DD214695A1 - Festphasen-immunoassay zur bestimmung von zirkulierenden immunkomplexen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft einen Festphasen- Immunoassay zur Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe aus humanen Seren durch Immobilisierung des die Immunkomplexe bindenden Proteins C1q an siliciumdioxidhaltige Formkoerper mittels Silanhaftmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien. Die derartig hergestellte feste Phase kann durch Anwendung nicht denaturierender Medien zur Abschaltung der gebundenen Immunreaktanten wiederholt im Immunoassay eingesetzt werden. Das Verfahren ist fuer die Bestimmung zirkulierender Immunkomplexe in der Medizin sowie der biowissenschaftlichen Forschung geeignet.
Description
"Festphasen-Immunoassay zur Bestimmung von zirkulierenden Immunkomplexen"
Die Erfindung betrifft einen Festphasen-Iramunoassay zur kovalenten Bindung von Proteinen an siliziunidioxidhaltige Formkörper, vorzugsweise aus Glas, und deren wiederholten Einsatz im (Enzym)-Immunoassay zum empfindlichen und spezifischen Nachweis von Antigenen» Antikörpern, Viren etc., insbesondere von zirkulierenden Immunkomplexen. Der Assay findet Anwendung in der pharmazeutischen Industrie, der Medizin, in der biowissenschaftlichen Forschung sowie der Biotechnologie.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die Anwendung von Iraraunoassays zur spezifischen und sensitiven Bestimmung von Haptenen, Antxgenen und Antikörpern hat in den letzten Dahren sowohl in der klinischen Routinediagnostik als auch der biowissenschaftlichen Forschung große Bedeutung erlangt· Am häufigsten angewandt wird hierbei die Festphasen-Technik (lf:?oiid-phase"-Technik), bei der einer der immunologischen Reaktionspartner an eine feste Phase gebunden ist und somit eine leichte Trennung der gebildeten Antigen-Antikörper· Komplexe von den freien, ungebundenen Reaktionspartnern möglich ist* Hierbei fand das auf K, 0· Gatt und G, W* Tregear (Science 158 (1967),1570) zurückgehende Verfahren der adsorptiven Bindung von Proteinen an feste Kuaststoffphasen (Polystyrol, Polyäthylen, PVC u. a.) eine weite Verbreitung (Übersicht:· 3, E. Herrmann in: Methods in Enzymology 72» (1981) •3. 239).
Nachteile dieses Verfahrens sind:
- Die Beladungsdichte an den Plasteinaterialien und damit die Empfindlichkeit des Imtnunoassays werden durch das jeweilige Kunststoffmaterial und die zur Verfügung stehende Oberfläche limitiert,
- Während der einzelnen Inkubations- und Waschvorgänge ira Immunoassay werden erheblich© Proteinmengen (68 % bei Virusantigenen: 3. E, Herrmann, R. M. Hendry, M. F. Collins: 3. Clin. Microbiol. IO (1979) 210 ; 50 % bei Antikörpern:
W.. Schößler, G. Wegner: Z. med. Labordiagn. im Druck) desorbiert. Derartige Desorptionen beeinflussen wiederum die Empfindlichkeit ungünstig und bestimmen entscheidend den Fehler der Methode.
- Die mit Proteinen beladenen Plastematerialien können nach Ablauf der Immunreaktion nur einmal verwendet werden» ,so daß sehr wertvolle und nur aufwendig zu präparierende Proteine verloren gehen.
- Die Verwendung dieser Plastematerialien als EimveggefäSe stellt bei größeren Probenzahlen in der klinischen Routine einen nicht unerheblichen ökonomischen Faktor dar·
Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, beschrieben verschiedene Autoren den Einsatz chemisch modifizierter (Plaste)materialien zur kovalenten Kopplung von Proteinen im Immunoassay (Obersicht: CU E. Herrmann in: Methods in Enzymology 73 (1981) S. 239). Von derartigen Materialien haben insbesondere Zellulose, Oextrane, Agar und dessen Derivate neben Polyacrylsäure-Derivaten, substituierten Polystyrolen oder Nylon als Matrix Anwendung gefunden· Diese Materialien haben sich jedoch nicht in dem gewünschten Umfang durchsetzen können, einmal, da die. chemischen Modifizierungen mit einem erheblichen Aufwand verbunden sind und zum anderen, da diese Materialien Proteine unspezifisch binden, thermisch und chemisch relativ instabil sind oder mikrobiell leicht angegriffen werden.
Es ist seit einigen Oahren bekannt, daß die OH-Gruppen auf SiOp-Oberflachen als individuelle Zentren für chemische Reaktionen zur Verfugung stehen. Zu den bedeutsamsten Reaktionen gehört hierbei die Umsetzung mit Qrganosilanen, dia unterschiedliche funktionelle Gruppen besitzen· Während die silikofunktionelle Gruppe in Anwesenheit von Wasser auf Glasoberflächen (oder ähnlichen Stoffen) gebunden wird, steht die organofunktionelle Gruppe den üblichen chemischen Reaktionen unter Verwendung von Amino-, Carbonyl-, Carboxy-, Isocyano-, Diazo-, Isothiocyano-, Sulfhydryl- oder Nitroso-Gruppen zur Verfugung, so daß diese siliziuraorganischen Verbindungen als Brücke zwischen dem anorganischen Material und der organischen/biochemischen Verbindung fungieren· Auf diese Art und Weise wurde die kovalente Bindung von Enzymen (R. A. Messing, H. H. Weetall: US-Pat» 3 519 538; R. E. Miller: US-Pat. 3 669 341) sowie Antigenen und Antikörpern (H. H· Weetall, N. Y· Elmirai US-Pat. 3 652 761) beschrieben. Diese Präparate wurden ausschließlich als immobilisierte Enzyme für präparative und analytische Zwecke sowie als immobilisierte Antigene/Antikörper für affinitätschroinatographische Zwecke eingesetzt (s.'hierzu auch: F. danowski, W„ Heyer: Poröse Gläser, Dt· Verlag für Grundstoffindustrie, Leipzig 1982)· In dem US-Patent 3 975 511 beschrieben W. P. Vann und S· Yaverbaum die Kopplung von Antikörpern an poröses Glas und deren Einsatz im Radioifiununoassay zur Bestimmung von Digoxin, Insulin und östriol. Dieses Verfahren hat zwei entscheidende Nachteile, die eine breite Anwendung in der Praxis stark einschränken» wenn nicht gar unmöglich machen. Die Verwendung von porösen Gläsern mit Partikelgrößen zwischen 0,05 und 12 ,ua und einer mittleren Porenweite zwischen 30 A und 1 200 A garantiert zwar eine große Oberfläche, führt aber andererseits zu erheblichen unspezifischen Reaktionen, da Serumproteine fast ausnahmslos in diese Poren eindringen und auf Grund des Molekularsiebeffektes der porössn Gläser nur mit großem Aufwand
vollständig ausgewaschen werden können» Weiterhin bedingt die Verwendung von porösen Gläsern aufwendige und ausgedehnte Zentrifugationsschritte zur Separation der gebundenen Reaktionspartner von den freien sowie zwischen den einzelnen Waschvorgängen. Dieser Aufwand steht einer rationellen·Bestimmung großer Probenzahlen in der klinischen Routine entgegen und schränkt die Möglichkeiten einer (halbautomatischen Bestimmung sehr stark ein. Hinzu kommt, daß die Wiederverwendung der auf diese Art und Weise gebundenen Antikörper durch Spm&tung der gebildeten Immunkomplexe nach Ablauf der Iinmunreaktion mit porösen Gläsern aus den beschriebenen Gründen nicht praktikabel erscheint und bisher noch nicht beschrieben ist. Die Bildung von Iramunkoraplexen stellt einen physiologischen Abwehrmechanismus zur raschen Eliminierung endogener und exogener Antigene im Körper dar· Sei einer Vielzahl von Erkrankungen sind die zirkulierenden Immunkomplexe jedoch in erhöhten Konzentrationen im Serum nachweisbar und können pathologische Folgereaktionen auslösen (s. hierzu: A. N· Theofllopoulos, F.. O* Dixon: Adv. Immunol» 2B (1979) 89). Deshalb erlangt die Bestimmung zirkulierender Iramunkoraplexe in der klinischen Praxis zunehmende Bedeutung (S. EV Ritzmann, D. G, Daniels: Clin. ehem. 28 (1982) 1259). Zu den allgemein als spezifisch anerkannten Methoden gehören solche» die Immunkoaplexe auf Grund ihrer Fähigkeit, CIq- eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente- zu binden, nachweisen. Die hierzu beschriebenen Clq-Festphasen-Immunoassays arbeiten ausschließlich mit an Polystyrol adsorptiv gebundenem CIq (R. H. Zubler et al·: 3. Immunol« 116 (1976) 232; D. A. Pohl et al..: O. immunol· methods 40 (1931) 313; Ch. Wehler et al.: Mol. Immunol. 18 (1981) 157; W. Schößler et al. Biomed. Biochim* Acta im Druck), welches aus den beschriebenen Gründen nur einmal eingesetzt werden kann.
Ss ist das Ziel der Erfindung, einen Festphasen-Imsnunoassay zur Bestimmung zirkulierender Imraunkomplexe zu schaffen, bei dem allgemein zugängliche und billige Trägermateriaiien eingesetzt werden, die sich praktisch nach Durchführung der Bestimmung einfach und schnell zwecks Wiederverwendung regenerieren lassen· Weiterhin wird angestrebt, hierdurch sowohl die Ökonomie als auch die Genauigkeit des Assays entscheidend zu verbessern.
Die Erfindung hat die Aufgabe, einen Festphasen-Iramunoassay auf der Grundlage von siliciuradioxidhaltigem Material, das auf an sich bekannte Weise mit Silanhaftmitteln oberflächenmodifiziert wurde» für die Bestimmung von zirkulierenden Immunkaraplexen.zu schaffen«
Die Aufgabe wird durch ein Festphasen-Itnmunoassay zur Bestimmung von zirkulierenden Imtaunkoroplexsn gelöst» Der erfindungsgemäße Assay ist dadurch gekennzeichnet, daß als feste Phase unlösliche siliziumdioxidhaltige Forakörper eingesetzt werden, die nach an sich bekannter vorheriger chemischer Oberflächenmodifizierung mit Silanhaftraitteln und hetero- oder horaobifunktionelle Reagenzien mit dem Protein CIq beladen werden und daß nach Spaltung der Sindung zwischen CIq und den aufgebrachten Imraunreaktanten durch nicht denaturierende Medien die iait CIq beladenen Formkörper-wieder Im Immunoassay eingesetzt werden. Die als feste Phase verwendeten Formkörper haben eine unterschiedliche geometrische Form, Besonders geeignet sind kugelförmige, planare oder zylindrische Körper, aber auch würfelförmige oder kegelförmige lassen sich verwenden« Das Volumen der Körper beträgt mindestens 0,1 era und sollte 15 cm nicht überschreiten. Die Formkörper sind kompakt oder hohl, wobei Hohlräume geschlossen oder offen sind. Das siliziuradioxidhaltige Material 1st im vvesentli-
chen Glas, wobei die Zusammensetzung unterschiedlich sein kann. »Es muß nur gewährleistet sein» daß sich genügend Si-OH-Gruppen auf der Oberfläche befinden* Die nicht denaturierenden Medien für die Spaltung der Bindung zwischen CIq .und den Itnmunraaktanten setzen sich aus gepufferten Lösungen» die zwischen 0,5 m bis 3 ra NaCl enthalten» zusammen» Die Qberflächenmodifizierung zum Zwecke der Schaffung von Bedingungen für das Eingehen kovalenter 3indungen mit dem Protein CIa erfolgt durch sogenannte Silanhaftmittel wie X-(CH2)--Si^QR
^OR,
wobei R Alkylreste und X Aminogruppen, Diazogruppen u. ä, sind* und durch Umsetzen der verbleibenden Aminogruppe mit hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien wie Glutaraldehyd. An die so aktivierte Glasoberfläche wird erfindungsgemäß das Protein CIq (eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente) in der bekannten Art und Weise gebunden. Wichtig ist hierbei»; daß die erfindungsgeraäß zu verwendenden Glaskörper leicht zu handhaben sind und eine hinreichend große Oberfläche besitzen.
Die so mit dem Protein GIq beladene Glassnatrix wird dann als feste Phase im (Enzym)-Immunoassay eingesetzt» Nach Ablauf der Immunreaktion werden die gebundenen Immunreaktanten durch geeignete, nicht denaturierende Medien wie 1 m NaCl-Losung abgespalten, so daß das kovalent gebundene CIq für einen erneuten Einsatz im Immunoassay zur Verfugung steht.. Der erfindungsgemäße Immunoassay zeichnet sich durch eine Reihe von Vorteilen aus:
- Durch die kovalente Bindung von CIq an Glasoberflächen lassen sich höhere Beladungsschichten erzielen. Diese führen ebenso wie die verbesserte starische Zugänglichkeit des Proteins - bedingt durch den Spacer - zu einer höheren Empfindlichkeit im Immunoassay·
- Durch die Immobilisierung treten keine Desorptionen des Iibmunreaktanten während der Inkubations- und·Waschvorgänge im Immunoassay auf. Dadurch wird der methodische Fehler erheblich reduziert.
- Die unspezifische Bindung an den Glas-Formkörpern ist vernachlässigbar gering·
- Der erfindungsgetnäSe Immunoassay führt zu einer erheblichen' Reduzierung der Kosten in der klinischen Praxis. Einmal, da die als Einweggefäße benutzten Plastemaferialien abgelöst werden und zum anderen, da sich dieser Immunoassay durch Wegfall aufwendiger Zentrifugationsschr.itte leicht automatisieren lassen.
- Durch die kovalente Bindung des Proteins CIq an die Glasoberfläche kann dieses unter Anwendung nicht denaturierender Medien wiederholt im Immunoassay eingesetzt werden. Dadurch wird das nur aufwendig zu präparierende Protein eingespart, was wiederum die Kosten des Assays günstig beeinflußt.
Im folgenden wird die Erfindung durch einige Beispiele erläui? tert·
Ausfuhrungsbeispiele Beispiel 1
In kommerzielle Glasröhrchen (iO ram χ 40 mm) werden je 500 ,ul einer 1 %igen Lösung des Silenhaftmittels N3 1114 (Aiainopropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) in Äthanol/Wasser (.1 : 1) gegeben und 4 Stunden bei höheren Temperaturen (370C - 6O0C) inkubiert* Nach dreimaligem Waschen mit P8S-Puffer, pH 7,4, werden je 500 ,ul 2 %iges Glutaraldehyd in PBS-Fuffer zugegeben und 2 h bei 370C inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen werden die so aktivierten Röhrchen mit je 500 ,ul CIq in PBS-Puffer versetzt und 4h bei Raumtemperatur bebrütet. Nach weiteren Waschvorgängen werden die eventuell noch freien Aldehydgruppen mit 0,2 m Lysinlösung blockiert, Nach wiederholtem Waschen mit 0,01 ia Phosphatpuffer, pH 7*4, der 0,05 a NaCl, 0,05 % Tween 20 und 0,01 % NaN3 enthält, erfolgt die Ausführung des Enzyrairarounoassays (EIA) in der üblichen Art und Weise·
CIq, eine Untereinheit der ersten Komplementkoraponente, bindet zirkulierende Iramunkomplexe bzw. aggregiertes IgG in vivo und in vitro» Zur Erstellung der Eichkurve werden geeignete Verdünnungen (7,8 ng/rnl bis 7,8 ,ug/ml) an aggregiertera IgG mit 0,01 m Phosphat-Puffer, pH 7,4, der 0,05 m NaCl, 1,5 % Tween 20 und 0,02 % NaN3 enthält, hergestellt. Die zu bestimmenden humanen Seren werden zunächst mit 0,2 m EDTA 1 : 3 und nachfolgend rait gleichem Verdünnungspuffer derart verdünnt, daß eine Endverdünnung von 1 : 100 resultiert. Deweils 0,5 ml dieser Serutaverdünnungen bzw. der Standardverdünnungen werden in die beladenen Glasröhrchen überführt und 4 h bei 37°C inkubiert. Nach dreimaligem'Waschen mit oben genanntem Waschpuffer werden 0,5 ml eines Konjugats, bestehend aus einem Kaninchen-anti-huraan-IgG-Antikörper und alkalischer Phosphatase, in einer Konzentration von 15 ng/ral zugegeben und 4 h bei 370C inkubiert. Nach erneutem Waschen wird die Enzymaktivität der alkalischen Phosphatase durch Hydrolyse von 4-Nltrophenylphosphat in 1 ml Diäthanolaminpuffer pH 9,8 und photoraetrische Messung des Enzymproduktes bei 405 nm nach Stoppen mit 1 η NaQH bestimmt (W· Schößler et al· Biomed. Siochira. Acta, im Druck),
Nach Ausführung des Enzymimmunoassays (EIA) werden die Röhrchen zweimal mit je 1 ml Waschpuffer gewaschen und mit je 1 ml PBS-Puffer, der 1 m NaCl enthält, inkubiert und 2 h bei 37 C stehen gelassen· Dadurch wird die Sindung zirkulierender Immunkomplexe bzw. von aggregiertem IgG an GIq unterbrochen, so daß die rait CIq beladenen Röhrchen wieder im EIA eingesetzt werden können»
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Glaskugeln von 5,5 mm Durchmesser (mattiert, F rJ 50 am )werden, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit dem Silanhaftmittel NB 1115 (Glycidoxypropyltriäthoxysilan, VEB Chemiewerk Nünchritz) behandelt und anschließend mit Glutaraldehyd aktiviert und mit CIq gebunden. Zur Ausführung des EIA werden die
Glaskugeln in kommerzielle Mikrotiterplatten, die 96 Proben a 300 yUl aufnehmen, gegeben und ira folgenden mit jo 200 ,ul Lösung an aggregiertem IgG bzw. Humanserura entsprechend Beispiel 1 versetzt. Die Reihenfolge der einzelnen Schritte erfolgt analog ßeispiel 1, wobei die Waschvorgänge dadurch erfolgen, daß hierzu nach Versetzen mit je 200 ,ul Waschpuffer die Mikrotiterplatte abgedeckt wird und durch einfaches Umdrehen entleert wird. Dadurch vereinfacht sich der Waschprozeß ira Vergleich zu Beispiel 1, bei dera jedes Röhrchen in der üblichen Art und Weise mittels Vakuum abgesaugt werden muß, erheblich· Nach Inkubation mit dem Konjugat und Versetzen mit dem Substrat wird die Enzyraaktivität durch Absaugen des gebildeten Farbstoffes mit einer Absaugküvette (VEB Carl Zeiss CJena) bestimmt· Entsprechend Beispiel 1 werden die gebundenen Imraunkocnplexe sowie das Konjugat mit PBS-Puffer, pH 7,4, der 10 mM EDTA und 1 ra NaCl enthält, abgespalten und eluiert, so daß die Glaskugeln erneut im ΞΙΑ eingesetzt werden können·
Zylinderförraige Formkörper aus Glas (Außendurchtnesser 6 mra
Innendurchmesser ca. 4 ram, Höhe ca. 3 mra) werden wie in Beispiel 1 oder 2 beschrieben mit Silanhaftmitteln, Glutaraldehyd und CIq aktiviert und beladen. Diese Glas-Formkörper werden in Polystyrol-Mikrotiter-Platten eingeführt und im folgenden der EIA in der beschriebenen Art und Weise ausgeführt. Die üYaschvorgänge erfolgen auch hier durch einfaches Füllen der Probenvsrtiefungen mit Waschpuffer (oder Leitungswasser) und Umdrehen der abgedeckten Mikrotiterplatten· Nach erfolgter Enzyrareaktion wird die Aktivität des Enzyms durch photometrische Bestimmung des Reaktionsproduktes senkrecht zu der glasklaren Mikrotiterplatte mit einem geeigneten Gerät bestimmt« Auch diese Formkörper werdsn wie im Beispiel 1 und 2 beschrieben durch Elution mit i m NaCl reaktiviert und wiederholt eingesetzt.
Claims (3)
- . 4 (Γ
Erfindungsanspruch1. Festphasen-Imnjunoassay zur Bestimmung von zirkulierenden Immunkckaplexsn auf der Grundlage siliciurndioxidhaltiger Materialien, dadurch gekennzeichnet* daß als feste Phase siliciumdioxidhaltige Formkörper eingesetzt werden, die nach vorheriger, an sich bekannter chemischer Qberflächenraodifizierung mit Silanhaftmitteln und hetero- oder homobifunktionellen Reagenzien mit dem Protein CIq beladen werden und daß nach Spaltung der Bindung zwischen CIq und den aufgebrachten Immunreaktanten durch nicht denaturierende Medien wie gepufferte Lösungen, die 0,5 bis 3 ra NaCl enthalten, die mit CIq beladsnen Formkörper wieder im Immunoassay eingesetzt werden· - 2. Festphasen-Immunoassay nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die im Immunoassay als feste Phase eingesetzten Formkörper kugelförmige, planare, zylinderförraige, würfelförmige und kegelförmige Gestalt haben, daß sie sowohl Kompakt- als auch Hohlkörper sind, daß die Hohlkörper offen oder geschlossen sind und daß das Volumen dsr Formkörper OyI cm0 bis 15 cm beträgt,
- 3. FSstphasen-Iramunoassay nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet* daß das geformte siliciumdioxidhaltige Material Glas ist·
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0881493A4 (de) * | 1996-09-27 | 2000-05-17 | Srl Inc | Immunoassayträger und immunoassayverfahren damit |
-
1983
- 1983-04-19 DD DD24999283A patent/DD214695B1/de not_active IP Right Cessation
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| DD214695B1 (de) | 1987-06-03 |
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