DD244357A5 - Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine, die zur Bildung von Antikoerpern gegen einen infektioesen Organismus oder zu einer zellulaeren Immunitaet gegenueber einem infektioesen Organismus fuehrt. Dazu wird in Adenoviren die Genkodierung fuer das Antigen insertiert, das den genannten Antikoerpern entspricht oder die zellulaere Immunitaet induzieren. Diese Adenoviren werden einer nur im Darm loeslichen Dosierungsform einverleibt. Nach Verabreichung an warmbluetige Tiere infiziert das Virus die Darmwand und induziert die Produktion von Antikoerpern fuer das Adenovirus bzw. fuehrt die zellulaere Immunitaet gegenueber diesem Adenovirus herbei.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine, die die Bildung von Antikörpern oder eine celluläre Immunität gegenüber einem infektiösen Organismus herbeiführt.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Ein Hauptziel der biomedizinischen Forschung ist es, durch Immunisierung gegen Viruserkrankungen zu schützen. Ein Weg, dies zu erreichen, besteht darin, daß man Vakzine aus abgetöteten Viren einsetzt. Jedoch sind große Mengen an Material für die Vakzine aus abgetöteten Viren erforderlich, um eine ausreichende, als Antigen wirkende Masse zu erhalten. Außerdem werden Vakzine aus abgetöteten Viren häufig während der Herstellung mit unerwüschten Produkten kontaminiert. Heterologe Vakzine aus Lebendviren, bei denen ein in geeigneter Weise engeniertes Adenovirus eingesetzt wird, das Wiederum eine Vakzine darstellt (man vergleiche R. M. Chanock et al, JAMA195,151 [1966]) scheinen ein ausgezeichnetes Immunogen zu sein. Die vorliegende Erfindung betrifft orale Vakzine aus Lebendviren unter Verwendung von Adenovirus als Vektor. Derzeit vertriebene Adenovakzine umfassen lebende, infektiöse Adenoviren in einer überzogenen, erst im Darm löslichen Dosierungsform. Nach Verabreichung des zu impfenden Patienten wird das Virus an dem oberen Atmungssystem (man nimmt an, daß dort die krankheitserregende Infektion stattfindet) vorbei transportiert und in den Eingeweiden freigegeben. In den Eingeweiden reproduziert sich das Virus in der Darmwand. Obwohl es dort nicht in der Lage ist, eine adenovirale Erkrankung hervorzurufen, induziert es jedoch die Bildung von Adenovirus-Antikörpern und führt somit zu einer Immunität gegenüber der adenoviralen Erkrankung.
Etwa 200000 Personen in den Vereinigten Staaten werden jedes Jahr mit dem Hepatitis-B-Virus infiziert. Außerdem besteht eine starke Korrelation zwischen der Hepatitis-B-Infektion und Leberkrebs. Die derzeit vertriebenen Impfstoffe gegen Hepatitis B stellen injizierbare Produkte dar, die aus den Blutplasma gesunder Träger mit Hilfe eines langwierigen Verfahrens, das verschiedene einzelne Stufen umfaßt, hergestellt werden.
Es existieren zwei Hauptantigene gegen das Hepatitis-B-Virus: Das Oberflächenantigen (HB5Ag) und das Innenkernantigen (HBcAg). Die Antigenstrukturvon HB3Ag ist etwas komplex. Es hat eine gemeinsame gruppenspezifische Determinante a. Außerdem existieren zwei Sätze sich gegenseitig ausschließender typenspezifischer Determinanten d oder y und w oder r. Das HB0Ag ist der Typus eines Einzelantigens. Es ist bekannt, daß die Produktion von Antikörpern gegen HB3Ag oder HB0Ag Immunität gegenüber einer Hepatitis-B-Infektion verleiht.
Verschiedene Arbeitsgruppen haben rekombinante DNA-Techniken eingesetzt, um das HB5Ag mit Hilfe von Mikroorganismen zu synthetisieren. HB8Ag wurde in Escherichia coli in Form eines Fusionsproteins synthetisiert (J.C.Edman et al, Nature, 291,503 [1981 ]). Dieses Antigen wurde auch in Hefe unter Verwendung des ADH-Promotors (Vaienzueia et al, Nature 298,347 [1982]) oder des Säurephosphatase-Promotors (Miyanohara et al, Proc. Natl., Acad. Sei. USA, 80,1 [1983]) synthetisiert. Schließlich ist auch das Vaccinia-Virus als Vektor zur Herstellung einer Lebendvirusvakzine für Hepatitis-Virus eingesetzt worden (Smith et al, Nature, 302,490 [1983]).
Rotaviren sind die Hauptursache für eine akute Gastroenteritis bei Säuglingen. Diese Viren besitzen ein Genom aus elf doppelsträngigen RNA-Segmenten, die in einem Kapsid eingekapselt sind. Das Kapsid enthält eine innere und äußere Hülle. Eines der Proteine (VP7) der Außenhülle ist ein Glykoprotein, das mit serotypspezifischen neutralisierenden Antikörpern reagiert (A.R. Kalica et al. Virology, 112,385 [1981]). Dieses Protein ist kodiert durch Gen 9 des human Typ 1 (WA) Rotavirus. Das Gen 9 des Typ 1 human Rotavirus wurde kürzlich in E. coli kloniert. Zudem wurde seine Sequenz bestimmt (M. Richardson et al, Viral., 51,860 [1984]). Bis jetzt ist noch nicht über die Expression dieses Proteins in einem anderen System berichtet worden. Adenoviren enthalten ein lineares Doppel-DNA-Molekül (Molekulargewicht 2Ox 106 bis 25 x 106), das für 20 bis 30 Polypeptide kodiert ist. Davon sind viele in das virale Partikel inkorporiert, das morphologisch komplex ist und auf komplizierte Weise zusammengesetzt wird. SV4OT-Antigen ist früher unter Verwendung einer Adenovirus-Rekombinante (D.Solnick, Cell., 24,135 [1981 ]), C.Thummel et al, Cell., 23,825 [1981 ], Y. Gluzman et al, in Eukaryotic Viral Vectors, S. 187, Cold Spring Harbor [1982]) exprimiert wurden. Auch Mäuse-Dihydrofolat-Reductose ist unter Verwendung einer Adenovirus-Rekombinante (K. Berkner und P.A.Sharp, Nucleic Acids Research, 12,1925 [1984]) exprimiert worden.
Ziel der Erfindung
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein neuer Impfstoff bereitgestellt.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung einer Vakzine bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zu Herstellung einer oralen Vakzine, die die Bildung von Antikörpern bewirkt oder eine celluläre Immunität gegenüber einem infektiösen Organismus in Warmblütern herbeiführt, wobei man in Adenoviren die Genkodierung für das Antigen insertiert, welches diesem Antikörper entspricht oder die genannte celluläre Immunität induziert, um lebende rekombinante Adenoviren zu produzieren, und diese lebenden rekombinanten Adenoviren in eine mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehene Dosierungsform einbringt.
Erfindungsgemäß werden lebende infektiöse Adenoviren in einer mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehenen Dosierungsform oral verabreicht. Diese Adenoviren würden so engeniert, daß sie Gene enthalten, die für Antigene kodiert sind, welche durch andere krankheitserregende Organismen produziert werden. Nach Freigabe in den Eingeweiden reproduziert sich das Virus in der Darmwand, induziert die Bildung von Antikörpern oder induziert die celluläre Immunität sowohl gegenüber dem Adenovirus als auch dem anderen krankheitserregenden Organismus. Unter einem „lebenden Virus" wird im Gegensatz zu einem „abgetöteten" Virus ein Virus verstanden, das entweder allein oder zusammen mit weiterem genetischem Material in der Lage ist, identische.Abkömmlinge zu produzieren. Unter „infektiös" wird die Fähigkeit verstanden, das virale Genom in Zellen zu transportieren.
Erfindungsgemäß erhältlich ist somit ein Vakzine, die Antikörper produziert oder eine celluläre Immunität gegenüber einem infektiösen Organismus in warmblütigen Tieren hervorruft. Diese Vakzine umfaßt lebende rekombinante Adenoviren, welche die Genkodierung für das entsprechende Antigen zu diesen Antikörpern oder für die Induzierung der genannten cellulären Immunität enthält, wobei diese Vakzine in einer mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehenen Dosierungsform formuliert ist.
Erfindungsgemäß erhältlich ist insbesondere eine Vakzine.zur Herstellung von Antikörpern für das Hepatitis-B-Virus oder das Rotavirus in warmblütigen Tieren, die lebende rekombinante Adenoviren aufweist, welche die Genkodierung für ein Hepatitis-B-Antigen bzw. Rotavirus-Antigen enthalten, wobei diese Vakzine in einer mit einem erst im Darm löslichen Überzug versehenen
Dosierungsform formuliert ist.
1. Adenovirus-Vektoren '
Drei Adenovirus-Vektoren (Y. Gluzman et al, in Eukaryotic Viral Vectors, S. 187, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) können ohne Schwierigkeiten konstruiert werden. Um die Länge der fremden DNA, die insertiert werden kann, zu maximieren, können zwei expandierbare Regionen des viralen Genoms deletiert werden, nämlich die „frühen" Regionen 1 (early regions 1) oder die „frühe" Region 3 (early region 3) (E 1 und E 3), oder beide, des viralen Genoms vom Adenovirus-Typ 5. ΔΕ1 erzeugt man durch ein in vivo Rekombinationsereignis zwischen einem Plasmid und einer modifizierten adenoviralen DNA (alle in der vorliegenden Beschreibung erläuterten Plasmide werden in E. Coli vermehrt). Das Plasmid wird gebildet durch Insertion der adenoviralen DNA-Sequenzen zwischen 0 und 17 Karteneinheiten in pBR 322 und anschließender (Verdauung mit Restriktionsendonucleasen und Ligation) Deletion der Sequenzen zwischen 1.4 und 9.1 Karteneinheiten und Anbringung einer Xba1-Restriktionssite an dieser Verbindung. Dieses Plasmid ist im Stand der Technik als pAC bezeichnet. Die modifizierte adenovirale DNA, die bei 4,0 Kartenkoordinaten eine einzelne Xba 1-Restriktionssite enthält, wird wie folgt gebildet. Xba 1 spaltet „wild typ" Ad 5 DNA an vier Sites: 4,29,79 und 85 Karteneinheiten. Modifizierte DNA mit fehlenden Sites bei 29,79,85 wird isoliert durch Schneiden von Ad5 DNAmitXba1,Transfektion der DNA und Isolierung des modifizierten Adenovirus, dem Xba 1 -Sites bei Positionen 29 und/oder 79 fehlen. Man wiederholt dieses Verfahren und isoliert das modifizierte Adenovirus, das die Xba 1 -Site lediglich in Position 4 enthält. Derart modifizierte Adenoviren können auch ohne Schwierigkeiten mit Hilfe der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese konstruiert werden (M.Smith und S.Gilliam [1981] in Genectic Engineering, J.K.Setlowund A. Hollaender, Hrsg. Bd. 3, S. 1-32, Plenum, New York). Bei dieser Technik werden die Xba 1 -Restriktions-Sites unter Verwendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide zerstört, die dazu dienen, „schweigende" Veränderungen in dem Aminosäurekodierungsregionen herbeizuführen, die durch die entsprechenden Xbai-Restriktionsendonukleasensites definiert sind. Der Vektor ΔΕ3 wird durch Deletion derE3-Regionsequenzen konstruiert. Zwei modifizierte Adenoviren (Typ 5) werden durch die oben erläuterten Verfahren gebildet. Eines enthält keine Xba 1 -Sites. Das andere enthält lediglich die Xba 1-Sites bei Kartenkoordinaten 29,79 und 85. Die linke Hälfte der DNA des Mutanten, der keine Xba 1 -Sites enthält, wird mit der rechten Hälfte der DNA des Mutanten, der Xba 1-Sites bei 79 und 85 enthält, vereinigt. Es wird so ein modifiziertes Adenovirus gebildet, das
Xba 1-Sites lediglich bei Kartenkoordinaten 79 und 85 enthält. Spaltung dieser DNA mit Xba 1 und anschließende Religation ergibt die ΔΕ3 virale DNA, welche die E3 Region zwischen 79 und 85 Kartenkoordinaten deletiert und ein einzelne Xba 1 klonierende Site an diese Verbindung setzt. ΔΕ1ΔΕ3 kann durch Deletionen in beiden Regionen in ähnlicher Weise konstruiert werden. (
Ähnlich wie ΔΕ1, ΔΕ3 und ΔΕ1ΔΕ3 können auch Vektoren vom Adenovirus-Typ 5 und Vektoren der Adenovirus-Typen 4 und 7 konstruiert werden. So ist beispielsweise im AdenovirusTyp 7 die E3-Region zwischen der Xba 1-Site bei 80,5 Kartenkoordinaten und der EcoR 1-Site bei Kartenkoordinate 85 deletiert. Kartenkoordinate = „map coordinate".
2. Plasmide der 6X-Reihe (für HB8Ag und Rotavirus VP7) |
Es können Plasmide konstruiert werden, welche es ermöglichen, den Adenovirus 2 „späten" Promotor (Adenovirus 2 late j
promoter) „stromaufwärts" von der DNA-Kodierung für Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder Rotavirus VP7 im Anschluß an j
SV 40 „Spleiß"-Signal zu plazieren. Diese sind jeweils flankiert von Xba 1-Sites für die Insertion in die Adenovirus ΔΕ 1,ΔΕ3 oder AE1AE3-Vektoren
a. p6XH
Das Plasmid 6XH enthält einen Xba I-Linker bei -400 bp vom Ad 2 „major late" Promotor und eine EcoR 1 -Site bei +33 bp, 8 bp vor dem Ende des ersten Adenovirus späten Leaders. Darauf folgt ein EcoR I-Linker bei 26 bp vor dem ATG des HB8Ag gefolgt von der HBsAg-Sequenz von 678 bp bis zu einem weiteren EcoR I-Linker bei 809 bp. Es schließt sich eine SV40-Sequenz an, die von 2753-2516bp auf der SV40-Karte reicht. Diese Sequenzen werden alle insertiert in das „große" pBR 322 Bam Hl bis EcoR I-Fragment via Xba I-Linker.
b. p6XR
Das Plasmid p6XR wird hergestellt, indem man das Rotavirus VP7 Gen mit EcoR I-Linkem bei Nukleotid 6 und 1036 an den Ad 2 major late-Promotor bindet, der eine Xba 1-Site bei -400 bp und einen EcoR 1-Linker bei +331 enthält, und SV 40-Sequenzen von 2753-2516 hinter das VP7-Gen mit einem EcoR 1 -Linker bei 2753 (SV40-Kartenkoordinate) und einer Xba 1 Site bei 2 516 bp anfügt. Diese „Kassette" insertiert man in das „große"EcoR1 bis BamH Fragment von pBr322.
c. Übertragung der Plasmidsequenzen zum viralen DNA-Vektor und Herstellung des rekombinanten Adenovirus
Die Übertragung der „Kassette" des Promotor-fremden Gen-Terminators auf den Adenovirus-Vektorführt man entweder wie nachstehend beschrieben oder mittels in vivo Rekombination durch (man vergleiche das nachstehende detailierte Beispiel). Die gereinigte Adenovirus-Vektor-DNA spaltet man mit einer Restriktionsendonuklease. Es schließt sich eine Behandlung mit alkalischer Phosphatase von Kälberdarm an, um „self ligation" zu verhindern. Vom Plasmid abgeleitete Sequenzen erhält man, indem man p6XH oder p6XR mit Xba I spaltet. Diese werden dann an die adenovirale Vektor-DNA gebunden. Entweder 293-Zellen, (Grahm et al. Gen. Virol., 86,10 [1978]), Heia-Zellen oder Wi38-Zellen werden dann mit der Ligationsmischung transfiziert und mit Agar überschichtet. 7 bis 10 Tage später werden Plaques gesammelt und Virus-"Stocks" hergestellt.
3. Expressionsassays
Drei Arten von Assays wurden eingesetzt, um die Expression von Hepatitis-B-Oberflächenantigen und Rotavirus VP7 zu untersuchen. Es handelt sich dabei um folgende:
a. Indirekte Immunofluoreszenz
Es wurden entweder monoklonale Antikörper von Mäusen oder Kaninchen-Antisera eingesetzt, um die Expression der rekombinanten Δ E1 und Δ E 3-Virus Stocks zu detektieren, welche HB5Ag oder VP7 DNA Sequenzen enthalten. Die Gegenfärbung erfolgte mit anti-Maus oder anti-Kaninchen FITC von der Ziege.
b. Immunopräzipitation Dielmmunopräzipitation von HB8Ag oder Rotavirus VP7 in Zellen, die mit den rekombinanten Adenoviren infiziert waren, wurde entweder unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern von Mäusen oder polyklonalen Antisera von Kaninchen gegen HB8Ag oder Rotavirus VP7 und Protein ASepharoseCL4B durchgeführt.
c. RIA
Die Expression von HB8Ag wurde auch mit einem im Handel erhältlichen Radioimmunoassay (Ausria, Abbott Labs.) getestet.
4. Immunogene Natur des rekombinanten Adenovirus
Das lebende, lyophilisierte rekombinante Adenovirus, das in einer Kapsel enthalten war, die mit einem Überzug ausgestattet war, der erst im Darm löslich ist, wurde auf Immunogenität untersucht durch Verabreichen (104 - 106 50% infektiöse Dosis/ Tablette) an Hamster oder Schimpansen und Feststellen der Antikörperspiegel und des Schutzes vor der Challenge. Die derzeit vertriebene Adenovirusvakzine enthält lebende lyophilisierte Adenoviren entweder vom Typ 4 oder Typ 7, die mit inerten Hilfsstoffen vermischt sind. Sie wird in Form von Tabletten bereitgestellt, die mit einem Überzug versehen sind, der sich erst im Darm löst. Die Verabreichung der Tabletten (in etwa 104 TCID50 des Virus) führt zu einer selektiven gastrointestinalen Infektion, ohne dabei eine Erkrankung hervorzurufen. Die Vakzine ist sicher; die induzierte Infektion ist in spezifischer Weise auf den Intestinaltrakt beschränkt. Das Vakzinvirus wird nicht von den geimpften Stellen auf susceptible „close contacts" Überträgen. 21 Tage nach der Immunisierung werden spezifische neutralisierende Antikörper in über 95% der geimpften Individuen festgestellt. Die neuen Impfstoffe der vorliegenden Erfindung, die spezifisch beschrieben sind, weisen rekombinante Adenoviren auf, die Hepatitis B-Oberflächenantigen und Rotavirus VP7 exprimieren. Die Impfstoffe werden formuliert und wirken in derselben Weise wie der derzeit vorhandene Adenovirusimpfstoff mit der Ausnahme jedoch, daß sowohl Antikörper für Hepatitis-B-Oberflächenantigen oder Rotavirus VP7 als auch Antikörper für das Adenovirus produziert werden. Bei jeder erfindungsgemäßen Ausführungsform führt die Verabreichung von etwa 104 TCID50 des rekombinanten Virus, oder sogar beträchtlich weniger davon, zu dem gewüschten Immunansprechen. Die Bestimmung der optimalen Dosis hängt von dem eingesetzten rekombinanten Adenovirus ab. Die Bestimmung der optimalen Dosis bleibt dem Fachmann überlassen.
5. Ausführliches Beispiel für eine Rekombinante, die authentisches HB3Ag exprimiert
Nachfolgend ist ein ausführliches Beispiel für die Konstruktion einer Adenovirus-Rekombinante erläutert. Das HB5Ag Gen des adw-Subtyps von 26bp „stromaufwärts" (upstream) des HBsAg-Translation-lnitiations-Codons und 131 bp „stromabwärts" (downstream) von dem Translation-Terminations-Codons wurde flankiert von „stromaufwärts"-Sequenzen von Ad2-"major Iate"-Promotor (+33 bis 400bp; D.Solnick, Cell. 24,135-143 [1981]) und durch „stromabwärts"-Sequenzen von SV40 ([2753 bis
-4- Z44 357
nennt man p6XH (siehe oben). Diese Sequenzen wurden in das einzige Xba1 Site Plasmid pAC insertiert, das ein Insert der Ad 5 DNA enthält, die vom EcoRI-Linker am linken Ende des Adenovirus Genoms bis zu der Hind III Site bei Ad 5 Kartenkoordinate 17.0 reicht (Y. Gluzman, H. Reichl und D. Solnick, 1982, in [Y. Gluzman, Hrsg.], Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, S.187 bis 192]. Die neuen Plasmide [pACH-2 und pACH-9] mit der „Kassette", welche die Ad2 „major late" Promotor-HBsAg Gen-SV40 „Verarbeitungs" Signale in beliebiger Reihenfolge enthält, wurde mit Hind III gespalten. Das jeweilige Spaltungsprodukt von Hindill wurde mit dem „großen" Xba 1 Fragment der Adenovirus Mutante ΔΕ1 kombiniert, die von Kartenkoordinaten 9.1 bis 100 reicht [Y. Gluzman, H. Reichl, D. Solnick, 1982 ind [Y. Gluzman, Hrsg.] Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, S. 187-192]). Diese DNA-Mischung wurde transfiziert (F. L.Graham und A. J. ven der Eb, Virology 52,456-467 [1973]) auf 293-Zellen (F.L.Graham, J.Smiley, W.C.Russell und R., J. Gen. Virol.,36,59-72 [1977]). Die Zellen wurden zur Detektion von Plaques mit Agar überschichtet. Etwa 10 bis 14 Tage später wurden 54 Plaques gesammelt und daraus Virus-„Stocks" hergestellt. Diese Viren wurden auf Anwesenheit von HB5Ag-DNA gescreent mittels Hybridisierung zu einer 32P-markierten HBsAg-DNA-Probe. Positive Plaques (49 von 54) wurden dann auf Monoschichten von 293-Zellen infiziert. Die Expression von authentischem HB3Ag wurde in Zellysaten sowohl durch Radioimmunoassay (Ausria, Abbott Laboratories, Inc. oder NML-HB3Ag RIA Nuclear Medical Laboratories) als auch durch Immunpräzipitation von 35S-radiomarkiertem HB5Ag unter Einsatz eines monoklonalen Antikörpers für HB3Ag (Anti-a-Subtyp, Boehringer Mannheim Biochemicals) detektiert.
6. Im oben aufgeführten spezifischen Beispiel wurde der Ad 2 „major Iate"-Promotor eingesetzt, der lediglich 33 Nukleotide „stromabwärts" von der Transcriptions-Initiations-Site reicht, so daß die erste Spleiß-Site nicht eingeschlossen ist. Dieser Promotor enthält nur den ersten Teil des Tripartit-Leaders des adenoviralen „major late'^Promotors. Jedoch kann der „major Iate"-Promotor von anderen Adenoviren, insbesondere von den Typen 3,4,5 oder 7, eingesetzt werden. Der vollständige Tripartit-Leaderdieses Promotors kann eingesetzt werden. Im nachstehenden Beispiel ist die Konstruktion von zwei bakteriellen Plasmiden, pHM 1 und pHM 2, beschrieben, die „Kassetten" enthalten, welche aufgebaut sind aus dem Ad2 „major late"-Promotor und den am weitesten links angeordneten 168bp des 200 bp Ad 2 „Tripartif'-Leaders, gefolgt vom HB5Ag und „Processing" und Polyadenylierungs-Signalen vom SV40-Virus. Diese Plasmide enthalten auch Adenovirussequenzen, welche die „Kassette" flankieren, so daß eine homologe Rekombination durchgeführt werden kann, um die Kassette in das adenovirale Genom einzufügen. Auf der linken Seite ist die „Kassette" durch die am weitesten links angeordneten 353 bp des Ad5-Genoms und auf der rechten Seite durch Kartenkoordinaten 8-15.5 des Adenovirus 5 flankiert. Das Plasmid pHM 1 enthält 19 bp der SV40-Virussequenz (SV40 Nucleotide 5173-5174), die dem HB5Ag-Gen voransteht. Das Plasmid pHM2 ist mit pHM 1 identisch, enthält jedoch nicht diese Sequenz.
Die „Kassetten" sowohl von pHM 1 als auch von pHM 2 wurden in die E1 -Region des Adenovirus 5 Genoms mit Hilfe derTechnik der homologen Rekombination eingefügt, wie dies zuvor beschrieben ist.
Jedes Plasmid wurde linearisiert und mit den „großen" Xba 1-Fragment der Adenovirus-Mutante ΔΕ1 kombiniert, die von Kartenkoordinaten 9.1 bis 100 reicht (Y. Gluzman, H. Reich und D. Solnick, 1982 in [Y. Gluznaan, Hrsgb.] Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories Seiten 187 bis 192). Die Plaques wurden gesammelt. Es wurden „Stock"-Viren von jeder erzeugt.
Diese „Stock"-Viren wurden auf eine human-embryonale Nieren (293)-Zellinie (F. L Graham, J. Smiley, W. C. Russell und R. Nairn [1977] J. Gen. Virol 36,59-72) infiziert. Es wurde festgestellt, daß nach einer 40stündigen Infektion etwa ^μg HB3Ag (bestimmt mittels Radioimmunoassay und Vergleich der cpm mit NML-HB5Ag-Kh als positive Kontrolle) pro 5 x 106 infizierten Zellen in der oberhalb der HM 2 infizierten Zellen befindlichen Kultur vorhanden waren. Das HM 1-Virus machte etwa 60% dieser Menge aus. Es wurde gefunden, daß die durch diese Viren produzierten HB5Ag-Polypeptide glykosilierte (P2) und nicht-glykosilierte (P 1) Formen darstellen (P. L. Marion, F. H. Salazar, J. J.Alexander und W. Robinson [1979] J. Virol, 32,796-802; D. L. Peterson [1981 ] J. Biol. Chem. 256,6975-6983). 40 Stunden nach der Infektion waren die meisten der HB5Ag (78%) von den Zellen in das Kulturmedium ausgeschieden worden als Partikel (Dichte = 1,20 g/ml), welches das gleiche oder fast das gleiche ist wie das 22 nm Partikel (J. L Gerin, R. H. Purcell, M. D. Hoggan, P. V. Holland und R. M.Chanock [1969] J. Virol. 4,763-768; J. L Gerin, P.V.Holland und R.H.Prucell [1971] J. Virol. 7,569-567), das im Humanserum gefunden wurde. HM2 ergab etwa 40% mehr HB5Ag als HM1. Beim HM 2-Virus wurde jedoch, verglichen mit dem zuvor beschriebenen Hybridadenovirus, ΔΕ1 H, eine 70fache Zunahme hinsichtlich des HBsAg-Polypeptids beobachtet.
Anstelle des adenoviralen „major Iate"-Promotors kann jeder andere geeignete eukaryotische Promotor eingesetzt werden, wie beispielsweise der Human-Metallothionein-Promotor oder der Human-Dihydrofolat-Reduktase-Promotor. Außerdem wurden in erfindungsgemäß durchgeführten Beispielen die Adenovirus Typ 5 DIMAaIs Vektor für die Fremdgenexpression eingesetzt. Es können jedoch auch andere Adenovirustypen als Vektor eingesetzt werden. Insbesondere nützlich sind die Typen 3,4 und 7, die derzeit in Impfstoffen Verwendung finden.
Erfindungsgemäß wird auch die Verwendung der „Processing"-und Polyadenylierungssignale von der SV50 DNA beschrieben. Jedoch können jede geeignete „Processing"- und Polyademylierungssignale eingesetzt werden. Diese können von adenoviraler DNA, insbesondere von den Typen 3,4 und 7 stammen.
Wird das Fremdgen erfindungsgemäß in die deletierte „frühe" Region 3 des Adenovirus insertiert, dann bleibt das rekombinante Virus infektiös. Zur Durchführung der Impfung ist es lediglich erforderlich, das rekombinante Virus in die Darmwand zu bringen. Andererseits ist die „frühe" Region 1 wesentlich für die infektiosität des Adenovirus. Wird daher das Fremdgen in die deletierte „frühe" Region 1 insertiert, muß gleichzeitig ein Helfervirus verabreicht werden. Dieses Helfervirus ist üblicherweise ein unmodifiziertes, infektiöses Adenovirus. Das Helfervirus kann jedoch auch selbst ein unvollständiges Virus mit einer Deletion sein, das durch das rekombinante Virus komplementiert werden kann. Auf diese Weise findet das Viruswachstum und die Produktion von Fremdantigen nur in Zellen statt, die mit beiden Viren infiziert sind. Dieses unvollständige Helfervirus kann vom gleichen oder einem anderen Subtyp sein als das rekombinante Virus. Im Falle eines anderen Subtyps (z. B. falls das rekombinante Virus von Ad4Subtyp ist und das unvollständige Virus vom Ad7Subtyp ist) sollte die Bildung von „wild typ virus" durch Rekombination minimiert werden. Die Vermehrung des Virus für die Herstellung des Impfstoffs kann man durchführen, indem man entweder beide Viren in human diploiden Fibroplasten gemeinsam kultiviert oder indem man die Viren getrennt voneinander in Zellinien kultiviert, von denen man weiß, daß sie jeden dieser Defekte komplementieren.
Außer den E1 und E3-Regionen gibt es verschiedene andere Regionen des viralen Genoms, wo die „Kassette", die Promotor, „Tripartit-Leader", Fremdgen und „processing"- sowie Polyadenylierungssignale enthält, insertiert werden kann. Dazu zählen eine Region zwischen E1 a und E1 b, Regionen am linken und rechten Ende des Genoms und bei der E4-Region und zwischen L5 und E4-Regionen. Einige Beispiele sind nachstehend beschrieben.
Ad5 enthält bei Kartenkoordinate 1,4 einen E1 a-Promotor und bei Kartenkoordinate 4.7 einen E1 b-Promotor. Die Polyadenylierungs-Site für E1 a ist bei Kartenkoordinate 4.6, Nucleotid 1631; bei Nucleotid 1671 befindet sich dieTATA-Boxfür den E1 b-Promotor. Bei Nucleotid 1572 befindet sich eine einzelne Hpa1-Site (GTTAAC). Diese Site kann eingesetzt werden für die Platzierung des Adenovirus Typ 2 „major Iate"-Promotors und Hepatitis-B-Oberflächenantigen und Verwendung der E1 a-Polyadenylierungs-Site. Die Polyadenylierung von E1 a kann man durchführen durch Plazieren eines Polyadenylierungssignals von der SV40 viralen DNA hinter E1 a oder von der L4-Region des Virus. Die zusätzliche DNA in dem Genom in der obigen Konstruktion kann kompensiert werden durch Entfernen der als nicht-wesentlich bestimmten DNA in der E3-Region. Andere Insertionspunkte befinden isch an den extrem linken und rechten Enden des Genoms. Am linken Ende befindet sich die Position zwischen der 116bp invertierten terminalen Wiederholung und der TATA-Box des E4-Promotors. In Ad2 gibt es eine Mbo Il-Site bei 99,3 Karteneinheiten. Diese befindet sich 191 bp vom äußeren rechten Ende der viralen DNA. In Ad 5 gibt es eine Thal (FnU4DII)-Site240bpvom linken Ende des Genoms. Diese Region befindet sich zwischen dem ITR und „stromaufwärts" von der E4TATA-Box. Auch in diesem Fall kann man erforderlichenfalls eine Insertion in eine E 3 Deletionsmutante vornehmen, um die extra-DNA unterzubringen.
In jedem Fall können dieselben Regionen als Insertionspunkte für die Kassette aus Adenovirus „major Iate"-Promotor, Adenovirus „tripartif-Leader, Fremdgen und „Processing"- und Polyadenylierungssignalen in Adenovirus Typ 4 und Tpy 7 Stämmen eingesetzt werden, die für die derzeit vertriebenen Adenovirusimpfstoffe verwendet werden. Obwohl sich obige Beschreibung insbesondere auf Adenoviren der Typen 4,5 und 7 bezieht, können infektiöse Adenovireh jeden Typs erfindungsgemäß eingesetzt werden. Adenoviren der Typen 4 oder 7 sind bevorzugt, da diese Typen derzeit in im Handel erhältlichen Adenovirusimpfstoffen eingesetzt werden.
Obwohl insbesondere Impfstoffe zur Herstellung von Antikörpern für Hepatitis-B und Rotavirus beschrieben sind, können erfindungsgemäß in ähnlicher Weise orale Vakzine gegen jedes infektiöse Agens bereitgestellt werden, das ein Antigen enthält, auf das ein warmblütiges Tier Antikörper produzieren wird oder einezelluläre Immunität herbeiführt und welches Antigen für ein Gen kodiert ist, das aus etwa 3000 Basenpaaren zusammengesetzt ist. Erfindungsgemäß ist somit beispielsweise die Immunisierung gegen Krankheiten umfaßt, wozu beispielsweise zählen: Influenza, grippeartige Erkrankung, respiratorische synzytiale Viruserkrankung, Hepatitis A, erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), Cholera, E. coli, Pertussis, Diphterie, Tetanus, Shigellose, Gonorrhöe, Mycoplasma Pneumonie usw.

Claims (9)

  1. Erfindungsanspruch:
    1. Verfahren zur Herstellung einer oralen Vakzine, die zur Bildung von Antikörpern gegen einen infektiösen Organismus, wobei es sich um das Rotavirus oder E.coli um ein Virus handelt, das Influenza, grippeartige Erkrankungen, respiratorische synzytiale Viruserkrankung, Hepatitis A, Hepatits B, erworbenes Immunschwächesyndrom (AIDS), Cholera, Pertusses, Diphterie, Tetanus, Shigellose, Gonorrhöe oder Mycoplasma Pneumonie hervorruft, oder zu einer zellulären Immunität gegenüber dem vorbezeichneten infektiösen Organismus führt, gekennzeichnet dadurch, daß man in Adenoviren die Genkodierung für das Antigen insertiert, das den genannten Antikörper entspricht oder das die zelluläre Immunität induziert, um lebende rekombinante Adenoviren herzustellen und daß man diese lebenden rekombinanten Adenoviren in eine nur im Darm lösliche Dosierungsform einbringt.
  2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem infektiösen Organismus um das Hepatitis-B-Virus handelt.
  3. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem infektiösen Organismus um das Hepatitis-B-Virus und bei den Genkodes um die für das Hepatitis-B-Oberflächenantigen handelt.
  4. 4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß das lebende rekombinante Adenovirus das Adenovirus Typ 4 oder 7 ist, wobei sich das Gen in der deletierten „frühen" Region 3 befindet. -, . ·
  5. 5. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß das lebende rekombinante Adenovirus das Adenovirus Typ 4 oder 7 ist, wobei sich das Gen in der deletierten „frühen" Region 1 befindet und daß man außerdem ein unmodifiziertes infektiöses Adenovirus desselben Typs zugibt.
  6. 6. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem infektiösen Organismus um das Rotavirus handelt.
  7. 7. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem infektiösen Organismus um das Rotavirus und bei den Genkodes um die für das Protein der Außenschale des Rotavirus handelt.
  8. 8. Verfahren nach Punkt7, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem lebenden rekombinanten Adenovirus um das Adenovirus Typ 4 oder 7 handelt, wobei sich das Gen in der deletierten „frühen" Region 3 befindet.
  9. 9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß das lebende rekombinante Adenovirus das Adenovirus Typ 4 oder 7 istj wobei sich das Gen in der deletierten „frühen" Region 1 befindet und daß man außerdem ein unmodifiziertes infektiöses Adenovirus desselben Typs zugibt.
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Expiry date: 20040325