DD215330A1

DD215330A1 - Mittel zur bakteriophagenbekaempfung in mikrobiologisch-technischen produktionsprozessen

Info

Publication number: DD215330A1
Application number: DD25184483A
Authority: DD
Inventors: Eckart Stenz; Gottfried Schuster; Gerhard Esser; Guenter Israel; Rainer Neumann; Ulrich Steinke; Harald Winter
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1983-06-09
Filing date: 1983-06-09
Publication date: 1984-11-07

Abstract

Die Erfindung betrifft Mittel zur Stabilisierung mikrobiologischer Produktionsprozesse durch Bekaempfung von Phagen, die Mikroorganismen-Produtionsstaemme befallen und damit zu unterschiedlichen Prozessstoerungen fuehren koennen. Diese Mittel sind dadurch gekennzeichnet, dass sie Verbindungen der allgemeinen Formel(I) enthalten, worin R tief 1, R tief 2 und R tief 3 in beliebiger Variation -H, Alkyl- oder Alkoxygruppen sowie substituierte Alkylreste, deren Substituenten Hydroxy- oder Aminogruppen sein koennen, und X und Y in beliebiger Variation H tief 2, O oder S bedeuten, und, dass sie neben den erfindungsgemaessen Verbindungen Loesungsvermittler und/oder weitere Formulierungshilmittel enthalten koennen. Die Mittel werden Fermentationsansaetzen direkt oder in geloester Form zugesetzt. Sie wirken gegen verschiedene Phagen in unterschiedlichen Wirten und sind zur Stabilisierung der Zuwachsraten von phagengefaehrdeten Produktionsstaemmen geeignet.

Description

Mittel zur Bakteriophagenbekämpfung in mikrobiologischtechnischen Produktionsprozessen

Anw endung sgebie t_ der „Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Stabilisierung Produktion in phagengefährdeten biotechnologischen Prozessen, soweit diese unter Verwendung oder Gewinn von prokaryontischen Organismen (Bakterien, Cyanöbakterien) betrieben wejrden. Phagen (Bakteriophagen bzw. Cyanophagen) können durch Abtöten der für sie als Wirte fungierenden Mikroorganismen, durch Verringerung ihrer Vermehrungsrate oder durch Veränderung anderer für den Nutzer wesentlicher Leistungen erhebliche Produktionsausfälle herbeiführen.

Maßnahmen zur Verringerung oder Aussetzung des Phagenrisikos in mikrobiologisch-bioteohnologischen Prozessen, z. B. der pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie, der Biomasseproduktion, kommen erhebliche Bedeutung zu. Phageninfektionen in bakteriellen Produktionsverfahren können bisher nur in "sterilen" (aseptischen) Verfahren mit einer gewissen Sicherheit vermieden werden.

. _ _n η e /, ο

Das bedeutet jedoch, daß Permentoren, Nährmedien, zugeführte Luft usw. sterilisiert und unter mikrobiologisch kontrollierten Bedingungen gehalten werden müssen. Wegen der damit verbundenen beträchtlichen Kosten kann ein solches Verfahren nur für Produkte^ bei denen ein höherer Preis tolerierbar ist (z. B. Antibiotika)ι angewendet werden, für viele andere Produkte verbietet sich seine Nutzung. Darüber hinaus , sind auch in Sterilverfahren Phageneinbrüche, ζ. Β. durch technische Mangel oder lysogene Stämme, die Phagen in Form von Prophagen in den Baktenenzellen selbst enthalten, möglich.

Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung des Phagenrisikos besteht in der Gewinnung und Nutzung von Bakterien-Mutanten, die sich durch Resistenz gegenüber einem oder mehreren Phagen auszeichnen. Die Grenzen dieser Methode liegen darin,

- daß es keine Resistenz gegen alle Phagen eines Bakterien'ötammes gibt,

- daß die resistenten Mutanten zumeist keine Hochleistungsstämme sind, d. h., die für die Produktion erforderliche Leistung nicht oder nur ungenügend erbringen, und

- daß auch die Phagen ihrerseits wieder mutieren und somit die Resistenz der V/irtsOrganismen durchbrechen können (z. B. S. Seto, T. Osawa und S. Yamamoto, Agr, Biol.,Chem. £2, 261 - 266, 1968; T. Oki und

A. Ozaki, Agr. Biol. Chem. 22, 320 - 328, 1968).

Analog zur Virus-Chemotherapie bzw. -prophylaxe bei anderen Organismen ist auch für Mikroorganismen die direkte Bekämpfung der Phkgen mittels geeigneter Chemikalien vorgeschlagen worden, was bisher nur zu Teilerfolgen geführt hat. Beispiele dieser Art sind der Ein-rsatz von Calcium-bindenden bzw. chelatisierenden Sub-

stanzen, reduzierenden Chemikalien, Basenanaloga, Aminosäuren, Antibiotika oder anderen Verbindungen gegen Phagen, die als Schadfaktoren bei der mikrobiellen Herstellung von Aceton und Butanol, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Antibiotika, Milchprodukten, Biomasse u. a. aufgetreten waren (Übersicht bei V. Rudolph, Process Biochem. 1978, S. 16 u. 26; weitere Beispiele: N. Kashima et al.,. Agr. Biol. Chem. 40, 41 - 47, 1976; H. Lipavska et al., Folia microbiol. 2JJy 60 - 63, 1978). Der Anwendung dieser Mittel steht entgegen, daß die Substanzen in der phagenwirksamen Konzentration oftmals auch den jeweiligen Bakterien-Produktionsstamm hemmend beeinflussen. Ein weiterer Nachteil besteht in der Phagenspezifität der Mittel. Die aufgeführten Verbindungen wirkten jeweils nur gegen einige industriell bedeutsame Phagen. Beispielsweise hat das als Phageninhibitor für Bacillus subtilis angegebene Inaöl (T. Ukita und K. Kusai, Jap. Pat. No. 32 - 1097, 1957) nach eigenen Untersuchungen keinen Einfluß auf die Vermehrung von PZ-Phagen in einem Produktionsstamm dieser Bakterienart.

Es ist das Ziel der Erfindung, das bei mikrobiellen Produktionsverfahren bestehende Phagenrisiko und die damit verbundenen Produktionsau&fälle bzw. -minderungen durch den Einsatz neuartiger chemischer Phageninhibitoren zu verringern^ die sich insbesondere durch eine gewisse Breitbandwirkung gegenüber Bakteriophagen vieler Wirtsorganismen auszeichnen, überdies gut wirtsverträglich sind und somit eine breite Anwendung in der technischen Mikrobiologie ermöglichen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, chemische Wirkstoffe aufzufinden, die auf Grund ihrer chemischen Konstitution die Phagenvermehrung hemmen, hierdurch eine antiphagale Therapie ermöglichen und die Erträge von mikrobiellen Syntheseprozessen stabilisieren. Auf Grund eines breiten Wirkungsspektrums der Hemmstoffe gegen un-*' terschiedliche Phagen soll ein phagengefährdeter Produktionsstamm wirksam geschätzt sein,und darüber hinaus soll das Verfahren auch zum Schutz unterschiedlicher mikrobieller Produktionen einsetzbar sein.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Bäkteriophagenbekämpfung in mikrobiologisch-technischen Produktionsprozessen Mittel verwendet werden, die Verbindungen der allgemeinen Formel

HgC O=X (I) ^RA?-^R2

Il Y

enthalten,

worin R-, Rg und Ro in beliebiger Variation -H, Alkyl- oder Alkoxygruppen sowie substituierte Alkylreste, deren Substituenten Hydroxy- oder Aminogruppen sein können und X und Y in beliebiger Variation Hp, O oder S bedeuten. Die Verbindungen werden zusammen mit Lösungsvermittlern und/oder weiteren Formulierungshilfsmitteln angewendet. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Wirkstoffgehalt 50 bis 95 % des Mittels ausmacht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeigen in unterschiedlichen Phagen/Prokaryonten-Systemen ausgeprägte antiphagale Wirkungen, z. B. in den

Systemen ^PZ~^B ' Bacillus subtills

φ 105 / Bacillus eubtilis

PZ-A / Bacillus subtilis

LPP-1 / Plectonema boryanum.

Um die Schadwirkung von Phagen in Flüssigkulturen (Permentationsbrühen) von Bakterien-Produktionsstämmen (Stagnieren bzw, Abnahme der Zellkonzentration) aufzuheben, werden die Mittel in solchen Mengen den Kulturmedien zugesetzt, daß sich, eine Konzentration der erfinduni

ergibt,

findungsgemäßen Verbindungen von 10"" bis 10 g/ml

AusführungsbeisgieLe

Zur Kennzeichnung der antiphagalen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden unterschiedliche Verfahren eingesetzt, und zwar in Versuchtsreihe A Plaquehemmtests mit Agar-Kulturen (Diffusions-Lochplatten) und in Versuchsreihe B Trübungstests mit Plüssigkulturen.

Versuchsreihe A: Plaquehemmtests

Bei der Auswahl der Testsysteme wurden möglichst unter_r schiedliche Phagen berücksichtigt (virulent oder temperent, Zugehörigkeit zu unterschiedlichen morphologischen Gruppen, zur Phagenvermehrung notwendige WirtsOrganismen heterotroph oder autotroph), wobei auch in Produktionsprozessen als Schadfaktoren aufgetretene Phagen mit einbezogen wurden» Demgemäß fanden im wesentlichen die folgenden Phagen/Wirt-Sys/teme Verwendung:

φ 105 /Bacillus subtilis

Phage temperent, morphologische Gruppe B Wirt heterotroph

PZ-A / Bacillus subtilis

Phage virulent, morphologische Gruppe C Wirt heterotroph, Produktionsstamm

PZ-B / Bacillus subtilis

Phage virulent, morphologische Gruppe A Wirt heterotroph, Produktionsstamm

LPP-1 / Plectonema boryanum

Phage virulent, morphologische Gruppe C Wirt photoautotroph, Cyanobakterium

Der Plaquehemmtest wurde als Agardiffusions-Lochtest ausgeführt» Zur Herstellung der Doppelschichtplatten wurde der nooh flüssige Deckschichtagar bei 48 ⁰C mit Phagen und WirtsOrganismen beimpft und auf die bei ; 37 ⁰C für 30 min vorgetrocknete Grundschicht aufgegossen^· In die Nährböden wurden nach ihrem Erstarren Löcher von 10 mm Durchmesser gestanzt und mit 0,05 ml einer 1 %igen,LPP~1-Test: 0,05 ^igen Lösung der Testsubstanzen gefüllt· Nach einständiger Diffusionszeit bei Zimmertemperatur wurden die Platten inkiibiert (Φ 105 bei 37 ⁰C, PZ-Phagen bei 28 ⁰C und LPP-1 bei 25 ⁰C und 1400 Ix). Durch die Diffusion der Testverbindungen im Agarsubstrat bildet sich in radialer Richtung ein Konzentrationsgradient aus, in dessen wirksamen Bereichen eine Phagenhemmung als plaquefreie Zone bzw. Zone mit weniger und/oder kleineren Plaques erkannt werden kann* Die Auswertung erfolgte durch Ausmessen der radialen Breite dieser Plaquehemmzonen. Alle Ansätze bestanden aus drei Parallelen und wurden meist mehrfach wiederholt· Die in der beschriebenen Weise durchgeführten und ausgewerteten Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen in den unterschiedlichen Testsystemen plaque- und somit phagenfreie Zonen von beachtlicher Breite hervorgerufen und somit erhebliche antiphagale Wirkungen entwickelt haben. In Beispielsreihe sind einige diesbezügliche Ergebnisse zusammengefaßt.

Beispielsreihe 1: Plaquehemmzonen in unterschiedlichen Phagen/Wirt-Kombinationen nach Applikation erfindungsgemäßer Verbindungen

Verbindung Plaquehemmzone (mm)

φ 105 PZ-A PZ-B LPP-1

• ι

1-Methy1-3-oxymethy !-hexahydrotriazin (1,3,5)~

thion (4) (II) 4,0±1,0 3,0±0 3,0±0 8,0±4,1

1-Athy1-3-oxymethyl-rhexahydro-

triazin (1,3,5)- '

thion (4) (HI) 2,7±Ο,7 2,7±Ο,7 3,3±θ,3 14,7^0,3

1-n-Propyl-3-oxymethyl-hexa-

hydro-triazin -

(i,3,5)-thion (4)

(IV) 2,3±O,3 2,7±O,3 3,0±0 15,0±0

1-i-Propyl-3~

oxymethyl-hexa- «

hyaro-triazin (1,3,5)-thion (4)

(V) 3_s7±O,7 2,7±O,3 3,3±O,3

1-n-Butyl-3-oxymethyl-hexahydro-

triazin (1,3,5)-

thion (4) (VI) 3,3±O,7 3,O±Ö,6 4,3±O,3 11,0±2,0

1-i-Bu t y 1-3-oxymethyl-hexahydro-

triazin (1,3,5)-

thion (4) (VII) 0 6,3±O_s3 6,7±O,3 9,7±1,5

1-(31-Amino)propy1-3-oxymethyl-hexahydro- triazin (1,3,5)-

thion (4) (VIII)4_s0±0 3,3±O,3 3,0±0 11,7±O,9

1-(2'-Hydroxy)äthyl-3-oxymethyl-hexahydro- triazin (1,3,5)-on

(4) (IX) . 5,0±0 5,3±O,3 5,0±0 15,3±O,3

Versuchsreihe B: Trübungstests

Zur Prüfung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen unter praxisnahen Bedingungen wurden Untersuchungen in Trübungstests vorgenommen. Flüssigkulturen eines Produktionsstarames von B. subtilis wurden etwa 3 Stunden vor Erreichen der stationären Wachsturnsphase mit dem Bakteriophagen PZ-A massiv infiziert (Infektionsmultiplizität etwa 0,1). Zuvor waren die Testsubstanzen¹ den Bakteriensuspenaionen in Konzentrationen zwischen 10"*^ und 10"*^ g/ml in gelöster Form zugesetzt worden. Danach wurde im Verlauf von 4,5 bis 5 Stunden bei einer Bebrütungstemperatür von 37 C die Bakterienvermehrung ständig durch Trübungsmessungen verfolgt. Zur Kontrolle dienten Kulturen ohne Phagen-, und Substanzzusatz, Kulturen ohne Phagen-, aber mit Substanzzusatz sowie Kulturen mit Phagen-, aber ohne Substanzzusatz. In letzteren beginnt nach 2,5 Stunden die phagenbedingte Lyse der Bakterien, d· h. es kommt zu einem zunehmenden Absinken der Trübungswerte in den Kulturen· Das Ausmaß der Verhinderung dieser Lyse durch die erfindungsgemäßen Verbindungen entspricht mithin ihrer antiphagalen Wirkung. An den phagenfreien Kontrollkulturen wurden eventuelle bakterienhemmende Einflüsse der Verbindungen erfaßt. Die in ,Trübungstests erzielten Ergebnisse zeigen, daß unter den dem Produktionsprozeß angenäherten Bedingungen die antiphagalen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen sich in einem Ausmaß manifestiert, der z. T. vollen kurativen Wirkungen gleichkömmt. Dabei ist bedeutsam, daß die Wirtsbakterien von den meisten Verbindungen nicht ader nur geringfügig negativ beeinflußt werden. In Beispielsreihe 2 sind einige diesbezügliche Ergebnisse zusammengefaßt« . . '

Wird der zeitliche Verlauf des Wachstums und der Lyse der Bakterien verfolgt (Beispielsreihe 3), so zeigt sich unter dem Einfluß der erfindungsgemäßen Mittel deutlich

ihre Iyseverhindernde Wirkung. Während unbehandelte Bakterienkulturen etwa 2,5 Stunden nach Phagenzugabe zu lysieren beginnen und nach 4 bis 4,5 Stunden fast klar sind, steigen demgegenüber die Trübungswerte von Bakterienkulturen mit Phagen und mit Substanzzusatz weiter an. Sie erreichen teilweise die Werte phagenfreier Kontrollkulturen. Es ist deutlich erkennbar, daß eine in manchen Fällen auftretende Verzögerung des Bakterienwachstums unter Mitteleinfluß vorübergehend ist, d. tu, auch in solchen Kulturen erfolgt ein kontinuierlicher Zuwachs, der meist schon nach 4 bis 5 Stunden wieder zur normalen Zelldichte führt.

Beispielsreihe 2: nachweis der antiphagalen Wirkungen und der geringen Bakterienbeeinflussung durch erfindungsgemäße Verbindungen in Plüssigkulturen durch Trübungsmessungen

Verbindung antiphagaler₁\ Bakterien- p-\

Effekt ^u beeinflussung ^;

1-Methyl-3~oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4)

i-Äthyl-3-oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thibn (4)

1-n-Propyl-3-oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4)

1-i-Propyl-3~oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4)

1-n-Butyl-3-oxäimethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4)

1-i-Butyl~3-oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4)

98,6	-29,0
95,9	- 4,0
95,9	- 3,0
97,1	. —22,7
97,0	0
92,9	+ 1,8

Verbindung antiphagaler-x Bakterien-

Effekt ^u beeinflussung

oxymethyl-hexahydro-(1,3,5)-thion (4) 92,5 - 7,0

1-(2^l-Hyaroxa)äthyl-3-

oxymethyl-hexahydro-

triazin (1,3,5)-on (4) 95,3 -15,0

Trübung phageninfizierter Kulturen mit Substanz in Prozent der Trübung phagenfreier Kulturen mit Substanz

^J Differenz der Trübung von Bakterienkulturen mit und

ohne Substanz in Prozent der Bakterienkulturen ohne Substanz

Beispielsreihe 3s Nachweis der Verhinderung phagenbedingter lyse und der Gewährleistung des Wachstums der Bakterien in Flüssigkulturen unter dem Einfluß erfindungsgemäßer Verbindungen. Dargestellt ist der in Trübungsmessungen festgestellte zeitliche Verlauf der Veränderungen der Zelldichte in Bakterienkulturen ohne Phagen (ausgezogene Linien), mit Phagen (unterbrochene Linien), ohne Substanzzusatz (punktförmige Meßwerte) und mit Substanzzusatz (kreuzförmige Meßwerte).

Angewendete Substanzen und Konzentrationen:

3.1·. i-Äthyl-3-oxymethyl-hexahydro-triazin (1*3,5)-thion (4) 4·10~⁴g/ml

3.2· i-n-rPropyl^-oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)· thion (4) ^v 4·1Ο"⁴ g/ml

3·3· i-n-Butyl-3-oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4) 2,4·10"⁴ g/ml

3·4· 1-i-Butyl-3-oxymethyl-hexahydro-triazin (1,3,5)-thion (4) 1·10"³ g/ml

Claims

^sMittel zur Bakteriophagen- bzw. Cyänophagenbekämpfung in mikrobiologischen Syntheseprozessen, gekenn zeichnet dadurch, daß Wirkstoffe der allgemeinen Formel (I)

H_pC^/ΛοβΧ

Il

R--N N-Rp

C
Il

' ^Y

eingesetzt werden,

worin R₁, Rg und R^ in beliebiger Variation -H, Alkyl- -oder Alkoxygruppen sowie substituierte Alkylreste, deren Substituenten Hydroxy- oder Aminogruppen sein können, und X und Y in beliebiger Variation Hg, O oder S bedeuten, und, daß neben den erfindungsgemäßen Wirkstoffen Lösungsvermittler und/oder weitere Formulierungshilfsmittel enthalten sein können.

1 Seite Zeichnungen