DD215331A1 - Mittel zur stabilisierung phagengefaehrdeter mikrobiologisch-technischer produktionsprozesse - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Mittel zur Stabilisierung mikrobiologischer Produktionsprozesse durch Bekaempfung von Phagen, die Mikroorganismen-Produktionsstaemme befallen und damit zu unterschiedlichen Prozessstoerungen fuehren koennen. Diese Mittel sind dadurch gekennzeichnet, dass sie Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten, worin in beliebiger Variation R tief 1 = Cl, CH tief 3 S oder CH tief 3 O R tief 2 und R tief 3 = Morpholino und/oder mit R tief 4 = H oder Alkyl und R tief 5 = Alkyl oder CH tief 3 O oder CN substituiertes Alkyl bedeuten und dass sie neben den erfindungsgemaessen Verbindungen Loesungsvermittler und/oder weitere Formulierungsmittel enthalten koennen. Die Mittel werden Fermentationsansaetzen direkt oder in geloester Form zugesetzt. Sie wirken gegen verschiedene Phagen in unterschiedlichen Wirten und sind zur Stabilisierung der Zuwachsraten von phagengefaehrdeten Produktionsstaemmen geeignet.

Description

Titel der Erfindung

Mittel zur Stabilisierung phagengefährdeter mikrobiologischtechnischer Produktionsprozesse .

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung, bezieht sich auf die Stabilisierung der Produktion in phagengefährdeten biotechnologischen Prozessen, soweit diese unter Verwendung oder Gewinn von prokaryontischen Organismen (Bakterien, Cyanobakterien) betrieben werden. Phagen (Bakteriophagen bzw. Cyanophagen) können durch Abtöten der für sie als Wirte fungierenden Mikroorganismen, durch Verringerung ihrer Vermehrungsrate oder durch Veränderung anderer für den Nutzer wesentlicher Leistungen erhebliche Produktions ausfälle herbeiführen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen . \

Maßnahmen zur Verringerung oder Aussetzung des Phagenrisikos in mikrobiologisch-biotechnologischen Prozessen, z.B. der pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie, der Biomasseproduktion, kommen erhebliche Bedeutung zu. Phageninfektionen in bakteriell len Produktionsverfahren können bisher nur in "sterilen" (aseptischen) Verfahren mit einer gewissen Sicherheit vermieden werden. Das bedeutet jedoch, daß Fermentoren, Nährmedien, zugeführte Luft usw. sterilisiert und unter mikrobiologisch kontrollier-, ten Bedingungen gehalten werden müssen. Wegen der damit verbundenen beträchtlichen Kosten kann ein solches Verfahren nur für Produkte, bei denen ein höherer Preis tolerierbar_vist (z.B. Antibiotika), angewendet werden, für viele andere Produkte verbietet sich seine Nutzung. Darüber hinaus sind auch in Sterilverfahren Phageneinbrüche, z.B. durch technische Mängel oder lysogene Stämme, die Phagen in Form von Prophagen in den Bakterienzellen selbst enthalten, möglich. ,

Eine weitere Möglichkeit zur Verringerung des Phagenrisikos besteht in der Gewinnung und Nutzung von Bakterien-Mutanten, die sich durch Resistenz gegenüber einem oder mehreren Phagen auszeichnen. Die Grenzen dieser Methode liegen darin,

- daß es.keine Resistenz gegen alle Phagen eines Bakterienstammes gibt,

- daß die resistenten Mutanten zumeist keine Hochleistungsstämme sind, das heißt, die für die Produktion erforderliche Leistung nicht oder nur ungenügend erbringen, und

- daß auch die Phagen ihrerseits wieder mutieren und somit die Resistenz der WirtsOrganismen durchbrechen können (z.B. 3. Seto, T.'Osawa und S. Yamamoto, Agr. Biol. Chem. ^2> 261-266, 1968} T. Oki und A. Ozaki, Agr. Biol. Chem. J32, 320-328, 1968).

Analog zur Virus-Chemotherapie bzw. -Prophylaxe bei anderen Organismen ist auch für Mikroorganismen die direkte Bekämpfung der Phagen mittels geeigneter Chemikalien vorgeschlagen worden, was bisher nur zu Teilerfolgen geführt hat. Beispiele dieser Art sind der Einsatz von Calcium-bindenden bzw. chelatisierenden Substanzen, reduzierenden Chemikalien, Basenanaloga,' Aminosäuren, Antibiotika oder anderen Verbindungen gegen Phagen, die als Schadfaktoren bei der mikrobiellen Herstellung von Aceton und Butanol, Aminosäuren, Nukleinsäuren, Antibiotika, Milchprodukten, Biomasse u. a. aufgetreten waren (Übersicht bei V. Rudolph, Process Biochem. 1978, S. 16 u. 26; weitere Beispiele; N. Kashima et al., Agr. Biol. Chem. 40, 41-4?, 1976; H. Lipavskä et al., Folia microbiol. 2£, 60-63, 1978). Der Anwendung dieser Mittel, steht entgegen, daß die Substanzen in der phagenv/irksamen Konzentration oftmals auch den jeweiligen Bakterien-Produkt ions st amm hemmend beeinflussen. Ein weiterer Kachteil besteht in der Phagenspezifität der Mittel. Die aufgeführten Verbindungen wirkten jeweils nur gegen einige industriell bedeutsame Phagen. Beispielsweise hat das als Phageninhibitor für Bacillus subtilis angegebene Indol (T. Ukita und K. Kusai, Jap. Pat. No. ,32-1097» 1957) nach eigenen Untersuchungen keinen Einfluß auf die Vermehrung von PZ-Phagen in einem Produktionsstamm dieser Bakterienart.

Ziel der Erfindung <

Es ist das Ziel der Erfindung, das bei mikrobiellen Produktionsverfahren bestehende Phagenrisiko und die damit verbundenen Produktionsausfälle bzw. -minderungen durch den Einsatz neuartiger chemischer Phageninhibitoren zu verringern, die sich besonders durch eine gewisse Breitbandwirkung gegenüber Bakteriophagen vieler WirtsOrganismen auszeichnen, überdies gut wirtsverträglich sind und somit eine breite Anwendung in der technischen Mikrobiologie ermöglichen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, chemische V/irkstoffe aufzufinden, die auf Grund ihrer chemischen Konstitution die Phagenvermehrung hemmen, hierdurch eine antiphagale Therapie ermöglichen und die·Erträge von mikrobiellen Syntheseprozessen stabilisieren. Auf Grund eines breiten Wirkungsspektrums der Hemmstoffe gegen unterschiedliche Phagen soll e.in phagengefährdeter Produktionsstamm wirksam geschützt sein und darüber hinaus soll das Verfahren auch zum Schutz unterschiedlicher mikrobieller Produktionen einsetzbar sein. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zur Bakteriophagenbekämpfung in mikrobiologisch-technischen Produktionsprozessen Mittel verwendet werden, die Verbindungen der· allgemeinen Formel '

3 1 ^

KJ

^R3 1

KJ

KJ

enthalten, .

worin in beliebiger Variation

Rl₁ - Cl, CHoS oder CHoO R₂ und Ro = Morpholino und/oder N\_R R₄ = H oder Alkyl

Rc₅ = Alkyl oder durch CHoO oder CN substituiertes Alkyl bedeuten.

Die Verbindungen werden zusammen mit Lösungsvermittlern und/oder weiteren Formulierungshilfsmitteln angewendet. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn der Wirkst offgehalt 50 bis 95 % des Mittels ausmacht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zeigen in unterschiedlichen Phagen/Prokaryonten-Systerneη ausgeprägte antiphagale Wirkungen, z.B. in den Systemen . Φ105 / Bacillus subtilis PZ-A / Bacillus subtilis PZ-B / Bacillus subtilis λ / Sscherichia coli· LPP-1 / Plectonema boryanum.

Um die Schadwirkung von Phagen in Flüssigkulturen (Fermenta- ' tionssubstraten) von Bakterien-Produktionsstämmen (Stagnieren bzw. Abnahme der Zellkonzentration) aufzuheben, werden die Mittel in solchen Mengen den Kulturmedien zugesetzt, daß sich eine Konzentration der erfindungsgemäßen'Verbindungen von 10 bis 10""^ g/ml ergibt.

Ausführungsbeispiele

Zur Kennzeichnung der antiphagalen Eigenschaften der erfindungs-. gemäßen Verbindungen wurden unterschiedliche Verfahren eingesetzt, und zwar in Versuchsreihe A Plaquehemmtests mit Agarkulturen (Diffusions-Lochplatten) und in Versuchsreihe. B Trübungstests mit,Flüssigkulturen.

Versuchsreihe A: Plaquehemmtests

Bei der Auswahl der Testsysteme' wurden möglichst unterschiedliehe Phagen berücksichtigt (virulent oder temperent, Zugehörigkeit zu unterschiedlichen morphologischen Gr.uppen, zur PhagenvermehrUng notwendige WirtsOrganismen heterotroph oder autotroph), wobei auch in Produktionsprozessen als Schadfaktoren aufgetretene Phagen mit einbezogen wurden. Demgemäß fanden im wesentlichen die folgenden Phagen/Wirt-Systerne Verwendung:

Φ105 / Bacillus subtilis

Phage. temperent, morphologische Gruppe B, PZ-A / Bacillus subtilis Phage virulent, morphologische Gruppe C, Wirt heterotroph, Produktionsstamm

·. ·.-.'.. —5—

PZ-B / Bacillus subtilis

Phage virulent, morphologische Gruppe Δ,

«Virt heterotroph, Produkt ions stamm X / Escherichia coli

Phage temperent, morphologische Gruppe B,

Wirt heterotroph LPP-1 / Plectonema boryanum

Phage virulent, morphologische Gruppe C, Wirt photoautotroph, Cyanobakterium

Der Plaquehemmtest wurde als Agardiffusions-Lochtest ausgeführt. Zur Herstellung der Doppelschichtplatten wurde der noch flüssige Deckschichtagar bei 48⁰C mit Phagen und WirtsOrganismen beimpft und auf die bei 37⁰C für 30 min vorgetrocknete Grundschicht aufgegossen. In die Nährböden wurden nach ihrem Erstarren Löcher von 10 mm Durchmesser gestanzt und mit 0,05 ml einer 1%igen Lösung der Testsubstanzen gefüllt. Kach einstündiger Diffusionszeit bei Zimmertemperatur wurden die Platten inkubiert (φ 105 und λ bei 37⁰C, PZ-Phagen bei 28⁰C und LPP-1 bei 25°C und 1400 Ix). Durch die Diffusion der Tesiverbindungen im Agarsubstrat bildet sich in radialer Richtung ein Konzentrationsgradient aus, in des-, sen wirksamen Bereichen eine Phagenhemmung als plaquefreie Zone bzw. Zone mit weniger und/oder kleineren Plaques erkannt werden kann. Die Auswertung erfolgte durch Ausmessen der radialen Breite' dieser Plaquehemmzonen. Alle Ansätze bestanden aus drei Parallelen und wurde"η meist mehrfach wiederholt.

Die in der beschriebenen V/eise durchgeführten und ausgewerteten Versuche zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen in den unterschiedlichen Testsystemen Plaquehemmzonen (also Zonen mit Hemmung der Phagenvermehrung) von beachtlicher Breite hervorrufen und somit erhebliche antiphagale Wirkungen entwickelt haben. In Beispielsreihe 1.sind einige diesbezügliche Ergebnisse zusammengefaßt.

Versuchsreihe B: Trübungstests

Zur Prüfung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen unter praxisnahen Bedingungen wurden Untersuchungen' in Trübungstests vorgenommen. Flüssigkulturen eines Produktionsstammes von B. subtilis wurden etwa drei Stunden vor Erreichen der stationären Wachstumsphase mit dem Bakteriophagen PZ-A massiv infiziert

(Infektionsmultiplizität etwa 0,1). Zuvor waren die Testsubstanzen den Bakteriensuspensionen in Konzentrationen zwischen 10 ^ und 10 ^J g/ml in gelöster Form zugesetzt worden, Danach wurde im Verlauf von 4,5 bis 5>5 Stunden bei einer Bebrütungstemperatur von. 37°C die Bakterienvermehrung ständig durch Trübungsmessungen verfolgt. Zur Kontrolle dienten Kulturen ohne Phagen- und Substanzzusatz, Kulturen ohne Phagen-, aber mit Substanzzusatz sowie Kulturen mit Phagen-, aber ohne Substanzzusatz. In letzteren beginnt nach 2,5 Stunden die phagenbedingte Lyse der Bakterien, das heißt, es kommt zu einem zunehmenden Absinken der l'rubungswerte in den Kulturen. Das Ausmaß der Verhinderung dieser Lyse durch die. erfindungsgemäßen Verbindungen entspricht mithin ihrer antiphagalen Wirkung. An den phagenfreien Kontrollkulturen wurden eventuelle bakterienhemmende Einflüsse der Verbindungen erfaßt.

Die in Trübungstests erzielten Ergebnisse zeigen, daß unter den dem Produktionsprozeß angenäherten Bedingungen die antiphagalen Wirkungen der erfindungsgemäßen Verbindungen sich in einem Ausmaß manifestiert, der z.T. vollen kurativen Wirkungen gleichkommt. Von außerordentlicher Bedeutung ist dabei die aus den in der stationären Wachstumsphase erreichten Zelldichten der Wirtsbakterien abzuleitende völlige Unschädlichkeit der Mittel, die darüber hinaus zum Teil sogar einen leichten stimulatorischen Einfluß auf dj.e Bakterien ausüben. In Beispielsreihe 2 sind einige diesbezügliche Ergebnisse zusammengefaßt.

Wird der zeitliche Verlauf des Wachstums und der Lyse der Bakterien verfolgt (vgl. Beispielsreihe 3), so zeigt sich unter dem Einfluß der erfindungsgemäßeη Verbindungen deutlich ihre lyseverhindernde 'Wirkung. Während unbehandelte Bakterieniculturen etwa 2,5 Stunden nach Phagenzugabe zu lysieren beginnen und nach 4 bis 4,5 Stunden fast klar sind, steigen demgegenüber die Trübungswerte von Bakterienkulturen mit Phagen und mit Substanzzusatz weiter an,. Sie übersteigen oder erreichen die Werte phagenfreier Kontrollkulturen. Es ist deutlich erkennbar, daß eine gegebenenfalls auftretende Verzögerung des Bakterienwachsturns unter Einfluß der Mittel vorübergehend ist, das heißt, auch in solchen Kulturen erfolgt ein kontinuierlicher Zuwachs, der meist schon nach 4 bis 5 Stunden mindestens wieder zur normalen Zelldichte führt.

Selbst solche.unter den antiptiagalen, erfindungsgemäßen Verbindungen, die in dem in Versuchsreihe B angewendeten Bakterien/ Phagen-Systern und unter den angegebenen Bedingungen keinen vollen kurativen Effekt erzielen, rufen eine bemerkenswerte Verzögerung der Phagenwirkungen hervor (vgl. Beispielsreihe 4). Derartige Verbindungen können.

- weniger massive Phageninfektionen abblocken

- die Anreicherung von Phagen bis zu einer kritischen, die gesamte Bakterienpopulation vernichtenden-Phagenmenge verhindern

- kurzzeitige Fermentationsprozesse selbst vor massiven Phageninf ektionen schützen. ,. . '.

Auch bezüglich dieser Mittel ist ihre völlige Unschädlichkeit! für das Wirtsbakterium

,.,,..Beispiels reihe 1: Plaquehemmzonen in unterschiedlichen Phagen/Wirt-Ivombinat ionen nach Applikation erfindungs gemäßer Verbindungen ~

Verbindung · Plaquehemmzone (mm)

LPP-1 Φ105 PZ-A PZ-B λ

2-Chlor-4,6-bis-dimethylaniino--1,3,5-triazin 11,0+0,6 O 4,3+0,6 1,7+1,7 3,ö+0,6

2-Chlor-4-diniethylaniino-6-diätayianiino-1,3,5- 4,0+0,6 10 + 0 3,3+0,3 O "1,2+0,4

,triazin , %

2-Chlor-4-dimethylamino-6-morpholino-1,3,5-triazin 0 ^+; 7+1 5,7+0,3 3,3+0,3 2,8+0,4

o-i^^- 17,3+0,9 7+1 4,7+0,3 2,7+1,7 3,7+0,5 triazin .

2-Chlor-4,6-bis-äthylaffiino-1,3,5-triazin 14,3+2,0 O 4,7+0,3 5,3+0,3 2,3+0,2

2-Chlor-4-diäthylamino-6-raethoxyätnyTamino- 4,7+1,7 7 + 1 4,3+0,3 O O

1,3,5-triazin

2-Chlor-4,6-bis-isopropylamino-1,3,5-triazin 11,5+0,9 O 5,3+0,3 0,0+1,2 3,0+0,0

2-Mercapto-4-dimethylamino-6-metho:xypropylamino- O 8+1 3,7+0,3 O O

1,3,5-t^iazin · - -"

2-Methylmercapto-4-methylamino-6-diπlethylamino- O O 5,0+0 5,0+0 1,8+0,4

135tiU

2-Methylmercapto-4-dJjaethylamino-6-morpholino- O ^J 16 + 2 4,0+0 4,0+0 1,8+0,2

1,3,5-triazin \ * " "~

2-Methylmercapto-4-dimethylamino-6-isopropylamino- 9,7+0,7 ,1 + 0 4,7+0,3 0 0

1,3,5-triazin

2-Methylmercapto-4-äthylamino-6-isopropylamino- 27,7+2,6 8+1 0 8,7+0,7 2,6+0,7

1,3,5-triazin '

2-Methylmercapto-4,6-bis-isopropylamino-1,3,5- 17,4+1,9 ?0 8,0+0 7,7+0,3 2,4+0,6

triazin · >.

2-Methylmercapt€-4,6-bis-(N-methyl-N-cyanäthyl-r 7,3+0,7^+; 0 - 3,7+O,.3 3,7+0,3 2,0+0,6

amino)-1,3,5-triazin : χ " *""

2-Methoxy-4-methylaJIlino-6-morpholino-1,3,5-triazin

2-Me t hoxy-4-dime thy lamino-6-me thoxy pr opy lamino-1,3,5-triazin .

2-Mefehoxy-4-diäthylamino-6-isopropylamino-1, 3,5-triazin -

2-Methoxy-4-diäthylamino-6-methoxyäthylamino-1,3,5-ta?iazin

, ' ⁺^l'estkonzentration 0,05%

	0	+ )	9.	+	1	4,	7+0,	3	3	0	3	1,	2+0,	3
15,	8+2	,0		0		3,	0+0,	6	3	,7+0,			0
	7+0	,7		0			0		4	,0+0	7	1,	4+0,	4
19,	3+1	,2	3	+	1		0		,3+0,	4,	3+0,	2

Beispielsreihe. 2: Nachweis der kurativen Wirkungen und der fehlenden oder positiven Bakterienbeeinflussung durch erfindungsgemäße Verbindungen in ilüssigkulturen durch Trübungsmessungen

Verbindung kurätive Bakterien-

Wirkung beeinflus- >, sung ου

2-Chlor-4,6-bis-dimethylamino-1,3,5-triazin 2-Ghlor-4~dimethylamino~6-morpholino-1,3,5-

triazin

2-Ghlor-4-dimethylamino-6-isopropylamino--

1,3,5-triazin

2-Ghlor-4-diäthylamino-6-methoxyäthylamino-

1,3,5-triazin

2-Mercapto-4-dimethylamino-6-metho:x;ypropyl-

. ^;amino-1,3,5-triazin

S-Methylmercaptio^-dimetihylamino-e-isoprp-

pylamino-1,3,5-triazin

2-IvIethylmercapto-4,6-bis-isopropylamino-

1,3,5-triazin

2-Methylmercapto-4,6-bis-(N-methyl-H-cyan-

äthylamino)- 1,3,5-triazin

103,6	+ . 3,6
99,0	+ 14,0
102,0	+ 6,0
98,0 -	+ 2,0
100,0	+ 2,0
102,1	+ 9,3
99,0.	' + 5,2
102,8	+ 5,6

1) ·

^J irübung phageninfizierter Kulturen mit Substanz in Prozent der Trübung einer unbehandelten Bakterienkultur ohne Phagen

2) ^J Differenz der Trübung von Bakterienkulturen mit .und ohne Sub-.stanz in Prozent der Trübung der Bakterienkultur ohne Substanz

- ίο -

Beispielsreilie, 4: Nachweis der Verzögerung der Phagenwirkung und

der fehlenden oder positiven Baicterienbeeinflussung durch erfindungsgemäße Verbindungen in Flüssigkulturen durch Trübungsmessungen

Verbindung

Verzöge rung der Phagen wirkung	Bakterien beeinflus sung
(min) J	(%)2) .
75	.+ 5,9
60	+ 0,8
55	-.+. 5,9
130	.. ο
150	0

2-Chlor-4-dimetihylaniino-6-diäthylaniino-

1,3,5-triazin 2-Methylmercapto-4-methylamino-6-dimethyl-

amino-1,3,5-t^ia2in 2-Methylmercapto-4-dimethylamino-6-morρho-.

,,5

2-Methoxy-4-methylamino-6-morpholino-1,3,5-

' _v triazin

2-Methoxy-4-dimethylamino-6-methoxypropyl-

amino-1,3,5-ti'iazin

'Zeit zwischen Lysebeginn in einer phageninfizierten Bakterienkultur und dem Beginn von Lyseer'scheinungen in einer phagen-r infizierten Bakterienkultur mit Substanzzusatz

2 V '

'wie in'Beispielsreihe 2

Legende zu Beispielsreihe 3* Nachweis der Verhinderung phagenbedingter Lyse und der Gewährleistung des Wachsturns der Bakterien in Flüssigkulturen unter dem Einfluß erfindungs gemäßer Verbindungen. Dagestellt ist der in !Trübungsmessungen festgestellte zeitliche Verlauf der Veränderungen der Zelldichte in Bakterienkulturen ohne Phagen (ausgezogene Linien), mit'Phagen (unterbrochene Linien),' ohne Subs tanz ζ us at ζ (punktföriaige Meßwerte) und mit Substanzzusatz (kreuzförmige Meßwerte). Angewendete Substanzen und Konzentrationen:·

3.1. 2-Chlor-4,6-bis-dimethylamino-i,3,5-triazin • ' 1·1O~³ g/ml

3.2. 2-Chlor-4-dimethylamino-6-isopropylamino-1,3,>-t;riazin 8-10""⁴ g/ml

3.3· 2-Mercapto-4~dimethylamino-6~methoxypropylamino-1,3,5-5ΊΟ-⁴ g/ml . " triazin

3.4. 2-Methylmercapto-4,6-bis-(N-methyl-N-cyanäthylüüiino)-1.10"³ g/ml - 1,3,5-ti'iazin

Claims (1)

1. ^rfindungsansprüche: _ - ·

   Liittel zur Stabilisierung phagengefährdeter inikrobiologischtechnischer Syntheseprozesse, gekennzeichnet dadurch, daß .7irk stoffe der allgemeinen Formel (I)

   - Λ

   eingesetzt werden,
   'worin in beliebiger Variation

   R₁ = Cl, CH₃S oder CiI₃O -R₄ R₀ und Ro = Morpholino und/oder N\

   R₄ = H oder Alkyl

   Rt = Alkyl oder durch CIUO oder CN substituiertes

   Alkyl

   bedeuten und daß neben den erfindungsgemäßen Wirkstoffen Lösungsvermittler und/oder weitere Formulierungshilfsmittel enthalten sein können.