DD213451A1 - Verfahren zur herstellung eines enzympraeparates von bacillus licheniformis - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympraeparates von Bacillus licheniformis, das neben extrazellulaerer Alpha-Amylase und Metalloprotease Beta-1,3-1,4-Glucanase enthaelt u. fuer verschiedene technische.und wissenschaftliche Zwecke, insbesondere zum Abbau von staerkehaltigen Substraten, von Proteinen oder eiweisshaltigen Materialien zu niedermolekularen Verbindungen sowie z. Spaltung von Beta-glycosidischen Verbindungen verwendet werden kann. Die erfindungsgemaess verwendete Bacillus licheniformis-Mutante ZFL-14 wurde in der zentr. Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut fuer Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Jena, unter der Nummer ZIMET 10716 hinterlegt. Sie unterscheidet sich vom Typ-Stamm Bacillus licheniformis ATCC 14580 durch folgende Merkmale: - kein anaerobes Wachstum in Glukosemedium, - kein anaerober Nitratabbau, - keine Verwertung von Citrat, - verminderte NaCl-Toleranz- veraenderte Koloniemorphologie auf Naehr- und Blutagar,- reduzierte. Sporenbildung. Im Fluoreszenz-Antikoerper-Test mit monospezifischen Antisporenseren konnte die Zugehoerigkeit von ZFL-14/ZIMET 10716 zur Species Bacillus licheniformis zweifelsfrei nachgewiesen werden.
Description
239362 7
a) Titel der Erf ladung
Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparat es von Bacillus lichenif ormis
b) Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates von einer Bacillus lic hen if or mis-Mut ante. Das Enzympräparat besteht aus verschiedenen extrazellulären enzymatischen Aktivitäten, von denen neben öd-Ämylase und Metalloprotease ß-1,3-1»4-Glucanase in hohen Konzentrationen nachweisbar ist. Dieses Präparat ist geeignet zum Abbau von Substraten oder Substratgemischen, die aus Stärke, stärkeähnlichen Polysacchariden und/oder eiweißhaltigen Materialien bestehen, zu niedermolekularen Verbindungen. Dabei ist insbesondere die Spaltung von ß-glycosidischen Verbindungen in Glucanen von Interesse. Das Enzympräparat ist für verschiedenartige technische und wissenschaftliche Zwecke verwendbar. Bevorzugt anwendbar ist es für den Abbau von Stärke, Glucanen und Proteinen in ungekeimten Getreidekaryopsen bei deren Verwendung anstelle von Malz in der Brauereiindustrie und für die Herstellung von spaltungsspezifischen Proteasepräparaten als Biochemikalien für Forschung szwecke.
c) Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Biotechnische Verfahren zur Herstellung von Enzympräparaten, die gleichzeitig Aktivitäten für <* -Amylase,glueanabbauende Enzyme und Metalloproteasen enthalten, sind aus der
2 O **< O Il C
O Il C ^
Patentliteratur'bekannt, 2. B, DD-WP 148 891, bzw. Ια dec Erfindungsanmeldungen beschrieben: DD-WP C 12 D/220 223 und DD-WP C 12 IT/229' 307. Als Produzentenstämme solches Enzympräparate werden Vertreter des Genus Bacillus genannt, die nicht der Species Bacillus licheniformis angehören.
Zur Herstellung von c*-Amylase mit Hilfe von Bacillus Iicheniformis sind Verfahren beschrieben, deren Produkte Proteasen als Hebenaktivitäten enthalten (GB-PS 1 296 839, US-PS 3 912 590). Bei der Produktion von alkalischer Protease unter Verwendung von Bacillus licheniformis tritt ct-Amylase als Febenaktivität auf (US-PS 3 623 957).
Der bekannte Stand der Technik ist mit dem Nachteil behaftet, daß zwar Enzympräparate, bestehend aus technisch und wirtschaftlich interessanten Mengen an of-Amylase, ß-Glucanase und- Metalloprotease, von Bacillus subtilis produziert werden, aber die Eigenschaften der oC -Amylase engen die Anwendungsfähigkeit des Präparates ein. Gegenüber von Bacillus subtilis zeichnet sich die von Bacillus licheniformis produzierte o<-Amylase durch eine gute Aktivität und Stabilität bei hohen-pH-Werten, niedrigen EaIzium-Ionen-Konzentrationen und hoher !Temperatur aus.
Bei den genannten Fermentationsverfahren mit Bacillus licheniformis wird (tf'-Amylase mit Proteasen als Febenaktivität bzw. alkalische Protease mit c<-Amylase als Hebenaktivität gebildet. J3-1,3-1,4-Glucanase fehlt ganz oder wird nur in so geringen Mengen gebildet, daß es nicht erwähnenswert wird.
d) Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung eines Bazympraparates mit einer Bacillus lic hen iformis-Mut ante zu entwickeln, das neben oC -Ärnylase und Metalloprotease B-I^-Ij^-Glucanase in wirtschaftlich und technisch interessanten Mengen enthält.
-3- 239 3 62 7
e) Darstellung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Enzympräparat herzustellen, das simultan οζ-Amylase, Metalloprοtease und ß-1,3-1*4-Glueanase enthält. Erfindungsgemäß wird für die Hersteilung eines solchen Enzympräparates die Bacillus licheniformis-Mutante ZFL-14 benutzt.
Der erfindungsgemäße Stamm Bacillus licheniformis ZFL-14 wurde in der zentralen Stammsammlung der DDH, im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDS, Jena, unter der Hummer ZMM? 10 716 hinterlegt und weist folgende Charakteristik auf:
Zellmorphologie: aerobes bewegliches grampositives Stäbchen, Sporulationsrate 15 %t Sporen sind oval und im Zentrum der sporulierenden Zelle gelagert
Koloniemorphologie:
auf Uähragar: durchscheinend, schleimig, glänzend
auf Blutagar: durchscheinend, schleimig, glänzend,
ß-Hämolyse
sog. "Biesenkolonie": Durchmesser 1,3 cm, milchig, feuchtglänzend
auf Glukose-Nitrat-Agar: sehr zart, durchscheinend weiß auf Glukose-Asparagin-Ägar: tropfenförmig, schleimig,
glänzend
auf Tyrosin-Agar: keine Verfärbung
Wachstum in Hährbouillon: Trübung, Bodensatz, keine Hautbildung
kein anaerobes Wachstum in Glukose-Medium Wachstum in UaCl-Bouillon: bis 3 %
Wachstum auf Kartoffelscheiben: massiv, Kolonie beige,
stark gefaltet, schleimig, glänzend
pH in Glukose-Bouillon: 5,2 - 8,7
positive "Reaktionen: Katalase, Amylolyse, Gelatinase, Ca-
seinhydrolyse, !Reduktion von Nitrat zu Nits it, Acetyl -Methyl -C arbinol-Bildung
negative Seaktionen: Lezithinase, Indolbildtmg, Citsat-ver-
westung, Urease, anaerobe Gasbildung aus Nitrat
Fermentationstests
Säurebildung aus: Glukose, Mannose, Galaktose, Fruktose,
Maltose, Trehalose, Saccharose, Mannit, Sorbitol, Hibose
keine Säurebildung aus: Arabinose, Xylose, Laktose, Saffi-
nose, Bhamnose, DuIcitol, Aesculin
Bacillus licheniformis ZFL-14/ZH£ar 10 716 unterscheidet sich in folgenden Merkmalen "7Om Typ-Stamm Bacillus lichenifoiBiis-ATCC 14 580 nach Buchanan, S.S. u. a., Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA, 1974:
- kein anaerobes Wachstum in Glukosemedium,
- kein anaerober Nitratabbau,
- keine Verwertung von Citrat,
- verminderte NaCl-Toleranz,
- veränderte Koloniemorphologie auf Nähr- und Blutagar,
- reduzierte Sporenbildung
Im Fluoreszenz-Antikörper—Test mit monospezifischen Antisporenseren konnte die Zugehörigkeit von ZFL-14/ΖΙΜΞΤ 10 716 zur Species Bacillus licheniformis zweifelsfrei nachgewiesen werden.
Im oralen Test auf akute Toxizität an Wistarratten wurde bakterien- und enzymhaltige Kulturlösung bis zur Dosierungsgrenze (20 ml Kulturlösung/kg Körpermasse) ohne toxische Wirkung vertragen.
Die Aufbewahrung des Stammes erfolgt in Form von Sporen.
H ι π
Bacillus licheniformis ZFL-14/ZBaET 10 716 synthetisiert unter Testbedingungen bei Kultivierungszeiten von bis zu 72 Stunden bis zu 7 000 IiS/tnl c*-Amylase, 150 IS/ml ß-1,3 1,4-Glucanase und 50 TS. „/ml Metalloprotease.
c as *
Der durch Chelatbildner (10""2 M EDTA) hemmbare Anteil der
proteolytischen Gesamtatfcivität bei pH 7,0 beträgt 95 %,
f) Äusführungsbeispiele
Die Erfindung soll anhand folgender Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Beispiel 1 KuI turf ührun g
Zellmaterial von Bac. licheniformis Ζ£Χ-14/ΖΙϋ!Γ 10 716 von Gerstenschrotschrägagar-Kulturen (2,5 % Gerstenschrot, 1 % So ο aschrot, 0,5 % Glukose, 2 % 2Ta2HK)2J χ 2 H2O, 3 % Agar, pH ?,0) wird nach 48 Stunden Bebrütung bei' 37 0C entweder direkt oder nach Zwischeapassage auf Nähragar I (Staatl. Institut für Immunpräparate und Hahrmedien, Berlin-Weißensee, DDB) bzw. auf Gerstensebrotagar in 50 ml Vorkulturmedium (YK-Medium) in 500 ml-Hundschüttelkolben überführt und 16 Stunden bei 30 0G geschüttelt (Sundschütteltisch, 200 U/ min).
VK-Medium: 0,1 % Maisstärke 0,5 % Eefeextrakt 2 % Glukose 0,1 % NaCl 0,4 % (HHZ|)2HP0Z{ 0,1 % MgSO4 χ 7 H2O
Mit dieser Yorkultur werden 50 ml Hauptkulturmedium (HK-Medium in 500 ml-Sundschütte!kolben mit einer Zeilsahl von 2 χ 10' koloniebildenden Einheiten/ml beimpft und bei 30 0C unter Schütteln inkubiert.
- 6 - . j < Q *3 C O 1
<£. V> w V^ ^1 aL. /
In einem HE-Medium aus: 1 % Stärke .
3,5 % Weizenfeinschrot 1,5 % Sog aschrot 3,5 % Gerstenfeinschrot 0,3 % Maisquellwasser o,5 % 0,5 % 0,1 %
0,08^5 MgSO4 χ 7 H2O 0,1 % H3PO4
(Weizenf einschrot und Stärke werden ^or dein Sterilisieren mit 2 000 IS Thermamyl bei 70 0C hydrolysiert)
werden nach 72 Stunden 35 TEA„ /ml Metalloprotease,- 130 IS/
c as
ml ß-Glucanase und 5 000 bis 7 000 HS/ml ofc-Amylase produziert.
Beispiel 2 Kulturführung
Bac. licheniformis ZFL-14/ZHSÜ 10 716 wird auf Hähragar I bzw. auf Yersporungsmedium
(0,5 % Glukose, 0,2 % (HE4)^O4, 0,6 % KH2PO4, 1,4 % S^PO4, 0,1 % Na-Citrat χ 5 H2O, 0,1 % L-Glutaminsäure, 0,025 % MgSO4 χ 7 H2O, 0,0025 % MnSO4 χ 7 H2O, 0,004 % FeCl3, 2 % Agar, pH 7,0)
5 bis 7 'Tage bei 37 0C bebrütet. Danach wird das Zellmaterial mit sterilem Aqua dest· abgeschwemmt und 30 Minuten mit Lysozym (400/ug Lysozym/ml Suspension) behandelt. Nach Zwischenwäsche und Hitzeinaktivierung (30 Minuten, 80 0C) werden die Sporen in Saline
(0,585 % NaCl, 0,15 % KH2PO4, 0,84 % Na2HPO4 χ 12 H2O, 0,002 % MgSO4 χ 7 H2O, pH 7,0)
aufgenommen und bei 4 0C aufbewahrt.
Mit dieser Suspension werden Nähragar-I-Platten beimpft, typische Einzelkolonien auf Gerstenschrotagar abgeimpft und wie in Beispiel 1 weitergeführt. Ss werden nach 72 Stunden Aktivitäten -von 35 K /ml Metalloprotease, 130
ι =S» ^J w w 1W
IB/ml ß-Glucanase und 5 000 bis 7 000 IB/ml o^-Amylase erreicht.
Beispiel 3 KuI turf ührun g
Verfahrensweise bis zur Vorkultur wie in Beispiel 1. Die Vorkultur wird 7 Stunden bei 30 0C geschüttelt. Mit einem HK-Medium aus 1 % Lactose
5 % SBP (Stärkehydrolyseprodukt)
1 % Weizenfeinschrot
3 % Sojaschrot
0,5 % Hefeextrakt
0,1 % KCl
0,05% MgSO4
0,5 % Na2HPO4 χ 2 H2O
0,1 % KH2PO4
0,5 % (WLn)0SBO11
konnten in einem 3 1-Ankum-IPermenter bei 1,5 1 51UIIt?olumen bei 30 0C, einer Hührung von 700 U/min und einer Belüftung •von Q^ v"7m nach 36 Stunden 3 000 IS/ml öi-Amylase, 140 IB/ ml ß-Glucanase und 57 TS -/ml Metalloprotease erreicht werden.
Beispiel 4 Xulturf uhr un g
Verfahrensweise bis einschließlich Vorkultur wie in Beispiel 1.
In einem HK-Medium aus: 1 % Stärkehydrolyseprodukt
7 % Weizenfeinschrot.
1,5 % Sojaschrot
0,3 % Maisquellwasser
0,5 % (HH^)2HPO4
0,5 %.Fa2HPO4
0,1 % K2HPO4 .
0,08% MgSO4 χ 7 H2O
konnten in einem 300 1-Fermenter unter Bähren nach 33 Stunden 28 TIiL „/ml erreicht werden
ο as
Claims (3)
- - 8 Srf in dungs an spräche1. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates von Bacillus licheniformis, dadurch gekennzeichnet, daß zur Fermentation Bacillus licheniformis ZFl-14/ΖΙΜΞΤ 10 716 eingesetzt wird, der o(.-Amylase, Metallopro tease und ß-1,3-1,4-Glucanase bildet.
- 2. Verfahren nach Funkt 1·, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufbewahrung des Stammes Bacillus licheniformis ZFL-14/ ZHSD 10 716 in Form von Sporen erfolgt,
- 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentation durch diskontinuierliche Kultivierung in wäßrigen Medien, die polysaccharidhaltige Naturstoffe,wie Getreide, Mais, Sojabohnen, Trockenhefe sowie verschiedene anorganische Salze enthalten, erfolgt.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD23936282A DD213451A1 (de) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | Verfahren zur herstellung eines enzympraeparates von bacillus licheniformis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD23936282A DD213451A1 (de) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | Verfahren zur herstellung eines enzympraeparates von bacillus licheniformis |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD213451A1 true DD213451A1 (de) | 1984-09-12 |
Family
ID=5538198
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD23936282A DD213451A1 (de) | 1982-04-27 | 1982-04-27 | Verfahren zur herstellung eines enzympraeparates von bacillus licheniformis |
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| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD213451A1 (de) |
-
1982
- 1982-04-27 DD DD23936282A patent/DD213451A1/de not_active IP Right Cessation
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