DD226590A1

DD226590A1 - Mittel zur phagenhemmung in mikrobiellen produktionsprozessen

Info

Publication number: DD226590A1
Application number: DD26710384A
Authority: DD
Inventors: Eckart Stenz; Alfred Barth; Gerhard Kempter; Gisela Menzel; Gottfried Schuster
Original assignee: Univ Leipzig
Priority date: 1984-09-07
Filing date: 1984-09-07
Publication date: 1985-08-28

Abstract

Die Erfindung betrifft Mittel zur Hemmung von DNA- und RNA-Phagen in mikrobiellen Produktionsprozessen und damit zur Stabilisierung biotechnologischer Verfahren. Die Aufgabe bestand im Auffinden chemischer Wirkstoffe, die nach Zusatz zu Produktionsansaetzen aufgrund ihrer chemischen Konstitution Phagen inaktivieren und/oder deren Vermehrung hemmen, so dass phagenbedingte Prozessstoerungen verhindert werden. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass Mittel verwendet werden, die unterschiedlich substituierte Piperidinoacetanilide oder von diesen hergeleitete Verbindungen enthalten. Die erfindungsgemaessen Mittel werden den Fermentationsansaetzen direkt oder in geloester Form zugesetzt. Sie koennen auch Loesungsvermittler und/oder weitere Formulierungshilfsmittel enthalten. Die erfindungsgemaessen Verbindungen wirken gegen verschiedene DNA- und RNA-Phagen in unterschiedlichen Wirten und sind besonders wegen ihres breiten Wirkungsspektrums zur Sicherung phagengefaehrdeter Produktionsprozesse geeignet.

Description

Titel der Erfindung;

Mittel zur Phagenhemmung in mikrobiellen Produktionsprozessen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung: bezieht sich auf die Stabilisierung der Produktion in phagengefährdeten biotechnologischen Prozessen, soweit diese unter Verwendung oder Gewinn von prokaryontischen Organismen (Bakterien, Cyanobakterien) betrieben werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Maßnahmen zur Verringerung oder Aussetzung des Phagenrisikos in mikrobiologisch-biotechnologischen Prozessen, die in zunehmendem Maße vor allem zur Stoffproduktion, Substanzwandlung und Erzeugung von Biomasse genutzt werden, kommt erhebliche Bedeutung zu. Phageninfektionen und ihre negativen Auswirkungen in bakteriellen Produktionsverfahren können mit gewisser Sicherheit durch aseptische ("sterile") Fermentation vermieden werden. Wegen der damit verbundenen beträchtlichen Kosten kann ein solches Verfahren nur für Produkte, bei denen ein hoher Preis tolerierbar ist (z. B. Antibiotika) angewendet werden. Darüber hinaus sind auch in Sterilverfahren Phagenein brüche, z. B. durch technische Mängel oder lysogene Bakterienstämme, die Phagen in Form von Prophagen in den Bakterienzellen selbst enthalten, möglich.

Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung des Phagenrisikos besteht in der Gewinnung und Nutzung von Bakterien-Mutanten, die sich durch Resistenz gegenüber einem oder mehreren Phagen auszeichnen. Die Grenzen dieser Methode liegen darin,

- daß es keine Resistenz gegen alle Phagen eines Bakterien-Stammes gibt,

- daß die resistenten Mutanten zumeist keine Hocbleistungsstamme sind,

- und daß die Pbagen ihrerseits wieder mutieren und somit die Resistenz der Wirtsorganismen durchbrechen können

(z. B. S. Seto, T. Osawa und S· Yamamoto, Agr. Biol. Ghem· 22., 261 - 266, 1968; T. Oki und A. O_zaki, Agr. Biol· Cbem. 22., 320 - 328, 1968).

Analog zur Virus-Chemotherapie bzw. -propfaylaxe bei anderen Organismen ist auch für Mikroorganismen die direkte Bekämpfung der Phagen mittels geeigneter Chemikalien vorgeschlagen worden. Diese hat jedoch bisher ebenfalls nur zu Teilerfolgen geführt. Beispiele dieser Art sind der Einsatz von Calcium-bindenden bzw. cheiatisierenden Substanzen, reduzierenden Chemikalien, Basenanaloga, Aminosäuren, Antibiotika oder anderen Verbindungen gegen Phagen, die als Schadfaktoren bei der mikrobiellen Herstellung von Aceton und Butanol, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Antibiotika, Milchprodukten, Biomasse u* a. aufgetreten waren (Übersicht bei V. Rudolph, Process Biochem. 1978, S. 16 u. 26; weitere Beispiele: N. Kaahima et al., Agr. Biol. Chem. 4Ό, 41 - 47, 1976; H. Lipavska et al., Folia microbiol. 22., 60-63, 1978). Der generellen Anwendung solcher Mittel steht entgegen, daß die Substanzen in der phagenwirksamen Konzentration auch die Bakterienvermehrung des Produktionsstammes selbst hemmend beeinflussen können. Ein weiterer Nachteil besteht in der Phagenspezifität der Mittel. Die aufgeführten Verbindungen wirkten jeweils nur gegen einen oder wenige biotecbnologisch bedeutsame Phagen. Beispielsweise hat das als Pfaageninhibitor für Bacillus subtilis angegebene Indol (T. Ukita und K. Kusai, Jap. Pat. No. 32 - 1097, 1957) nach eigenen Untersuchungen keinen Einfluß auf die Vermehrung von PZ-Phagen in einem Produktionsstamm dieser Bakterienart. Auch die inzwischen entwickelten Phageninhibitoren mit breiterem Wirkunsspektrum (B. Kiesel et al., DD-IAP Ή Ή?- , 1981;

) sind nicht in allen potentiell möglichen Produktionsstämmen anwendbar und nicht gegen die Gesamtheit aller Phagen wirksam· Die selbständig oder im Rahmen integrierter Maßnahmen anzuwendende Cbemoprophylaxe bzw. -therapie phagaler Infektionen in mikrobiellen Produktionsprozessen erfordert daher eine möglichst umfangreiche Palette unterschiedlicher Pbageninbibitoren.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, das bei mikrobiellen Produktionsverfahren bestehende Phagenrisiko und die damit verbundenen Produktionsausfälle bzw. -minderungen durch den Einsatz neuartiger chemischer Phageninhibitoren zu verringern, die sich von den bisher bekannten in ihrem Wirkungsspektrum unterscheiden, vor allem indem sie sowohl gegen Desoxyribonukleinsäure (DUA) - Phagen als auch gegen Ribonukleinsäure (RUA)-Pbagen vieler WirtsOrganismen wirksam sind, so daß bei gleichzeitiger Wirtsverträglicbkeit eine umfassendere Anwendung in der Biotechnologie als selbständige Maßnahme wie auch im Rahmen integrierter antiphagaler Regimes möglich ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, chemische Wirkstoffe einzusetzen, die aufgrund ihrer chemischen Konstitution die Phagenvermehrung hemmen ohne die Wirtsorganismen (Produktionsstämme) zu beeinträchtigen, hierdurch eine antiphagale Prophylaxe bzw. Therapie ermöglichen und die Erträge von mikrobiellen Wachstums- und Syntheseprozessen stabilisieren. Die chemischen Wirkstoffe sollen ein breites Wirkungssprektrum gegen unterschiedliche Vertreter sowohl der DITA- al3 auch der RHA-Phagen aufweisen und damit einen pbagengefäbrdeten Produktionsstamm vor unterschiedlichen Schadphagen und ggf. auch deren Mutanten wirksam schützen. Darüber hinaus sollen entsprechende Inhibitoren auch zum Schutz unterschiedlicher mikrobieller Produktionsprozesse einsetzbarsein·

Die Aufgabe wird erfindungsgemaß dadurch gelöst, daß zur Phagenbekämpfung in mikrobiologisch-technischen Produktionsprozessen Mittel verwendet werden, die Verbindungen der allgemeinen Formeln

(I) ?1 H-CH-CO-HH-Ar

(ID

(CH₀) ' H-CH-CO-HH-Ar

(III)

(IV)

(CH₂) H-CH-CO-HH-Het

Π H-CH-CO-HH-Het

(V) H-CH-CO-HH-Ar

(VI) H-CH-CO-HH-Ar

X"

(VII) Y

H-CH-CO-HH-Het

(VIII) H-CH-CO-HH-Het

(IX) Z

H-CH-CO-HH-Ar

(X)^R1 H-CH-CO-HH-Ar

(XI) Z

H-CH-CO-HH-Het

Uli)

-CH-CO-HH-Heΐ

X^J

enthalten, wobei Y = 0, S; Z = -IiH-, -U-R₃ bzw. -II (R₄, R₅); X = komplementäres Anion; R₁ = -H oder Alkylreste; R₂ = Alkyl· substituenten; R₃ = -H bzw. Alkylreste oder Acyl-, SuIfuryl-, Phosphoryl- oder Pbosphonylreste; R., Rc = gleiche oder verschiedene Alkylreste· Ar kann für den Benzenring oder verschieden substituierte Arylreste und Het für substituierte und unsubstituierte Hetarylreste stehen· m a 2; η = 4,5 und 6; ρ= 1, 2, Im Falle von R. = -H können die optischen Antipoden oder auch die Racemate zum Einsatz kommen· Die Verbindungstypen (I), (III), (V), (VII), (IX) und (XI) können als freie Basen oder in Salzform angewendet werden.

Die Verbindungen können zusammen mit Lösungsvermittlern und/ oder weiteren Pormulierungshilfsmitteln angewendet werden· Es bat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Wirkstoffgehalt 50 bis 95 % des Mittels ausmacht·

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formeln (I) bis (XII) zeigen in unterschiedlichen Pbagen/Prokaryonten-Systemen antipbagale Wirkungen, z. B. in den DHA-Phagen-Systemen

PZ-A /Bacillus subtilis,

PZ-B /Bacillus subtilis

χ /Escberichia coli C 600

LPP-1 /Plectonema boryanum

und den RNA-Pbagen-Systemen

M 12 /Eschericbia coli W 1665 F⁺ und Qß /Escberichia coli AB 301.

Um die Schadwirkung von Pbagen in Flüssigkulturen (Fermentations brühen) von Bakterien-Produktionsstämmen (Stagnieren bzw. Abnahme der Zellkonzentration) aufzuheben, werden dieu Mittel in solchen Mengen den Kulturmedien zugesetzt, daß sich eine Wirkst off konzentration von 10 bis 10."^ g/ml ergibt.

Ausführungsbeispiele

Zur Kennzeichnung der antiphagalen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde der Plaquehemmtest mit Agarkulturen in der Variante des Diffusions-Lochplattentests eingesetzt. Bei der Auswahl der Testsysteme wurden möglichst unterschiedliche Phagen berücksichtigt: virulent oder temperent, Zugehörigkeit zu unterschiedlichen morphologischen Gruppen, Uukleinsäuretyp DITA oder RKA, zur Pfaagenvermehrung notwendige Wirtsorganismen grampositiv oder gramnegativ, ihre Ernährungsweise beterotropb oder autotroph. Dabei wurden auch in biotechnologiscben Prozessen als Schadfaktoren aufgetretene Bakteriophagen mit einbezogen.

Es fanden im wesentlichen die folgenden DKA-Phagen/Wirt-Systeme Verwendung:

PZ-A /Bacillus subtilis

Phage virulent ("pseudotemperent"), morphologische Gruppe C, Wirt grampositiv, heterotroph; Produktionsstamm

PZ-B / Bacillus subtilis

Phage virulent, morphologische Gruppe A, Wirt grampositiv, heterotroph; Produktionsstamm

X / Escherichia coli G 600

Pbage temperent, morphologische Gruppe B, Wirt gramnegativ, heterotroph

LPP-1 / Plectonema boryanum

Phage virulent, morphologische Gruppe C Wirt gramnegativ, photoautotroph; Cyanobakterium

Darüber hinaus wurden folgende RSA-Phagen/Wirt-Systerne in die Untersuchungen einbezogen:

M 12 / Escherichia coli W 1665 F⁺

Pbage virulent, morphologische Gruppe E, serologische Gruppe I, Wirt gramnegativ, heterotroph

Qß / Escherichia coli AB 301

Phage virulent, morphologische Gruppe E, serologische Gruppe III,

Wirt gramnegativ, heterotroph·

Der Plaquehemmtest wurde als Agardiffüsions-Lochtest ausgeführt. Zur Herstellung der Doppelscbicbtplatten wurde der noch flüssige Deckschichtagar bei 48 ⁰C mit Phagen und Wirtsorganismen beimpft und auf die bei 37 ⁰C für 30 min vorgetrocknete Grundschicht aufgegossen« In die Nährböden wurden nach ihrem Erstarren Löcher von 10 mm Durchmesser gestanzt und mit 0,05 ml einer 0,1 molaren, in einigen Fallen auch 1%igen Lösung der Testsubstanzen gefüllt. Nach einstündiger Diffusionszeit bei Zimmertemperatur wurden die Platten inkubiert (PZ-Pbagen bei 28 ⁰C,Λ, M 12 und Qß bei 37 ⁰C und LPP-1 bei 25 ⁰C und

HOo Ix). Durch die Diffusion der Testverbindungen im Agarsubstrat bildet sich in radialer Richtung ein Konzentrationsgradient aus, in dessen.wirksamen Bereichen eine Phagenhemmung als plaquelfreie Zone bzw. Zone mit weniger und/oder kleineren Plaques erkannt werden kann. Die Auswertung erfolgte durch Ausmessen der radialen Breiten dieser Plaquehemmzonen. Alle Ansätze bestanden aus drei bis fünf Parallelen und wurden meist mehrfach wiederholt. Die in der beschriebenen Weise durchgeführten und ausgewerteten Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen in den unterschiedlichen Testsystemen beachtliche Plaquehemmzonen (also Bereiche mit Hemmung der Phagenvermehrung) hervorrufen und somit antiphagal gegen sehr unterschiedliche DNA-Phagen und auch RITA-Phagen wirken. In den Beispielsreihen 1 bis 3 sind einige diesbezügliche Ergebnisse mit DUA-Phagen und in Beispielsreihe 4 solche mit RUA-Phagen zusammengefaßt wiedergegeben.

Die angeführten Beispiele zeigen, daß viele der erfindungsgemäßen substituierten Piperidinoacetanilide, z. B. Piperidinoacetanilidhydrobromid und 4-i*luor-piperidinoacetanilid-bydrochlorid, gegen zahlreiche Phagen wirksam sind. Aus der zum Teil beachtlichen Breite der Hemmzonen geht unter anderem hervor, daß sich die antiphagale Wirkung dieser Verbindungen über einen größeren Konzentrationsbereich erstreckt. Damit sind wichtige Vorbedingungen für den Einsatz zur Stabilisierung mikrobiologisch-biotechnologischer Produktionsprozesse erfüllt.

Beispielsreihe 1

Antiphagale Wirksamkeit erfindungsgemäßer Verbindungen gegen PZ-A- und PZ-B-Bakteriophagen im Lochtest mit Bacillus subtilis

Verbindung

Piperidinoacetanilid-bydrobromid

3-PlUOr-piperidinoacetanilid-bydrocblorid 4-Fluor-piperidinoacetaniiid-hydrochlorid 3-Gblor-piperidinoacetanilid-bydrocblorid 3-Chlor-piperidinoacetanilid-hydrobromid 3-Trifluorometbyl-piperiäinoacetanilid-hydro-

chlorid

3-Stboxy-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 4-Ethoxy-piperidinoacetaniliä-bydrochlorid 3-Nitro-piperidinoacetanilid-bydrocblorid 4-Hitro-piperidinoacetanilid-hydrocfalorid 2-Cblor-(IT-metbyl)-piperidinoacetanilid-;jodid 4-Metbyl-(li-inetbyl)-piperidinoacetanilid-jodid Morpbolino-acetanilid-bydrobromid 4-Brom-piperidinoacetanilid 4-Metbyl-(N-metbyl)-morpboliniuiD-acetanilid-

jodid Piperidino-acet-2-aminobenzaldebyd

-GH-C O-KH-f OH-

Plaquebemm-	5 Aus in mm
z one (radiale dehnung	PZ-B
PZ-A	3,0
6,3	3,0
3,7	5,7
5,3	2,7
3,0	7,0
10,0	8,7
6,7	3,7
2,7	0
3,0	3,3
2,7	5,7
3,7	1,7
1,7	5,7
3,0	2,0
0	0
3,7	0
6,7	1,7
4,7

1,3

Beispielsreihe 2

Antiphagale Wirksamkeit erfindungsgemäßer Verbindungen gegen Λ Bakteriophagen im Lochtest mit Escherichia coli

Verbindung

3-Ghlor-piperidinoacetanilid-hydrobromid 4-jod-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 3-Metbyl-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 2-Methoxy-piperidinoacetanilid-hydrocblorid 3-Metboxy-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 3-Etboxy-piperidinoacetanilid-bydrocblorid

Plaquebemmzone

(radiale Ausdehnung in mm)

4,7 1.7 1,3 1.0 2,3 1.0

Beispielsreihe 3

Antiphagale Wirksamkeit erfindungsgemäßer Verbindungen gegen LPP-1-Cyanopbagen im Lochtest mit Plectonema boryanum

Verbindung

Piperidinoacetanilid-hydrochlorid Piperidinoacetanilid-hydrobromid 2-Fluor-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 4-i'luor-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 3-Jod-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 4-Jod-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 2-Trifluoromethyl-piperidinoacetanilid-

hydrochlorid

3-Metbyl-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 3-Methyl-piperidinoacetanilid-hydrobromid 2-Methoxy-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 3-Metboxy-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 4-Methoxy-piperidinoacetanilid-bydrocblorid 3-Ethoxy-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 4-Etboxy-piperidinoacetanilid-bydrochlorid 3-Nitro-piperidinoacetanilid-byärocblorid 2-Gblor-(]5-methyl)-piperidiniuin-acetanilid-

Jodid

Plaquehemmzone	weniger u./oder kleinere Plaques
(radiale Ausdeh nung in mm)	0
plaquefrei	12,0
7,3	3,0
6,3	6,0
18,7	0
16,0	0
9,0	4,0
12,0	0
6,7	0
22,0	0
20,7	5,0
9,7	0
20,0	4,7
16,7	5,0
17,0	0
19,7	0
14,3
5,7

Beispielsreibe 4

Antipbagale Wirksamkeit erfindungsgemäßer Verbindungen gegen M12- und Qß-Bakteriophagen im Lochtest mit Escherichia coli

Verbindung Plaquebemmzone

(radiale Ausdehnung in mm)

M12

Piperidinoacetanilid-hydrocblorid Piperidinoacetanilid-hydrobromid

2-Fluor-piperidinoacetanilid-bydrocblorid 3-i'luor-piperidinoacetanilid-hydrochlorid 4-Fluor-piperidinoacetanilid-hydrocblorid 3-Trifluormetbyl-piperidinoacetanilid-hydro-

cblorid

3-Metbyl-piperidinoacetanilid-bydrobromid 3-Metboxy-piperidinoacetanilid-bydrocblorid 4-Uitro-piperidinoacetanilid-bydrochlorid Piperidinoacet-(4-pyridino)amid 4-Brom-piperidinoacetanilid

4,0	4,0
4,5	4,0
3,0	3,0
2,5	2,5
3,0	2,5
5,0	4,0
2,5	2,5
3,0	3,0
4,0	3,0
3,0	3,5
3,5	2,0
2,5	0

CH-

Claims

Erfindungsansprücfae

1. Mittel zur Bakteriophagen- bzw_# Cyanopbagenbekämpfung in mikrobiologiscben Produktionsprozessen, gekennzeichnet dadurch, daß antiphagale Wirkstoffe der allgemeinen Formeln (I) bis (XII)

(ID

(CH₀)„ H-CH-CO-NH-Ar

(III) (CH₂)_n U-CH-CO-HH-Het

(IV)

(CH₂) N-CH-CO-HH-Het

(V) Y (VI)

N-CH-CO-im-Ar

IT-CH-C 0-im-Ar

X"

(VII) Y

U-CH-CO-NH-Het

(VIII)

H-CH-CO-HH-Het

^R1 (IX) Z N-CH-CO-UH-Ar

(X) Z N-CH-CO-SH-Ar

(XI) Z N-CH-CO-NH-Het

2. Mittel nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die antipbagalen Wirkstoffe einzeln oder in beliebiger Kombination miteinander vorliegen.

2 m

S~ (^GE2^m\® ^R1

(XII) Z N-CH-CO-NH-Het

wobei Y = O,S; Z = -MH, -HH-R- bzw. -Η" R₄₁R₅); X = komplementäres Anion; R. = -H oder Alkylreste; Rp = Alkylsubstituenten; R^, = -H bzw. Alkylreste oder Acyl-, SuIfuryl-, Phospboryl oder Phospbonylreste; R., Rc = gleiche oder verschiedene Alkylreste bedeuten; Ar für den Benzenring oder verschieden substituierte Arylreste und Het für substituierte oder unsubstituierte Hetarylreste stehen, m = 2; η s 4, 5 und 6; ρ =1, 2 sein können, zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen enthalten sind·

3. Mittel nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die V/irkst off konzentration im Mittel zwischen 1 und 99 % liegt.

4· Mittel nach Punkt 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß

Lösungsvermittler und/oder Formulierungshilfsmittel enthalten sind.