DD254593A1 - Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen humanes interferon-alpha - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung monoklonaler Antikoerper, die zur Reaktion mit humanem Interferon-alpha (HuIFN-alpha) befaehigt sind. Das Ziel der Erfindung besteht darin, monoklonale Antikoerper herzustellen, die fuer die immunchemische Bestimmung und fuer eine immunaffinitaetschromatographische Anreicherung von HuIFN-alpha geeignet sind. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man Milzzellen von Maeusen, die intralienal mit HuIFN-alpha immunisiert worden sind, mit Myelomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 in vitro fusioniert, die erhaltenen Hybridome mit spezifischer Antikoerperproduktion selektioniert, anschliessend eine Einzelzellklonierung mittels eines speziellen Mikromanipulators durchfuehrt und die erhaltenen Klone in ueblicher Weise weiter vermehrt. Nach dem erfindungsgemaessen Verfahren werden durch Kultivierung der Hybridzellklone H/B61D3 und H/C61D2 die monoklonalen Antikoerper ZIMET B61D3 und ZIMET C61D2 gewonnen. Anwendungsgebiet der Erfindung sind die Humanmedizin, die Veterinaermedizin und die Biotechnologie.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes Interferon-alpha (HulFN-alpha). Diese Antikörper können in der biotechnologischen Analytik und in der medizinischen Diagnostik angewendet sowie überdies zurimmunaffinitätschromatographischen Anreicherung von biotechnologisch produziertem HulFN-alpha eingesetzt werden. Das Anwendungsgebiet liegt somit in der biotechnologischen Forschung und Industrie sowie für die verfahrensgemäß hergestellten Produkte weiterhin in der medizinischen Diagnostik.
Interferone sind Proteine, die von tierischen Zellen nach Virusinfektion oder nach Kontakt mit Mitogenen freigeschützt werden und normale Zellen vor einer Virusinfektion schützen. Sie sind in bezug auf chemische Zusammensetzung und biologische Aktivität heterogen (Pestka, Arch. Biochem. Biophys. 221,1983,1-37).
Monoklonal Antikörper gegen humanes Interferon-alpha sind seit 1980 bekannt (Secher and Burke, Nature 285,1980,446-450; Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78,1981,1848-1852). Diese Antikörper wurden jeweils nach der bekannten Hybridomtechnikvon Köhler und Milstein (Nature 256,1975,495-497) hergestellt, und sie werden hauptsächlich für die Interferon-Analytik bei.der gentechnologischen Bearbeitung von Interferon sowie zur Anreicherung biotechnologisch hergestellter Interferone verwendet.
Im Inland istdas'SchutzrechtWP 231007 bekannt, welches ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes Interferon-alpha zum Gegenstand hat.
Die im Ergebnis dieses Verfahrens gewonnenen zwei monoklonalen Antikörper haben den Nachteil, daß jeder von ihnen nur einen bestimmten HulFN-alpha-Subtyp binden kann und somit für die immunaffinitätschromatographische Anreicherung von biotechnologisch produzierten HulFN-alpha-Subtypen als auch für deren immunchemische Bestimmung beide Antikörper benötigt werden.
Die Erfindung verfolgt das Ziel, neue monoklonale Antikörper gegen humanes Interferon-alpha herzustellen, die zur immunchemischen Bestimmung von Interferon in Medizin und Biotechnologie sowie zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung gentechnisch produzierter HulFN-alpha-Subtypen eingesetzt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein hinreichend einfaches und zuverlässig handhabbares Verfahren zur Gewinnung von neuen monoklonalen Antikörpern, die zur Reaktion mit HulFN-alpha befähigt sind, anzugeben.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe wie folgt gelöst:
Mäuse des Stammes BALB/c werden mehrmals intralienal mit gereinigtem HulFN-alpha immunisiert. Die Milzzellen der so immunisierten Mäuse werden in an sich bekannter Weise mit der Maus-Myelomzellinie P3-X63-Ag8.653 in vitro fusioniert und in Mikrotiterplatten in einem Selektionsmedium, das nur die Vermehrung der Hybridzellen gestattet (HAT-Medium), ausgesät.
Nach Erscheinen der Hybridomzellhaufen werden die Kulturüberstände mit Hilfe eines Cellulosenitrat-Immunospottests auf Antikörpergehalt getestet und anschließend in an sich bekannter Weise die Spezifität durch einen Festphasen-Bioassay bestimmt.
Von durch diese Tests ausgewählten Hybridomen mit spezifischer Antikörperproduktion gegen HulFN-alpha werden verfahrensgemäß durch Einzelzellklonierung mittels eines speziellen Mikroaminpulators stabile monoklonale Hybridzellinien selektioniert. Die von ausgewählten Hybridzellinien produzierten Anti körper werden in an sich bekannter Weise auf ihre Eignung für immunchemische Bestimmungsmethoden und für die Immunaffinitätschromatographie geprüft.
Die auf diese Weise erhaltenen Hybridzellklone H/B61D3 und H/C61D2 werden anschließend weitervermehrt, in flüssigem Stickstoff gelagert und bei Bedarf für die Produktion monoklonaler Antikörper in vitro oder in Aszitesform verwendet.
Die Gewinnung der neuen monoklonalen Antikörper erfolgt aus Kulturbeständen der stabilen monoklonalen Hybridzellinien bzw. aus derAszitesflüssigkeitHybridom-tragenderBALB/c-Mäuse, vorzugsweise von BALB/c χ NMRI-oder NMRI χ BALB/'c-Hybridmäusen, nach gebräuchlichen Isolierungsverfahren.
Die Vorteile der vorliegenden Erfindung liegen
— in der intralienalen Immunisierung, welche zu hohen Ausbeuten an gewünschten Hybridomen führt, sowie
— in der Einzelzellklonierung, die eine sichere und schnelle Gewinnung stabiler Hybridzellklone ermöglicht. Darüber hinaus werden erhebliche Einsparungen an teuren Zellzuchtmedien erzielt.
Die verfahrensgemäß hergestellten neuen monoklonalen Antikörper ZIMET B61D3 und ZIMET C61D2 haben weiterhin den Vorteil, daß zwei HulFN-alpha-Subtypen (alpha 1, alpha 2) mit jedem dieser Antikörper angereichert werden können und zur immunchemischen Bestimmung der genannten HulFN-alpha-Subtypen nur ein Antikörper markiert werden muß. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung monoklonaler Antikörper gegen HulFN-alpha, die für die Bereitstellung von Immunoassays für Human-Medizin, Veterinärmedizin und Biotechnologie sowie von Immunsorbentien zur immunaffinitätschromatographischen Anreicherung von biotechnologisch produziertem HulFN-alpha für therapeutische Zwecke von volkswirtschaftlicher Bedeutung sind.
1. Beispiel
— Herstellung der Hybridome
Mäuse des Stammes BALB/c werden in mehrwöchigen Abständen mit jeweils 106 bis 107 IU HulFN-alpha intralienal immunisiert. Drei Tage nach der letzten Immunisierung erfolgt die Fusion der Milzzellen einer immunisierten Maus mit Myelomzellen der Linie P3-X63-Ag8.653 (hergestellt von Kearny et al., J. Immunology 123,1979,1548-1550) nach bekannten Verfahren (Köhler, G., and C. Milstein, Nature 256,1975,459-497; Campbell, A.M., Monoclonal antibody technology in Laboratory Techn. in Biochem. and Molec. Biol. Vol.13, Elsevier 1984). Die Hybridome werden in HAT-Medium angezüchtet.
— Die Auswahl der Hybridome mit spezifischer Antikörperproduktion erfolgt mit Hilfe eines Cellulosenitrat-Immunospottests (Wollweberand Wisniewski,Acta histochem., Suppl.-Band33 [1986], 305-307) und eines Festphasen-Bioassays (Berthold et al., Arzneim.-Forsch. 35 [I], [1985], 364-369).
Die Klonierung wird in vitro, hier konkret durch Einzelzellklonierung mit Hilfe eines speziellen Mikromanipulators in 96-well-Mikrotiterplatten und Plaste-Petrischalen, durchgeführt.
Die von den gewonnenen Hybridomklonen produzierten neuen monoklonalen Antikörper ZIMET B61D3 und ZIMET C61D2 weisen folgende Eigenschaften auf:
Eigenschaften Monoklonaler Antikörper
ZIMETB61D3 ZIMETC61D2
Ig-Klasse IgGI IgGI
Interferon-Subtyp-spezifität HUIFN^HuIFN2 HuIFN11HuIFN2
Eignung zur Immunaffini- sehr gut sehr gut tätschromatographie
Gewinnung der neuen Antikörper
Die Gewinnung der neuen monoklonalen Antikörper erfolgt aus Kulturbeständen der stabilen monoklonalen Hybridzellinien bzw. aus der Aszitesflüssigkeit Hybridom-tragender BALB/c-Mäuse nach gebräuchlichen Isolierungsverfahren.
2. Beispiel ' .
— Herstellung der Hybridome
Die Herstellung der Hybridome erfolgt analog Ausführungsbeispiel 1.
— Gewinnung der neuen Antikörper
Eine gegenüber BALB/c-Mäusen deutlich erhöhte Aszitesbildung wird durch die Verwendung von NMRIx BALB/c bzw. BALB/c χ NMRI-FrHybridmäusen erreicht, wodurch die Effektivität der Produktion der monoklonalen Antikörper ZIMET B61D3 und ZIMET C61D2 auf etwa 350% gesteigert wird.
Claims (1)
- Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen humanes Interferon-alpha (HulFN-alpha) durch Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit HulFN-alpha, Fusion ihrer Milzzellen mit Myelomzellen, Selektion der erhaltenen Hybridome, Bestimmung ihrer Antigendeterminantenspezifität, Auswahl der spezifischen Hybridome und ihre Kultivierung bzw. Transplantation auf Mäuse in der Aszitesform, gekennzeichnet dadurch, daß— die Antigendeterminationsspezifität durch einen Feststoffphasen-Bioassay bestimmt wird,— zur Kultivierung bzw. Transplantation die Klone H/B61D3 und H/C61D2 eingesetzt und— die monoklonalen Antikörper ZIMET B61D3 sowie ZIMET C61D2 aus den Kulturüberständen der Hybridzellinien bzw. aus der Aszitesflüssigkeitvon Hybridom-tragenden Mäusen, vorzugsweise von BALB/cxNMRI- oder NMRIxBALB/c-Hybridmäusen, isoliert werden.
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| CN111087461A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-01 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种重组蛋白、编码该重组蛋白的核酸及其应用 |
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