NO854347L - Oral vaksine, samt fremgangsmaate for fremstilling av en slik. - Google Patents

Description

Et hovedmål for biomedisinsk forskning er å gi beskyttelse mot virus-sykdommer gjennom immunisering. En tilnærming har vært å bruke drept vaksine. Imidlertid trenges store mengder materiale til drept vaksine for å sikre seg tilstrekkelig anti-genmasse. I tillegg blir drept vaksine ofte forurenset med uøns-kede produkter under fremstillingen. Heterolog levende vaksine bruker et passende fremstilt adenovirus, som selv er en vaksine, R.M. Chanock et al., JAMA, 195, 151 (1966), synes som et utmer-ket immunogen. Vår oppfinnelse vedrører levende oral vaksine som bruker adenovirus som vektor.

Nåværende markedsført adenovaksine innbefatter levende, in-feksiøs adenovirus i en tarmdekket doseringsform. Ved administrering i pasienten som skal vaksineres, blir viruset brakt for-bi det øvre respirasjonssystem (hvor den sykdomsproduserende infeksjon er tenkt å forekomme), og blir frigjort i tarmen. I tarmen reproduserer viruset seg i tarmveggen, hvor, selv om det ikke er i stand til å forårsake adenoviral sykdom, det ikke desto mindre induserer dannelsen av adenovirus-antistoffer, som således forårsaker immunitet mot adenoviral sykdom. I vår oppfinnelse vil levende, infeksiøs adenovirus som er blitt utarbeidet til å inneholde gener som koder for antigenet produsert av andre sykdomsforårsakende organismer, administrert i en tarmdekket doseringsform. Ved frigjøring i tarmen vil viruset reprodusere seg i tarmveggen, og indusere dannelse av antistoffer eller indusere cellemediært immunitet mot både adenovirus og den andre sykdomsforårsakende organisme. Ved "levende virus" menes det i motset-ning til "drept" virus, et virus som enten ved seg selv eller i konjuksjon med genetisk tilleggsmateriale er i stand til å produsere identisk avkom. Ved "infeksiøs" menes det å ha evne til å overføre det virale genomet inn i celler.

Omtrent 200 000 personer i De Forente Stater blir hvert år infisert med Hepatitt B virus. I tillegg er det en sterk korre-lasjon mellom hepatitt B-infeksjon og levercancer. De nåværende markedsførte vaksiner mot hepatitt B er injiserbare produkter fremstilt fra blodplasma av friske bærere ved en omstendelig pro-sess som involverer flere adskilte trinn.

Det er to hepatitt B virale hovedantigener: overflate-antigen (HBsAg) og kjerneantigen (HBcAg). Den antigene struktur av HPgAg er noe kompleks. Det er en felles gruppe-spesifikk deter-minant ,a. I tillegg er det to sett innbyrdes eksklusive type- spesifikke determinanter d eller y og w eller r. HBcAg er av en enke It-an ti gen type. Det er kjent at produksjon av antistoff mot HB Ag eller HB Ag gir immunitet mot hepatitt B-infeksjon.

Flere grupper har anvendt rekombinant DNA-teknikker til å syntetisere HBgAg ved mikroorganismer. HBgAg er blitt syntetisert i Escherichia coli i form av et fusjonsprotein (J.C. Edman et al., Nature, 291,503 (1981). Det er også blitt syntetisert i gjær ved å bruke ADH-promoter (Valenzuela et al., Nature 298, 347 (1982)) eller syrefosfatase-promoter (Miyanohara et al.,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80, I (1983). Til slutt er vaccinia-virus blitt brukt som en vektor for å produsere en levende virus-vaksine mot hepatitt-virus (Smith et al., Nature, 302, 490 (1983)).

Rotaviruser er en hovedårsak til akutt gastroenteritt i

barn. Disse viruser har et genom på 11 dobbeltstrengete RNA-segmenter innelukket i en kapsel. Kapselen inneholder et indre og et ytre skall. Ett av de ytre skallproteinene, VP7, er et glykoprotein som reagerer med serotype-spesifikke nøytraliserende antistoffer (A.R. Kalica et al., Virology, 112, 385 (1981)).

Dette protein blir kodet for av gen 9 av humantype 1 (Wa) rotavirus. Gen 9 av type 1 human-rotavirus er nylig blitt klonet i E. coli og dets sekvens bestemt (M. Richardson et al., J. Virol., 51, 860 (1984)). Så langt har det ikke vært noen rapport om ekspresjonen av dette protein i noe annet system.

Adenoviruser inneholder et lineært dupleks DNA-molekyl (m.v.

6fi

20 x 10 - 25 x 10 ) som koder for 20-30 polypeptider. Mange av disse er inkorporert i den virale partikkel som er morfologisk kompleks og har en avansert oppbygningsprosess. Tidligere er SV40 T-antigen blitt fremstilt ved å bruke en adenovirus-kombi-nant (D. Solnick, Cell, 2A, 135 (1981), C. Thummel et al., Cell, 23, 825 (1981), Y. Gluzman et al., i Eukaryotic Viral Vectors,

s. 187, Cold Spring Harbor (1982)). Også muse-dihydrofolat-re-duktase er blitt fremstilt ved å bruke en adenovirus-rekombinant (K. Berkner og P.A. Sharp, Nucleic Acids Research, 12_, 1925 (1984 ) ) .

Oppfinnelsen som søkes å bli patentert i sin metode med behandlingsaspekt, innbefatter en metode for fremstilling av antistoffer eller celle-indusert immunitet mot en infeksiøs organisme i et varmblodig dyr som innbefatter oral administrering til nevnte varmblodige dyr, i en tarmdekket doseringsform, av levende rekombinant-adenovirus som inneholder genet som koder for antigenet som tilsvarer nevnte antistoffer eller induserer nevnte cellemedierte immunitet.

Oppfinnelsen som søkes å bli patentert i en subgenerisk metode med behandlingsaspekt, innbefatter en metode for fremstilling av antistoffet mot hepatitt-B virus eller rotavirus i et varmblodig dyr som innbefatter oral administrering til nevnte varmblodige dyr av levende rekombinant adenovirus som inneholder genet som koder for, henholdsvis, et hepatitt-B antigen eller et rotavirus-antigen.

Oppfinnelsen som søkes å bli patentert i sitt sammensetnings-aspekt, innbefatter en vaksine for fremstilling av antistoffer eller celle-indusert immunitet mot en infeksiøs organisme i varmblodige dyr som innbefatter levende rekombinant adenovirus som inneholder genet som koder for antigenet som tilsvarer nevnte antistoffer eller indusering av nevnte celle-medierte immunitet, idet nevnte vaksine er utformet i en tarmdekket doseringsform.

Oppfinnelsen som søkes å bli patentert i et subgenerisk sam-mensetningsaspekt, innbefatter en vaksine for fremstilling av antistoffer mot hepatitt-B eller rotavirus i varmblodige dyr, som innbefatter levende rekombinant adenovirus som inneholder genet som koder for, henholdsvis, et hepatitt-B antigen eller et rotavirus-antigen, idet nevnte vaksine er utformet i en tarmdekket doseringsform.

1. Adenovirus-vektorer.

Tre adenovirus-vektorer (Y. Gluzman et al., i Eukaryotic Viral Vectors, s.187, Cold Spring Harbor Laboratories, 1982) kan lett bli konstruert. For å maksimere lengden av det fremmede DNA som kan bli innført, kan to områder av det virale genom som kan deleteres, tidlig område 1 eller tidlig område 3 (El og E3), eller begge, av det type 5 adenovirus virale genom. AEl blir dannet ved en in vivo rekombinerings-begivenhet mellom et plasmid og en modifisert adenovirus DNA. (Alle plasmider beskrevet i denne beskrivelse, blir formert i E. coli). Plasmidet blir dannet ved innføring av adenovirus DNA-sekvenser mellom 0 og 17 kartenheter inn i pBR322 og videre, ved å bruke restriksjons- endonuklease spalting og legering, deletering av sekvens mellom 1,4 og 9,1 kartenheter og plassere et Xbal restriksjonsytelse ved denne forbindelse. Dette plasmidet er på fagspråket betegnet som pAC. Det modifiserte adenovirus DNA som inneholder et enkelt Xbal restriksjonssitus ved 4,0 kartkordinater, blir dannet som følger. Xbal spalter villtype Ad5 DNA på fire steder; 4, 29, 79 og 85 kartenheter. Modifisert DNA som mangler situs ved 29, 79 og 85, blir isolert ved å kutte Ad5 DNA med Xbal, transfektere DNA og isolere det modifiserte adenovirus som mangler Xbal situs i posisjoner 29 og/eller 79. Denne fremgangsmåte blir gjentatt igjen, og modifisert adenovirus som inneholder bare Xbal situs i posisjon 4, blir isolert. Slike modifiserte adenoviruser kan og-så lett konstrueres ved å bruke oligonukleotid-rettet mutagenese-teknikker (M. Smith og S. Gillam (1981) i Genetic Engineering, J.K. Setlow og A. Hollaender, Eds. Vol. 3, s. 1-32, Plenum, New York). I denne teknikken blir Xbal restriksjonssitus ødelagt ved å bruke kjemisk syntetiserte oligonukleotider utformet til å produsere stille forandringer i aminosyre-kodeområdene definert ved de henholdsvise Xbal restriksjons-endonuklease-situs. Vector AE3 blir konstruert ved delesjon av E3 område-sekvenser. To modifiserte adenoviruser (type 5) blir dannet ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Ett inneholder ingen Xbal situs, det andre inneholder bare Xbal situs ved kartkoordinater 29, 79 og 85.

Den venstre halvdel av DNA av mutanten som ikke inneholder noe Xbal situs, er forenet med den høyre halvdelen av DNA av mutanten som inneholder Xbal situs ved 79 og 85, som danner et modifisert adenovirus som inneholder Xbal situs bare ved 79 og 85 kartkoordinater. Spalting av dette DNA med Xbal fulgt av religering, danner AE3 viral DNA som deleterer E3-området mellom 79 og 85 kartkoordinater og plasserer et enkelt Xbal kloningssitus ved denne forbindelse. AE1 AE3 kan bli konstruert ved delesjoner i begge områder på lignende måte.

På en måte som er lik konstruksjonen av AEl, AE3 og AEl AE3 vektorer av adenovirus type 5 blir vektorer av adenovirus type 4 og 7 dannet. F.eks. i adenovirus type 7 er E3-området deletert mellom Xbal-situs ved 80,5 kart-koordinater og EcoRl-situs ved kart-koordinat 85.

2. 6X serier plasmider (For Hfc>sAg og rotavirus VP7).

Plasmider som tillater plassering av adenovirus 2 sen promoter oppstrøms fra DNA som koder for hepatitt B overflateantigen eller rotavirusVP7 fulgt av SV40 forbindingssignaler, kan konstrueres. Hvert av disse er flankert av Xbal-siti for innfør-ing inn i adenovirus av AEl, AE3 eller AElE3-vektorer.

a. p6XH

Plasmid 6XH inneholder en Xbal-linker ved -400bp av Ad2-hovedsenpromoter og etEcoRl-situs ved +3 3bp, 8bp før enden av den første adenovirus sen-leder. Dette er fulgt av en Eco RI-linker ved 26bp som kommer foran ATG av HB Ag fulgt av HB Ag-sekvens av 6 78bp til en annen EcoRI-linker ved 809bp. Denne er fulgt av SV40-sekvens som går fra 2753-2516 bp på SV40-kartet. Disse sekvenser er alle innført inn i det store pBR322 Barn HI til EcoRI-fragment via Xbal~linkers.

b. p6XR

Plasmid p6XR lages ved å forene rotavirus VP7-gen med EcoRI-linkers ved nukleotid 6 og 1036 til Ad2 hovedsenpromoter som inneholder et Xbal-situs ved -400bp og en Eco RI linker ved +331 og ved å feste SV40-sekvenser fra 2753-2516 bak VP7-genet med en Eco RI linker ved 2753 (SV40 kart-koordinat) og et Xbal-situs ved 2516 bp. Denne kassetten blir innført i det store Eco Ri til BamH fragment av pBR322. c. Overføring av plasmid-sekvenser til den virale DNA-vektor og produksjon av rekombinant adenovirus.

Overføringen av kassetten som består av promoter-fremmed-gen-terminator til adenovirus-vektoren gjøres enten som følger eller ved in vivo rekombinering (se detaljert eksempel nedenfor). Det rensede adenovirus vektor DNA blir spaltet med en restriksjons-endonukleose fulgt ved behandling med kalvetarm-alkalin-fosfatase for å forhindre selv-ligering. Plasmid-deriverte sekvenser fås ved spalting av p6XH eller p6XR med Xbal. Disse blir så ligert til adenovirus vektor DNA-, Enten 293 celler, Grahm et al., Gen. Virol., 86_ 10 (1978)), Hela-celler eller Wi38-celler blir så transjfæktert med ligeringsblandingen og over-lagt med agar. Plakk blir plukket 7-10 dager senere og virus-beholdninger fremstilt.

3. Ekspresjons-bestemmelser.

Tre typer bestemmelser er blitt brukt for å vurdere ekspresjonen av hepatitt B overflateantigen og rotavirus VP7. Disse er:

a. Indirekte immunofluorescens.

Enten muse-monoklonale antistoffer eller kanin-antisera brukes til å påvise ekspresjon av rekombinant AEl og AE3 virus-beholdningen som inneholder HB Ag eller VP7 DNA sekvenser. Motfarging er med geite-anti-mus eller anti-kanin

FITC.

b. Immunopresipitering.

Immunopresipitering av HBgAg eller rotavirus VP7 i celler infisert med de rekombinante adenoviruser blir gjort enten ved å bruke muse-monoklonale antistoffer eller kanin-poly-klonalt antisera mot HBsAg eller rotavirus VP7 og protein A Sepharose CL4B.

c. RIA

Ekspresjon av HBsAg blir også testet ved en i handelen tilgjengelig radioimmunoassay (Ausria, Abbott Labs.).

4. Immunogen natur av det rekombinante adenovirus.

Levende, lyofilisert rekombinant adenovirus inneholdt i en tarmdekket kapsel blir vurdert for immunogenitet ved å gi dem (IO<4>- IO5 50% infeksiøs dose/tablett) til hamstere eller sjimpanser og testet for antistoffnivåer og beskyttelse fra angrep.

Den nåværende markedsførte adenovirus-vaksine inneholder levende lyofilisert adenovirus av enten type 4 eller type 7 blandet med inerte ingredienser fremstilt i tarmdekkete tabletter. Administrering av tabletter (omtrent 10 4 TCID^Qav virus) resulterer i selektiv gastrointestinal infeksjon uten sykdom.Vaksinen er trygg; den induserte infeksjon blir spesifikt begren-set til tarmtraktraktor, og vaksineviruset blir ikke overført fra vaksinerte til mottagelige nærkontakter. Spesifikt nøytrali-serende antistoff er funnet i over 95% av vaksinerte individer 21 dager etter immunisering. De nye vaksiner av den foreliggen-de oppfinnelse som er spesifikt beskrevet, består av rekombinante adenoviruser som gir ekspresjon av hepatitt B overflate-antigen og rotavirus VP7 og er utformet og arbeider på samme måte som den nåværende adenovirusvaksine med unntak av at antistoff mot hepatitt B overflate-antigen eller rotavirus VP7 blir produsert like mye som antistoff mot adenovirus. I alle utgave-ne av oppfinnelsen vil selvfølgelig administreringen av omtrent 10 4 TCIDj-q av rekombinant virus, eller selv betraktelig mindre, produsere denønskede immunogen-respons. Bestemmelsen av opti-mumsdoseringen vil variere avhengig av det spesielle rekombinante adenovirus som blir anvendt; bestemmelse av dette optimum er innen det faglige utgangsnivå. 5. Detaljert eksempel av en rekombinant som gir ekspresjon av autentisk HBgAg.

Som et detaljert eksempel på konstruksjonen av en adenovirus rekombinant, ble HBsAg genet av adw-undertypen fra 26 bp oppstrøms av HBsAg translasjonsinitierings-codon og 131 bp ned-strøms fra translasjons-terminerings-codon flankert av oppstrøms-frekvenser fra Ad2 hoved-senpromoter ( +33 til 400 bp; D. Solnick, Cell, 2£, 135-143 (1981) og ved nedstrøms-sekvenser fra SV40

(2753 til 2516 bp; J. Tooze, (Ed.) Molecular Biology of Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, s. 801-829 (1980)).

Dette plasmid er betegnet p6XH (se ovenfor). Disse sekvenser ble innført i det unike Xbal-situs plasmid pAC som inneholder et inn-ført stykke av Ad5-DNA som går fra Eco RI linker i den venstre enden av adenovirus-genomet til Hind III-situs ved Ad5--kart'-koordinat 17,0(Y. Gluzman, H. Reichl og D. Solnick;, 1982, i (Y. Gluzman, Ed.) Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, s. 187-192). De nye plasmider (pACH-2 og pACG-9) med kassetten som inneholder Ad2 hoved-senpromoter-HBsAg gen-SV40 som prosesserer signaler i begge retninger, ble spaltet

med Hind III. Hind III-spaltningsproduktet av hver ble kombinert med det store Xbal-fragment av adenovirusmutant AEl som går fra kart-koordinater 9,1 til 100 (Y. Gluzman, H. Reichl og D. Solnick, 1982 i (Y.Gluzman, ed.) Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, s.187-192). Denne DNA blanding-en ble transektert (P.L. Graham og A.J. ven der Eb,Virology 52, 456-467 (1973)på 293 celler (F.L. Graham, J. Smiley, W.C.Russell og R. Nairn; Gen. Virol. , 3_6 , 59-72 (1977)) og cellene ble over-lagt med agar for plakk-påvisning. Omtrent 10-14 dager senere ble 54 plakk plukket og virus-beholdninger laget fra hver. Disse viruser ble underkastet screening for nærvær av HB Ag-DNA ved

32

hydrolysering til en R-merket HB Ag DNA-prøve. Positive plakk

(49 av 54) ble så infisert på monolag av 293 celler, og ekspresjonen av autentisk HBgAg ble påvist i celle-lysater ved både radioimmunoassay (AUSRIA, Abbott Laboratories, Inc. eller NML-Hg Ag RIA; Nuclear-Medical Laboratories) og ved immunopresipite-35

ring av S-radiomerket HBgAg ved å bruke et monoklonalt antistoff mot HBgAg (anti-a subtype, Boehringer Mannheim Biochemi-cals). 6. I det spesifikke eksemplet ovenfor bruker vi Ad2-hovedsenpromoter som går fra bare 33 nukleotider nedstrøms fra transkrip-sjonsinitierings-situs slik at det første forbindingsstedet ikke er inkludert. Denne promoter inneholder bare den første delen av den tredelte leder av den adenovirale hovedsenpromoter. Imidlertid kan hovedsenpromoteren fra andre adenoviruser, spesielt typene 3,4, 5 eller 7 bli brukt og den fulle tredelte lederen av denne promoter kan bli brukt. I det følgende eksempel beskriver vi konstruksjonen av to bakterieplasmider, pHMl og pHM2,

som inneholder kassetter sammensatt av Ad2-hovedsenpromoteren og den venstreside 168 bp av den 200 bp Ad2 tredelte leder fulgt avHBgAg-genet og prosessering og polyadenylerings-signaler fra SV40-virus. Disse plasmider inneholder også adenovirussekvenser som flankerer kassetten slik at homolog rekombinering kan brukes til å innføre kassetten i det adenovirale genom. På venstre si-de er kassetten flankert av den venstresidige 353 bp av Ad5 genomet, og på høyre side av kart-koordinater 8-15,5 av adenovirus 5. Plasmid pHMl inneholder 19 bp av SV40-virus~sekvens (SV40-nukleotider 5173-5174) som ligger foran HBsAg-genet. Plasmid pHM2 er identisk med pHMl med unntak av at det ikke inneholder denne sekvensen.

Kassettene fra både pHMl og pHM2 ble plassert i El-området av adenovirus 5-genomet ved teknikken homolog rekombinering som beskrevet ovenfor. Hvert plasmid ble linearisert og kombinert med det store Xbal-fragment av adenovirus-mutant AEl som går fra kart-koordinater 9,1 til 100 (Y. Gluzman, H. Reichl og D. Solnick, 1982 i (Y. Gluzman, ed.) Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratories, s. 187-192). Plakk ble plukket og stokk-viruser dannet fra hver.

Når disse stokk-viruser (HMl og HM2) ble infisert på human embryonisk nyre (293) cellelinje (F.L. Graham, J. Smiley, W.C. Russell og R. Nairn (1977) J. Gen. Virol, 36_, 59-72) fant vi etter 40 h infeksjon omtrent 1 ug HBgAg (basert på radioimmunoassay og sammenlign6 ing av cpm med NML-HB^Ag testsett positiv kontroll) pr. 5x10 infiserte celler ble observert i kultursuper-natanter av HM2-infiserte celler. HMl-virus gav omtrent 60% av denne mengden. Vi fant at HBsAg-polypeptider produsert av disse viruser var glykosylerte (P2) og ikke-glykosylerte (Pl) former (P.L. Marion, F.H. Salazar, J.J. Alexander og W. Robinson

(1979) J. Virol, 32., 796-802; D.L. Peterson (1981) J. Biol.Chem. 256, 6875-6983). Ved 40 timer etter infeksjonen ble det meste av HBgAg (78%) utfylt fra cellene inn i kulturmediet som partik-ler (tetthet = 1,20 g/ml) den samme eller nesten den samme som 22 nm partikkelen (J.L. Gerin, R.H. Purcell, M.D. Hoggan, P.V. Holland og R.M. Chanock (1969) J. Virol, 4_, 763-768; J.L. Gerin, P.V. Holland og R.H. Purcell (1971) J. Virol. ]_, 569-576) observert i human-serum. HM2 gav omtrent 40% mer HBgAg enn HMl. Imidlertid, når HM2 ble sammenlignet med det tidligere beskrevne hybrid-adenovirus, AE1H, la man merke til en 70 gangers økning i HBgAg-polypeptid ved HM2_virus.

Istedenfor den adenovirale hovedsenpromoter kan en hvilken som helst annen passende eukaryotisk promoter brukes, som human-metallotionein-promoter eller den humane dihydrofolat-reduktase-promoter. I tillegg har vi i våre eksempler brukt adenovirus type 5 DNA som vektor for fremmed-gen-ekspresjon. Imidlertid kan andre adenovirus-typer brukes som vektor, og spesielt anvend-bare er typene 3, 4 og 7 som nå er i bruk som vaksiner.

Vi beskriver også anvendelsen av prosessering og polyadeny-leringssignaler fra SV40-DNA; imidlertid kan hvilken som helst passende prosessering og polyadenylerings-signaler bli anvendt. Disse kan komme fra adenoviral DNA, spesielt typer 3, 4 og 7.

I praktisering av metoden av denne oppfinnelse hvor det fremmede gen er innført i deletert tidlig område 3 av adeno-viruset, forblir det rekombinante virus infektiv, og vaksina-sjonen trenger ikke noe mer enn avleveringen av det rekombinante virus til tarmen. På den annen side er tidlig område 1 vesent-lig for adenovirus-infektivitet. Derfor må, hvis det fremmede genet er innført i deletert tidlig område 1, hjelpevirus være ko-administrert. Dette hjelpe-virus er i passende form umodi-fisert, infeksiøs adenovirus. Hjelpeviruset kan også selv være et defektivt virus med en delesjon som kan være komplementert av rekombinant-viruset. I denne utformingen vil virusvekst og fremmed-antigenproduksjon bli fremlokket bare i celler infisert med begge viruser. Dette defektive hjelpevirus kan være av samme eller av forskjellig undertype fra det rekombinante virus. Hvis av forskjellig undertype (f.eks. hvis rekombinant-virus var Ad4-undertype og defektiv virus av Ad7-undertype), bør dannelsen av vildtypevirus gjennom rekombinering bli minimalisert. Forme-ring av virus til vaksineproduksjon kan bli utført enten gjennom ko-kultivering av begge viruser i humane diploid-fibroblaster eller dyrking av viruser separat i cellelinjer kjent for å komp-lementere hver av defektene.

I tillegg til El og E3 områdene er det flere andre områder av det virale genom hvor den kassett-inneholdende promoter, den tredelte leder, fremmed-gen og prosessering og polyadenylerings-signaler kan bli innfelt. Dette inkluderer et område mellom Ela og Elb, områder i venstre og høyre ender av genomet, og det E4 området, og mellom L5-og E4-områdene. Noen eksempler er gitt nedenfor:

Ad5 inneholder en Ela-promoter ved kart-koordinat 1.4 og

en Elb promoter ved kart-koordinat 4,7. Polyadenyleringssitus for Ela er ved kart-koordinat 4.6, nukleotid 1631, ved nukleotid 1671 er TATA-boksen for Elb-promoteren. Ved nukleotid 1572 er det et unikt Hpal-situs (GTTAAC). Dette situs kan bli anvendt til plassering av adenovirus type 2 hoved-sen-promoteren og hepatitt B overflate-antigen og anvendelse av Ela polyadenyleringssitus. Polyadenylering av Ela kan fåes ved plassering av et polyadenyleringssignal fra SV40-viral- DNA bak Ela eller fra L4 området av viruset. Tilleggs-DNA i genomet i konstruksjonen ovenfor kan bli kompensert ved fjerning av DNA bestemt som ikke-essensielt i E3 området.

Andre innføringspunkter er de ytterste venstre og høyre ender av genomet. I venstre ende vil posisjonen være mellom 116 bp invertert terminal repeat og TATA-boksen av E4-promoteren. I Ad2 er det et Mbo II-situs ved 99,3 kart-enheter. Dette er 191 bp fra den ytterste høyre enden av det virale DNA. I Ad5 er det et Thai (FnU4DII) situs 240 bp fra den venstre ende av genomet. Dette område er mellom ITR og oppstrøms av E4 TATA-boksen. Igjen, hvis nødvendig, vil innføring bli gjort i en E3 delesjons-mutant for å tilpasse det ekstra DNA.

I hvert tilfelle kan disse samme områder brukes som innfør-ingspunkter for kassetten av adenovirus hoved-sen-promoteren, den tredelte adenovirusleder, fremmedgen og prosessering og poly-adenyleringssignaler i adenovirus type 4 og type 7 stammer som brukes til de nåværende markedsførte adenovirus-vaksiner.

Selv om den foregående sesifikasjon spesifikt refererer

til adenovirus av typer 4, 5 eller 7, kan levende infeksiøs adenovirus av en hvilken som helst type anvendes i denne oppfinnelsen. Adenovirus av typer 4 eller 7 er foretrukket siden dette er de nåværende anvendte typer i kommersielle adenovirusvaksiner. Likeledes, selv om spesifikk referanse er blitt gjort til vaksiner som produserer antistoffer mot hepatitt B og rotavirus, gir vår oppfinnelsen orale vaksiner mot ethvert infeksiøs agens som inneholder et antigen mot hvilket et varmblodig dyr vil produsere antistoffer eller celle-indusert immunitet, og hvis antigen blir kodet for av et gen sammensatt av opp til omtrent 3000 base-par. Således, for eksempel, inkludert innen området for oppfinnelsen, er immunisering mot slike sykdommer som influensa, para-influensa, respiratorisk synsetiell virussykdom, hepatitt A, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), kolera, E. coli, per-tussis, difteri, tetanus, shigellose, gonorrhea, mycoplasma pneumonia osv.

Claims (4)

1. Et rekombinant adenovirus som inneholder et gen som koder for et antigen produsert av en sykdomsforårsakende organisme, idet nevnte rekombinante adenovirus er av type 4, 5 eller 7; genet koder for hepatitt B overflate-antigen eller rotavirus ytre skallprotein; og genet er lokalisert ved deletert tidlig område 1 eller deletert tidlig område 3.

2. En metode for produsering av en oral vaksine for produsering av antistoffer eller cellemediert immunitet mot en in-feksiøs organisme som innbefatter innføring inn i adenoviruser av genet som koder for antigenet som tilsvarer nevnte antistoffer eller induserer nevnte cellemedierte immunitet, for å produsere levende rekombinante adenoviruser, og plassering av nevnte levende rekombinante adenoviruser i en tarmdekket doseringsform.

3. En metode i henhold til krav 2, hvor nevnte infeksiøse organisme er hepatitt B-virus.

4. En metode i henhold til krav 2 hvor nevnte infeksiøse organismer er rotavirus.