DD226156A3

DD226156A3 - Verfahren zur herstellung einer metalloprotease aus bacillus cereus

Info

Publication number: DD226156A3
Application number: DD23644581A
Authority: DD
Inventors: Reiner Grunow; Johann Huber; Martina Mueller; Barbara Winkler
Original assignee: Inst F Techn Miikrobiologie
Priority date: 1981-12-30
Filing date: 1981-12-30
Publication date: 1985-08-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Bacillus cereus-Metalloprotease fuer den Einsatz fuer verschiedene kommerzielle, technische und wissenschaftliche Zwecke, bei denen Proteine oder eiweisshaltige Materialien zu niedermolekularen Produkten abgebaut werden sollen. Ziel der Erfindung ist es, ein oekonomisches, biotechnisches Verfahren zur Herstellung eines Proteasepraeparates mit einer oligosporen Bacillus cereus-Mutante zu entwickeln, die eine durch EDTA hemmbare, toxikologisch unbedenkliche Metalloprotease bildet und keine Nebenaktivitaeten an a-Amylase und b-1,3-1,4-Glucanase synthetisiert. Die erfindungsgemaess verwendete Bacillus cereus-Mutante ZF C-39 wurde in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut fuer Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Jena, unter der Nummer ZIMET 10 700 hinterlegt. Sie unterscheidet sich von Typ-Stamm Bac. cereus ATCC 14 579 durch folgende Merkmale:- stark reduzierte Versporung- keine Lezithinaseaktivitaet- kein Wachstum auf Citratagar- kein Tyrosinabbau- anaerober Nitratabbau- keine Bildung von loeslichen, fuer Maeuse und Ratten bei oraler Applikation toxischen Substanzen.Im Fluoreszenz-Antikoerper-Test wurde die Zugehoerigkeit zur Species Bacillus cereus bestaetigt.

Description

10 % -

-I-

BiochemischeTests: .

Säurebiidungaus: Glukose, Maltose, Trehalose, Saccharose, Ribose

keine Säurebildung aus: Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, Fructose, Lactose, Raffinose, Rhamnose, Mannit,

Dulcit,Aesculin, Sorbit positive Reaktionen: Reduktion von Nitrat zu Nitrit, anaerober Nitratabbau, Katalase,Amylase, Gelatinase,

Caseinpeptidasen, Acetyl-Methyl-Carbinol-Bildung

negative Reaktionen: Lezithinase, Urease, lndolbildung,Citratverwertung

Die Mutante Bac. cereus ZF C-39/ZIMET 10700 unterscheidet sich in wensentlichen Merkmalen vom Typ-Stamm Bac. cereus ATCC 14579 nach Buchanan, R.E. u.a., Bergey's manual of determinative bacteriology, 8th ed., The Williams and WilkinsCo., Baltimore, USA, 1974. Im Fluoreszenz-Antikörper-Test (FAT) mit monospezifischen Antisporenseren konnte jedoch die Zugehörigkeit zu Bac. cereus bestätigt werden.

Bac. cereus ZF C-39/ZIMET 10700 synthetisiert unter Testbedingungen (vgl. Ausführungsbeispiele) bis zu 28TE_cas/ml proteolytische Gesamtaktivität bei pH 7,0 und keine nachweisbaren Aktivitäten an a-Amylase und /3-1,3-1,4-Glucanase. Der durch Chelatbildner (10~² M EDTA) inhibierbare Anteil der Gesamtaktivität beträgt mehr als 90%. Die Synthese der extrazellulären Metalloprotese beim Stamm ZF C-39/ZIMET 10700 wird durch Glucose reprimiert. Die Fermentation erfolgt durch diskontinuierliche Kultivierung in wäßrigen Medien erfindungsgemäß mit Feststoffgehalten von 3,0 bis 7,5%.

Die mittleren Generationszeiten bei 30°C in Glucose-Nährbouillon und in kohlenhydratreichen Medien betragen 50 bis 60min.

Im oralen Test auf akute Toxizitat an Wistar-Ratten und ICR-Mäusen wurde bakterienhaltige Kulturlösung mit Enzymaktivität bis zur Dosierungsgrenze (36m|/kg Körpermasse bei Wistar-Ratten und 15ml/kg Körpermasse bei ICR-Mäusen) ohne toxische Wirkung vertragen. Bac. cereus ZF C-39/ZIMET 10700 ist gegen die Bacillusphagen PBS1, PZA, PZB, PZC, PZD und PZF resistent.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung soll an Hand folgender Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

Beispie! 1

Kulturführung . .

Zelimaterial von Bac. cereus ZF C-39/ZIMET 10700 von Schrägagarkulturen auf Gerstenschrot (2,5% Gerstenschrot, 1 % Sojaschrot, 0,5% Glucose, 2% Na₂HPO₄ x 2 H₂O, 3% Agar, pH 7,0) wird nach 48 Stunden Bebrütung bei 37°C entweder direkt oder nach Zwischenpassage auf Nähragar I (Staatl. Institut für Immunpräparate und Nährmedien, Berlin-Weißensee, DDR) bzw. auf Gerstenschrotagar in 50ml Vorkulturmedium (VK) in 500ml-Rundschüttelkolben überführt und 16 Stunden bei 3O⁰C geschüttelt (Rundschütteltisch, 200 U/min).

VK: 1% Maisstärke . . ~

0,7% Sojaschrot 0,5 % Weizenfeinschrot 0,1 % Hefeextrakt 0,1 % Glucose 0,05% MgSO₄ x 7 H₂O 0,5% (NH₄J₂HPO₄ 0,1% KC!

Mit dieser Vorkultur werden 50 ml Hauptkultur-Medium (HK) in 500ml-Rundschüttelkolben mit einer Zellzahl von 2 χ koloniebildenden Einheiten/ml beimpft und bei 3O⁰C unter Schütteln inkubiert. In einem HK-Medium aus:

1 % Maisstärke 0,7% Sojaschrot 0,5% Weizenfeinschrot 0,2% Trockenhefe 0,05% MgSO₄ x 7 H₂O 0,5% (NH₄J₂HPO₄

0,1% KCi . werden nach 48 Stunden 27 ± 5TE_cas/ml (0,168AEZmI) gebildet.

Beispie! 2 . .

Kulturführung: siehe Beispiel 1 Bei Verwendung eines VK-Mediums aus:

0,1 % Maisstärke 0,5% Hefeextrakt 2% Glucose 0,1% NaCI 0,4% (NH₄J₂HPO₄ 0,1% MgSO₄ χ 7 H₂O

und eines HK-Mediums aus:

2% Maisstärke 1,5% Sojaschrot 2 % Weizenfeinschrot 1,5%(NH₄J₂HPO₄ 0,02% CaCI₂ x 5 H₂O 0,15% KCi

0,05 % MgSO₄ x 7 H₂O werden nach 48 Stunden 26TE_cas/ml (0,162 AE/ml) und nach 72 Stunden 29TE_cas/ml (0,181 AE/ml) gemessen.

Beispiel 3

Verfahrensweise bis zur Vorkultur wie in Beispiel 1 Hauptkultur im 3001-Fermenter mit 1501 Medium, Kultivierung bei 30⁰C und Rührung.

Im Hauptkulturmedium entsprechend Beispiel 1 werden nach 12 Stunden 22TE₀₃₃ZmI (0,137 AE/ml) gemessen.

Claims

Erfindungsansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer Metalloprotease aus Bac. cereus, dadurch gekennzeichnet, daß Bac. cereus ZF C-39/ ZIIVIET 10700 diskontinuierlich in wäßrigen Medien mit Feststoffgehalten von 3,0 bis 7,5% fermentiert wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrigen Medien polysaccharidhaltige Naturstoffe, wie Getreide, Mais und Sojabohnen, Trockenhefe sowie verschiedene anorganische Salze enthalten.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer extrazellulären Metalloprotease aus Bacillus cereus, die für verschiedene kommerzielle, technische und wissenschaftliche Zwecke, insbesondere zum Abbau von Proteinen oder eiweißhaltigen Materialien zu niedermolekularen Verbindungen verwendet werden kann.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Mikrobielle Metalloproteasen können von einer Vielzahl von Bakterien und Pilzen synthetisiert werden. In biotechnischen Verfahren werden bevorzugt Stämme von Bacitlus-Arten (B. subtilis, B. cereus, B. licheniformis, B. brevis, B. amyloliquefaciens, B. megaterium, B. stearothermophilus) verwendet (Ruttloff, H., u.a., Industrielle Enzyme, Fachbuchverlag Leipzig, 1979), Weiterhin wird in der Literatur (Ruttloff, H., Mikrobielle Enzymproduktion, Akademie-Verlag Berlin, 1981, S.448) erwähnt, daß B. cereus-Metalloproteasen für die Käseherstellung verwendet werden können, ohne daß ein Hinweis auf die toxikologische Unbedenklichkeit der Präparate gegeben ist.

Extrazelluläre Metalloproteasen treten in der Regel als Nebenaktivitäten bei der Herstellung von a-Amylase und/oder Glucan abbauenden Enzymen auf, z.B. bei den Verfahren nach DD-WP C 12D/220223, DD-WP C 12N/219 710 und DD-WP 148891. Bacillus cereus synthetisiert eine Protease, die weitgehend frei von extrazellulären Nebenenzymen ist (CH-PS 547858 und CH-PS 567100).

In CH-PS 547858 wird eine Protease produzierende asporogene Bac.-cereus-Mutante beschrieben, deren Art der Protease nicht näher erläutert wird. Der Patentanspruch bezieht sich dabei auf die Verwendung von nicht-sporenbildenden, enzymbildenden Mutanten für die Herstellung eines Enzymproduktes mit niedrigem Bakteriengehalt. Zur Herstellung der Protease werden Kulturiösungen verwendet, die Feststoffgehalte von 12 bis 20% aufweisen. Die proteolytische Aktivität in der Fermentationsbrühe beträgt 150AE/kg.

CH-PS 567100 beschreibt eine Bac.-cereüs-Mutante, die eine Protease mit hohen Aktivitäten bei pH 7,0 und einem Molekulargewicht von weniger als 10000 synthetisiert. Nach den dargestellten Untersuchungen über den Einsatz spezifischer Hemmer kann es sich jedoch um keine Metalloprotease handeln, da eine Hemmung durch EDTA nicht nachweisbar ist. in beiden Patenten werden keine toxikologischen Prüfungen erwähnt; auf die Rolle von Bac. cereus als unspezifischer Lebensmittelvergifter wird nicht eingegangen.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein ökonomisches biotechnisches Verfahren zur Herstellung eines Proteasepräparates mit einem Bac.-cereus-Stamm zu entwickeln, der ein durch EDTA hemmbares, toxikologisch unbedenkliches Metalloproteasepräparat ohne weitere Nebenenzyme bildet.

Darstellung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, mit einer oligosporen Bac.-cereus-Mutante ein^von anderen extrazellulären Enzymen weitgehend freies, toxikologisch unbedenkliches Metalloproteasepräparat in Kulturlösungen mit einem niedrigen Feststoffgehalt und mit hohen Ausbeuten zu produzieren.

Erfindungsgemäß wird für die Hersteilung eines solchen Enzympräparates die Bac. cereus-Mutante ZF C-39 benutzt, die sich durch folgende Eigenschaften auszeichnet:

— stark reduzierte Versporung (Versporungsrate liegt bei maximal 5%)

— keine Lezithinaseaktivität

— kein Wachstum auf Citratagar

— kein Tyrosinabbau

— anaerober Nitratabbau

— Bildung einer bis zu 90% durch EDTA hemmbaren extrazellulären proteolytischen Aktivität

— keine Freisetzung einer löslichen Substanz in die bakterienhaltige Kulturlösung, die bei oraler Verabfolgung an ICR-Mäuse und an Wistar-Ratten toxische Reaktionen hervorrief.

Der erfindungsgemäße Stamm Bacillus cereus ZF C-33 wurde in der zentralen Stammsammlung der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Jena, unter der Nummer ZIMET 10700 hinterlegt und weist folgende Charakteristik auf:
Zellmorphologie: aerobes bewegliches grampositives Stäbchen, Sporulationsrate maximal 5 %, Sporen sind

oval und im Zentrum der sporulierenden Zelle gelagert Koioniemorphologie

aufNähragar: hellbeige, mattglänzend, großflächig, glatter Rand

auf Blutagar: graugrün, mattglänzend,/3-Hämolyse nach 48Stunden bei 37⁹C

sog. „Riesenkolonie": rund, ca. 40 mm Durchmesser, hellbeige, mattglänzend, gelappter Rand

auf Glukose-Nitrat-Agar: zart, sehr klein

auf Glukose-Aspa-ragin-Agar: zart

Wachstum in Nährbouillon: Trübung, Bodensatz, keine Hautbiidung

anaerobes Wachstum in Glukose-Medium mit Gasbildung
Wachstum in NaCI-Bouillon: 3% 4-