DD231007A1 - Verfahren zur herstellung von monoklonalen antikoerpern gegen humanes interferon-alpha (huifn) - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen humanes Interferon-alpha. Das Ziel der Erfindung ist die Herstellung monoklonaler Antikoerper, die fuer die immunchemische Bestimmung und die immunaffinitaetschromatographische Reinigung von menschlichem Interferon-alpha geeignet sind. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Maeusen, die mit Interferon immunisiert wurden, mit Plasmacytomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikoerperbildenden Hybridome selektiert, die Eigenschaften der gebildeten monoklonalen Antikoerper bestimmt, die spezifischen Hybridome auswaehlt und in ueblicher Weise weiter vermehrt. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin und die Biotechnologie.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die in der biotechnologischen und medizinischen Diagnostik angewendet und für die immunaffinitätschromatographische Reinigung von Interferon-alpha eingesetzt werden können.
Interferon-alpha wird von Lymphozyten in Folge einer Virusinfektion gebildet und verhindert dann die Ausbreitung der Virusinfektion auf andere Zellen, indem diese unter der Wirkung von Interferon-alpha einen sogen, antiviralen Status erwerben.
Monoklonal Antikörper gegen humanes Interferon-alpha gibt es seit 1980 (Secher, D.S. and D.C.Burke, Natur 285,446-450
Die Herstellung dieser Antikörper erfolgte nach der bekannten Lymphozytenhybridomtechnik (Köhler, G. and C. Milstein, Nature 256,495-497 /1975/). Solche Antikörper werden vorzugsweise für den Interferon-Nachweis bei der gentechnischen Herstellung von Interferon in Mikroorganismen und für die Isolierung und Reinigung der biosynthetisch gewonnenen Interferone eingesetzt.
Die Interferone sind eine heterogene Stoffklasse (Pesta, S. and S. Baron in Methods in Enzymology/ ed. S. Pestka/ Vol. 78, p.3 Acad. Press 1981), so daß eine Vielzahl monospezifischer Antikörper gebraucht werden, um alle Interferon-alpha-Subtypen spezifisch erkennen zu können.
Die Erfindung hat das Ziel, monoklonal Antikörper gegen menschliches Interferon-alpha mit geeigneter Affinitätskonstante und großer Spezifität herzustellen. Solche Antikörper sollen zur Entwicklung eines Testbesteckes für menschliches Interferon-alpha und für die Präparation von Immunsorbentien zur immunaffinitätschromatographischen Reinigung von Interferon eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-alpha ist dadurch gekennnzeichnet, daß man Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit gereinigtem HuIFN bis zum Erscheinen von Serumantikörpern immunisiert werden, mit Maus-Myelomzellen in der Zellkultur hybridisiert und die erhaltenen Hydridome in Mikrotestplatten aussät. Die antikörperproduzierenden Hybridomklone werden zunächst mit einem Immunodot-Assay nachgewiesen. Dafür wird HuIFN auf kleine Nitrozellulosefilter aufgetragen, das so behandelte Filter mit den Hybridomüberständen inkubiert; nach Waschung erfolgt die Inkubation mit Anti-Anitkörper-Enzymkonjugat und schließlich wird das Filter mit dem Enzymsubstrat behandelt. Die antikörperproduzierenden Hybridome werden kloniert und erfindungsgemäß auf ihre Verwendungsfähigkeit für immunchemische Bestimmungsmethoden und in der Immunaffinitätschromatographie geprüft. Die spezifischen Hybridomklone werden ausgewählt, weiter vermehrt, in flüssigem Stickstoff gelagert und bei Bedarf für die Produktion von monoklonalen Antikörpern entweder in Ascitesflüssigkeit auf Mäuse transplantiert oder in Zellkultur vermehrt. Wesentliche Voraussetzung zur Durchführung der Erfindung ist der Antikörper-Hemmtest zur Bestimmung der Spezifität der einzelnen monoklonalen Antikörper hinsichtlich ihrer Erkennung der verschiedenen antigenen Determinanten auf den Interferonmolekülen.
Dieser Test kann folgendermaßen durchgeführt werden:
Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper werden an eine feste Phase gebunden, danach erfolgt die Inkubation mit einem monoklonalen Antikörper, der eine bestimmte Determinante erkennt. Anschließend wird mit normalem Mausserum behandelt und danach mit 125J-IFN im Gemisch mit einem zu testenden anderen monoklonalen Antikörper inkubiert. Wird keine Radioaktivität an die feste Phase gefunden, haben beide Antikörper die gleiche Spezifität. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung spezifischer Antikörper gegen humanes Interferon-alpha, seine Subtypen und gentechnisch hergestellte modifizierte Formen und damit die Entwicklung von rationellen Testkits für die Medizin und Biotechnologie sowie für die Herstellung von effektiven Immunsorbentien zur Immunaffinitätschromatographie, die bei der industriellen Herstellung von humanem Interferon-alpha für medizinische Zwecke unbedingt gebraucht werden.
1. Herstellung der Hybridome
Balb/c-Mäuse werden mehrfach in mehrwöchigen Abständen mit etwa 106IU HulFN-alphai.p. und in die Fußsohlen immunisiert. Die Fusion der Milzzellen einer immunisierten Maus mit Maus-Plasmacytomzellen P3/X63-Ag8-6.5.3. (hergestellt von Kearny, I. F. et al., J. Immunolgy 123,1548-1550 /1979/) erfolgt nach bekannten Verfahren (Köhler, G. and C. Milstein, Nature 256,495-497 /1975/); Hudson, L and F. C. Hay: Practical Immunology, 2. Auflage Oxford 1980). Die Hybridome werden in einem Selektivmedium angezüchtet. Die Klonierung und weitere Bearbeitung der Hybridome erfolgt in 96 well-Mikrotiterplatten.
2. Das Screening der angezüchteten Hybridome erfolgte mit einem Immunodot-Assay und mit einem Festphasen-Bioassay.
3. Der Antikörperhemmtest und die Bestimmung der Affinität werden mit den Kulturüberständen der verschiedenen Hybridomklone auf Anti-Interferon-Spezifität durchgeführt.
Eigenschaften der von den erhaltenen Hybridomklonen produzierten monoklonalen Antikörpern:
-2- B/ö /7
Monoklonal Antikörper Eigenschaften ZIM-IIB2 ZIM-IIG7
IgD-Klasse IgGI IgGI
Affinität (1/MoI) >108 noch nicht getestet
Interferon-Subtypenspezifität noch nicht bestimmbar noch nicht bestimmbar
Antigendeterminante I noch nicht bestimmt
Eignung zur Immunaffinitäts-
chromatographie sehr gut noch nicht bestimmt
4. Herstellung der Antikörper Die Gewinnung der Antikörper erfolgt aus der Kulturflüssigkeit der kultivierten oder aus der Ascitesflüssigkeit der transplantierten Hybridomzellen entsprechend üblicher Verfahren.
Claims (1)
- -1- 678 77Erfindungsanspruch:Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-alpha (HuIFN), dadurch gekennzeichnet, daß man Milzzellen von Mäusen, die mit Interferon immunisiert wurden, mit Maus-Plasmacytomzellen in der Zellkultur fusioniert, die antikörperbildenden Hybridome mittels Immunodot-Assay und Festphasen-Bioassay selektiert, die Eigenschaften der gebildeten monoklonalen Antikörper hinsichtlich ihrer Reaktivität mit HuIFN bestimmt und die Produktion der Antikörper durch die spezifischen Hybridomklone entweder in der Zellkultur oder in Ascitesform durchführt.
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