DD251575A1 - Verfahren zur herstellung von aklanonsaeure - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Aklanonsaeure auf mikrobiologischem Wege. Der zur Herstellung der Aklanonsaeure verwendete Mikroorganismus gehoert zur Art Streptomyces galilaeus und traegt die Bezeichnung NTG 061. Ziel der Erfindung ist die oekonomische Herstellung von Aklanonsaeure als Ausgangssubstanz fuer Mutasynthesen und Partialsynthesen von Anthracyclin-Antibiotika mit potentiell cancerostatischen, antiviralen, antibakteriellen, immunsuppressiven und ergotropen Eigenschaften. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes NTG 061 der Art Streptomyces galilaeus in Medien mit bekannten C-, N-Quellen und Mineralsalzen Aklanonsaeure gebildet, diese mit bekannten Methoden aus dem Mycel isoliert und nachfolgend gereinigt wird.

Description

Die Isolierung der Aklanonsäure erfolgt mit an sich bekannten Methoden durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, Fällung mit Petroläther und anschließende chromatographische Reinigung. Die auf diese Weise isolierte, in gelb-orange-farbene Nadeln kristallisierende Substanz wurde im Vergleich mit authentischer Aklanonsäure analysiert:

a) Dünnschichtchromatographie auf Merck-DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 gepuffert mit 0,5N Oxalsäure; System: Chloroform-Aceton/10:2. Gleiches chromatographisches Verhalten wie Aklanonsäure. Rf: 0,51

b) Massenspektrometrie: Das Massenspektrum der Substanz ist identisch mit dem Massensprektrum, das bei Prüfung von authentischer Aklanonsäure erhalten wird (Eckardt, K. et al., 1985. J. Antibiot. 38,1034-1039)

c) ^-NMR-Spektrometrie: das ^-NMR-Spektrum der Substanz wies alle Signale in charakteristischer Lage auf, die auch im Spektrum von Aklanonsäure gefunden wurden

d) Umlagerung zu Aklanon: Die Substanz wurde in an sich bekannter Weise (Eckardt, K. et al., 1985. J. Antibiot. 28,1034-1039) in Dimethylsulfoxid gelöst und bei Zimmertemperatur belassen. Als Umlagerungsprodukt wurde Aklanon erhalten, welches durch Chromatographie mit Standard-Material identifiziert wurde.

e) Infrarotspektroskopie: Die Infrarotspektren der erfindungsgemäß hergestellten Substanz und authentischer Aklanonsäure sind identisch.

Somit konnten mit den eingesetzten Methoden keine Unterschiede zwischen der erfindungsgemäß hergestellten Substanz und authentischer Aklanonsäure gefunden werden.

Ausführungsbeispiele

Durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele soll die Erfindung erläutert, jedoch nicht begrenzt werden.

1. Zwei 500ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80 ml des folgenden Vorzucht-Mediums:

Glukose . 1,5%

Sojamehl 1,5%

Natriumchlorid 0,5%

Kalziumkarbonat 0,1 %

Kaliumhydrogenphosphat 0,3%

in Leitungswasser

Sterilisierung: 35 Min bei 110⁰C. Nach der Sterilisierung liegt die Azidität bei pH 6,3.

Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporensuspension beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten 10 bis 14 Tage alten Kultur des Stammes NTG 061 hergestellt wird:

Hafermehl 2% .

Agar-Agar 2%

- in Leitungswasser

Sterilisierung": 40min bei 120°C. Nach der Sterilisierung wird die Azidität auf pH 7,0 eingestellt.

Die beimpften Vorzucht-Kulturen werden 48 Stunden bei 28⁰C auf einem Schütteltisch mit einer Frequenz von 180U/min bebrütet. 8 ml einer so bebrüteten Vorzucht-Kultur dienen zur Beimpfung von 500ml-Steilbrustflaschen,dieje80ml des folgenden Produktionsmediums enthalten:

Glukose 2,0%

Sojamehl 2,0%

Natriumchlorid 0,5%

Kalziumkarboriat 0,3%

in Leitungswasser

Sterilisierung: 35min bei 110⁰C. Die Azidität beträgt nach der Sterilisation pH 6,3.

Die Temperatur während der Fermentation liegt bei 28°Cund die Schüttelfrequenz bei 180 U/min. Nach 72 bis96stündiger Fermentation wird die höchste Ausbeute an Aklanonsäure erreicht. Von der so gewonnenen Kulturlösung wird ohne vorherige Veränderung des pH-Wertes das Mycel abgetrennt und mit organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise Aceton, extrahiert. Der Extrakt wird nach dem Konzentrieren mit Wasser versetzt und bis zum Farbumschlag nach gelb angesäuert. Nunmehr wird die Substanz durch Zugabe von organischen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln erneut extrahiert und aus den Extraktkonzentraten durch Zugabe von Petroläther ausgefällt. Durch Abfiltrieren und-Waschen mit Petroläther wird Aklanonsäure als gelbbraunes Pulver erhalten, das durch Säulenchromatographie weiter gereinigt werden kann.

2. Mit einer Kultur des Stammes NTG 061 von einem halbfesten Nährboden, wie in Beispiel 1 beschrieben, beimpft man 400 ml des im Beispiel 1 angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2I-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet 48 Stunden bei 28⁰C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/min. Die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 201 des im Beispiel 1 beschriebenen Produktionsmediums, das in einem 32I-Glasfermentor enthalten ist. Während der Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400U/min und einer Luftzufuhr von 15 l/min ausgeführt werden kann, wird die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert. Die Aufarbeitung der Fermentationsbrühe erfolgt wie im Beispiel 1.

3. Mit den im Beispiel 1 beschriebenen Medien wird die Vorzucht zunächst für 24 Stunden in einer 500 ml-Steilbrustflasche mit 80 ml Inhalt und daran anschließend für weitere 24 Stunden im gleichen Medium in einem 2I-Glaskolben mit 400 ml Inhalt durchgeführt, ehe ein 400l-V2A-Stahltank beimpft werden kann, der das im Beispiel 1 beschriebene Produktionsmedium enthält. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 280U/min und die Luftzufuhr 400 l/min. Die Gewinnung der Aklanonsäure aus der Fermentationsbrühe erfolgt auf die im Beispiel 1 und 2 angegebene Weise.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von Aklanonsäure auf mikrobiologischem Wege, gekennzeichnet dadurch, daß ein Stamm eines gut sporulierenden Mikroorganismus der Art Streptomyces galilaeus unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff-, eine Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einerTemperaturvon 25 bis 34 ⁰C, während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, kultiviert und die gebildete Aklanonsäure aus dem Mycel mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und chromatographisch gereinigt wird.

2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet durch die Verwendung des Stammes NTG 061, der durch Mutagenbehandlung aus einem als Bildner von Pyrromycinonen und ε-Pyrromycinonglykosiden bekannten Stamm der Art Streptomyces galilaeus gewonnen wurde.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Aklanonsäure auf mikrobiologischem Wege. Aklanonsäure ist einegeeigneteVorstufezur halbsynthetischen bzw. mutasynthetischen Herstellung verschiedener neuer antibiotisch wirksamer Substanzen, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und von Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Aklanonsäure auf mikrobiologischem Wege hergestellt werden kann (Eckardt, K. et al., 1985. J. Antibiot. 38, 1034-1039; DD 225714, 7.8.85).

Der in diesem Verfahren eingesetzte Mikroorganismus (Streptomyces spec. ZIMET 43717) weist jedoch den Nachteil auf, daß er nicht fähig ist, Luftmycel und Sporen zu bilden. Deshalb ist eine Artzuordnung nicht möglich. Weiterhin werden dadurch wesentliche Arbeitsschritte eines mikrobiologischen Herstellungsverfahrens wie Stammerhaltung, Stammanzucht und genotypische Optimierung der Biosyntheseleistung erschwert.

Ziel der Erfindung -

Die Erfindung hat zum Ziel einen neuen Mikroorganismus mit Biosynthesefähigkeit für Aklanonsäure einzusetzen, der aufgrund seiner morphologischen, biochemischen und genetischen Parameter sich günstiger für industrielle Prozesse handhaben läßt als dieses bisher möglich ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Aklanonsäure als Ausgangspunkt für Partialsynthesen bzw. Mutasynthesen von Anthracyclin-Antibiotika nach einem neuen mikrobiologischen Verfahren herzustellen, das die Nachteile der bekannten technischen Lösungen vermeidet.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß in dem Verfahren ein Stamm eines gut sporulierenden Mikroorganismus der Art Streptomyces galilaeus eingesetzt wurde. Als geeignet wurde der Stamm NTG 061 der Art Streptomyces galilaeus gefunden, der in der ZIMET-Hinterlegungsstellefür Mikroorganismen im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, 6900 Jena, Beutenbergstraße 11 unter der Registriernummer ZIMET 43811 hinterlegt wurde. Dieser Mikroorganismus, der es gestattet, Aklanonsäure aus leicht zugänglichen Rohstoffen mit guter Ausbeute herzustellen, konnte überraschenderweise nach Mutagenbehandlung aus einem Streptomyceten-Stamm, der als Bildner von Pyrromycinonen und ε-Pyrromycinonglykosiden bekannt war, isoliert werden. Durch Vergleich seiner Eigenschaften mit Literaturangaben, insbesondere denen des International Streptomyces Project (SHIRLING and GOTTLIEB, 1972 Int. J. Syst. Bacteriol. 22: 265-349, PRIDHAM and TRESNER, 1974. In „Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8.Aufl. [Hrsgb. R.E.Buchanan und N.E.Gibbons] S.748-829) wurde der Ausgangsstamm als Vertreter der Art Streptomyces galilaeus ETTLINGER, CORBAZ and HÜTTER identifiziert. Der in der vorliegenden Erfindung benutzte Mikroorganismus NTG 061 zeigt eine sehr gute Sporulationsfähigkeit. Diese Eigenschaft wirkt sich vorteilhaft für Stammerhaltung, Stammanzucht und genetische Bearbeitung des Produktbildners aus. Die Kultivierung des Stammes NTG061 sowie seiner Varianten erfolgt unter aeroben und sterilen Bedingungen. An Erde getrocknetes Sporenmaterial wird auf geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft, und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einerTemperatur zwischen 25 und 34 °C, vorzugsweise bei 28⁰C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Aziditätkultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie aus organischen Salzen. Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Glukose, Glyzerin, Dextrin, Mannit, Saccharose, Sojamehl und Sojaöl verwendet werden. Als Stickstoffquelle kommen außer den o. g. stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natriumphosphat bzw. Kaliumphosphat als vorteilhaft erwiesen.