DD206393A5

DD206393A5 - Fermentationsverfahren zur herstellung von insbesondere 9-hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd

Info

Publication number: DD206393A5
Application number: DD82241900A
Authority: DD
Inventors: John C Knight; Merle G Wovcha
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1981-07-24
Filing date: 1982-07-23
Publication date: 1984-01-25
Also published as: FR2510138A1; IE53354B1; US4425429A; CH656390A5; IT1158019B; GB2102429B; IT8248847A1; IE821783L; GB2102429A; NL8202849A; DE3225649A1; JPS5856693A; IT8248847A0; HU186868B

Abstract

BESCHRIEBEN WIRD EIN NEUES FERMENTATIONSVERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DES WERTVOLLEN STEROIDZWISCHENPRODUKTS 9-HYDROXY-3-OXO-4,17(20)-PREGNADIEN-20-CARBOXALDEHYD. DIESE VERBINDUNG LAESST SICH BEI DER SYNTHESE WERTVOLLER CORTICOIDE ZUM EINSATZ BRINGEN.

Description

Fermentationsverfahren zur Herstellung von insbesondere 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Aus der US-PS 4 029 549 ist die Vervendung von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4-pregnen-20-carbonsäure [9-Hydroxybisnoracid] bekannt. Dieselbe Mutante dient gemäß der US-PS 4 035 236 zur Herstellung von 9-Hydroxy-4-androsten-3,17-dion [9-Hydroxyandrostendion] bzw. gemäß der US-PS 4 214 051 zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxa-4-pregnen-20-carb'"onsäureinethylester [9-Hydroxybisnoracidmethylester].

Aus der EP-Patentanmeldung 79104372.2 ist ein zweistufiges Fermentationsverfahren zur Herstellung der als Zwischenprodukt bei der Synthese wertvoller Corticoide brauchbaren 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20~ carbonsäure. bekannt. Bei dem bekannten Verfahren er-,. ^ folgt zunächst eine Umwandlung von Sterinen in 3-0xo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure durch Fermentation mit dem Mycobacterium Stamm NRRL B-8054. Danach wird

³^ diese Verbindung durch Inkubation in irgendeinem zur Einführung einer Hydroxylgruppe in 9cc-Stellung befähigten Mikroorganismus in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carbonsäure überführt.

./6

Gegenstand der Erfindung ist demgegenüber ein Fermenta-

tionsverfahren zur Herstellung des neuen wertvollen , Zwischenprodukts 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel

CHO

(1)

Dieses Verfahren wird mit Hilfe einer Mutante von Mycobacterium fortuiturn NRRL B-8119 durchgeführt.

Andererseits läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit Hilfe neuer Boppelmutanten der in der US-PS 4 029 549 genannten Mikroorganismen-Gattungen Arthrobacter,'Bacillus,- Brevibacterium, Corynecacterium, ' Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia , Protaminobacter, Serratia und Streptomyces durchführen. Von den Mikroorganismen dieser Gattungen ist bekannt, daß sie Sterine abbauen* Die wilden Stämme dieser Arten bauen Sterine nicht selektiv zu ein geringes Molekulargewicht aufweisenden Verbindungen, beispielsweise CO-,. + H₉O ab. Diese wilden Stämme.lassen sich gemäß Beispiel 1 der ÜS-PS 4 029 549 in Mutanten, 2.3, Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119, überführen.

hergestellten

Die gemäß Beispiel 1 der US-PS 4 029 Mutanten der genannten Arten lassen sich dann in der im folgenden geschilderten Weise zu Doppelmutanten mutieren. Letztere Mutanten,, beispielsweise M.fortuitum

NRRL B-12433, eignen sich dann zur Durchführung des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens zur Herstellung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I.

Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit 17-Alkylseitenketten und zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(2Q)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnen, erhält man durch Mutation von Mikroorganismen der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Mycobacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und Streptomyces.

Im folgenden wird anhand eines Beispiels die Herstellung einer im Rahmen des erfindungsgemäßen Fermentationsverfahrens einsetzbaren neuen Mutante näher erläutert. Bei dieser Mutante handelt es sich um

M. fortuitum NRRL B-12433. Ähnliche Mutanten von .,anderen Mycobacterium-Arten und anderen Mikroorganismen- ' Gattungen (vgl. oben) erhält man in analoger Weise.

Herstellung einer Mutante, die als Hauptprodukt eines Sterinabbaus 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd bildet.

Mycobacterium fortuitum I¹JRRL 3-8119 wird in einem Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 1 g Hefeextrakt, 5 g Glycerin, 0,1 % (w/v) Tween 80 und destilliert'em Wasser bei einer Temperatur von 31⁰C wachsen gelassen. Das Medium wird durch 20-minütiges Erhitzen in einem Autoklaven unter einem Druck von 103- kPa sterilisiert. Die Zellen werden bis zu einer Dichte von etwa

^öo 5x10 /ml wachsen gelassen und dann auf einem sterilen

j.

0,2 'μπι-Filter gesammelt. Nachdem die Zellen mit einem ^: gleichen Volumen eines sterilen 0,1 M Natriumcitrat-Puffers eines pH-Werts von 5,6 mit 0,1 % Tween 80 gewaschen und dann in dem halben Volumen desselben Puffers resuspendiert wurden, wird N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin in einer Konzentration von 100 μg/ml zugesetzt, worauf die Zellensuspension 1 h bei 31⁰C inkubiert wird. Nun werden die Zellen mit 2 Volumina eines sterilen 0,1 M Kaliumphosphat-Puffers eines pH-Werts von 7 mit 0,1 % Tween 80 gewaschen ,und dann in 1 Volumen desselben Puffers resuspendiert.

Ferner wird ein Medium aus (pro Liter) 8 g Nährbrühe, 5 g NaCl und 5 g Glycerin und destilliertem Wasser zubereitet. Nach Zugabe von Agar in einer Menge von 15 g/l wird das Medium 20 min lang unter einem Druck von 103 kPa einer Autoklavenbehandlung unterworfen und dann in sterile Fetrischaien gegossen. Danach werden die mutierten Zellen auf dem geschilderten Medium gezüchtet. Die auf den Platten gewachsenen Kolonien werden danach- im Rahmen von Versuchsfermentationen auf ihre Fähigkeit zur Umwandlung von Sterinen in 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd getestet. Der Nachweis der gewünschten Verbindung erfolgt durch Dünn-..

Schichtchromatographie von Methylenchloridextrakten der Versuchsfermentationen unter Verwendung von Silikagel und Methylenchlorid/Aceton/Sssigsäure (212/38/1) als Lösungsmittelsystem. Auf diese weise läßt sich die

9-Hydroxy-3-οχο-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt der biologischen umwandlung vcn Sterinen anhäufende Mutante NRRL 3-12433 isolieren. .

Der Schlüssel für die Isolierung einer Mutante entspre-³^ chend der beschriebenen Mutante ist, daß man mit einer

Mutante, z.B. NRRL B-8119, die hinsichtlich des Steroidringabbaus bereits derart blockiert ist, daß sie 9a-Hydroxyandrostendion liefert, beginnt und diesen Mikroorganismus einer zweiten Mutation, die dann einen Ξίη-fluß auf den Sterinseitenkettenabbau besitzt, unterwirft .

Die die geschilderte biologische Umwandlung·herbeifüh-_; rende Mutante unterscheidet sich von ihrer Mutterkultur, beispielsweise Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119, lediglich in ihrer Wirkung auf Steroidmoleküle, In sämtlichen sonstigen Eigenschaften, z.B. der Morphologie und der Chemikalienempfindlichkeit, entspricht sie der Mutterkultur, wenn sie mit dieser nicht sogar identisch ist. Beide M,fortuitum-KuItüren sind säurefeste, nichtbewegliche, nicht-sporenbildende Bazillen, die zur Familie Mycobacteriaceae der Ordnung Actinomycetales gehören. Nach der Klassifizierung von Runyon (vgl. R.H. Runyon in "Med.Clin. North America", Band 43, Seite 273 (1959)) handelt'^s;es sich um ein nicht-chromogenes Mycobacterium der Gruppe IV, d.h. um,ein'bei niedriger Temperatur unter Bildung nicht-pigmentierter Kolonien auf relativ einfachem Medium wachsendes Mycobacterium.

·

Mi.fortuitum NRRL B-8119 und NRRL B-12433 sind in der -DauerSammlung von Northern Regional Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peori.a, Illinois, USA, hinterlegt und auf Anfrage von dieser Hinterlegungsstelle erhältlich.

9-Hydroxy-3-oxo~4,17(20)-pregnadien-2Q-carboxaldehyd der Formel 1 eignet sich als Zwischenprodukt bei der Herstellung wertvoller Corticoide. So kann er beispielsweise zu der entsprechenden Säure 3-Hydroxy-3-

241900 I οχο-4,17(20)-pregnadien-2P-carbonsäure oxidiert und diese dann gemäß den Lehren der EP-Patentanmeldung 79104372.2 in Hydrocortisonacetat überführt werden.

Ausführungsbeiapiele

Die folgenden Beispiele sollen das Fermentationsverfahren gemäß der Erfindung näher erläutern. Sofern nicht anders angegeben, bedeuten sämtliche Angaben "%ⁿ - "Gew. -96". Sämtliche Verhältnisse bei Lösungsmittelgemischen stellen, soweit nicht anders angegeben, "Volumenverhältnisse" dar.

Beispiel

J5 Fermentation von rohem Sitosterin.

Das biologische Umwandlungsmedium bzw. Biotransformationsmedium enthält (pro Liter) 8,0 g Ucon, 5,0 g Cerelose, 3,0 g NH^Cl, 3,0 g CaCO₃, 3,0 g Na,(Citrat)»2H₂0, 2,0 g Tween 80, 1,0g Sojamehl, 0,5 g KH₂PO₄, 0,5 g Harnstoff und 30,0 g rohes Sitosterin in Leitungswasser. Der pH-Wert des Mediums ist auf 7,0 eingestellt. Mit jeweils 100 ml dieses Mediums gefüllte Kolben werden mit 10 ml Saatkulturen von bei 28°C in einem Medium aus (pro Liter) 8,0 g Nährbrühe, 5,0 g Glycerin, 1,0g Hefeextrakt und 1,0g Tween 80 in destilliertem Wasser (pH-Wert: 7,0) gezüchtetem M.fortuitum NRRL B-12433 beimpft. Danach werden die Kulturen 336 h lang bei einer Temperatur von 28^eC auf einem Drehrüttler inkubiert. Nach der Inkubation wird entsprechend Beispiel 3 das Gemisch extrahiert und das Produkt isoliert.

241900 2

l Beispiel 2

Entsprechend Beispiel 1 werden anstelle von Sitosterin andere Sterinsubstrate in roher oder reiner Form, z.B. Sitosterin und/oder Cholesterin und/oder Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.

Beispiel

Isolierung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd aus der M. fortuitum NRRL B-12433-Fermentation.

1200 ml Fermentationsbrühe aus der mit Hilfe von M.fortuitum NRRL B-12433 durchgeführten biologischen Sitosterinumwandlung werden angesäuert und zweimal mit gleichen Volumina Methylenchlorid extrahiert, wobei 29,2 g bzw. 8,9 g Rohextrakt erhalten werden.

Der erste Extrakt wird erneut in Methylenchlorid gelöst, worauf die Lösung zur Entfernung saurer Bestandteile mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung gewaschen wird. Bei Entfernung des Lösungsmittels fallen die restlichen neutralen Komponenten in Form eines braunen Öls (18,6 g) an. Bei dünnschichtchromatographischen und flüssigkeitschromatographischen Untersuchungen erscheinen drei Haupt-UV-Absorptionszonen. Die am wenigsten polare Zone enthält ein Gemisch aus den Methylestern der Formeln

30 CH₃^ ^COOCH

nrn ^nOO ^. nQ £» Ρ» β

241900 2

wobei der Ester der Forme.l B überwiegt. Die am stärksten polare Zone entspricht der 9»22-Dihydroxyverbindung der Formel

CH₂OH

Die Verbindung mittlerer Polarität wird gemäß folgendem Verfahren als 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I identifiziert: Aus einem Vorchromatogramm auf einer kurzen Silikasäule erhält man bei Verwendung von 30 % Ethylacetat enthaltendem Methylenchlorid (als Eluiermittel) eine Fraktion, in der der Aldehyd der Formel I angereichert ist. 3,3 g dieser Fraktion werden sorgfältig auf drei in Reihe angeordneten, vorgepackten Lobar-Silikagelsäulen (Größe B, E.Merck & Co.) rechromatographiert, wobei als Eluiermittel Methylenchlorid mit 20 % Ethylacetat verwendet wird. Aus Ethylacetat/Methylenchlorid erhält man schließlich 1,05 g Aldehyd der Formel I in Form eines farblosen und nadeiförmig kristallisierenden Feststoffs eines Fp von 194 - 212⁰C und einer . optischen Drehung [<x]_D von +96° [c, 1.024; CHCl,].

Eine Elementaranalyse der Verbindung Zoo^iCp*) ^erS^ib'^t folgende Werte:

C H

Berechnet: 77,16 % 8,83 % Gefunden: 77,53 % 8,71 % 35

241900 2

Das Massenspektrum zeigt ein Molekülion bei m/e 342 (Grundpeak) und Hauptfragmentionen bei 324, 309» 295» 191, 136 und 124.

H-Kernresonanz-Spektrum: 1.02 (18-CH₃); 1.36 (19-CH₅);

1.82 (21-CH₃); 5.88 (4-H); 10.04 (CHO) ppm.

IR-Spektrum: '497, 3440 cm"¹ (-0H);

1663 cm" (α,β-ungesättigter Carbonylrest); 1622, 1617 cm"¹ (C=C).

UV-Spektrum: \_m'. 250 mn; (£ = 27 900 in Methanol).

Beispiel 4

Beim Ersatz von Mycobacterium fortuitum NRRL B-8119 im Rahmen des beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von M. fortuitum NRRL B-12433 durch einen sterinabbauenden Mikroorganismus der Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Nocardia, Protaminobacter, Serratia oder Streptomyces erhält man Mikroorganismus-Mutanten, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit C-17-Seitenkette und zur Ansammlung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt (der Fermentation) auszeichnen.

Beispiel 5

Ersetzt man in Beispiel 1 M.fortuitum NRRL B-12433 durch gemäß Beispiel 4 hergestellte Mutanten, erhält man ebenfalls den 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(2G)-pregnadien-20-carboxaldehyd der Formel I.

nr-n λ~ μ λ _ _. __

Claims

PATENTANSPRÜCHE

Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel:

(O

dadurch gekennzeichnet, daß man Mycobacterium fortuitum NRRL B-12433 unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium in Gegenwart eines Steroids mit C-17-Seitenkette züchtet und das gewünschte Produkt gewinnt.
2. ' Verfahren nach Punitt 1, dadurch gekennzeichnet, - daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und/oder Campesterin verwendet.
3'. Fermentationsverfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Punkt 1> dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mutante der Mikroorganismen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacteriuni, Corynebacteriuin, Nocardia, Protaminobacter, Serratia und/oder Streptomyces, die sich durch ihre Fähigkeit

A4

zum selektiven Abbau von Steroiden mit einer C-17-Seitenkette und zur Anhäufung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,i7(20)-pregnadien-20-carboxaldehyd als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnet, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Steroids mit einer C-17-Seitenkette in einem wäßrigen Nährmedium züchtet.
4. Verfahren nach _Punkt. ._: 3 > dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin urfd/oder Campesterin verwendet,
5. Fermentationsverfahren zur Hersteilung einer Verbindung nach Punkt 1» dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mycobacterium-Mutante, die sich durch ihre Fähigkeit zum selektiven Abbau von Steroiden mit einer C-17-Seitenkette und zur Anhäufung von 9-Hydroxy-3-oxo-4,17(20)-pregnadien-2C-carboxaldehyd als Hauptprodukt in der Fermentationsbrühe auszeichnet, unter aeroben Bedingungen in Anwesenheit eines Steroids mit einer C-17-Seitenkette in einem wäßrigen Nährmedium züchtet und das gewünschte Produkt gewinnt.
6. Verfahren nach Punkt 5» dadurch gekennzeichnet, daß man als Steroid Sitosterin, Cholesterin, Stigmasterin und/oder Camnesterin verwendet.