstellung erfolgte durch Jacob, F.,"et al. J. Mol. Biol· 13, 704 (1965). In diesem Experiment wurden enzymcocTierende Gene, die in eine Purinbiosynthese einbezogene Enzyme codieren, auf einen Bereich übertragen, der durch das Lactoseoperon gesteuert wurde. Es wurde dann beobachtet, daß der "Ausdruck", des Purinbiosynthese-Enzyms in Abwesenheit von Lactose oder eines Laetoseanalogen unterdruck wurde und auf Umwelteinflüsse, die normalerweise seinen "Ausdruck" ' hervorrufen, nicht wieder erfolgte.

- Zusätzlich zu dem Operatarbereich, der die Initiierung der Kopierung des Gens in Abwärtsrichtung reguliert, existieren bekanntermaßen Codons, die als Stop-Signal wirken und das C-terminale Ende eine gegebenen Proteins anzeigen (Siehe Tabelle 2). Derartige Codons sind als Terminalsignale und ebenfalls als "Unsinn"-(nonsense)codons bekannt, da sie eine Aminosäure nicht normal codieren. Die Herausnahme eines Terminalsignals zwischen strukturellen Genen eines Operons führt zu einem fusionierten Gen, was zur Synthese eines chimeren Proteins führen kann, das aus.zwei Aminosäuresequenzen besteht, die durch benachbarte Gene codiert-und durch^ine Peptidbindung verbunden sind. Derartige chimere Gene werden synthetisiert, wenn Gene fusioniert werden, was durch Benzer, S. und Champe,S. P., Proc. liat .Acad.,Sci.USA 48 , 114 (1962) demonstriert wur.de.

Ein gegebenes Gen wurde isoliert, gereinigt und in einen Transfervektor eingesetzt. Das ganze Verfahren, das als Elonieren des Gens bezeichnet wird, führt zu einer wesentliehen Quantität, Das klonierte Gen wird in einen geeigneten Mikroorganismus übertragen, worin sich das Gen so repliziert, wie sich der Mikroorganismus fortpflanzt, und aus dem das Gen durch übliche Mittel zurückisoliert werden kann. Dadurch

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entsteht eine sich kontinuierlich erneuernde Quelle von Genen für weitere Manipulationen, Modifikationen und Übertragungen auf andere "Vektoren oder Orte innerhalb des gleichen Vektors.

Einen "Ausdruck" erhält man durch Übertragen des klonierten G-ens bei genauer Orientierung und mit Hilfe eines "Ableserahmens" in einen Steuerungsbereich derart, daß das Ablesen durch das procaroytische Gen zu einer Synthese eines chimeren Proteins führt, das die Aminosäuresequenz enthält, die durch das klonierte Gen codiert ist. Eine Vielzahl von Protein-Schneidetechniken kann zur Zerschneidung des chimeren Proteins an einem gewünschten Punkt 'eingesetzt werden, so daß die gewünschte Aminosäuresequenz freigesetzt wird, die dann auf übliche Weise gereinigt wird. "Techniken für den Aufbau eines "Ausdrucks^-Tranfervektors mit dem klonierten Gen in genauer Nebeneinanderstellung mit einem Steuerungsbereich sind beschrieben worden von Polisky, B., et al., Proc.Nat. Acad.Sci. USA J73, 3900 (1976); Itakura, Σ., et al., Science 198 , 1056 (1977); Villa-Komaroff, L., 'et al., Proc. Hat. Acad. Sei. USA, _75, 3727 (1978); Mercereau-Puijalon, 0., et al., Nature ^75, 505 (1978); Chang, A. CY., et al., Nature 275, 617 (1978) und in der US-Patentanmeldung Nr. 933 035 von Kutter, et al., wobei die hier mit eingeschlossene genahnte Anmeldung durch Hinweise gekennzeichnet ist.

Insgesamt erfordert ein Verfahren zur Herstellung eines Säugetierproteins, wie menschliches Pre-Wachstumshormon, mit Hilfe der DNS-Rekombinanttechnik das Klonieren eines Säugetier-Gens. Einmal kloniert,' kann das Gen in bestimmten Mengen produziert werden, unter Einsatz chemischer oder enzymatischer Mittel modifiziert und auf ein "Ausdrucks"-Plasmid übertragen werden. Das klonierte Gen ist ebenso für die Isolierung damit in Beziehung stehender Gene geeignet, oder, wenn ein Fragment kloniert worden ist, für die Isolierung des gesamten Gens unter Einsatz des klonierten

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Gens als Hybridisierungs"fühler". Weiterhin ist,das klonierte Gen bei der Prüfung der Identität oder öer Homologie von unabhängigen Isolaten des gleichen oder mit diesem in Verbindung stehender Gene durch Hybridisierung nützlich. Wegen der Natur des genetischen Codes wird das klonierte Gen, wenn es in den genauen "Ableserahmen" übertragen ist, die Produktion nur auf die Aminosäuresequenz ausrichten, für die es codiert ist und auf keine andere.

Bas klonierte Gen für menschliches Pre-Wachstumshormon ist für eine Vielzahl von Verfahrennützlich. Die Transponierung auf einen "Ausdrucks"-Transfervektor erlaubt die Synthese von Pre-Wachstumshormonen durch einen Wirts-Mikroorganismus, übertragen mit dem Vektor, der das klonierte Gen trägt. · Das Wachstum des transformierten Wirts führt zu einer Synthese des Pre—Wachstumshormons als Teil eines chimeren Proteins. Wenn der procaroytische Teil des chimeren Proteins der Signalteil eines ausgeschiedenen oder anderweitig abgesonderten Wirtsproteins ist, kann die Ausscheidung oder Absonderung erfolgen, wodurch die Stabilität wesentlich vergrößert und "die Reinigung des Pre-Wachstumshormonchimeren erleichtert wird. Zusätzlich wird, wenn der procaroytische Teil kurz ist, die Absonderung von dem procaroytischen Wirt durch die' Pre-Sequenz selbst erleichtert, wenn die Pre— Sequenz in dem procaroytischen Wirt so wirkt, wie sie es in der eucaroytischen Zelle tut. Das klonierte Gen ist weiterhin bei Hybridisierungstechniken für die Isolierung genetischen Materials mit partieller Sequenzhomologie nützlich. Die Wachstumshormon-Gene anderer Säugetierspecies sind in dieser Weise isolierbar, da, abgesehen von ihrem Mangel ,an physiologischer Kreuzaktivität, für die effektive Hybridisierung eine ausreichende Sequenz ähnlich vorkommt. Die Wachstumshormone verschiedener tierischer Species sind für landwirtschaftliche und Veterinäre Zwecke einsetzbar. Das Wachstumshormongen eines individuellen menschlichen Patienten

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Auascheidungsanmeldg. aus APC12IT/221 521(57 5'

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durch die Hybridisierungstechnik isolierbar zwecks Analyse und Behandlung einer spezifischen Wachstumsstörung.

Das klonierte Pre-Wachsturnshormon-Gen kann in einer Vielzahl von Verfahren für die Herstellung von Pre-Wachstumshormon verwendet werden. Pre-Wachstumshormone selbst sind nützlich, da sie durch bekannte enzymatische und chemische-Verfahren in Wachstumshormone selbst umgewandelt "werden können. Beispielsweise kann die Pre-Sequenz durch ein gangbares enzymatisches Verfahren entfernt werden, wie das von Blobel, G.. weiter oben spezifisch für die Entfernung von Signalpeptiden beschrieben wurde.

Ziel der Erfindung . .

Ziel der Erfindung ist es, die bekannten Verfahren zur Pre-Wachstumshormongewinnung weiterzuentwickeln.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt, die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines chimeren Proteins bereitzustellen·

Die Originalquelle des genetischen Materials ist menschliches Tumorgewebe aus der Hypophyse, das operativ gewonnen wurde. Vorzugsweise wird das genetische Material aus den Zellen eines menschlichen Individuums isoliert und eine spezielle erfindungsgeinäße Technik angewandt, das Gen aus dem menschlichen Tumor zu klonieren.

Aus den Zellen wurde Messenger-RHS isoliert und partiell durch Chromatografie und Sedimentation gereinigt. Aktive Fraktionen wurden identifiziert durch ihre Fähigkeit, die Synthese eines Proteins von ca· 200 Aminosäuren in einem

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Aus s ehe i dungs anme 1 dg. aus APC12N/221 52i(57 593 12)

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zellfreien Synthesesystem zu leiten, was durch Gel-Elektrophorese bewiesen werden konnte.

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i Έυ. der isolierten Messenger-EliS (eDFS) wurde. DUS unter Verwendung einer Umkehr-Transkriptase in zwei Eeak- tionszyklen synthetisiert, um zu einer doppelsträngigen eDNS zu gelangen, wie das im Detail weiter unten beschrieben wird. Das -heterogene.Eeaktionsprodukt, bestehend aus Umkehr-Transkriptase und Doppelstrang-DNS wurde naoh Länge durch Gel-Elektrophorese fraktioniert. Pur die weiteren Untersuchungen wurde der Bereich der DNS-Wanderung ausgewählt, der bei etwa.. 800 Basenpaaren in der Länge lag. Der Hauptteil der cDNS mit 800 Basenpaaren wurde für das Codieren des Wachstumshormons eingesetzt, indem er mit den Restriktionsendonucleasen PvuII und" BgIII getrennt behandelt wurde. Es ist-bekannt, daß PvuII Wachstumshormon cDIfS zerschneidet, wobei man ein ca. 495-Basenpaarfragment erhält. Yon BgIII ist bekannt, daß es eine.Schnittstelle innerhalb dieses Fragments hat.λ Nach der Zerschneidung und Fraktionierung der erwarteten Teile erhält man die Charakteristik der Wachstumshormon-cDNS. .

Die nicht zerschnittene, heterogene, doppelsträngigecDNS von annähernd 800 Basenpaaren Länge wurde behandelt, um spezifische Yerbinder-Gligonucleotid&s- Sequenzen an jedem Ende zu erzeugen, um den Einsatz an einer Stelle gleicher Eestriktionsspezifität eines? Transfervektor$ zu erleichtern.

Zum Klonieren wurde ein Transf.ervektor ausgewählt, der eine gute Selektivität und stabile Eeplikationseigenschaften aufwies. Die behandelte 800-Basenpaar-cDIiS wurde unter Verwendung allgemein üblicher Techniken in einen Transfervektor an einer vorbestimmten.Stelle der Vektor-DNS eingesetzt, um einen Rekombinant-Transfervektor zu bilden.Wirt-Mikroorganismuszellen wurden mit.dem Eekombinantvektor transformiert. Entsprechend den Kriterien für den Einsatz an der vorher- bestimmten Stelle wurden Transformierungsmittel ausgewählt.

+) komplementäre

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Einzelne Kolonien, jede von einer einzeln transformierten Mikroorganismuszelle herrührend, wurden aufgenommen und in individuellen Kulturen wachsen gelassen, um die Keplikation der Eekombinant-Transfervektor-DNS-Klone zu ermöglichen. Dann wurde die..Transfervektor-DNS isoliert und über Platten-Gel-Elektrophoresereihen laufen gelassen, um Transfer-Yektoren korrekter Größe herauszusuchen und Defekte sowie Fehlstellen zu eliminieren. Die Kolonien, die die Rekombinant-Transfervektor-DNS von entsprechender Größe lieferten, ließ man in größeren Einzelkulturen wachsen, um die Transfervektor-DNS zu isolieren und die DNS der Restriktions-Enzymanalyse auszusetzen. Die in den Transfervektor eingesetzte DNS kann für jedes Klon identifiziert werden durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym, das für die Zerschneidung an der. Einsatzstelle verwendet wird, sowie durch die Enzyme PvuII und BgjL.II, mit denen die Wachstmnshormon-cDNS ein Fragment von charakteristischer Größe ergibt. Ein Klon, das alle" Erfordernisse zufriedenstellend erfüllt, wurde für die genaue Identifizierung der Nucieotidsaquenz des klonierten Pre-Wachstumshormonsgens ausgewählt und für die Übertragung auf ein entsprechendes "Ausdrucks"-Plasmid.

Wachstumshormon wird bei normalen Individuen ausschließlich im Hypo-physenvorderlappen synthetisiert. Im Prinzip konnte das Gen für das Wachstum shormon aus Gewebe isoliert werden. Allerdings gibt es im menschlichen Wachstumshormongen Zwischensequenzen, die in der normalen eucaroytischen Umgebung kopiert und dann aus dem Prozeß ausgeschleust werden, um die "reife" mRNS ohne .Zwischensequenzen zu ergeben. Eine Desoxynucleotidsequenz, die in eine procaroytische Zelle, wie ein Bakterium, übetragbar ist, "kann.solche Zwischensequenzen nicht enthalten, da man von procaroytischen Zellen erwartet, daß sie solche Sequenzen

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übertragen und so zu einem Anwachsen an unerwünschtem Proteinprodukt-führen. -Als praktisches Erfordernis muß ··- ----.^ daher die De soxynucleot idsequenz von der Messenger-RNS abgeleitet werden, die aus aktiv, das Wachstumshormon synthetisierenden Zellen isoliert wird.

Die Hauptzüge für das Klonieren einer cDNS, die ein gegebenes Protein codiert, ausgehend von der eurocaroytischen Messenger-ENS, wurde von Ullrich, A., weiter oben, und Seeburg, P.H., et al., ebenfalls weiter oben schon zitiert, beschrieben. Kurz zusammengefaßt besteht das Verfahren aus folgenden Schritten: 1) Isolieren der polyadenylierten ENS, im wesentlichen nicht abgebaut, aus differenzierten Zellen oder Gewebe, die das gewünschte Protein produzieren, 2) Synthese eines DNS-Stranges, komplementär in Basen-Sequenzen zur isolierten ENS unter Verwendung von Umkehr-Transkriptase und Erhalten eines ENS-DNS-Hybrids, 3) selektiver Abbau des BNS-Teiles des Hybrids unter Zurückbleiben einer einzelsträngigen oDNS, 4) Synthese der zu der einzelsträngigen cDNS komplementären DNS zwecks Ausbildung einer doppelsträngigen cDNS, 5) Fraktionieren der doppelsträngigen cDNS, um Moleküle in der gewünschten Größenordnung anzureichern, 6) Herstellung eines ausgewählten Transfervektors für die Einpflanzung der cDNS, 7) kovalentes Verbinden der cDNS mit dem Transfervektor unter Verwendung von. DNS-Ligase, um zu einem Eekombinant-Transfervektor zu.· gelangen und 8) Eeplikation des gewünschten Eekombinant-Transfervektors durch Transformation, Selektion und Wachstum eines geeigneten Wirts-Mikroorganismus-Stammes.

Hypophysenzellen können entweder aus menschlichen Hypophysenlappen erhalten werden durch transphenoidale Hype physektoiaie oder aus einer in Kultur aufgezogenen menschlichen Hypophysen-Tumorzelle. Die aus einer der beiden Quellen

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isolierte ENS'wird partiell gereinigt^ um die Endausbeute zu-"-erhöhen und- als Schablone für die Kopierung in die . cDNS eingesetzt. Die Partiaireinigung kann eine Sedimentation in einem Saocharosegradienten sein, um die entweder zu kleine oder zu große DNS zu entfernen. Zusätzlich

"kann eine Reinigung"durch: Chromatografie Über SligodT-Zellulose erfolgen, um die polyadenylierte SHS zu isolieren, die. die Hauptform der Messenger-KNS in eurocaroytischen Zellen darstellt.

Partiell gereinigte Mess eng er-MS kann als Schablone für den Aufbau von cDNS unter Verwendung des Enzyms Umkehr— Transkriptase verwendet werden. Die Bildung von doppelsträngiger· eDNS-unter Verwendung von Umkehr-Transkriptase. in Verbindung mit Sl Nuklease und bekannter Trenntechnik wurde bereits vorher beschrieben, (siehe Ullrich, A, et al* Sciene 196, 1313 (1977) und Seeburg, P.H. et /al., Nature 270, 486 (1977).) Das resultierende cDNS-Produkt ist in der Länge heterodispers. Wenn die Nucleotidsequenz der zu klonierenden cDNS bekannt oder innerhalb vernünftiger wahrscheinlicher Grenzen vorhersehbar ist, und wenn die Restriktionsstellen ziemlich dicht an Anfang und Ende des zu klonierenden Gens angeordnet werden können, sind geeignete Restriktionsenzyme einsetzbar, um das gewünschte cDNS-Produkt in homogener Länge und getrennt von Verunreinigungen unterschiedlicher Sequenzen wiederzugeben. Es ist klar, daß eine derartige Nucleotidseauenzinformation für Gene wie menschliches Pre-Wachstumshorm^inicht brauchbar ist, die vorher nicht isoliert und gereinigt worden sind, ausgenommen sind gewisse Ausnahme- und Zufallsumstände. Daher müssen alle späteren Schritte generell mit dem heterogenen cDNS-Produkt durchgeführt werden.

Hinreichende Informationen hinsichtlich des Teils der Nucleotidsequenz der menschlichen Wachstumshornf-cDNS sind

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aus bekannten Daten der US-Patentanmeldung Ser.Nr. 897 7i~ von Goodmann et al. zu entnehmen, um die Identifikation der Unterfragmente der Pre-Wachstumshormon-Gens zu ermöglichen, wie das weiter oben beschrieben wurde. Weger der bekannten Anzahl von Aminosäuren in menschlichem Wachstumshormon, wurde die ungefähre Länge der erwünschten c33J2 auf 800 Basenpaare geschätzt. Bei doppelsträngiger cDNS , deren Gel-Elektrophorese-Beweglichkeit etwa 800 Basenpaaren entspricht, wurde gefunden, daß sie nach der Spaltung-mit_^den-Ee striktionsenzymen PvuII und BgJJI vorwiegend Wachstumshormon'-".codierende Sequenzen enthält. Die Übertragung von cDNS auf einen DNS-Transfervektor ksrr an irgendeiner zufälligen Stelle auf'den Yektor erfolg==-, bewirkt durch einen, einzelnen Endonuclease-Stoß, verbunfLsr mit der Anknüpfung der cDNS durch DNS-ligasekatalysiertes Verbinden der glaiten Enden. (Sgaramelle, V. et al, Prcc. Nat.Acad.Sci. USA _67, 1468 (i970).-_!Die Selektion wird ts. durch wesentlich vereinfacht, und die Ausbeuten werden erhöht durch Verwendung einer spezifischen Einsatzstelle, deren Anordnung im Transfervektor bekannt ist sowie auri die Behandlung der cDNS zur Erhöhung der Einsatzspeziii~tr„ In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein fervektor mit einer einzelnen Restriktionsstelle die mit einem Markierungs-Gen versehen ist. Die Plasmid-DKS wird mit der entsprechenden Έ.βstriktions-Endonuclease zerschnitten. Das Verbinden der Enden der cDNS mit den Enden der offenen Piasmid-DNS ' führt zur Bil^n eines Eekombinant-Plasmids mit derlan der Restriktion??"=—-eingesetzten cDNS, das Markierungs-Gen wirkungsvoll u""5-~ brechend und dadurch zum Verlust der Punktion des Mar'ri— rungs-Gens. Beispielsweise enthält das Plasmid pBR32- :--'- einzige Hindlll-Restriktionsstelle, die in dem Beschli^-?"-des Gens für.die Tetracyclinresistenz angeordnet ist.

+) ringförmigen

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E. coli -Zellen, die durch pBR322 transformiert wurden,

..sind in der Lage, in der Gegenwart von 20/ig/ml Tetracyclin im Wachstumsmedium zu wachsen und sich zu teilen. Im Gegensatz dazu werden nicht-transformierte Zellen unter gleichen Bedingungen abgetötet. Die durch Rekombinant pBR322 transformierten. -Zellen,_:die,einen Einsatz an der Hindlll- Stels enthalten, sind nicht in der Lage, in der Gegenwart von 20/ug/ml Tetracyclin zu wachsen und sich zu teilen. Das Plasmid pBR322 trägt auch ein Gen, das die Ampieillinre-

- sistenz' verleiht.-Die:-Verbindung dieser beiden genetischen Kennzeichen ermöglicht die Selektion von transformierten Zellen aus nicht—transformierten durch Wachstum der ersteren in Gegenv/art von Ampicillin und Selektion der derart transformierten durch Jiicht-Rekombinänt-pBE322 aus Rekombi-

. nant-pBR322 durch Wachstum nur der ersteren in Gegenwart von Tetracyclin.

Die Einsatzspezifität und die Ausbeute an HindIII-SchnittpBR322 wird noch erhöht, wenn HindiII-Yerbindungsoligonucleotide an den Enden der heterogenen cDNS angesetzt werden, siehe Scheller, R.H., et al., weiter oben zitiert. Weiterhin werden liebenreaktionen bei der Bildung des Re-.kombinant—Transfervektors,wie Ringschluß ohne Einsatz der cDWS. oder D linearisierung, wesentlich durch Vorbehandlung der Enden der Restriktionsschnitt-Transfervektor—DNS vermindert, und zwar durch Entfernung der 5'-Terminal-Phosphatgruppen.· Das wird von Shine in der gleichfalls anhängigen US-Patentanmeldung Ser.Ur. 898 887 beschrieben. In Kombination eingesetzt, ermöglichen die beschriebenen Techniken eine absolute .und relative Ausbeuteerhöhung an gewünschten Rekombinant-Transfervektoren.

Bei früheren Klonierungsstudien wurde die cDNS aus Messenger-RNS synthetisiert, die aus vereinigten Zellextrakten verschiedener Individuen herrührte. Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, ein kloniertes Gen von einem einzigen Individuum

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zu erhalten. Die Technik verbindet Verringerungen der Größe und des Reaktionsvolumens miteinander., "bemüht sich-darum, das Endprodukt nicht zu zerstören und die Träger-DNS zu eliminieren. Letzterer Vorteil verbessert überraschenderweise die Gesamtausbeute und den Wirkungsgrad der verschiedenen, in diesem Verfahren benutzten enzymkataly- -sierten"^TRakt±Onen. Die Messenger-RNS "wird aus einzelnen^ ' Hypophysentumoren nach den entsprechend beschriebenen Verfahren isoliert (Seeburg, et al., weiter oben zitiert), Die Säulenchromatografie-Schritte können in schmalen Glasröhrchen mit herabgezogener Spitze, zum Beispiel in Pasteur-Pipetten durchgeführt werden. Die Reinigung zur Proteinentfernung kann nach irgendeiner der geeigneten Phasentrenntechniken durchgeführt werden, wie die Phenolextraktion, vorzugsweise durch Extraktion mit chloroformgesättigtem Phenol. Die Eonzentrierung der Nucleinsäuren durch Fällung mit Alkohol bei niederen Temperaturen, vorzugsweise durch Äthanolfällung bei - 70⁰C, kann vollständig erfolgen. Sowohl die Extraktion als auch die Fällung können in einem einzigen Röhrchen ausgeführt werden, vorzugsweise in einem konischen Plastik-Zentrifugenröhrchen von.ein bis zwei ml Gesamtvolumen.

Auch Enzymreaktionen wie die Behandlung mit Umkehr-Transkriptase können in dem gleichen kleinen Reaktionsrohrchen durchgeführt werden. Synthesegrad- und-umfang an einzelsträngiger und doppelsträngiger cDNS werden im allgemeinen · durch Einbeziehung eines radioaktiv markierten Atoms in die entstandene cDNA bestimmt. Ein geeignetes Isotop ist /J 'S] an der alpha-Position eines der Vorläufer des Nucleosidtriphosphats, zum Beispiel oZ/-³²P-dCTP. Die radioaktive Markierung gestattet außerdem eine entsprechende Beobachtung des cDNS-Produktes während des Durchgangs durch die Säulen und auf dem Elektrophorese-Gel. Wo es erforderlich ist,

T(L

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eine ganze Reihe von Säulenchromatografie-Fraktionen zu beobachten, beispielsweise nach der Chromatrografie bei der Entfernung nichtreagierter Ausgangsprodukte von der Reaktion mit Umkehr3!ranskriptase₃ ist am zweckmäßigsten eine Eadioassay durchzuführen, wobei das Eeaktionsprodukt nicht zerstört wird. In dem vorliegenden Verfahren werden die Fraktionen, die in den-kleinen Plastik-Röhrchen, wie ~^: .oben beschrieben, gesammelt werden, dicht verschlossen. Die Röhrchen werden dann in ScintiOationsampullen ohne Scintillationsflüssigkeit gesteckt. Die sich ergebende.

-Cerenkov-Strahlung kann mit dem entsprechenden Instrumentarium gemessen werden.

Arbeitsweisen mit kleinen DNS-Mengen werden üblicherweise mit Träger-DNS durchgeführt, die dem Gemisch zugegeben werden. Grundlage für die Verwendung von Träger-DNS ist die Verbesserung der Rückgewinnung von gewünschter DNS, die durch unspezifische Adsorption an den Behälterwänden zurückgehalten wird oder wo durch Mängel bei der DNS-Pällung und dergleichen Verluste auftreten. Angemessene DNS-Ausbeuten werden in Abwesenheit von der hinzugesetzten Träger-DNS erhalten, die selbst bei Nanogramm-Mengen an DNS erhältlich sind. Das Weglassen von Träger-DNS bringt zwei entscheidende Vorteile im vorliegenden Verfahren. Erstens ist keine unspezifische DNS vorhanden, die zu unspezifischen Reaktionsprodukten bei den enzymkatalysierten Reaktionen führen könnte. Zweitens ist keine verunreinigende DNS vorhanden, die zu unspezifischen Rekombinant-Transfervektbren führen könnte.

Unter kombinierter Verwendung der beschriebenen Techniken ist es möglich, die Desoxynucleotidsequenz zu klonieren, die menschliches Pre-Wachstumshormon aus der gypophyse eines einzelnen menschlichen Patienten codiert.

Ausführung sbelfpiel

In den folgenden Beispielen werden die Isolierungs- und

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- 23 -

Reinigungsverfahren detaillieft beschrieben. Die Identitätsprüfung des klonierten Gens erfolgt durch Kucleotid-

Sequenzanalyse.

Beispiel 1

Verfahren zum Klonieren eines Gens₃ das menschliches Pre— Wachstumshormon aus dem Gewebe eines einzelnen Individuums codiert.

Die Hypophysen von sechs menschlichen Patienten mit Hypophysentumoren wurden durch transphenoidale Hypophy— sektomie entfernt, eingefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Im folgenden Verfahren wurde jede Hypophyse getrennt behandelt, alle sechs wurden jedoch gleichzeitig aufgearbeitet. Die Drüsen wurden aufgetaut und in 4 M Guanidinthiοcyanat, das auf pH 5,0 abgepuffertes 1 M Mercaptoathanol enthält, bei 4° C homogenisiert. Jedes Homogenisat wurde mit 1,2 ml.5,7 M CsCE₅ enthaltend 10 mM ADTE₃ überschichtet und 18 Stunden bei 37 000 U/min in einem SY/ 50,1 Rotor einer Beckmann Ultrazentrifuge bei 15° C zentrifugiert. Dabei setzte sich die RNS am Boden des Röhrchens ab. Die weitere Reinigung der Messenger-RNS unter Verwendung einer Oligo-dT-Cellulosesäule wurde im wesentlichen durchgeführt, wie es bei Ullrich, A., et al. und Seeburg, P.H., et al., beide weiter oben zitiert, beschrieben wurde. Die -biologische Aktivität der 'partiell gereinigten Messenger-RNS wurde mittels ihrer Fähigkeit gemessen, den Einschluß von £~^^ Sy^7-Me"thionin in das Wachstumshormon zu lenken, in einem zellfreien Proteinsynthesesystem aus V/eizenkeimen. Die experimentellen Bedingungen für den Test wurden im wesentlichen von Martial, J.H., et al., Proc.Nat.Acad. Sei. USA 7±, 1816 (1977) beschrieben.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse eines solchen Tests. Die radioaktiven Proteinprodukte wurden durch Gel-Elektrophorese

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auf 12_?5 % Polyacrylamid-G-el, das 0,1 _# Natriumdodecylsutfat enthielt, 4 Stunden "bei 20 mA fraktioniert. Die radioaktiven Proteinbanden wurden durch Autoradiografie bestimmt. Band (a) zeigt £" c7-^maI>kierte Markierungsproteine des lakteriophagen T4, die als G-rößenmarkierer • eingesetzt "wurden. -Die^: B and en---1—6 zeigen die Übertragungsprodukte der oligo-dT-zellulosegereinigten Messenger-RNS der einzelnen Tumore. Es kann daraus entnommen werden₃ daß "bei den Tumoren 1-5 das Pre-Wachstumshormon den Hauptbestandteildes zellfreien synthetischen Produktes darstellt'.

Die RNS-Chargen, die am meisten mit dem Wachstumshormon zellfrei übertragener Aktivität angereichert waren (Beispiel in den Banden 2, 4 und 5)^-wurden gesammelt und als-Schablone für die Synthese der doppelsträngigen cDNS eingesetzt . Alle Reaktionsschritte wurden in 1,5 ml fassenden Pl-astik-Zentrifugenröhrchen durchgeführt. Die erste Umkehr-

itrt

transkriptase-katalytisfeae Reaktion., die zu einem RNS-DNS-Hybrid führt, wurde in einem Reaktionsgemisch durchgeführt, das 68 /ul der RNS-Charge mit etwa 13/ug RNS darin enthielt, sowie Togel-Myeloblastosisvirus-Umkehrtranskriptase, 4 Wl . des unverdünnten Präparats, wie es vom Office of Program Recources and Logistic, Viral Cancer Program, Viral Oncology, Division of Cancer Cause and Prevention, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland geliefert wird und 3.2 All eines Reaktionsgemisches, das 10 ul "Umkehr-Transkriptasepuffer" (0,5 M Tris-HCß pH 8,3; 1 mM ÄDTE; 70 mH -^gCl₂; 200 mM KCfc), 1 yul 2-Mercaptoäthanol 1M, 5 /Ul oligo-dT . 1 yug/ml, jeweils 5 yul dATP, dC-TP und TTP (20 mM Vorratslösung),

^ dCTP 20 mM Vorratslösung enthielt und ungefähr 2 χ 10⁶cpm (Zählstöße pro Minute)^- -/~^²P_7-dCTP, direkt aufgelöst in dem Reaktionsgemisch.

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Die Reaktion wurde unter Bedingungen ausgeführt, die im wesentlichen-von Seeburg, P.H. et al., weiter oben zitiert, "beschrieben worden sind. Das Inkubationsgemisch wurde mit chloroformgesättigtem Phenol im gleichen Reaktionsröhrchen extrahiert, mit Äthanol gefällt, die Röhrchen ^;dann bei -70° C-für-wenigstens 15 Minuten stehen gelassen und anschließend zentrifugiert.

Das gefällte RNS-DNS-Hybrid wurde in 0,1 N NaOH, 125/tu. 5 mM 'KDTS gelöst öund bei 68° σ für eine halbe Stunde inkubiert, um die selektive alkalische Hydrolyse der RNS zu er--möglichen. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine kleine Sephadex G 50-Säule in einer Pasteurpipette gegeben und mit einer Pufferlösung aus JO mM Tris (pH 7,5) und 0,5 mM ÄDTE eluiert. Die radioaktive einzelsträngige DNS wurde in einer einzigen 2-Tropfen-Fraktion zurückgewonnen und in einem Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Die Praasktionsröhrchen wurden verschlossen, in Scintillationsampullen gesteckt und in einem Plüssigkeits-Scintillationszähler zwecks Bestimmung der Cerenko^-Strahlung gezählt.

Die Synthese der doppelsträngigen cDNS aus dem einzelsträngigen cDNS—Produkt der vorher beschriebenen Reaktionschritte wurde über eine Umkehr-Transkriptase katalysierte Reaktion durchgeführt. Die Reaktion wurde mit einem Gesamtvolumen von 51 -jtil, durchgeführt. Diese enthielten 30 jol an einzelsträngiger DNS-Lösung, 3,5 /ul Enzymlösung und 17,5 /il eines Reaktionsgemisches folgender Zusammensetzung: 96" /ul Wasser, 60 pi Umkehr-Transkriptase-Puffer, 6 μΐ 1M 2-Mercaptoäthanol, 15 jul. 20 mM dATP,15 μΐ 2OmM dGTP, 1§ yul 2OmM TTP, 3 μΐ 20ώΜ dCTP, etwa.6x10⁸ Zählstöße pro Minute^ oC - /~³²P_7-dCTP, direkt aufgelöst in dem Reaktionsgemisch. Die Reaktion ließ man 90 Minuten bei 47° G vonstatten gehen. Nach der Beendi-. gung wurde das Protein durch Extraktion und Sephadex G-5'0-Chromatografie entfernt, wie weiter oben beschrieben und anschließend erfolgt die ebenfalls beschriebene Äthanolfällung.

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Zur Bestätigung der Tatsache,-daß cDNA, die das Wachstumshormon codiert, ein zahlreich vorkommender Teil in der Charge war, wurde ein Teil der doppelsträngigen cDNS-Charge mit Eestriktions-Endonuclease gespalten und durch Polyacrylamid (4,5 ?&)-Gel^Elektröphorese analysiert (Fig· 2) Die Streifen (e) und (k) der Pig. 2 zeigen die Banden der radioaktivemarkierten Bakteriophagen-fd-DNS, gespalten durch die Endonuclease Hpa H₃ Streifen (c) und Haelll, Streifen (k). Die Streifen (a) und (b) zeigen die ungespaltene doppelsträngige cDNS. Die Streifen (d) bis Q) zeigen die DNS, gespalten durch: Streifen (d) PstI plus BGlII; Streifen (e) PvuII» Streifen (f) PvuII plus BrStII; Streifen (g) Hinf plus Sma I; Streifen (h) Haell^; Streifen (i) PvuII und Streifen Q) Haelll.

Die beobachteten Banden waren die erwarteten der cDNS, komplementär zu menschlicher Wachstumshormon-mENS, basierend auf der Struktur eines vorherklonierten 550 Basenpaar-Fragmentes menschlichen'Wachstumshormons, das in der US-Patentanmeldung Ser.Nr. 897 710, auf die bereits Bezug genommen wurde, beschrieben wurde. Diese Daten bestätigen die Tatsache, daß die vorherrschende cDNS tatsächlich komplementär zu menschlicher Wachstumshormon-Messenger-HliS ist.

Die resultierende doppelsträngige cDNS wurde mit Sl-Nuclease behandelt (wie das im wesentlichen von Ullrich, A. et al. beschrieben wurde, der bereits weiter oben zitiiert wurde), um die "haarnadel"-förmige Struktur in dem ungepaarten Krümmungsbereich zu' spalten. Wie bereits bei den vorigen Schritten folgte der Enzymbehandlung die Extraktion, Chromatografie und Fällung. Die unpaarigen Enden wurden mittels einer DNS-Polymerase I katalysierten Eeaktion ver- ' vollständigt. Das Seaktionsgemisch von 20yul Gesamtvolumen enthielt 60 mM Tris-HCL, pH 7,5; 8 mM MgCl_?; 10 mM 2-Mercaptoäthanol; 1 mM ATP; jeweils 200^1 dATP, dTTP, dGTP

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und dCIP. Das Gemisch wurde mit einerEinheit S. coli DNS-Polymerase I "bei 10° C für 10 Minuten inkubiert. ~ um exonueledLytisch irgendwelche 3'—"hervorstehenden" (protruding) Enden zu entfernen und etwaige 5'-"hervorstehenden" Enden mit den komplementären Sequenzen aufzufüllen."Die Reaktion sollte zu cDHS-Molekülen mit "glatten" Enden führen.

Verbindungs-Oligonucleotide, die für die HindIII-RestriktionsstellensequenZ: spezifisch sind, wurden durch Liga- tion der glatten Enden an die cDETS angefügt. Das erfolgte unter Verwendung von DNS-ligase, wie es von Seeburg, P.H.," et al., weiter oben zitiert, beschrieben wurde. Das Plasmid pBR3.22, Bolivar, P, et al., Gene _2, 95 (1977), wurde als Transfervektor aus den weiter oben beschriebenen Beweggründen gewählt. Die Einsatz- und Screening-Te-chniken sind von Ullrich, A., et al., weiter oben zitiert, beschrieben worden. Ampicillin-resistente Kolonien wurden aufgenommen und auf Platten mit Ampicillin und Tetracyclin übertragen. Es wurden für die weiteren Untersuchungen .solche Kolonien ausgewählt, die Ampicillin-resistent jedoch Tetracyclin-empfindlich waren. Defekte Einsätze, einschließlich Fehlstellen und Verdoppelungen wurden mit Hilfe von .Platten-Gel-Elektrophorese-Durchläufen der mit Hindlllbehandelten Plasmid-DNS bestimmt, die aus Kulturen isoliert wurde, die aus einer einzigen Kolonie transformierter Zellen gewachsen waren und wie oben beschrieben ausgewählt worden sind. Derartige Defekte waren mit Hilfe der Größe der Hindlll-Fragmente leicht bestimmbar. Die klonierte DES wurde als menschliches Pre-Wachstumshormon codierend bestimmt, nachdem sie durch Hindlll-Digestion vom Transfer-Vektor entfernt worden war und weiterer Behandlung mit den Restriktionsenzymen PvuII und BgIII unterworfen wurde. Die abgetrennte cDITS und die Restriktionsfragmente wurden durch Gel-Elektrophorese fraktioniert, wobei die DNS durch

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Fluoreszensfärbung mit ÄthylbromicL"bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind aus Pig. 3 zu entnehmen, wobei die größeren DNS-Fragmente näher am oberen Teil der Fig. angeordnet sind. Streifen (a) ist ein vorher kloniertes 550-Basenpaar-Fragment menschlicher Wachstumshormon-DNS, "beschrieben in US-Anmeldung Ser.TTr. 897 710. Streifen (b) ist die 800-Basenpaar-DNS menschlichen Pre-Wachstumshormons des vorliegenden Beispiels. Die Streifen (c) und (e) sind Beispiele für das 500-Basenpaarfragment, das mit PvuII und BgIII entsprechend gespalten wurde. Die Streifen (d) und (f) sind Beispiele für die 800-Basenpaar-Pre-Wachstumshormon-DNS, die entsprechend mit PvuII und BgIIl gespalten wurde. Die Spaltung durch PvuII führt in beiden Fällen zu Fragmenten ähnlicher GröQey wie das auch wegen der bekannten Anordnung einer PvuII-Stelle nahe am Ende des 500-Basenpaar-Fragmentes erwartet werden konnte. Die Spaltung v&n BgIII. führt zu größeren Fragmenten mit der 800-Basenpaar-DNS als mit dem 550-Basenpaar-Fragment, wie das ebenfalls zu erwarten war. Diese gefundenen Ergebnisse stimmen mit der Identifikation des klonierten 800—Basenpaar-Fragments überein, wie es in menschlichem Wachstumshormon-Gensequenzen enthalten ist. Die klonierte DNS, die als cHGHSOO bezeichnet wurde, wählte man.für die Sequenzanalyse aus.

Beispiel 2

Nucleotid-Sequenzanalyse von" cHGHSOO

Die Nucleotidsequenz von cHGH800 wurde mit Hilfe der Methode von Maxam und Gilbert,· Proc.Nat.Acad.Sci. USA _74j 560 (1977) bestimmt sowie mit der von Sanger, F. et al., Proc.Nat.acad.Sci. USA _7i 5463 (1977). Das Ergebnis ist aus Tabelle 4 zu entnehmen. Das klonierte Gen enthält die gesamte Sequenz, die menschliches Pre-Y/achstumshormon

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codiert, einschließlich eines 29-Basenpaar-Bereiches am 5'-Ende, wahrscheinlich nicht übertragen (untranslated)., sowie einen nicht übertragenen Bereich von 108 Basenpaaren am 3'-Ende (mit Ausnahme des PoIy-A Stückes). (Die 5'j und 3'-Enden sind gekennzeichnet durch Bezugnahmen auf den Strang der cDNS, der in der Sequenz mit- der Wachstumshormon-Messenger-ENS korrespondiert). Einige Ungewißheit bleibt in der Pre-Sequenz nahe am Beginn der Wachstumshormonsequenz. Es ist außerdem festzustellen^ daß die !Tucleotidsequenz der Tabelle 4 eine Aminosäuresequenz für das Wachstumshormon ergibt, die leicht von der veröffentlichten Sequenz differiert. Die Aminosäuresequenz, die durch die Nucleotid-Sequenzanalyse störend beeinflußt wird, nähert sich mehr der korrekten an. Die Abweichungen treten bei charakteristischen Aminosäurepaaren auf, wie GIn oder GIu, die weniger leicht durch direktes Aminosäuresequentieren als durch Nueleotidsequentieren charakterisiert werden können. Weiterhin macht die ITucleotid-Sequenzanalyse den Zugang zu vorher nicht zu erhaltenden Informationen möglich, zum Beispiel die wahrscheinliche Aminosäuresequenz der Wachstumshormon-Pre-Sequenz.

Beispiel 3

Aufbau des Pla-smids ptrpED50-HGH

Ein als ptrpED5-1 bezeichnetes Plasmid, Sesrle Res.Lab.j High Wycombe, Bucks, England, wurde modifiziert, um den Einsatz und den "Ausdruck" der klonierten Pre-Wachstumshormon-cDNS zu ermöglichen.Das Plasmid ptrpSD5-1 wurde aus dem Hindlll-Fragment des E.coli-Trypt6phan(trp)operons abgeleitet, übertragen vom BakteriophagenjlptrpE, beschrie-

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"ben von Hopkins, A.S. et al.,· J. Mol. Biol. 107,. 549 (1976), und eingesetzt an der HindiIl-Steile von pBE322, Bolivar, P. et al., Gene 2, 95 (1977)·

Das Plasmid ptrpE 335-1 wurde mit Hindlll gespalten und mit dem Kenow-Fragment der DNS-Polymerase-1 "behandelt, um die einzelsträngigen 5'-Enden zu paaren (Seeburg, P.H. et al, weiter oben zitiert). Dekanucleotid-HjLndlll-Verbinder wurden an die Plasmid—DNS angefügt. Dann wurden die kohäsiven Enden durch Hinlll herausgebildet, und die Plasmid-DlTS wurde durch Sephadex G-100-Chromatografie isoliert. Das ringförmige Plasmid wurde mit Hilfe von T4-DNS-Ligase regeneriert und dazu verwendet, den RR-I-rStamm von S.coli zu transformieren. Das Klone enthaltende Plasmid ptrpED50 wurde durch Selektion nach Ampicillinresistenz isoliert.

Klonierte menschliche Pre-Wachstumshormon-DNS (cIIG-HBOO, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben), wurde an der Hindlll-Stelle. von ptrpED50 eingesetzt. Der Rekombinant-Transfervektor wurde benutzt, um B.coli C1776 zu transformieren. Die Transformanten ^Tirden von Ampicillin enthaltenden Platten ausgewählt. Die aus verschiedenen Klonen isolierte Plasmid—DNS wurde für die korrekte Orientierung des Einsatzes durch Spaltung mit BamHI und Pstl getestet. Die korrekte Orientierung, so daß Codons des Pre-Wachstumshormons in Phase von denen des trp-Qperons gelesen werden können, ist aus der asymmetrischen Anordnung der Pstl-Steile ersichtlich, was zu einem 700-Basenpaar-Fragiaent führt. Eine nicht richtige Orientierung führt zu einem 290-Basenpaar-Pragment. Plasmide mit korrekter Orientierung, als ptrpED5Q-HGH bezeichnet, wurden dann in S.coli trpQEvl. transformiert. . .

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Beispiel 4

"Ausdruck" des menschlichen Wachstumshormons

In dem Plasmid ptrpE 135Q-HGH erfolgt der "Ausdruck" der trpE-· und trpD—Gene unter Tryptophan-Steuerung, so daß die Spiegel an Proteinprodukten, die durch diese Gene codiert werden, von einem Basisspiegel durch die Anwesenheit einer induzierenden Verbindung wie ß-^Indolylacrylsäure angehoben werden.; Man erwartet, daß die Induktion von E.ooli trpOEvl/ptrpED5Q-HGH zu Einern Ansteigen der Produktion des trpE-Gen-Produkts und des trpD-Pre-Wachstumshormon-Pusionsproteins führt. Das letztere umfaßt einen Teil des HH^-Terminalstückes, das trpD-Gen-Produkt, verbunden mit dem menschlichen Pre-Wachstumshormon.

Eine Kultur von E.coli trpOEvl/ptrpED5Q-HGH wurde mit ß-Indolylacrylsäure induziert und 3 ml-Proben davon

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impulsmarkiert mit "2 /iCi C-markierten Aminosäuren für eine konstante Zeit bei verschiedenen Intervallen nach der Induktion. Proben von null bis vier Stunden induzierter Kulturen wurden immungefällt unter Verwendung von Porinaldehyd-behandeltem Staphylococcus aureus, um Antigen-Antikörper-Komplexe zu sammeln, wie es von Martial, J.A. et al., Proc. Nat.Acad.Sci. USA Jh., 1816 (1977) beschrieben wurde. Die Proteine wurden aufgelöst und fraktioniert durch Elektrophorese in Natrium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen. Die Ergebnisse sind aus Pig. 4 zu entnehmen.

Streifen (a) enthält C-markierte Proteine aus mit Bakteriophagen T4 infizierten E.coli-Zellen, die als Größenmarkierungsmittel benutzt wurden. Die breiteren Streifen (b) bis (g) zeigen impulsmarkierte Proteine bei null, 0_}5, 1, 2, 3 und 4 Stunden nach der Induktion. Der breitere Streifen (h) zeigt die immungefällten Proteine von 4 Stunden

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induzierten Kulturen, mit Antiserum gegen menschliches Wachstumshormon.

Der "breitere Streifen (i) zeigt die Immunfällung.der vier Stunden induzierten, impulsmarkierten Proteine mit nichtimmunem Serum. Der breitere Streifen Q) zeigt die Immunfällung von impulsmarkierten, nicht-induzierten Proteinen. Die oberen und unteren Pfeile zeigen entsprechend die Anordnungen der trpE- und der erwarteten trpD-HGB-Pusionsproteine. Die Zahlen auf der linken Seite geben die Molekulargewichte x10 der Markierungsproteine an.

Die Ergebnisse zeigen das Auftreten von trpD-HGH-Protein nach Induktion und seine spezifische Fällung durch Antiserum menschlichen Wachstumshormons. Es tritt auch eine bestimmte Menge von immungefälltem trpE-Protein auf. Da die trpE— und trpD-Proteine normalerweise in einem Komplex assoziiert sind, scheint es so zu sein , daß eine Assoziierung zwischen dem trpD-HGH-Fusionsprotein und dem trpS-Protein eintritt, wobei der trpP'-Teil des Pusionsproteins davon nicht berührt wird. Jedenfalls wird der "Ausdruck" des klonierten menschlichen Pre-Wachstumshormon-Gens in S .coli klar bewiesen.

Die Erfindung wurde zwar mit bestimmten Ausführungsformen beschrieben. Es sollte jedoch klar sein, daß weitere Modifikationen, Yariierungen, Verwendungen oder Adaptionen der vorliegenden Erfindung einschließlich des folgenden .Srfindungsanspruchs mit erfaßt ,werden.

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Tabelle 1

1 10

NHp-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-

^ 20

Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu-His-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-

30 40 .

Glu-Glu-Phe-Glu-Glu-Ala-Tyr-Ile-Prc-Lys--Glu--Gln~Lys--Tyr-

50 Ser-Phe-Leu-Gln-Asn-Pro-Gin-Thr-Ser-Leu-Cys-Phe-Ser-Glu-

60 70

Ser-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-Gln-Gln-lys-

80 Ser- Asn-Leu-Gln- Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-

90 Ser-Try-Leu-Glu-Pro-Val-Glu-Phe-Leu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-

100 100

Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-Gly-Ala-Ser-Asn-Ser-Asp-Val-Tyr-Asp-

120 Leu-Leu-Lys-Asp-Leu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-

130 HO

Arg-Leu-Glu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-Lys-

150 Gln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-Asn-Asp-Asp-

Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr-Cys-Phe-Arg-Lys-

170 180

Asp-Met-Asp-Lys-Yal-Glu-Thr-Phe-Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-

190 191 Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Phe-COOH.

Tabelle 2

DNS=DeSoxyribonuceinsäure A-Adenin

RHS=Ribonucleinsäure T-Thymin

cDITS-vervollständigte DNS G-Guanin

(enzymatisch synthetisiert C-Cytosin

aus einer mRNS-Sequenz) U-Uracil

mRliS=Messenger RNS' ATP-Adenosintriphosphat

dATP=Desoxyadenosintriphosphat TTP-Thymidintriphosphat

dGTP=Desoxyguanosintriphosphat . ÄDTE-AthylendiamintetradCTP=Desoxycytidintriphosphat essigsäure

Tabelle 3

Genetischer Code

Phenylalanin (Phe) TTK

Leucin (Leu) XTY

Isoleucin (lie) ATM

Methionin (Met) ATG

Valin (VaI) GTL

Serin (Ser) QRS

Prolin (Pro) CCL

Threonin (Thr) ACL

Alanin (Ala) GCL

Tyrosin (Tyr) TAK

Terminalsignal TAJ

Terminalsignal TGA

Histidin (His) CAK

Glutamin (Gin) CAJ

Asparagin (Asn) AAK

Lysin (Lys) AAJ

Asparaginsäure (Asp) GAK

Glutaminsäure (GIu) GAJ

Cystein(Cys) TGK

Tryptophan (Try) TGG

Arginin (Arg) Y/GZ

Glycin (GIy) GGL

Schlüssel: Jedes Dreibuchstaben-Desoxynucleotid-Triplet korrespondiert mit einem Trinucleotid der mRNS mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Alle hier aufgeführten DNS-Sequenzen sind solche des Stranges, deren Sequenz mit der Sequenz der mRUS korrespondiert, mit Thymin anstelle von Uracil. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Desoxynucleotidsequenz bilden.

W=C oder A wenn Z A oder G W=C wenn Z C oder T ist Z=A, G, C-oder T wenn WC i Z=A oder G- wenn W A ist QR = TC wenn SA₅ G, C oder QR = AG wenn S T -oder C ist S=A, G, C oder T wenn QR TC L = A, T, C oder G M=A, C oder T

A	= Adenin	oder	C	wenn	Y A	oder G	X T	ist
G	= Guanin	äf					QR	AG ist
T	= Thymin	wenn	Y		C oder T	ist
X	= T	, G, C				oder T wenn
	is	C ist
X	— C	oder	G		wenn
Y	= A.	oder	C	wenn
	x'	oder	G
Y	= A	oder	C
S	= T
J	= A
K	= T

Tabelle A _y

Übertragung von cHGH 800 .

-26 -20

met ala thr gly ser arg thr ser leu leu leu ala phe GG A: G CUG UGG ACA GCU CAC CUA GCU GCA AUG GCU ACA GGC UCC CGG ACG UCC CUG CUC CUG GCU UUU

-10 1 10

gly leu leu cys leu pro trp leu gin glu ala val pro phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe

GGC CUG CUC UGC CUG CCC UGG CUU CAA GAG GCA GUG CCU UUC CCA ACC AUU CCC UUA UCC AGG CUU UUU

20 '" 30

asp asn ala met leu arg ala his arg leu-his gin leu ala phe asp thr tyr gin glu phe glu glu

GAC AAC GCU AUG CUC CGC GCC CAU CGU CUG CAC CAG CUG GCC UUU GAC ACC UAC CAG GAG UUU GAA GAA

40 - 50

ala tyr ile pro lys glu gin lys tyr ser phe leu gin asn pro gin thr ser leu cys phe ser glu

GCC UAU AUC CCA AAG GAA CAG AAG UAU UCA UUC CUG CÄG AAC CCC CAG ACCUCC CUC UGU UUC UCA GAG

60 70

ser ile pro thr pro ser asn arg glu glu thr gin gin lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser

UCU AUU CCG ACA CCC UCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA UCC AAC CUA GAG CUG CUC CGC AUC UCC

80 90 100

leu leu leu ile gin ser trp leu glu pro val gin phe leu arg ser val phe ala asn ser leu val

CUG CUG CUC AUC CAG UCG UGG CUG GAG CCC GUG 'CAG UUC CUC AGG AGU GUC UUC GCC AAC AGC CUG GUG

110 120

tyr gly ala ser asp ser asn val tyr asp leu leu lys asp leu glu glu gly ile gin thr leu met

UAC GGC GCC UCU GAC AGC AAC GUC UAU GAC CUC CUA AAG GAC CUA GAG GAA GGC AUC CAA ACG CUG AUG

Ö .O

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-P <ί	O -P O t>- CD P	O P O
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O P O

P O O

O O P

O O O

O O

O P

P P

O O

O P P

O O

Claims

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Ausscheidungsanmeldg.aus APC12N/221 521 (57 593 12]

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Erfindungsanspruch

1· Verfahren zur Herstellung eines chimepen Proteins mit der Aminosäuresequenz menschlichen Pre-Wachstumshormons als C-Terminalsequenz und eines Teiles eines procaryotischen Proteins als N-Terminalsequenz durch Herstellung eines Expressions-Transfervektors, der eine menschliches Pre-Wachstumshormon codierende,Deoxynucleotidsequenz enthält, Transformieren eines Mikroorga- nismus mit dem Expressions-Transfervektor und Inkubieren des transformierten Mikroorganismus unter- für die Expression geeigneten Bedingungen, gekennzeichnet dadurch,- daß der Expressions-Transfervektor durch Umsetzen einer menschliches. Pre-Wachstumshormon codierenden Deoxynucleotidsequenz mit einem DNS-Molekül hergestellt wurde, das durch Schneiden eines Transfervektors mit einem Restriktionsenzym entstanden ist*
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das DIS-Molekül durch Schneiden von ptrp_ ED 50 mit Hind III-Endonuclease hergestellt wird.

3· Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Pre-Wachstumshormon codierende Deoxynucleotidsequenz folgenden Aufbau hat:

Q^R_22^S-22^W-21^GZ-21^ACL-20^QR-19^S-19^X-18^TY-18^X-17^TY-17^X-16 -Ιδ⁰⁰ -15 -H -13 -12¹ -12 -11^iy-11^i(lK-10 -9 -9

₅ty₁

W₁₆GZ₁₆GCL₁₇CAK₁₈W₁₉GZ₁₉X₂₀TY₂₀CAK₂₁CAJ₂₂X₂₃Ty₂₃GCL₂₄

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Ausscheidungaanmeldg. aus APC12N/221 521 (57 59;

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TTK₄

X₇₆TY₇₆W₇₇GZ₇₇ATM₇₈QR₇₉S₇₉X₈₀TY₈₀X₈₁TY₈₁X₈₂TY₈₂Am₈₃CAJ₈₄ QR₈₅S₈₅TGGX₈₇TY₈₇

Q₀X_1o1Ty_1o1GTL₁Q₂TAK₁₀₃

GGL

₁ Q₄GCI₁ Q₅QR₁ Q₆S₁ ^GAK₁ Q₇QR₁ _QQS^ QgAAK₁ Q₉GTL₁₁

GGL₁2QATM₁₂₁ CAJ₁22ACL₁₃₃X₁ ^TY₁ ^ATGGGI.,^W_{1 2?}GZ₁ ^TY

128^GAJ129^GAK13O^GGL131^QR132^S132^CCL133^W134^GZ134^AGL135

_144145146147

O GAE₁53GAK₁₅₄-GCI₁₅₅X₁₅₆TY₁₅₆X₁

^GGL161^X162^TY162^X163^TY163^TAK164^TGK165^TTK166^167^GZ167^AAJ168

₇₉GTL₁

₁₈₆₁₈₇R₁₈₈S₁₈₈TGK₁₈₉GGL₁₉₀TTk₁₉₁TAG^₃,,worin die Buchstaben folgende Bedeutung haben:

A = Desoxyadenyl G = Desoxyguanyl C = Desoxycytosyl T = Thymidyl J=A oder G K=T oder C

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Ausscheidungaanmeldg. aus APC12U/221 521(57 593

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L=A, TC oder G

M=A, C oder T

X = T. oder C, wenn Y=A oder G, und C, wenn Y=C

oder T;
Y=A, G, C oder T, wenn X = C, und A oder G, wenn X_n = T₅

W = C oder A, wenn Z_n = G oder A,. und C, wenn Z=C oder T;

Z_n = A, G, C oder T, wenn W_n = C, und A oder G, wenn W_n= A; QR_n = TC, wenn S_n= A, G, C oder T, und AG, wenn S_n = T oder C;

S_n = A, G, C oder T, wenn QR_n = TC, und T oder C, wenn

QR_n = AG;

wobei sich die tiefgestellten Zahlen, n, auf die Position in-der Aminosäuresequenz von menschlichem Wachstumshormon beziehen, mit der jedes Triplet in der Aminosäuresequenz korrespondiert und wobei entsprechend dem genetischen Code die Aminosäurepositionen vom Aminoende her numeriert sind.
4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die menschliches Pre-Wachstumshormon codierende Desoxynucleotid-Sequenz folgenden Aufbau hat:

-26 -20

ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC

-10 1

CTG CTC TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GCA GTG CCT TTC CCA

ACC ATT CCC TTA TCC AGG CTT TTT GAC AAC GCT ATG CTC CGC

.20 - 30

GCC CAT CGT CTG CAC CAG CTG GCC' TTT GAC ACC TAC CAG GAG

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40
TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA TTC

50
CTG CAG AAC CGC CAG ACC TCC CTC TGT TTC TCA GAG TCT ATT

60 70

CCG ACA CCC TCC AAC AGG GAG GAA ACA CAA CAG AAA TCC AAC

CTA GAG CTG CTC CGC ATC TCC CTG CTG CTC ATG CAG TCG TGG

90 100

CTG GAG CCC GTG CAG TTC CTC AGG AGT GTC TTC GCC AAC AGC

110

CTG GTG TAC GGC GCC TCT GAC AGC AAC GTC TAT GAC CTC CTA

120

AAG GAC CTA GAG GAA GGC ATC CAA ACG CTG ATG GGG AGG CTG

130 140

GAA GAT GGC AGC CCC CGG ACT GGG CAG ATC TTC AAG CAG ACC

150

TAC AGC AAG TTC GAC ACA AAC TCA CAC AAC GAT GAC GCA CTA

160 170

CTC AAG AAC TAC GGG CGT CTC TAC TGC TTC AGG AAG GAC ATG

180

GAC AAG GTC GAG ACA TTC CTG ATC GTG CAG TGC CGC TCT GTO-

190 191

GAG GGC AGC TGT GGC TTC
5. Verfahren naoh einem der.Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß der MkrοOrganismus in einem Medium inkubiert wurde, das eine die Synthese des procaryotischen Proteins auslösende Verbindung enthält.
6. Verfahren nach Punkt 1 bis 4 oder 5» gekennzeichnet
dadurch, daß der Expressions-Transfervektor einen Teil

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Ausscheidungsanmeldung aus APC12JS/221 521(57

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des trpD-Gens von Escherichia coli für die Expression des chimeren Proteins enthält.

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