DD222041A1 - Verfahren zur herstellung neuer anthracyclinon-derivate - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung zweier neuer Anthracyclinon-Derivate auf mikrobiologischem Wege. Der zur Herstellung des neuen Bisanhydro-7-hydroxy-g-rhodomycinons (1 PI) und des neuen Bisanhydro-7-hydroxy-e-rhodomycinons (1 PII) verwendete Mikroorganismus ist eine Antibiotika-geblockte Mutante der Art Streptomyces griseus und traegt die Bezeichnung ZIMET 43 707. Ziel der Erfindung ist die oekonomische Herstellung der neuen Bisanhydro-7-hydroxy-rhodomycinone 1 PI und 1 PII. Diese Substanzen koennen als potentielle Ausgangsprodukte fuer Mutasynthesen bzw. Biokonversion dienen, die zu neuen Anthracyclin-Antibiotika fuehren, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und von Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind sowie als potentielle Enzyminhibitoren zur gezielten Steuerung von Anthracyclinbiosynthese-Prozessen eingesetzt werden koennen. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes ZIMET 43 707 der Art Streptomyces griseus in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen die Bisanhydro-7-hydroxy-rhodomycinone 1 PI und 1 PII gebildet, mit geeigneten Methoden aus dem Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend getrennt und gereinigt werden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung zweier neuer Anthracyclinon-Derivate auf mikrobiologischem Wege. Die Anthracyclinon-Derivate können als potentielle Ausgangsprodukte für Mutasynthese bzw. Biokonversion dienen, die zu neuen Anthracyclin-Antibiotika führen, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und von Bakterien hervörgerufenenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind sowie als potentielle Enzyminhibitoren zur gezielten Steuerung von Anthracyclinbiosynthese-Prozessen eingesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen .

Ein Verfahren zur Herstellung von Anthracyclinpn-Derivaten vom B*isanhydro-7-hydroxy-rhodomycinon-Typ auf mikrobiologischem Wege ist bisher nicht bekannt. Bisher wurden lediglich zwei strukturell ähnliche Anthracyclinon-Derivate (Bisanhydro-7-hydroxyaklavinone) in Kulturbrühen von zwei Mutanten des Aclacinomycin-Bildners Streptomyces galileus MA 144-M1 gefunden (Tobe, M. et al., 1982. J. Antibiot., 35,1641-1645).

Als Ausgangssubstanzen für Muta- bzw. Biosynthesen von Anthracyclin-Antibiotika sind bisher Anthracyclinone (Yoshimoto, A. et al., 1980. J. Antibiot, 33,1150-1157; Oki, T. et al., 1980. J. Antibiot., 33,1331-1340; Yoshimoto, A. et al., 1980. J. Antibiot, 34, ,1492-1494, Eur. Pat. appl. EP 62,327,13 Oct ί982) bzw. Anthracycline (Arcamone, F.: Doxorubicin. Acad. Press, New York 1981) eingesetzt worden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat die ökonomisch günstige Herstellung der beschriebenen neuen Anthracyclinon-Derivate zum Ziel. Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung neuer Anthracyclinon-Derivate zu beschreiben. . '

Überraschend wurde gefunden, daß ein durch Mutagenese aus einer Population des Streptomyces griseus JA5570 selektierter Ahtibiotika-geblockter Mikroorganismus es gestattet, Bisanhydro-7-hydroxy-rhodomycinone in guten Ausbeuten aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen herzustellen.

Unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen wird in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoffquellen und Mineralsalzen der genetisch modifizierte Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet. Der Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, ist unter der Registriernummer ZIMET 43707 in der ZIMET Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW der DDR,-6900 Jena, Beutenbergstr. 11 hinterlegt worden.

Die Kultivierung des Stammes 43707 sowie seiner Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Glucose/Gelatine (5%ig) lyophilisierte Mycelfragmente werden auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft, und das entstandene Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37⁰C, vorzugsweise 28°C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6.2 und pH 7.0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7.5 und pH 8.3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glucose, Glycerin, Dextrin, Mannit, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquellen kommen außer den o.g. stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natriumphosphat bzw. Kaliumphosphat als vorteilhaft erwiesen. Die Isolierung der Bisanhydro-7-Viydroxy-rhodomycinone wird in der Weise durchgeführt, daß die Substanzen mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Butanol, aus dem Kulturfiltrat extrahiert, nach Konzentrieren mit Wasser versetzt, durch Zugabe von organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln erneut extrahiert und aus dem Extraktkonzentrat durch Zugabe von Petroläther ausgefällt werden. Durch Abfiltrieren und Waschen mit Petroläther wird ein Rohprodukt erhalten, aus dem diese Anthracyclinon-Derivate säulenchromatographisch getrennt und weiter gereinigt werden können.

Die auf diese Weise isolierten reinen Bisanhydro-7-hdroxyrhodomycinone kristallisieren aus Benzol in braunroten Kristallen, die sich in Benzol, Chloroform, Aceton mäßig und in Cyclohexan, Petroläther sehr schwer lösen. Bisanhydro-7-hydroxy-y-rhodomycinon (1 Pl):

Die Substanz 1 Pl schmilzt bei 246 bis 248°C unter Zersetzung. Die Substanz hat die Summenformel C₂₀Hi₄O₆ (MG = 350) und die in Abb. 1 gezeigte Struktur.

Die Adsorptionsmaxima im sichtbaren Spektralbereich liegen bei (Amax [ε] in Chloroform) 560 (44211); 520 (38316); 484 (18053)nm und bei (λmax [ε] in Dimethylformamid) 610 (22380); 574 (20529) nm. IR-Spektrum (KBr): 1600cm"¹ (Chinoncarbonyl chel.).

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Massenspektrum: m/z M⁺ 350,0803 (C₂₀H₁₄O₆); 335,0549 (M⁺-CH₃); 321,0734 (M⁺-CHO); 307,0549 (M⁺-CO-CH₃).

'H-NMR-Spelctrum: Siehe Tab. 1.

Dünnschichtchromatographisches Verhalten: DC-Älufolie-Kieselgel 60, (Laufmittel Benzol: Rf-Wert 0,42; Laufmittel Chloroform:

Rf-Wert O₁BG. DC-Alufoiie-Kieselgel 80) getränkt in 0,5n Oxalsäure und an der Luft getrocknet, Laufmittel Benzol: Rf-Wert 0,70; Laufmittel Chloroform: Rf-Wert 0,82.

Bisanhydro^-hydroxy-s-rhodomycinon (1 Pll):

Die Substanz 1 Pll schmilzt bei 260 bis 265°C unter Zersetzung. Die Substanz hat die Summenformel C₂₂H₁₆O₈ (MG408) und die in Abb.2 gezeigte Struktur.

Die Adsorptionsmaxima im sichtbaren Spektralbereich liegen bei (Ämax (ε) in Chloroform 565 (41586); 525 (35592); 488 (16859) nm und bei (λ max (ε) in Dimethylformamid 628 (25513); 584 (21772) nm. IR-Spektrum (KBr): 1600cm"¹ (Chinoncarbonyl); 1735cm-¹ (CO-Ester) Massenspektrum: m/z M⁺ 408,0839 (C₂₂H₁₆O₈); 376,0583 (M⁺-CH₃OH); 350,0796 (M⁺-CH₂COO); 334,0762 (M⁺-C₂H₂O₃); 307,0594 (M⁺-CH₂COOCH₃-CO).

¹H-NMR-Spektrum: Siehe Tab. 1 Dünnschichtchromatographisches Verhalten: DC-Alufolie-Kieselgeieo, Laufmittel Benzol: Rf-Wert 0,18; Laufmittel Chloroform:

Rf-Wert 0,46. DC-Alufolie Kieselgel 60 getränkt in 0,5n Oxalsäure und getrocknet an der Luft, Laufmittel Benzol: Rf-Wert 0,29, Laufmittel Chloroform: Rf-Wert 0,75.

Diese Bisanhydro-7-hydroxy-rhodomycinone können als Ausgangsprodukte für Muta- bzw. Biosynthesen von Anthracyclin-Antibiotika sowie als potentielle Enzyminhibitoren für gezielte Steuerung von Anthracyclinbiosynthese-Prozessen verwendet

werden. .

Ausführungsbeispiele

Anhand eines Ausführungsbeispieles soll die Erfindung näher erläutert werden.

a) Zwei 500 ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80ml des folgenden Vorzucht-Mediums: Glukose 1,50%

Sojamehl 1,50%

Natriumchlorid , 0,50%

Calciumkarbonat 0,10%

primäres Kaliumphosphat in

Leitungswasser 0,03% ' ^;

Sterilisierung: 35Min. bei 110⁰C. Nach der Sterilisierung liegt die Acidität bei pH6,3. '

Jede Steilbrustflasche wird mit einer Mycelsuspension beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten 10-14 Tage alten Kultur des Stammes ZIMET 43707 .hergestellt wird:

,Saccharose 0,300%

Dextrin 1,500%

^.Harnstoff 0,010%

"Hefeextrakt 0,100%

Pepton(bakt) 0,500%

Natriumchlorid 0,050% ,

,,Eisensulfat 0,001%

primäres Kalium-Phosphat .0,050%

Agar-Agar (gewaschen) ·

.jinAquadestillata 2,000%

; Sterilisierung: 40Min. bei 116°C. Nach der Sterilisierung liegt die Acidität zwischen pH6.5 und pH7.0.

Bei beimpften Vo.rzucht-Kulturen wird 48 Stunden bei 28°C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 180U/Min. bebrütet. 8npl einer so bebrüteten Vorzucht-Kultur dienen zur Beimpfung von 500ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktions-Mediums enthalten:

Glukose 2,0% , .

Sojamehl 2,0%

Natriumchlorid - 0,5% -

Calciumkarbonat . .

in Leitungswasser 0,3%

Sterilisierung: 35Min. bei 110⁰C. Die Acidität beträgt nach dem Sterilisieren pH6.3.

Die Temperatur während der Fermentation liegt bei 28°C und die Schüttelfrequenz bei 180 U/Min. Nach 72 bis 96stündiger Fermentation wird die höchste Ausbeute an den Bisanhydro-7-hydroxy-rhodomycinonen erreicht.

b) Man verfährt wie im Verfahrensteil A mit dem Unterschied, daß das Produktions-Medium folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 3,000%

Sojamehl ·' 3,000%

Calciumkarbonat 0,300%

Natriumchlorid ' 0,300%

Eisenchloridhydrat Jn Leitungswasser 0,025%

Sterilisierung: 35Min. bei 110⁰C. Die Acidität liegt nach der Sterilisierung bei pH 6,5.

C) Man geht wie in B) vor mit dem Unterschied, daß der Anzucht-Agar, das Vorzucht- und das Produktions-Medium folgende "Zusammensetzung haben: ,

Anzucht-Agar

Saccharose 2,0%

Trockenhefe 0,1%

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Natriumnitrat 0,2%

Magnesiumsulfat 0,2%

sekundäres Kaliumphosphat 0,2%

Agar-Agar in Leitungswasser 1,5%

Sterilisierung: 40Min. bei 116X. Die Acidität liegt nach dem Sterilisieren bei pH7,0.

Vorzucht-Medium '

Bacto-Pepton 0,60%

Trockenhefe 0,30%

Calciumnitr.athydratin

Leitungswasser 0,05%

Sterilisierung: 30Min. bei 120⁰C, pH7,2 nach Sterilisieren. _t

Produktions-Medium

' Glukose 4,000%

Trockenhefe 1,500%

Natriumchlorid 0,200% '

Calciumkarbonat 0,100% >

sek. kaliumphosphat 0,100%

Magnesiumsulfat 0,010%

Eisensulfat 0,001 % '

Zinksulfat 0,001%

Kupfersulfat in Leitungsw. 0,001%

Sterilisierung: 30Min. bei 120⁰C. Glukose wird separat 20Min. bei 110°C sterilisiert. Die Acidität liegt danach bei pH7,0.

d) Man verfährt wie im Teil C) mit dem Unterschied, daß das Vorzucht- und Produktions-Medium folgende Zusammensetzung aufweist:

Vorzucht-Medium

Dextrin 3,00%

Maisquellwasser 0,40%

Calciumkarbonat 0,30%

Ammoniumsulfat 0,10%

Casein 0,50%

sek. Kaliumphosphat

in Leitungswasser 0,01 %

Sterilisierung: 35Min. bei 120⁰C. Acidität nach dem Sterilisieren: pH7,0.

Produktions-Medium ' . ,

Dextrin 3,00% ,

Calciumkarbonat 0,60%

Maisquellwasser 0,80% , ·

Casein 0,50%

Ammoniumsulfat 0,10%

sek. Kaliumphosphat in

Leitungswasser 0,01 %

Sterilisierung: 35Min. bei 120°C. Acidität nach dem Sterilisieren: pH7,0. ,

e) Das Verfahren unterscheidet sich von demjenigen des Teiles B) dadurch, daß die zu beimpfende Kultur auf folgendem halbfestem Nährboden entwickelt wird:

Hafermehl 2,0% ' . ·

Agar-Agar (gewaschen)

in Aqua destillata 2,0%

Die Sterilisierung wird in üblicher Weise durchgeführt und die Acidität liegt bei 7,OpH. Anschließend beimpft man das in Beispiel B) beschriebene Vorzucht-Medium und mit dem so erhaltenen Impfmaterial werden 500ml-Steilbrustflaschen beimpft, die 80ml des wie folgt zusammengesetzten Produktions-Nährmediums enthalten: Glukose 1,0% ^ '

Kartoffelstärke 1,0% . '

Sojamehl 1,0%

Trockenhefe 0,5%

·.; Natriumchlorid 0,5%

Calciumkarbonat , '

in Leitungswasser 0,3%

Sterilisierung: 40Min. bei 110⁰C. Nachdem Sterilisieren liegt die Acidität bei pH7,0.

f) Mit einer Kultur des Stammes ZIMET 43707 von einem halbfesten Nährboden, wie im Teil E) beschrieben, beimpft man 400ml des im Teil A angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2-l-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet 48Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/Min. Die so erhaltenen 400ml Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 2Ol des im Teil A) beschriebenen Produktions-Mediums, das in einem 32I-Glasfermenter enthalten ist. Während der Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400U/Min, und mit einer Luftzufuhr von 151 je Min. ausgeführt werden kann, wird die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert.

401 Kuiturflüssigkeit^die man durch Vereinigen von 2 Fermentationsansätzen im 321 Glasfermenter erhielt, wurden zentrifugiert und das Kulturfiltrat3mal mit je 41 Butanol ausgerührt. Die abgetrennten Butanolphasen wurden vereinigt, mit verdünnter Salzsäure auf pH 5 eingestellt, im Vakuum konzentriert, mit der 10fachen Menge Petroläther versetzt und vom hierbei ausgefällten Pigment-Rohprodukt abgesaugt. Das Rohprodukt wird in Chloroform gelöst, mit Wasser gewaschen, die Chloroformphase abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum konzentriert und die beiden

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Änthracyclinonderivate 1Pl und 1PII durch einmalige Säuienchromatögraphie an Oxalsäure-gepuffertem Kieselgel mit Chloroform/Aceton=95/5 von anderen polaren Pigmenten abgetrennt. Die Trennung des 1Pl und 1PII Anthracyclinonderivat-Gemisches erfolgte durch einmalige Säulenchromatographie an Oxalsäure-gepuffertem Kieselgel 60 mit Benzol. Die Ausbeuten an den reinen kristallinen Substanzen — bezogen auf 11 Kulturflüssigkeit — betragen: 1 PI (Bisanhydro-y-hydroxy-Y-rhodomycinon) 32mg und 1 Pll (Bisanhydro-y-hydroxy-e-rhodomycinon) 65mg. Tabelle 1 ¹H-NMR-Daten von Bisanhydro-^hydroxy-y-rhodomycinon (1 Pl) und Bisanhydro^-hydroxy-e-rhodomycinon (1 Pll) Meßfrequenz: 200MHz, Lösungsmittel: CDCI₃. Die chemischen Verschiebungen wurden auf Tetramethylsilan als inneren Standarcfbezogen.

Proton

1Pl

COOCH₃: CH₂VOnC₂H₅: CH₃VOnC₂H₅:

4-OH: 6-OH: 7-OH: 11-OH:

ca.

1PII

7,98Q(A)	8,00Q(A)'
7,69T(M)	7,69T(M)
7,25 Qa) (X)	ca. 7,23 Qa) (X)
JAM = 8,0 Hz	JAM = 8,0Hz
Jax — 1,5 Hz	Jax=1,BHz
JMX = 8,0Hz	JMX = 8,0Hz
7,10D(A)	7,17S
7,82D(X)	—
Jax =2,4 Hz
—	4,00 S
2,78Q(A)	2,69Q(A)
1,31D(X)	1,28D(X)
Jax = 7,5 Hz	Jax = 7,5 Hz
16,34 S, ν	16,28 S, ν
15,39 S	15,1OS
11,01 S	11.77S
10,79 S	10,27 S

a) Signal wird vom Chloroform-Restsignal überlagert. S, Singulett; D, Dublett; T, Triplett; Q, Quartett; v, Signal verbreitert.

Abb.I

COOCH₅'

Abb.I

Claims (2)

1. -1- 260 724 8

   Erfindungsansprüche: · _

   1. Verfahren zur Herstellung neuer Anthracyclinon-Derivate, gekennzeichnet dadurch, daß eine Antibiotika-geblockte Mutante der Art Streptomyces grisaus. Stamm ZIMET 43707, unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die Kohlenstoff-, Stickstoff-Quellen sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur von 25 bis 37°C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, kultiviert und die gebildeten neuen AnthracycMnon-Derivate, Bisanhydro-7-hydroxy-y-rhodomycinon (1 Pl) und Bisanhydro^-hydroxy-e-rhodomycinon (1 Pll), aus dem Kulturfiltrat bei einer Acldität von pH 3 bis pH 9.5, mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und chromatographisch getrennt und gereinigt werden.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Fermentationsprozeß bei 28⁰C während einer Zeitdauer von 4 Tagen durchgeführt wird.

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