DD216451A5

DD216451A5 - Verfahren zur gewinnung eines dipeptidderivats

Info

Publication number: DD216451A5
Application number: DD24340782A
Authority: DD
Inventors: Kiyotaka Oyama; Shigeaki Irino; Norio Hagi
Original assignee: Toyo Soda Mfg Co Ltd; Sagami Chem Res
Priority date: 1981-09-21
Filing date: 1982-09-21
Publication date: 1984-12-12

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Dipeptidderivates. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und industriell vorteilhaften Verfahrens zur Abtrennung der Additionsverbindung. Erfindungsgemaess wird ein organisches Loesungsmittel, das geeignet ist zur Bildung eines binaeren Phasensystems mit Wasser, mit einem waessrigen Gemisch vermischt, das als eine feste Komponente ein Dipeptidesterderivat der Formel I enthaelt, worin R tief 1 eine Niedrigalkylgruppe ist, R tief 2 eine Seitenkettengruppe einer Aminosaeure ist, n 1 oder 2 ist, X eine Benzyloxycarbonylgruppe, die einen Kernsubstituenten haben kann, und Y ein Wasserstoffion u. a. Danach laesst man das resultierende Gemisch absetzen unter Bildung einer organischen Loesungsmittelphase, die eine wesentliche Menge des Dipeptidderivates im festen Zustand enthaelt, und einer waessrigen Phase. Die organische Loesungsmittelphase wird von der waessrigen Phase getrennt und das Dipeptidderivat aus der organischen Loesungsmittelphase gewonnen.

Description

.:> © rl in, den. 21.3.198 Ai? G 07 G/243 407" (61 437/12)

Verfahren aur Gewinnung eines Dipeptidderivats

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren aur Gewinnung eines DipeptidderivatSe Inabesondere betrifft sie ein Verfahren «ur Gewinnung eines Dipeptidderivats aus einer wlißrigen ou3pension davon mit einem organischen Lösungsmittel»

Eine Additionaverbindung eines Dipeptidecters, wie eines jK-Benayloxycarboayl-ot-Lraspartyl-L-phenylalaninniedrigalkylesters mit einem Aminosäureester, wie einem Phenylalanin-niedrigalkylester oder Valinniedrigalkyleater, ist geeignet als Zwischenprodukt für einen OC-L--Aspartyl-L-phenylalanin-niedrigalkylester, der ein Süßstoff ist oder als ein Zwischenprodukt für die optische Trennung einer razemischen Aadnosäuremodifikation,

Gharakturistik der bekannten technischen Lösungen

Eine derartige Additionsverbinduag ist beispielsweise erhältlich durch Reaktion einer itf-geschützten Aminodi~ carbons.lure mit einem Aminosäureester in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit oiner Protease (U3~P3en 4 I6^lj> 311 und 4 256 836) oder durch Reaktion eines Dipeptidessers mi: einem 'Aminosäureester in einem Lösungsmittel,, wie Wa.jaer (JA-Oben Ür. 19234/80 und 72644/80). Bei diesen Reaktionen scheidet sich die Additioxisveroinduag als eine ffcotc Komponente in dem wäßrigen Medium ab. Darüber hinaus verbleibt eine .ve sent liehe Menge von noch aktiver Protease wie gelöst im ersteren ialle im wäßrigen Medium, Dementsprechend ist es sehr wichtig, die Zusatz-

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verbindung sowie die Protease aus dem water igen Me.dium .. :-.--, wirksam wiederzugowinnen. ....

Bei den vorstehend genannten üblichen Methoden erfolgt die. Wiedergewinnung der Additionsverbindung durch. Filtrieren, wobei keine Wiedergewinnung der Protease durchgeführt wird.

ώ3 ist auch bekannt, ein organisches Lösungsmittel, das zur Bildung eines binären Phasensystems mit Wasser' geeignet ist, zu dem Reaktionsgemisch zuzusetzen, wodurch die Additionsverbindung gelöst und in das Lösungsmittel extrahiert "wird und in der Form einer gleichmäßigen ' Lösung in dem organischen Lösungsmittel abgetrennt werden ka.un( US-PS 4 212 946). Um die Extraktion wirksam dui-chaufuhren, sollte das organische Lösungsmittel geeignet^v" ' eein, nicht nur ein binäres Phasensystem au bilden, son«¹-'' dern auch ein gutes Lösungsvermögen für die Additions-" verbindung aufzuweisen. Es gibt jedoch nur eine begrenzte Anzahl organischer Lösungsmittel, die'diesen Srforder- ^; nissen entsprechen. Typische Beispiele sind äster, wie A'thylaeetat oder Alkylhalogenide, wie 1,2-Dichloräthaa» Jedoch, ergeben Ester das Problem, daß sie der Hydrolyse' unterliegen, während Alkylhalogenide in"der letst en Zeit als Ge.rcinogen angesehen werden und deren Verwendung ζur Behandlung der Additionsverbindung, die als Aus-¹ ' gangs täterial für Nahrungsmittel verwendet wird, ver-'mieden werden seilte.

Darüber hinaus iat es, v/erm das organische Lösungsmittel weniger, wirksam aur Auflösung-'der Additions verbindung ist, erforderlich, es in einer größeren rfenge au ver- vve.aden, 'was au v.'irtGchaftlicaen Nachteilen '.führt·

-3~ ,21.3.1983

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Ziel der Erfindung

Eb ist das Ziel der Erfindung, die vorstehenden Schwierigkeiten zu überwinden und ein industriell vorteilhaftes Verfahren zur Abtrennung der Additionsverbindung· bereitzustellen,

Ds.rleft.uug des Wesens der.Erfindung

per Erfindung liegt die Aufgabe¹ zugrunde, die Abtrennung

der Additions verbindung in einem binären fhaaensystem vor-' aunehnien.

Brfindungsgemäß, hat sich überraschenderweise gezeigt, daß in einem binären Phasensystem, das eine wäßrige Phase und eine organische' Lb'sungsmittelphase enthält, Kristalle der Additionsverbindung in die organische Lösungsmifcfcelphase im featen Zustand aufgenommen werden und dadurch wirksam von. tier wäfirigen Phase, die daa nichtreagierte Material und Protease enthält, abgetrennt werden kann. Dies stellt den Gegenstand der Erfindung dar.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Gewinnung eines Dipeptidderivats, das darin besteht, ein organisches Losungsniitxel, das zur Bildung eines binären

Phaoensystems mit Wasser geeignet ist, mit einera wäßrigen Gemisch zu vermischen, das als eine feste Komponente ein Dipeptidesterclerivat mit der Formel

ο ρ ion. ο

R₁-O-C-CH-JAH-C-CH-C CH₉ J_n-C-O^iY"¹* (1)

Cm

enthält, worin R- eine lüedrigalkylgruppe ist, H_? eine öeitenköttengruppe einer Aminosäure ist, η 1 oder 2 ist, X eine Benzyloxycarbony!gruppe ist, die einen Kernsubstituenten aufweisen kann, und Y ein Wasserstoffion oder ein Ammoniumderivation der Formel

I₁

H₀N-CH-C-O-R. (Π)

3 ι 4

R_n

ist, worin R-. eine Seitenkettengruppe einer Aminosäure darstellt und R. eine Niedrigalkylgruppe ist, daß man das Reaktionsgemisch absetzen läßt, unter Bildung'von . .

1. einer organischen Lösungsmittelphase, die im festen Zustand eine wesentliche Menge des Dipeptidderivats der Formel ·

O O NHX O

. ii, Hi Ii ,_ + .. . .. .

R₁-O-C-CH-NH-C-CH-(CH₀) -C-O -Z , (III)

χ ι ^n

enthält, worin R₁, R₀, η und X wie vorstehend definiert sind und Z ein Wasserstoffion oder ein Ammoniumderivation der Formel ,

H₃N⁺-CH-C-O-R₄ ^(IV^

*3

ist, worin R₃ und R. wie vorstehend definiert sind, und

2. einer wässrigen Phase,

daß man die organische Lösüngsmittelphase von der wässrigen Phase abtrennt und das Dipeptidderivat aus der organischen Lösungsmittelphase gewinnt.

Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der

Erfindung beschrieben. In den vorstehenden Formeln bedeuten R₁ und R. jeweils, eine Niedrigalkylgruppe, wie eine Methylgruppe, eine Äthylgruppe, eine Propylgruppc oder eine Butylgruppe, und jedes von R₂ und R₃ ist eine Seitenkettengruppe einer Aminosäure, wie eine Methyl-

v gruppe, eine Isopropylgruppe, eine Isobutylgruppe, eine Isoaraylgruppe, eine Benzy!gruppe oder eine p-Hydroxybenzylgruppe. Besonders bevorzugt als R_ ist eine Benzylgruppe. X kann eine Benzyloxycarbonylgruppe sein, die einen Substituenten an ihrem Kern aufweisen kann, wie eine Benzyloxycarbonylgruppe oder eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe.

Das wässrige Gemisch, das die Additionsverbindung der allgemeinen Formel I im festen Zustand enthält, kann erhalten werden durch Reaktion eines Aminosäureesters mit der Formel

Ii

R₁-O-C-CiI-NH₂ (V)

R

worin R₁ und R- wie vorstehend definiert sind, mit einer N-geschützten Aminödicarbonsäure mit der Formel

«p- O NHX O

ti I Il

HO-C-(CH₉) - CH-C-OH (VI)

worin η und X wie vorstehend definiert sind, in Anwesenheit einer Protease, vorzugsweise einer Metalloprotease, in einem wässrigen Medium, wodurch die

Additionsverbindung der Formel I, worin R₃ gleich wie R„ ist und R₄ gleich ist wie R₁, ausfällt.

Die Additionsverbindung der Formel I, der Aminosäureester der Formel V und die N-geschützte Aminödicarbonsäure der

Formel VI werden im folgenden einfach als Additionsver- bindung'/ Aminosäureester, bzw. N-geschützte Aminodicarbonsäure bezeichnet.

Das vorstehend erwähnte Verfahren zur Herstellung der Additionsverbindung kann durchgeführt werden unter den Bedingungen, wie sie beschrieben werden in den US-PSen 4 16.5 311 und 4 256 836. Beispielsweise können folgende Bedingungen angev/endet werden.

Konzentrationen des Aminosäureesters und der N-geschützten Aminodicarbonsäure in dem wässrigen Medium von etwa 0,1 bis etwa 5 m, vorzugsweise von etwa 0,2 bis etwa 2m

Molverhältnis des Aminosäureesters zu der N-geschützten Aminodicarbonsäure von etwa 5:1 bis etwa 1:5, vorzugsweise von 2:1 bis etwa 1 :4

Enzyme

Proteasen wie saure Proteasen, Thiolproteasen, Metalloproteasen und Serinproteasen_f vorzugsweise Metalloprotea- ; sen, wie Prolisin, Thermolysin, Tasinase und PS-Protease. Ein rohes Enzym von z.B. .Thermoase kann ebenfalls verwendet werden.

Enzymkonzentration Gewöhnlich etwa 2 bis etwa 400 mg pro Mol des Substrats (d.h. etwa 5 χ 10~ bis

-2 etwa 1 χ 10 rtiMol) , Vorzugs-

_7 —

weise etwa 5 bis etwa 100 mg

pro Mol des Substrats (d.h.

etwa 1 χ 10~⁴ bis 3 χ 10~³ rriMol) .

pH-Wert der Lösung zum Zeitpunkt der Reaktion

Im Bereich, in dem das Enzym seine proteolytische Wirksamkeit ausübt, gewöhnlich bei einem pH-Wert von etwa 4 bis etwa 9, vorzugsweise von 4 bis 8.

15'

Reaktionstemperatur

Innerhalb des Temperaturbereichs, bei dem das Enzym seine enzymatische Aktivität beibehalten kann, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 50°C.

Bei diesem Verfahren werden der Aminosäureester bzw. die N-geschützte Aminodicarbonsäure in der L-Form oder in Form eines Gemischs der L- und D-Formen verwendet. Wenn ein L-Aminosäureester verwendet wird, so erhält man eine Additionsverbindung eines L,L-Dipeptidesters mit einem L-Aminosäureester. Wenn ein Gemisch eines L-Aminosäureesters und eines D-Aminosäureesters verwendet wird, so erhält man eine Additionsverbindung eines L,L-Dipeptidesters mit einem D-Aminösäureester oder ein Gemisch von D- und L-Aminosäureestern.

Das erfindungsgemäße wässrige Gemisch kann auch hergestellt werden durch Reaktion des Aminosäureesters mit einem Dipeptidester, dargestellt durch die allgemeine Formel ,

35 O

HO

-i-

NIIX O ο I Il I (CH₂)_n- CH -C-NH-CH-C-O-R

(VII) *

worin R^, R., η und X wie vorstehend definiert sind, in einem wässrigen Medium. Die dabei erhaltene Additionsverbindung ist geeignet für die optische Trennung von D,L-Aminosäureestern, wie beschrieben in den JA-OSen Nr. 19234/80 und 73644/8o.

Das erfindungsgemäß zu verwendende wässrige Gemisch ist nicht auf eines beschränkt, das nach den vorstehenden Verfahren erhalten wurde, und kann eine wässrige Sus-]0 pension sein, die erhalten wurde durch Suspendieren einer Additionsverbindung, hergestellt nach den vorstehend erwähnten Verfahren oder jeglichen anderen Verfahren in Wasser.

]5 Wenn ein organisches Lösungsmittel, das zur Bildung eines binärer. Phasensystems mit Wasser geeignet, ist, zu dem so erhaltenen wässrigen Gemisch gefügt wird,, werden Kristalle der Additionsverbindung im festen Zustand in die organische Lösungsmittelphase unter Bildung

:>0 einer Aufschlämmung übertragen.

Als geeignetes organisches Lösungsmittel, das zur Bildung eines binären Phasensystems geeignet ist, können genannt werden, ein aromatischer Kohlenwasserstoff,wie J5 Benzol oder Toluol, ein aliphatischer Kohlenwasserstoff, wie η-Hexan, n-Heptan oder Cyclohexan, ein Äther, wie Diäthyläther oder Diisopropyläther, ein Keton, wie Methylisobutylketon, Dibutylketon oder Diisobutylketon, oder ein Gemisch davon.

Erfindungsgemäß wird das organische Lösungsmittel verwendet, um die Additionsverbindung in der Form einer Aufschlämmung des Lösungsmittels abzutrennen und das Lösungsmittel wird in einer Menge verwendet, die es ermöglicht, daß ein wesentlicher Teil der Additionsverbindung in festem Zustand verbleibt. Die Menge des orga-

.1 nischen "Lösungsmittels beträgt gewöhnlich etwa 1 bis etwa 20 Gew.-Teile, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 15 Gew.-Teile, besonders bevorzugt weniger als 10 Gew.-Teile und nicht mehr als 1 Gew.-Teil, basierend auf 1 Gew.-Teil der Additionsverbindung.

Wenn das binäre Phasensystem, das eine organische Lösungsmittelphase und eine wässrige Phase enthält, derart gebildet wird, daß die Additionsverbindung in der organischen Phase suspendiert ist, so enthält das organische Lösungsmittel die Additionsverbindung im wesentlichen in fester aufgeschlämmter Form, obwohl,ein Teil der Additionsverbindung je nach ihrer Löslichkeit in dem organischen Lösungsmittel gelöst ist.

, ; ·

Die Wassermenge in dem als Ausgangsmaterial gemäß der Erfindung verwendeten wässrigen Gemisch ist nicht kritisch. Sie liegt jedoch gewöhnlich bei"0,3 bis etwa 20 Gew.-Teilen, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 15 Gew.-Teilen, basierend auf 1 Gew.-Teil der Additionsverbindung

Erfindungsgemäß liegt die Temperatur zum Zeitpunkt des Kontakts des wässrigen Gemischs, das die Additionsverbindung enthält, mit dem organischen Lösungsmittel gewohnlich bei etwa 0 bis etwa 80°C. Jedoch ist es im Falle, wenn die verbleibende Protease aus der wässrigen Phase wiedergewonnen werden soll, bevorzugt, das Vermischen bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 50°C durchzuführen. Die Zeit für das Vermischen oder die Phasentrennung ist nicht kritisch und liegt gewöhnlich bei 5 min bis 3h.

Die organische Lösungsmittelphase, die den wesentlichen Anteil der Additionsverbindung in Form einer Aufschlämmung enthält, kann von der wässrigen Phase, die die

. -ιοί Protease enthält, in üblicher Weise, wie sie gewöhnlich für die Flüssigkeits-Flüssigkeits-Trennung verwendet wird, durchgeführt werden. Der Hauptanteil des Aminosäureesters, der N-geschützten Aminod.!carbonsäure und der nichtjumgesetzt und nichtdesaktiviert in der vorstehenden Reaktion zur Bildung der Additionsverbindung verbleibenden Protease, verbleiben in der wässrigen Phase, und dementsprechend kann die Additionsverbindung von diesen abgetrennt werden. Die Additionsverbindung kann aus der abgetrennten organischen Phase isoliert werden in üblicher Weise, wie durch Filtrieren oder Entfernen des organischen Lösungsmittels durch Verdampfen.

Es ist auch möglich, die abgetrennte organische Phase mit einer wässrigen saueren Lösung in Kontakt zu bringen, derart, daß der Aminosäureester als ein Bestandteil der Additionsverbindung dadurch in die wässrige Phase übertragen wird, worauf der Aminosäureester aus der wässrigen Phase isoliert wird, während der Dipeptid- ;:0 ester als anderer Bestandteil der Additionsverbiridung aus dem organischen Lösungsmittel isoliert wird.

Tatsächlich werden nach der Trennung der organischen Lösungsmittelphase von der wässrigen Phase Wasser und 2,b eine Br0nsted-Säure zu der abgetrennten organischen Lösungsmittelphase zugesetzt und damit vermischt, und das so erhaltene Gemisch wird einer Phasentrennung unterzogen, unter Bildung von

1. einer zweiten organischen Lösungsmittelphase, die ein Dipeptidesterderivat der Formel

K₁-U-C-UH-NH-C-

O O NHX O

c;

I R.

R₁-O-C-CH-NH-C-qi.I-(CII₂)_n-C-O"-H⁺ (VHl)

\ enthält, worin R., R„, X und η wie vorstehend defi*- niert sind, und . , ; . ;

2. einer zweiten wässrigen Phase, die ein Aminosäureesterion enthält, mit der Formel

R₄-O-C-CH-N HL (IX)

I ^R3

worin R~ und R. wie vorstehend definiert sind.

Die beiden Phasen werden voneinander getrennt und das endgültige Dipeptidderivat wird aus der zweiten orga^· nischen Lösungsmittelphase gewonnen, während ein Aminosäureester der Formel

H₂N-CH-C-O-R₄ (X)

worin R^' und R. wie vorstehend definiert sind, aus der zweiten wässrigen Phase gewonnen wird.

Falls X in dem Dipeptidester eine Benzyloxycarbonylgruppe ist, so ist es vorteilhaft, Toluol als organisches Lösungsmittel zu verwenden, da Toluol leicht, wie nachstehend beschrieben, wiedergewonnen und erneut verwendet werden kann.

Die Menge an Wasser, die zu der ersten von der ersten wässrigen Phase abgetrennten organischen Lösungsmittelphase gefügt wird, liegt gewöhnlich bei etwa 0,5 bis etwa 15 Gew.-Teilen, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 'Gew.-Teilen, basierend auf 1 Gew.-Teil der Additions-

„ιοί verbindung, unter Einbeziehung von Wasser, das von der Säure stammt. Wenn die Säure in der Form einer wässrigen Lösung verwendet wird, so kann die erforderliche Wassermenge in der Form der wässrigen Lösung der Säure zugesetzt werden.

Die zusammen mit dem Wasser zu der Reaktion mit der Additionsverbindung zuzusetzende Säure ist eine anorganische oder organische Br0nsted-Säure. Als anorganische Br0nsted-Säure können genannt werden, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Als organische Br^nsted-Säure können Ameisensäure, Essigsäure, Zitronensäure oder Toluolsulfonsäure genannt werden. Diese Säuren können in der Form einer wässrigen Lösung verwendet werden. Die Konzentration der Säure in der wässrigen Lösung ist nicht kritisch und kann wahlfrei derart bestimmt werden, daß die Wassermenge in den vorstehend angegebenen Bereich fällt.,

•20 Darüberhinaus kann auch eine feste Säure, wie ein Kationenaustauscherharz vom Η-Typ verwendet werden. In diesem Falle setzt sich eine derartige feste Säure am Boden des Systems ab.

Die wesentliche Funktion der Säure liegt in der elektrolytischen Dissoziation des Aminosäureesterteils der Additionsverbindung und dadurch der Bildung einer wässrigen Lösung eines Salzes des Aminosäureesters. (Jedoch wird im Falle der Verwendung einer festen Säure der Aminosäureester mit den Wasserstoffionen der festen Säure ionenausgetauscht und aus dem wässrigen Phasensystem abgezogen.) Daher ist die Menge der Säure, bezogen auf die Additionsverbindung in dem wässrigen Gemisch als Ausgangsmaterial eine stöchiometrische Menge oder mehr, d.h. von etwa 1 bis etwa

-13- ..-. .;. . _Γ ^ν

Äquivalente, vorzugsweise etwa 1 bis 20 Äquivalente, besonders bevorzugt etwa- 1 bis etwa 10 Äquivalente, basierend auf 1 Mol der Additionsverbindung. Jedoch muß in einigen Fällen der Dipeptidester nicht notwendigerweise so rein, je nach seinem speziellen Zweck,sein. In einem derartigen Falle kann die Säure in einer Menge von weniger als der stöchiometrischen Menge verv/endet werden.

Die Abtrennung des Dipeptide nach der elektrolytischen Dissoziation von der Additionsverbindung wird gewöhnlich durchgeführt durch Übertragen in das organische Lösungsmittel in der Form einer Aufschlämmung. Wird jedoch ein Keton, das zur Bildung eines binären Phasen-^ systems mit Wasser geeignet ist, verwendet, so kann die Abtrennung in der Form seiner Lösung erfolgen.

Die Temperatur zum Zeitpunkt der Behandlung der Additionsverbindung bei dieser Ausführungsform liegt gewohnlich bei etwa 0 bis etwa 100°C, vorzugsweise bei etwa 5 bis etwa 80⁰C. Die Dissoziationsreaktion der Additionsverbindung ist gewöhnlich innerhalb von 10 min vollständig, vorausgesetzt daß in entsprechender Weise gerührt wird.

Ist jedoch die Schutzgruppe X eine Gruppe, die relativ gut hydrolysierbar ist, wie eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, so sollte in entsprechender Weise darauf geachtet werden, die Reaktionszeit und die Reaktionstemperatur zu steuern, um eine Freisetzung der Gruppe zu vermeiden, mit Ausnahme des Falles, daß die Freisetzung der Gruppe gewünscht oder zulässig ist.

Beim Kontakt mit der Säure wird die feste Additionsverbindung in einen Dipeptidester und ein Salz eines Amino-

- ΜΙ säureesters rait der Säure dissoziiert. Der Dipeptidester

weist eine geringe Löslichkeit in der wässrigsauren ι Lösung auf, und der wesentliche Anteil davon liegt in der organischen Lösungsmittelphase in der Form einer Aufschlämmung oder eines gelösten Materials vor. Andererseits ist das Salz des Aminosäureesters in der wässrigsauren Lösung sehr gut löslich und löst sich in der ^; wässrigen Phase. Wenn eine feste Säure verwendet wird, so fällt der Aminosäureester als ihr Salz aus. Somit

führt das Reaktionssystem zu einem binären Phasensystem das eine organische Phase, die den Dipeptidester in der Form einer Aufschlämmung oder eines gelösten Materials enthält, und eine wässrige Lösung des Salzes des Aminosäureesters aufweist. Die Trennung des binären Phasensystems kann nach einer üblichen Flüssigkeits-Flüssigkeits-Trennmethode erfolgen. Die Gewinnung des Aminosäureesters aus dem festen Säuresalz kann auch leicht in üblicher Weise durchgeführt werden.

Der Dipeptidester kann aus der organischen Aufschlämmungsphase in üblicher Weise gewonnen werden, wie durch Filtrieren, Zentrifugenabscheidung oder Entfernung des Lösungsmittels durch Verdampfen. Andererseits kann die organische Aufschlämmung direkt der nächsten Reaktionsstufe zur Entfernung der Schutzgruppe unterzogen werden. Insbesondere für den Fall, daß X in der Formel I für den Dipeptidester eine Benzyloxycarbonylgruppe ist und das organische Lösungsmittel Toluol ist, wird, wenn Wasser zu der abgetrennten organischen Aufschlämmungsphase gefügt wird und die Entfernung der Benzyloxycarbonylgruppe reduktiv durchgeführt wird, der Dipeptidester mit seiner Aminogruppe mit entfernter Schutzgruppe in die wässrige Phase übertragen. Es ist daher möglich, nicht nur die Entfernung der N-Schutzgruppen durchzuführen, son-

dern auch die entfernten Schutzgruppen in das Toluol, bei dem es sich um das gleiche wie das Lösungsmittel handelt, zu übertragen. So führt die Entfernungsreaktion nicht zu einer Verunreinigung des Lösungsmittels, und das als Lösungsmittel verwendete Toluol kann leicht zur Wiederverwendung wiedergewonnen werden.

Dies ist besonders günstig für die industrielle Erzeugung von Aspartam, einem Süßstoff mit geringem Kaloriengehalt, wenn die Additionsverbindung die allgemeine Formel I aufweist, worin jedes ,von R₁ und R. eine Methylgruppe ist, und jedes von R- und R₃ eine Benzylgruppe ist und η 1 ist.

Darüberhinaus ist es möglich, den Aminosäureester, aus der wässrig-sauren Lösung abgetrennt von der organischen Phase in üblicher Weise zu gewinnen, z.B. durch Konzentrieren der sauren Lösung, um den Aminoester in Form eines Salzes auskristallisieren zu lassen, oder durch Alkalischmachen der Lösung, gefolgt von der Extraktion mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel. Die Wiedergewinnung des Aminosäureesters aus dem Salz einer festen Säure kann auch leicht in üblicher Weise durchgeführt werden. '·...

Wenn die erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial zu verwendende Additionsverbindung nach der vorstehenden Methode der US-PSen 4 165 311 und 4 256 836 hergestellt wird, so liegt der Dipeptidrest davon in der L,L-Konfiguration vor, während der Aminosäureesterrest davon in einer der L-Konfigurationen, D-Konfigurationen oder einem Gemisch von D- und L-Konfigurationen vorliegt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf jegliche dieser Konfigurations-Variationen durchführbar. Darüberhinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren auch auf den Fall

anwendbar, wenn der Dipeptldrest in der D,D-Konfiguration der D,L-Konfiguration oder L,D-Konfiguration vorliegt.

Der durch das erfindungsgeraäße Verfahren erhaltene Dipeptidester ist als solcher brauchbar als Zwischenprodukt für die Peptidsynthese, und ein Dipeptidester, der erzielbar ist, durch Entfernung der Aminoschutzgruppe X daraus, ist ebenfalls eine brauchbare Verbindung. Beispielsweise ist ein o^-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester als Süßstoff brauchbar, wie vorstehend erwähnt. Darüberhinaus -sind optisch getrennte Aminosäureester aus der Additionsverbindung erhältlich, die durch Vermischen des. Dipeptidesters und eines razemischen Aminosäüreesters gebildet wird . Somit ist das Verfahren als Methode zur optischen Trennung brauchbar.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Säure, vorzugsweise die vorstehende Br?5nsted-Säure zu dem .wässrigen Ausgangsgemisch zusammen mit dem organischen Lösungsmittel zum Zeitpunkt des Vermischens des organischen Lösungsmittels mit dem wässrigen Gemisch gefügt, wodurch· die Additionsverbindung, d.h. das Dipeptidesterderivat der vorstehenden Formel I, worin Y ein Ammoniumderivation der vorstehenden Formel II

?,b ist, elektrolytisch durch Säure dissoziiert wird, zu einem Dipeptidderivat der vorstehenden Formel III, worin Z Wasserstoffion ist, und eine_m Aminosäureester der vorstehenden Formel X und das Dipeptidderivat wird in die organische Lösungsmittelphase im wesentlichen im festen Zustand übertragen, während der Aminosäureester in der wässrigen Phase gelöst wird.

Das Dipeptidderivat und der Aminosäureester können aus der organischen Lösungsmittel und bzw. der wässrigen o5 Phase in gleicher Weise, wie vorstehend für die Säure-

. _-|7- . ·, . ,; .-. ' .

behandlung der abgetrennten organischen Phase beschrieben, wiedergewonnen werden.

Die für diese Ausführungsform zu verwendende Säure ist die gleiche anorganische oder organische Brjinsted-Säure wie vorstehend in bezug auf die Säurebehandlung der abgetrennten organischen Lösungsmittelphase erwähnt. Die Menge der Säure liegt in gleicher Weise gewöhnlich bei etwa 1 bis etwa 100 Äquivalenten, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 20 Äquivalenten, besonders bevorzugt etwa 1 bis etwa 10 Äquivalenten, basierend auf 1 Mol der Additions verbindung. Jedoch kann die Menge geringer sein als die stöchiometrische Menge, falls das Dipeptid nicht in hochreinem Zustand erforderlich "ist.

Die Wassermenge einschließlich des Wassers, das von der Säure stammt, liegt gewöhnlich bei etwa 0,3 bis etwa 20 Gew.-Teilen, vorzugsweise bei 0,5 bis etwa 15 Gew.-Teilen, besonders bevorzugt bei etwa 1 bis etwa 10 Gew.-Teilen, basierend auf 1 Gew.-Teil der Additionsverbindung.

Andere Arbeitsbedingungen dieser Säurebehandlung, einschließlich der Abtrennung der organischen Lösungsmittelphase und der wässrig-sauren Phase, der Entfernung der N-Schutzgruppen und der Wiedergewinnung der gewünschten Produkte und der Lösungsmittel sind grundlegend die gleichen, wie sie vorstehend im Hinblick auf die Säurebehandlung der abgetrennten organischen Phase beschrieben wurden.

In der von der organischen Lösungsmittelphase abgetrennten wässrigen Phase liegt noch eine wesentliche Menge der aktiven Protease vor. Diese wässrige Phase kann weiter nach dem Konzentrieren und Wiedergewinnen

der Protease mittels beispielsweise Ultrafiltration erneut verwendet werden. Auch kann die Protease von der wässrigen Phase in üblicher Weise, wie durch Aussalzen abgetrennt und dann wiederverwendet werden. Unter diesen Methoden ist die Methode unter Anwendung der Ultrafiltration für die industrielle Verfahrensweise am vorteilhaftesten. Das Material für die Ultrafiltration ist nicht kritisch und das Ultrafilter kann aus einem Material hergestellt werden, wie Polyacrylnitril, PoIyamid, Polyimid, Polysulfon oder Celluloseacetat. Es ist jedoch bevorzugt, ein Filter mit einer geeigneten Fraktionierungseigenschaft je nach dem Molekulargewicht der verwendeten Protease und einen minimalen Absorption der Protease zu verwenden. Der Filtermodul ist nicht kritisch und es.kann jeglicher Hohlfasertyp, Spiraltyp, Zylindertyp oder Rahmen- und Plattentyp verwendet werden.

Die so konzentrierte Proteaselösung kann zusammen mit dem Aminosäureester und der N-geschützten Aminodicarbonsäure, die nicht umgesetzt verblieb, als Ausgangsmaterial für die anschließende Reaktion zur Bildung der Additionsverbindung verwendet werden 1

:ϊ5 Alternativ kann eine wässrige Lösung eines Salzes zu der konzentrierten Proteaselösung gefügt werden, und es wird erneut filtriert, um die Protease in der Form einer Lösung des Salzes, das die Protease in im wesentlichen reiner Form enthält, zu gewinnen.

Die Protease oder ihre Lösung, die so gewonnen wurde, kann erneut verwendet werden zur Reaktion zur Bildung der Additionsverbindung oder kann selbstverständlich für andere Reaktionen, bei denen eine Protease erforderlich ist, verwendet werden.

-19- "1.3.1903 .

AP C 07 G/243 407 (61 437/12)

iäs ist ersichtlich, daß durch die vorliegende Erfindung die Additionsverbindung in dem wäßrigen Gemisch in wirksamer Weise von anderen Komponenten abgetrennt und in das organische Lösungsmittel in Porin einer hochkonzentrierten Aufschlämmung übertragen werden kann« Darüber hinaus muß die Additionsverbindung nicht vollständig gelöst sein, sondern der wesentliche Anteil davon kann in die organische Lösungsniittelphase im festen Zustand extrahiert werden, wodurch die Menge des erforderlichen Lösu-igsmittels auf ein Minimum herabgesetzt wird, was industriell von Vorr.eil ist. Darüber- hinaus ist es möglich, ein organisches Lösungsmittel au verwenden, das stabiler und physiologisch sicherer ist als die lösungsmittel, die normalerweise bei der Ii)xti*aic~ tionsmethode, bei der die Additionsverbindung gelöst wird, verwendet werden. Auch ist es möglich, die Protease aus der wäßrigen Phase zu gewinnen und sie wiederzuverwen~ den, was wirtschaftlich vorteilhaft ist.

Auaführangsbeispiel

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

-20- 21.3.1983

Ai? ü 07 C/243 (61 437/12)

B e i a ρ -χ e 1 1

In einen 2-1-Kolben wurden 53»45 g N-Benzolyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 107,84 g D,L-PhenylalaniJtimethylester~ Hydrochlorid eingeführt und 400 ml destilliertes Wasser, 100 ml einer wäßrigen 5n-Iiatriumhydroxidlösung, 4,8 g rohes Tiaemiolysin (Thermoase PS-160, Warenzeichen)und 0,9 g Calciumacetatmönohydrat zugesetzt· Das Gemisch wurde bei 40 ⁰C unter Rühren umgesetzt» Wach 15 h erhielt man ein Realctionsgernisch in Form einer Suspension» 600 ml Toluol wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 20 min bei 40 ⁰C gerührt. Bei Beendigung des Rührens wurden eine Toluolphase, die eine feste Komponente in suspendiertem Zustand und eine homogene wäßrige Phaee getrennt» 10 min wurde die Toluolphase, die die feste Komponente enthielt, von der wäßrigen Phase abgetrennt, und die abgetrennte roluolphase wurde zweimal mit 200 ml einer 0,5 ί° wäßrigen Galciumacetatlösung gewaschen, und anschließend wurde die feste Komponente durch Filtrieren unter Anwendung eines Glasfilters abgetrennt. Nach dem Trocknen wurde aus einem Äthylacetat-n-Hexan-Lösungsmittelgemisch umkristallisiert, wodurch 101,1 g (Ausbeute 83,2 %) einer 1:1 -AdditionBverbindung von H-Benzoyloxycarbonyl-.OC L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester (im folgenden als "Z-APM" bezeichnet) und Phenylalaninmethylester, hauptsächlich der D-Form (im folgenden als "D-PM" bezeichnet) erhalten wurden. Diese Kristalle bestätigten sich als 1 j 1 -Additionsverbindung von Z-APM und hauptsächlich D-PM, da MiR, IR, Elementaranalyse und optische Drehung im wesentlichen identisch mit den in der US-PS 4 165 angegebenen Daten waren»

-21-

Beispiel 2

Die Reaktionen zur Bildung des Peptids und zur Bildung der Additionsverbindung wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch 7,2 g rohes Thermolysin und 1,3 g Calciumacetat-monohydrat verwendet wurden und die Reaktionszeit 8 h betrug.

Nach Beendigung der Reaktionen wurde die gleiche Behandlung wie im Beispiel 1 durchgeführt, wobei jedoch 1 1 Methylisobutylketon anstelle von Toluol verwendet wurde. Nach der Trennung wurde die Methylisobutylketonphase, die die feste Komponente in suspendiertem Zustand erhielt einer Entfernung des Lösungsmittel durch einen Rotationsverdampfer unterzogen, und der Rückstand würde aus einem Äthylacetat/n-Hexan-Lösungsmittelgemisch umkristallisiert, unter Bildung von 102*2 g (Ausbeute 84,1 %) einer 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und D-PM,

Beispiel 3

Die Reaktionen der Peptidbildung under Bildung der Additionsverbindung wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt.

Nach Beendigung der Reaktionen wurde die gleiche Behandlung wie im Beispiel 2 durchgeführt, wobei jedoch 500 ml Diisopropylather anstelle von Methylisobutylketon verwendet wurden. Nach der Trennung wurde die Diisoprcpyl· ätherphase, die die feste Komponente im suspendierten Zustand enthielt, einer Entfernung des Lösungsmittels durch einen Rotationsverdampfer unterzogen, und der Rückstand wurde aus einem Äthylacetat/n-Hexan-Lösungs-

mitte'lgemisch umkristallisiert, wobei man 96,5 g (Ausbeute 79,5 %) einer 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und D-PM erhielt.

B e is ρ' i e 1 4

Die Reaktionen zur Bildung des Peptids und zur Bildung der Additionsverbindung wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt, wobei jedoch L-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid anstelle von D,L~Phenylalaninmethylester-hydrochlorid verwendet wurde.

Nach Beendigung der Reaktionen wurde eine Nachbehandlung in gleicher Weise wie im Beispiel 2 durchgeführt, wobei jedoch ein Losungsmittelgemisch aus 900 ml Methylisobutylketon und 100 ml Toluol anstelle von Methylisobutylketon verwendet wurde. Nach der Abtrennung von der wässrigen Phase wurde aus der organischen Phase die die feste Komponente in suspendiertem Zustand enthielt, das Lösungsmittel durch einen Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde aus einem Äthylacetat/n-Hexan-Lösungsmittelgemisch umkristallisiert, wobei man 98,68 g (Ausbeute 81,2 %) einer 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und L-Phenylalaninmethylester (im folgenden als "L-PM" bezeichnet) erhielt.

Die Additionsverbindung erwies sich als eine 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und L-PM, da NMR, IR, Elementaranalyse und optische Drehung identisch mit den in der US-PS 4 165 311 beschriebenen Daten waren.

" · ' " , . ' -23- ,.'. :.;.. . /; /:· ' . -'y " ::; :;- : '

Beispiel 5 '

In einen 200 ml Kolben wurden 5,345 g N-Benzoylöxycarbonyle£-L-asparaginsäure und 10,784 g D,!^Phenylalaninmethylester-hydrochlorid eingeführt, und 40 ml destilliertes Wasser, 10 ml einer wässrigen 5n-NatriumhydroxidlÖsungi 200 mg Thermolysin und 130 mg Calciumacetat-monohydrat wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 40 C unter Rühren umgesetzt. Nach 7 h wurden 100 ml Methylisobutylketon zu dem Reaktionsgemisch gefügt, und das Gemisch wurde 20 m±n bai 40°C gerührt. Nach 10 min nach Beenden des Rührens wurde die organische Phase, die die feste Komponente enthielt, von der homogenen wässrigen Phase abgetrennt, und die abgetrennte organische Phase wurde zweimal mit 20 ml einer 0,5 % wässrigen Calciumacetatlösung gewaschen, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch einen Rotationsverdampfer entfernt, und der Rückstand wurde aus Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert,wnbs.i man 10,34 g (Ausbeute 85,2 %) einer 1 :1-Addit.ionsverbindung von Z-APM und hauptsächlich D-PM erhielt.

Beispiel 6

Die Peptidbildung, die Bildung der Additionsverbinduncr und die Behandlung nach den Reaktionen wurden in gleicher Weise wie im Beispiel 5 durchgeführt, wobei jedoch 1 g PS^Protease anstelle von Thermolysin verwendet wurde Nach dem Umkristallisieren erhielt man 9,87 g (Ausbeute 81,2 %) einer 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und hauptsächlich D-PM.

-24- 21.3.1983

AP G-07 C/243 (61 437/12)

B e i -a ρ, i e 1

In 20 nil Wasser wurden 5»0 g eines .Natriumsais es von ίί-Benzyloxy carbonyl« oC ~L-aapartyl-L~phenylalanin-methylester gelöst, und diese Lösung wurde tropfenweise zu 20 ml einer wässrigen Lösuag gefügt, die 5>0 g D,L-VaIinmethylester enthielt, wobei gerührt wurde, lach dem Stehenlassen des Gemische bei Raumtemperatur während 2 h wurden 50 ml Methylisobutylketon zugesetzt, und es wurde gerührt. Die organische Lösungsmittelphase wurde von der wässrigen Phase abgetrennt, filtriert und'getrocknet,, wodurch 5,9 g einer Additionsverbindung von E-Benzoyloxycarbonyl- {£ -L-aspartyl-L-pheny'lalaninmethyleater und Valinmethylester erhalten wurden«

Diese Additionaverbindung wurde mit einer 1n~Chlor*tfasserst off säurelös ung behandelt, wodurch D-Valinmethylester mit einer optischen Reinheit von 72 % erhalten wurde.

Bei a ρ i e_n JL_m 8 . .

In Beispiel 1 wurden die abgetrennte wässrige Phase und .die Waschlösungen vereint (Gesamtmenge 840 ml), und die enzymatische Aktivität der vereinten Lösung wurde durch eine Casein-Digestionamethode gemessen, wobei die ilestaiitivität als 86 % der beschickten Protease gefunden wurde. Diese wässrige Lösung wurde mittels einer 'Ultrafiltratlötvorrichtung vom Polysulfon-Hohlfaaertyp fraktioniertes Molekulargewicht 5.000» spezifische Filteroberfläche 0,05 ta ΐ Innendurchmesser der Hohlfaser 0,5 mm) konzentriert. Die enzymatische Aktivität der konzentrierten Lösung betrug 86 % der beschickten Protease,

-25-. 21.3.1983

AP G 07 G/243 407 (6Ί 437/12)

Unter¹ Verwendung der so erhaltenen Proteaoelösung wurde die Reaktion zur Bildung der Reaktionsverbindung wiederholt (diese Proteaselösung wurde zum Ersatz von 200 ml von 400 ml des destillierten Wasser verwendet, und die Menge an zugesetztem rohem Thermolysin betrug 0,6 g). Man erhielt im wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie bei der ersten Bildungcreaktion· '

Bei a ρ i e 1 9

Im Beispiel 2 wurden die abgetrennte wässrige Phase und die Waschlösung vereint (Gesamtmenge 840 ml), und die onzymatische Aktivität der vereinten Losung betrug 90 % der ,beschickten Protease. Diese Lösung wurde mittels einer Ultrafiltrationsvorrichtung aus Polyacrylnitril-Hohlfasern auf 200 ml konzentriert Fraktionierungs-Molekulargewicht 6,000; spezifische Filteroberfläche 0,2 m"} Innendurchmesser der Hohlfaser 0,8 mm)»

Die enzymatic ehe Aktivität der konzentrierten Lösung betrug 75 > der beschickten Protease.

B e i s ρ i e 1 10

Im Beispiel 3 wurden die wässrige Phase und die Waschlösungen vereint (Gesamtmenge 680 ml), und die enzymatis ehe Aktivität der vereinten Lösung betrug 72 % der beschickten x'rotease·

-2b- 21,3.1933

AP C 07 G/243 (61 437/12)

Diese Lösung wurde mittels einer lilt rafilt rat ionsvorriciitung vom Polyimid-Zylindertyp auf 200.ml konzen-

fcriert spezifische Filterobsrfläche 0,014 m \ Fraktionier« Molekulargewicht 20,000).

Die' enzymatlache Aktivität der konzentrierten Lösung betrug 70 fo der'beschickten Protease.

U_-1B₁₁₁I „3..P _i_r e,.1 _in ..,,.11..

Ini Beispiel 4 wurden die abgetrennte wässrige Phase und die Waschlösungen vereint C G es am t menge 920 ml), und die ensymax lache Aktivität der vereinten Lösung betrug 92 % der beBchickteri Protease, ; .

Diese Lösung wurde in gleicher Weise wie im.Beispiel 8 auf 200 ml konzentriert,

Die enzymatische .\Ktivität der konzentrierten Lösung betrug 88 % der beschickten Protease« - · . .

Darüber hinaus¹ wurde die L^;isan.g in einer konstanten Menge von 200 ml filtriert, während kontinuierlich Oj5 % -wässrige Galciumacetatlösung zugesetzt wurden, _: um die- durch die Filtration verringerte üenge zu ergänzen, wodurch eine 0,5 % wässrige Galciumacetatloöung von rohem Tfa^rmolysin, ei as im wesentlichen keine anderen Bestandteile erhielt, erhalten wurde. Die so erhaltene rohe TLiarmolysiniösung wies eine enzymatic ehe Aktivität von 85 ,1 dar, beschickten Protease auf.

-27- 21,3.1983

AP G 07 G/243 407 (61 437/12)

B e i 3 ρ i el 12

Im Beispiel 3 wurden die wässrige Phase und die Waschlösungen vereint (Gesamtmenge 70 ml), und die enzymatische Aktivität der vereinten Lösung betrug 82 % der beschickten Protease,

Diese Lösung wurde mittels einer UTfcrafiltrationsvorrichtung vom Polyacrylnitril-Hohlfasertyp auf 20 ml

konzentriert (Minitnodul i\tH—3 Modell, spezifische Filter-. ο ' ' ' '

Oberfläche 25 cm ; Innendurchmesser der Hohlfaser 0,63 mm; Fraktionier-iviolekulargewicht 6,000),

Die enzymatiache Aktivität der konzentrierten -Lösung betrug 77 % ,der beschickten Protease,

Beispiel 13

Ita Beispiel 6 wurden die abgetrennte wässrige Phase und die Waöchlösungen vereint, und die enzymatlache Aktivität der vereinten Lösung betrug 84 % der beschickten

ι .

Protease, . .

Die Lösung wurde in gleicher Weise wie in: Beispiel 12 konzentriert, und die enzymatisch^ Aktivität der konzentrierten lösung betrug 78 % der beschickten Protease»

Be i a pi e _r l V^ . ' , .

In einen 2-1-Kolben wurden 53,45 g K-Benzoyloxycarbonyl

, ~2ö- 21.3.1933

>-.· AJ? O 07 ,.G/243 407

(61 437/12)

!•-asparaginsäure und 107,84 g D,L~Phen;ylalaninmethylesterhydrochlorid beschickt, und 400 ml destilliertes Wasser, 100 tnl einer wäßrigen Sn-Nabriumhydroxidlosung, 7,2 g rob.es T.iiermolysin (Thermoase PS-I60, Warenzeichen) und 1,3 g Oalciumacetatmonohydrat wurden zugesetzt» Das Geraisch wurde bei 40 G unter Rühren umgesetzt, flach 8 h wurde das Reaktionsgeniisch zu einem wäßrigen Gemisch, das das Rea^tionsproduiit im suspendierten Zustand enthielt, gefügt* Zu diesem wäßrigen Gemisch wurden 700 ml Toluol gefugt, und es wurde 20 min bei 40 ⁰G gerührt· Beim Beenden des Rührens trennten sich eine Toluolphase, die eine feste Komponente im suspendierten Zustand enthielt, und eine homogene transparente wäßrige Phase.

üin Teil der festen Komponente wurde gesammelt, aus Athylacetat/n-Hexan umkristallisiert und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 analysiert, wordurch sich bestätigte, daß es sich um eine 1 : 1 -Additionsverbindung von Z-AMP und hauptsächlich D-PM handelte«

Die Toluolphase wurde von der wäßrigen Phaee abgetrennt, und 500 ml einer wäßrigen In-Ohlorwasserstoffsäurelosung wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 h bei 60 ⁰G gerührt· Nach dem Stehenlaosen des Gemische während etwa 20 min wurde die die feste Komponente enthaltende Toluolphase von der homogener! .transparenten· wäßrigen Phase abgetrennt· '

Die abgetrennte Toluolphase wurde zweimal mit 200 ml destilliertem. V/aaser bei 60 ⁰G gewaschen und .auf Raumtemperatur gekühlt» .Die Kristalle in der'Toluolphase wurden durch Filtrieren unter verringertem Druck mittels eines Glasfiltera gesammelt und getrocknet, wodurch man 73,42 g Z-APM. erhielt (Gesamtausbeute, bezogen auf das Ausgangs-

29- 21.3.1933 > AP G 07 ü/243 407 (61 437/12)

material, 85,2 %\ Reinheit 99,4 %)»

Beiyspiel 15 · ·

In einen 2-1-KoIben wurden 53,45 g Jti-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 86,27 g L~Phenylalaninmethylesterhydrochlorid eingeführt, und 350 ml destilliertes Wasser, 90 ml einer wäßrigen 5n-i\latriumhydroxidlösung, 4,8 g ; rohes Thermolysin (l'hermoase PS-160» »Varenzeichen) und 0,9 g Calciuüiacetatcnonohydrat wurden zugesetzt. Das Gemis^:ch wurde! unter führen bei 40 ⁰G umgesetzt. Kach 5 h wurden 600 ml Toluol zu dem Heaktionsgemisch gefugt, und das Gemisch wurde 20 min^lbei 40 ⁰G gerührt. Beim. Beenden des ßührens trennten sich eine Toluolphaae, die eine feste iioniponente im suspendierten Zustand enthielt, und eine homogene transparente wäßrige Phase. "

Teil der festen Komponente wurde als Probe entnommen, aus Athylacetat/n-Hexan unikristallisiert und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 analysiert, wodurch sich eine 1 : 1 -Ad dit L ons verbindung von Z-ArJm und L-PM bestätigte.

Die Toluolρhäse wurde von der wäßrigen Phase abgetrennt, und es wurden 500 ml einer 1n wässrigen ChiorwaüserstoffaüurelcJsung sugesetüt«, Das Gemisch wurde 1 h bei 60 C gerührt. ßacL deai äteaenlasaen des Geniischs während 20 min wurde i. ie X'oiuolphase, die die feste Komponente enthielt, von dei homogenen transparenten wäßrigen Phase abgetrennt», iiach de ω Küh.len der auge .rennten Toluolphase wurden die d^rin enthaltenen iCristalle durch Filtrieren unter verringertem Drucic mittels eines Glasfilters gesammelt und getroc-cnet, wobei man 73,27 g Z-APM erhielt (Ge samt ε. us-

. -30-

beute, bezogen auf das Ausgangsmaterial, 85,3 %, Reinheit 99,7 %) .

Beispiel 1 6

Zu einer Suspension, hergestellt durch Suspendieren ναι 4,25 g einer 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und

IC D-PM in 35 ml Toluol, wurden 10 ml in-ChlorWasserstoffsäure und 20 ml destilliertes Wasser gefügt. Das Gemisch wurde 30 min bei 60 C gerührt. Nach dem Stehenlassen des Gemischs während 20 min wurde die Toluolphase, die die feste Komponente enthielt, von der transparenten homögenen wässrigen Phase abgetrennt. Die Toluolphase wurde zweimal mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen mittels eines Rotationsverdampfers entfernt, wobei man 2,92 g Z-APM (Reinheit 99,7 %) erhielt. · ' .

Beispiel 17

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 16 gearbeitet, wobei jedoch anstelle von Toluol Diisopropyläther verwendet wurde. Das Lösungsmittel wurde aus der Isopropylätherphase, die die feste Komponente enthielt, durch Verdampfen mittels eines Rotationsverdampfers entfernt, wobei man

;}0 2,96 g Z<-APM (Reinheit 98,0 %) erhielt.

Beispiel 1 8

Es wurde xn gleicher Weise wie im Beispiel 16 gearbeitet, wobei jedoch die Temperatur und die Zeit für das Vermisehen der Toluolsuspension der Additionsverbindung und der wässrigen Chlorwasserstoffsäurelösung auf 25 C bzw. 60 min geändert wurden, wodurch man 2,96 g Z-APM (Reinheit 98,1 S). erhielt.

Beispiel 19

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 16 vorgegangen, wobei jedoch 0,715 ml einer 95 % Schwefelsäure anstelle der Chlorwasserstoffsäure verwendet wurden, und 26,3 ml destilliertes Wasser anstelle von 20 ml verwendet wurden,, wobei man 2,96 g Z-APM (Reinheit 99,6 % ) erhielt.

' '

Beispiel 2 0

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 19 gearbeitet, wobei jedoch 0,733 ml Essigsäure anstelle der 95 % Schwefelsäure verwendet wurden, wobei man 3,06 g Z-APM (Reinheit 91,7 %) erhielt.

' , .

Beispiel 21

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 16 gearbeitet, wobei man jedoch n-Heptan anstelle von Toluol verwendete, wodurch man 3,12 g Z-APM (Reinheit 89,6 %) erhielt.

' . ' · -32-Beispiel 22

In 20 ml Wasser wurden 5,0 g eine's Natriumsalzes von N-Benzyloxycarbonyl- ^-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester gelöst, und diese Lösung wurde tropfenweise zu 20 ml einer wässrigen Lösung gefügt, die 5,0 g D,L-Valinmethylester-hydrochlorid enthielt, wobei gerührt wurde, woraufdas 'Reaktionsprodukt ausfiel und das Reaktionsgemisch zu einer Suspension wurde. Nach dem Stehenlassen dieser Suspension bei Raumtemperatur während 2 h, wurden 50 ml Methylisobutylketon zugesetzt, es wurde gerührt und anschließend stehengelassen, wobei sich eine Methylisobutylketon-Suspensionsphase, die das Reaktionsprodukt enthielt, und eine homogene transparente wässrige Phase trennten.

Die Methylisobutylketonsuspensionsphase wurde von der wässrigen Phase abgetrennt und 10 ml einer wässrigen InChlorwasserstoff säurelösung und 20 ml Wasser wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 min bei 60 C gerührt und anschließend ruhig stehengelassen, wobei sich eine homogene 0 Methylisobutylketonphase und eine homogene wässrige Phase trennten.

Methylisobutylketon wurde aus der Methylisobutylketonphase durch Verdampfen mittels eines Rotationsverdampfers entfernt, wobei man 4,5 g Z-APM' (Reinheit 99,5 %) erhielt.

Außerdem wurde die wässrige Phase durch Zusatz von Natriumcarbonat auf den pH-Wert 8 gebracht und anschließend mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridphase wurde

SO über wasserfreiem Magnesiumsulfa't getrocknet, und nach dem Einblasen von Chlorwasserstoffgas wurde sie konzentriert. Diäthyläther wurde darüberhinaus zugesetzt, um eine Ausfällung der Kristalle zu bewirken, und die Kristalle wurden gesammelt. Man erhielt 1,6 g Kristalle von

C 5 D-Valinmethylester-hydrochlorid (optische Reinheit 69 %)

Be i s ρ i e le 23 bis 26 -.'...' "

Es wurde in gleicher Weise gearbeitet wie im Beispiel 16,- wobei jedoch anstelle der 1:1.Additionsverbindung von Z-APM und D-PM 5,00 g der 1:1 Additionsverbindungen von Z-APM und Aminosäurester, die sich von Phenylalaninmethylester unterschieden, verwendet wurden. Die so erhaltenen Ergebnisse; sind nachstehend aufgeführt:

Beispiele Additions -Verbindungen gewonnene Z-APM

. - _____ (Reinheit)

23 D-Valinmethylester 3,76 g (98,3 %)

24 L-Alaninäthylester 3,82.g (99,4 %)

25 D-Leucinmethylester 3,71 g (99,1 %)

. _e 26 L-Tyrosinäthylester 3,11 g (98,4 %)

Ib . '. ::.. -'

Beispiel 27

' .. ·

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 16 gearbeitet, wobei jedoch anstelle der 1:1 Additionsverbindung von Z-APxM und D-PM 5,00 g einer 1:1 Additionsverbindung von N-Benzyloxycarbonyl-_*' -L-aspartyl-L-phenylalanin-äthyl- · ester (Z-APE) und D-PM verwendet wurden, wodurch man

.. ·.- ' ' '- '

3,42 g Z-APE (Reinheit 98,8 %) erhielt.

Beispiel 28 ι

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 16 gearbeitet, wobei jedoch anstelle der .1:1 Additbnsverbindung von Z-APM und D-PM 5,00 g einer 1:1 Additionsverbindung von N-p-Methoxybenzyloxycarbönyl-A^-L-aspartyl-L-Ohenvlalanin-

ab ·

methylester (PMZ-APM) und D-PM verwendet wurden, und die

-34- 21.3-1983

AP C 07 G/243 407 (61 437/12)

Kon takt temperatur der Toluol lösung· mit der wässrigen Qhlorwasserstoffsäurelösung 20 ⁰G betrug, wobei man 3,45 g PMZ-APM)- (Reinheit 97,2%) erhielt.

B e i s ρ i e 1 2J)

In einen 2-1-Kolben wux'den 53,45 -g itf-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 107,84 g DjL-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid eingeführt, und 400 ml destilliertes Wasser, ;00 pil einer wäßrigen Sn-iiatriumhydroxidlösung, 7,2 g rohes Ttiermolysin (Thermoase PS-160, Warenzeichen) und 1,3 g CaXciumacetatmonohydrat wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 40 ⁰G unter Rühren umgesetzt. Nach 8 h wurde ein Teil des festen Bestandteils in dem wäßrigen Gemisch in der Form einer Suspension als Probe entnommen, sorgfältig mit kaltem Wasser gewaschen, getrocknet und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 analysiert, wobei sich die feste ,Komponente als 1 : 1.-Additionsverbindung von Z-APM und hauptsächlich DMP bestätigte.

Zu dem wäßrigen Gemisch, d. h. dem Reaktionsgemisch, wurden 600 ml Toluol und 100 ml konzentrierte Chlorwasserstoff säure gefügt, und das Geniisch wurde bei 60 ⁰C 1 h gerührt und anschließend während etwa 20 min still stehengelassen, wobei sich eine Toluolphase, die einen festen Bestandteil enthielt, von der homogenen transparenten Phase abtrennte. Die abgetrennte Toluolphase wurde zweimal mit 200 ml destilliertem Wasser bei 60 ⁰C gewaschen und einschließend auf Raumtemperatur gekühlt, und die Kristalle in der i'oluol phase wurden durch Filtrieren unter verringertem Druck gesammelt, mittels eines Glasfilters getrocknet, wobei man 74,75 g Z-APM erhielt

(Gesamtausbeute, bezogen auf das Ausgängsmaterial, 86,3 %; Reinheit 99,.3 %) .

Beispiel, 3 0 _t

ί

Die Reaktion wurde in gleicher Weise wie im Beispiel durchgeführt, wobei, jedoch L-Phenylalaninmethylasterhydrochlorid anstelle von D^-Phenylalaninmethylesterhydrochlorid verwendet wurde, 3,6g rohes Thermolysin anstelle von 7,2 g eingesetzt wurden und 0,6 g Calciumacetat-monohydrat anstelle von 1,3 g verwendet wurden. Nach 8 h wurde ein Teil der festen Komponente aus dem wässrigen Gemisch in Form einer Suspension als Probe entnommen, sorgfältig mit kaltem Wasser gewaschen,getrocknet und anschließend in gleicher Weise wie im Beispiel 1 analysiert, wodurch die feste Komponente als eine 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und L-PM bestätigt wurde.

Das wässrige Gemisch, d.h. das Reaktionsgemisch wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 29 behandelt und man erhielt Z-APM durch Filtrieren der Toluolphase in einer Menge von 74,56 g, getrocknet (Gesamtausbeute, bezogen auf das Ausgangsmaterial 86,4 %, Reinheit 99,3 %).

Beispiel 31

In eine Suspension, erhalten durch Suspendieren von 5,00 g einer 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und D-PM in 20 ml destilliertem Wasser wurden 35 ml Toluol und

10 ml einer wässrigen 1 η-Chlorwasserstoffsäurelösung gefügt, und das Gemisch wurde 30 min bei 60°C gerührt und anschließend etwa 20 min stehengelassen, wobei sich die eine feste Komponente enthaltende Toluolphase von der homo.genen transparenten wässrigen Phase trennte. Die abgetrennte Toluolphase wurde zweimal mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen, und das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen mittels eines Rotationsverdampfers entfernt, , wobei r.an 3,49 g Z-APM (Reinheit 99,5 I) erhielt,

Beispiel 32

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet, wobei jedoch anstelle von Toluol Diisopropyläther verwendet wurde, wodurch man 3,36 g Z-APM (Reinheit 97,4 %.) erhielt. .

Beispiel, 3 3

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet, wobei jedoch die Temperatur und die Mischzeit der wässrigen Suspension der Additionsverbindung mit Toluol und der wässrigen Chlorwasserstoffsäurelösung auf 25 C bzw. 60 min geändert wurden, wobei.man 3,45 g Z-APM (Reinheit 99,7 %) erhielt

'

Beispiel 3 4

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet,

wobei jedoch 10 ml 95 % Schwefelsäure anstelle von Chlorwasserstoff säure verwendet wurden und.30 ml destilliertes Wasser anstelle von 20 ml verwendet wurden, wobei man 3,42 g Z-APM (Reinheit 99,5 %) erhielt.

Beispiel 35

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 34 gearbeitet, wobei jedoch 1,0 ml Essigsäure anstelle von 95 % Schwefelsäure verwendet wurden, wodurch man 3,21 g Z-APM (Reinheit 91,8 %) erhielt.

Beispiel 36

. Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet, wobei jedoch anstelle von Toluol n-Heptän verwendet wurde, wodurch man 3,21 g Z-APM (Reinheit 91,8 %) erhielt.

Beispiel 37

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet, wobei jedoch 5,00 g einer 1:1 Additionsverbindung von N-Benzoyloxycarbonyl- U-L-aspartyl-L-phenylalaninäthy1-ester (Z-APE) und D-PM verwendet wurde anstelle der 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und D-PM, wodurch man 3,38 g Z-APE (Reinheit 99,1 %) erhielt.

-38-Beispiel 38

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet, wobei jedoch eine Suspension von 5,00 g einer 1:1 Additionsverbindung von N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- w!-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester (PMZ-APM) und D-PM anstelle der Suspension von 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und D-PM verwendet wurden, und die Kontakttemperatur der wässrigen Suspension mit Toluol und der wässrigen Chlorwasserstoffsäure 20 C betrug, wobei man 3,41 g PMZ-APM (Reinheit 98,4. %) erhielt.

Beispiel 3 9

80 ml einer heißen Äthylacetatlösung, enthaltend 6,66 g D,L-Phenylalaninmethylester und 200 ml einer heißen A'thyl- : acetatlösung, enthaltend 7,72 g N-Benzyloxycarbonyl-c^ Lr-aspartyl-L-phenylalaninmethylester wurden vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen, worauf die gebildete Additionsverbindung durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet wurde. 5,00 g der so erhaltenen Additionsverbindung wurden in 20 ml destilliertem Wasser zur Erzielung eines wässrigen Gemischs suspendiert. Zu diesem wässrigen Gemisch wurden 35 ml Toluol und 10 ml einer wässrigen In-Chlorwasserstoffsäure-

lösung gefügt, und das Gemisch wurde 30 min bei 60 C gerührt und anschließend 20 min ruhig stehengelassen. Die eine feste Komponente enthaltende Toluolphase wurde von der homogenen transparenten wässrigen Phase abgetrennt. Die abgetrennte Toluolphase wurde zweimal mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen, und anschließend wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen mittels eines Rotations-

35* Verdampfers entfernt, wobei man 3,47 g Z-APM (Reinheit 99,6 %) erhielt.

Außerdem wurden die wässrige Phase von der Toluolphase abgetrennt und die Waschlösung von der Wäsche der Toluolphase vereint, und Natriumcarbonat wurde zugesetzt, um den pH-Wert der vereinten Lösung auf 8 einzustellen. Die Lösung wurde anschließend mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridphase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und nach dem Einblasen von Chlorwasserstoffsäuregas konzentriert. Diäthyläther wurde weiter zu der Kristallausfällung gefügt, und die Kristalle wurden durch Filtrieren gewonnen. Man ethielt 1,58 g Kristalle von D-Phenylalaninmethylester-hydrochlorid (optische Reinheit 97 %) .

Beispiele 40 bis 43' _{( ;}

Es wurde in gleicher Weise wie im Beispiel 31 gearbeitet, wobei jedoch anstelle der 1:1 Additionsverbindung von Z-APM und D-PM 5,00 g der 1:1 Additionsverbindungen von Z-APM und Aminosäureestern, die sich von Phenylalaninmethyles.ter; unterschieden, verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt:

Beispiele Additions - Verbindungen gewonnenes Z-APM · , (Reinheit)

40 L-Valinäthylester 3,58 g (99,2 %)

41 L-Alaninmethylester 3,92 g (99,3 %)

42 L-Leucinäthylester 3,41 g (99,1 %) 43 D-Tyrosinmethy!ester 3,13 g (98,8 %)

Claims

- 40 - 24? 407 ^c)

Er f 1. η dungs an sρr uch ' · .

1. Verfahren zur Gewinnung eines Dipeptidderivats, gekennzeichnet dadurch, daß man ein organisches Lo suiig.smi.tt.el , da;-, geeignet ist zur.Bildung eines bihären Phasensystems mit. Wasser mit einem wäßrigen Gemisch vermischt, das als festen Bestand- ·. teil ein Dipeptidesterderivat enthält mit der Formel

.0 . 0 NHX Q
R₁-O-C-GH-NH-C-CH-(CH₀) -C-0~.Y⁺ (I).

worin, h, eine Niedrigalkylgruppe ist, Rp eine Seitenkettengrupne einer Aminosäure ist, η T oder 2 ist, X eine Benzyloxycarbonyl- -gruppe ist, die einen Kernsubstituenten aufweisen kann, und Y ein Wasserstoffion oder ein Ammoniumderivation mit der Formel

, . H^N⁺-CH-C-O-R,, . (II)

Ji r+

R₃

i:.;1;, worin ¹R- eine Seitenkettengruppe einer Aminosäure ist und H eine Niedrigalkylgruppe ist, das resultierende Gemisch abcitzen läßt, unter Bildung von
.1) einer organischen Lösungsmittelphase, enthaltend in festem Zusxand eine v^esentliche Menge eines Dipeptidderivats der Formel

O O NHX O

ti 11 I It

R₁-O-C-CH-NH-C-CH-(CH,.) -C-O .Z (III).

R₂

worin R,,- Rp, η und X wie -vorstehend definiert sind,- und Z ,ein Wasserstoffion oder ein Ammoniumderivation der Formel

H-Ji⁺-CH-C-O-Rλ , ' (IV)

^R3

worin R, und R, wie vorstehend definiert sind, und ?.) einer wäßrigen Phase,

- 41 - 243 407

und die organische Lösungsmittelphase von der wäßrigen Phase abtrennt und das Dipeptidderivat aus der organischen Lösungsmittelphase gewinnt. · ·
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch,.daß das organische Lösungsmittel in einer derartigen Menge verwendet wird, daß das Peptidderivat im wesentlichen im festen Zustand verbleiben kann.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet, dadurch,' daß der Rest

0 0 NHX 0 .
R₁-O-C-CH-NH-C-CH-(CH₀) -C-O".

R₂
in den Formeln I und III in L,L-Konfiguration vorliegt.
4. Verfahren nach Punkt 3, 2 oder 1 , gekennzeichnet dadurch, daß Y und Z beide das Ammoniumderivation der Formel

' 0
H_nN⁺-CH-C-O-R,

sind, worin R,, eine Seitenkettengruppe einer Aminosäure ist und R/ eine Niedrigalkylgruppe ist.

Verfahren nach Punkt 4 oder einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß das organische Lösungsmittel ein Keton,, das zur Bildung eines binären Phasensystems mit Wasser geeignet ist, ein aliphatischer oder aromatischer Kohlenwasserstoff oder ein Äther ist.

Verfahren nach Punkt 5 oder einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß da^ organische Lösungsmittel in einer Menge von weniger als 10 Gew.-Teilen und nicht weniger als 1 Gew.-Teil, bezogen auf das Dipeptldesterderivat, verwendet wird. ·

Verfahren nach den Punkten 1 bis 5 oder 6, gekennzeichnet dadurch, daß R, und R^ Methylgruppen sind, Rp und R, Benzylgruppen sind, η 1 ist, X eine Benzyloxycarbonylgruppe ist und Y und Z in der L-, L- und D-, oder D-Konfiguration vorliegen. Verfahren nach den Punkten 1 bis 7 oder 8, gekennzeichnet dadurch, daß das organische Lösungsmittel Toluol, Methylisobutylketon.oder Isopropyläther ist.

- 42 - 243 407
9. Verfahren nach Punkt 6 oder einem der übrigen vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet, dadurch, daß das wäßrige Gemisch darüber hinaus eine .Protease on i,h;i. I t und da. Ii darüber In naiiü d i e Protease aus der wäßrigen Phase nach der Phasentrennung gewonnen wird.
10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß R- .und R. .Methylgruppen sind, Rp und R^ Benzylgruppen sind, η 1 ist, X

eine 'Benzyloxycarbonylgruppe ist und Y und Z in der L-, L-. .und D-, oder D-Konfiguration vorliegen.
11. Verfahren nach Punkt 9 oder 10, gekennzeichnet dadurch, daß das organische Lösungsmittel Toluol, Methylisobutylketon oder Isopropyläther ist.
12. Verfahren nach Punkt 4 oder einem der übrigen vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß nach der Phasentrennung die wäßrige. Phase einer Ultrafiltration unterzogen wird, um , eine konzentrierte Proteaselösung zu erzielen und diese zu gewinnen.

13· Verfahren nach Punkt 3 oder einem der übrigen vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß Y das- Ammoniumderivat der Formel II ist und Z.ein Wasserstoffion ist, bei dem darüber hinaus zum Zeitpunkt des Vermischens des organischen Lösungsmittels mit dem wäßrigen Gemisch eine Brönsted-Säure zu dem wäßrigen Gemisch zusammen mit dem organischen Lösungsmittel gefügt wird.
14. Verfahren nach Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß das organische Lösungsmittel ein Keton, das zur Bildung eines binären Phasensystems mit Wasser geeignet ist, ein aliphatisch aromatischer Kohlenwasserstoff oder ein Äther ist, wobei das Lösungsmittel.in einer Menge von weniger als 10 Gew.-Teilen und nicht weniger als 1 Gew.-Teil, basierend auf der Menge des- Dipeptidesterderivats, verwendet wird.

15- Verfahren nach Punkt 20 oder 21, gekennzeichnet dadurch, daß die Brönsted-Säure in einer Menge im Bereich von etwa, 1 bis etwa 10 Äquivalenten, basierend auf der Molarität des Dipeptidesterderivats verwendet wird.

, - 43 - 243 407
16. Verfahren nach Punkt 20, 21 oder 22, gekennzeichnet dadurch, daß Wasser in dem wäßrigen Gemisch in einer Menge von etwa.

.1 bis etwa 10 Gew.-Teilen, basierend auf der Menge des .Di-peptldesterderivats verwendet wird. ..
17. Verfahren nach Punkt 20, 21, 22 oder 23', gekennzeichnet da-, durch, daß als Brönsted-Säure Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Essigsäure verwendet wird.
18. Verfahren nach Punkt 20, 21, 22, 23 oder.24, gekennzeichnet | dadurch, daß R,. und R. Methylgruppen sind, R~ und R-- Benzyl-' j gruppen sind, η 1 ist, X eine Benzyloxycarbonylgruppe ist · und Z das Ammoniumderivat der Formel IV ist, das in der L-, L- und D-, oder D-Konfiguration vorliegt.
19. Verfahren nach einem der Punkte 20 bis 24 oder 25, gekennzeichnet dadurch, daß nach der Phasentrennung aus der wäßrigen Phase ein Amminosäureester mit der Formel

0
R₄-O-C-CH-NH₂

R₃ .. - ".. ; ..,;

gewonnen wird, worin R^ eine Methylgruppe und R^ eine Benzyl™ gruppe sind. . .
20. Verfahren nach Punkt 9 und 12 oder einem der übrigen vorhergehenden Punkte, gekennzeichnet dadurch, daß die Protease eine Metalloprotease ist.