JPS61118326A - 経口ワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、温血動物における感染性生物に対する抗体に
対応する抗原または細胞性免疫を惹起する抗原をコード
する遺伝子を含有する生組換アデノウィルスを温血動物
に経口投与することにより該抗体または細胞性免疫を産
生ずる方法およびワクチンに関する。

発明の背景 生物医学的研究の主な目的は、免疫法により、ウィルス
性疾病に対する防御法ｖｉ供することである。一方法と
しては、死菌ワクチンを用いることである。しかじ、十
分な抗原量を保持するためには、死菌ワクチンでは装置
の材渣を必要とする。

その上、死菌ワクチンは、しばしば製造中に望ましくな
い生成物により汚染される。それ自体がワクチンである
、適当に操作したアデノウィルス（シャノック、アール
・エムラ、ジャーナル・オブ・アメリカン・メディカル
アソシエイション（Ｃｈａｎｏｃｋ　、　Ｒ，Ｍ、　ｅ
ｔ　ａｌ、、　　Ｊ　ＡＭＡ　）、１９５．１５）（１
９６６）参照）を用い次場合、異種生ワクチンは、優れ
た免疫原であると考えられる。本発明は、アデノウィル
スをベクターとして用いた経口生ワクチンに関する。

現在、市販のアデノワクチンは、腸溶皮錠の形態の生態
性アデノウィルスからなる。接種すべき患者に投与され
ると、該ウィルスは、上部呼吸器系（疾病をひき起こす
感染が起こると考えられる部位）乙通って運ばれ、腸内
で放出される。腸内で該ウィルスは腸壁で増殖し、腸内
では、アデノウィルス性疾病は起こらないが、アゾンウ
ィルス抗体の形成ヲ惹起するので、アデノウィルス性疾
病に対する免疫が得られる。本発明においては、他の疾
病の原因となる生物により生産される抗原をコードする
遺伝子を含む様に操作された、生態染性アデノウィルス
を、腸溶及錠の形態で投与する・腸内で放出されると、
該ウィルスは腸壁で増殖し、抗体の形成を惹起するが、
または、アデノウィルスおよび他の疾病の原因となる生
物の両方に対する細胞性免疫を惹起する。「生ウィルス
」なる語は１「死菌」ウィルスに対して、それ自体、ま
たは別の遺伝物質と結合して、同一の後世代を産生でき
るウィルスを意味する。「感染性」なる語は、ウィルス
性ゲノムを細胞中に送達できることを意味する。

米国では、約２０００００　　人が、毎年、Ｂ型肝炎ウ
ィルスに感染している。さらに、Ｂ型肝炎感染と肝臓ガ
ンの間には、強い相関関係がある。現在市販のＢ型肝炎
に対するワクチンは、数種の不連続な段階を含む長い工
程により、健全な保菌者の血漿から生産される注射可能
な製品である。

主な２つのＢＷ肝炎ウつルヌ抗原として、表面抗原（８
Ｂ、Ａｇ）およびコア抗原（ＨＢｃＡｇ）がある。

ＨＢ、Ａｇの抗原構癒は多少複雑である。各グループに
共通な群特異性決定基ａがある。さらに、２組の互いに
排他的な型特異性決定基、ｄまたはｙ。

およびＷま念はｒがある。ＨＢｃＡｇは単−抗原型であ
る。Ｈａ、Ａｇ’ｌ：たはＨＢｃＡｇに対する抗体の産
生により、Ｂ型肝炎惑染に対する免疫が得られることが
刈られている。

微生物によりＨＢ、Ａｇを合成するのに、組換ＤＮＡ技
術が用いられ；きた。ＨＢ、Ａｇは、エシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ　）において
、融合蛋白質の形態で合成されている〔エドマン、ジｊ
：（、シーら、ネイｆヤ−（Ｅｄｍａｎ、　Ｊ、Ｃ０ｅ
ｔａｄ　＋＋１　Ｎａｔｕｒｅ）、２９１．５０３（１
９８１）参照〕。

酵母において、ＡＤＨプロモーター（バレンツエラら、
ネ（ｆ　ＪＩＦ　−（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ　ｅｔ＋、
ａｌ　、　、　Ｎａｔｕｒｅ入２９８．３４７（１９８
２）参照）、または、酸性ホスファターゼ・プロモータ
ー（ミャノハラら、プロシーディゲス・オブ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｍｔｙａｎｏｈ
ａｒａ　ｅｔ＋＝ａｃｅＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、８０．１（１９８３）参照
）を用いても合成されている。また、ワクチン性ウィル
スは、肝炎ウィルスに対する生ウイルスワクチンを産生
ずるベクターとして用いられる（スミスら、ネイｆ　ヤ
−（Ｓｍｉ　ｔｈ　ｅｃ　ａｌ　、　、　Ｎａｔｕｒｅ
）、３０２．４９０（１９８３）参照）、 ロタウィルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓｅｓ）は、乳児にお
ける急性胃腸炎の主な原因である。これらのウィルスは
、カプシドに包まれた１１個の二本ＩＡＲＮ　Ａのゲノ
ムを有する。カプシドは、内殻および外殻を有する。外
殻蛋白質の１種であるｖｐ７は、血清型特異性中和抗体
と反応する糖タンパク質である（カリ力、エイ参アール
ラ、パイララジイ（Ｋａｊｉｃａ。

Ａ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１１２．
３８５（１９８１）参照）、このタンパク質は、ヒト１
型（Ｗａ）ロタウィルスの遺伝子９によりコードされる
。ｌ型ヒトロタウィルスの遺伝子９は、近年イー・コリ
（Ｅ、、　ｃｏｌｉ）においてクローンされ、その配列
が決定されている（リチャードソン、エムら、リサーチ
）Ｌｔ　−、ｔブａバイｏｏシイ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ、Ｍ　ｅｔａｌ。

Ｊ、Ｖｉｒｏｊ、）、５）．８６０（１９８４）参照）
、このタンパク質のいかなる他の系にあける発現も報告
されていない。

アデノウィルスは、２０〜３０のポリペプチドをコード
する線状二本鎖ＤＮＡ分子（分子１２０×１０〜２５Ｘ
１０　　）を含有する。これらの多くは、形態学上複雑
で、複雑な組立プロセスを有するウィルス粒子内にある
。予め５Ｖ４ＱＴ抗体を、アデノウイルス組換体を用い
て発現しておく（ンルニツク、ディー、＊　ル（５ｏｌ
ｎｉｋ、　Ｄ、、　Ｃｅ１ｌ）、２４．１３５（１９８
１）、スンメル、シイら、セル（Ｔｈｕｒａｎｅｌ、　
Ｃ０ｅｔａ１．、　Ｃｅ１ｌ）、２３．８２５　（１９
８１）、グルラマン、シイら、ユーカリオテイツク・バ
イラル・ベクターズ、コールド・スプリング・バーバー
（ＣＪｕｚｍａｎ、　Ｙ、　ｅｔ　ａＪ、、　ｉｎ　Ｅ
ｕｋａｒｙｏｃｉｃ　ＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ、　（
：ｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｉａｒｂｏｒ）、ｐ１８
７（１９８２）参照）。また、マウスジヒドロ葉酸還元
酵素も、アデノウイルス組換体を用いて発現されている
（バーフナ−、ケイおよびシャープ、ビイ・エイ、ニュ
ークレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｂｅｒｋｎｅｒ、
　Ｋ、　ａｎｄ　５ｈａｒｐ、　Ｐ、Ａ、、　Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅｒｃｈ）、１２，１９２５
（１９８４）参照）。

発明の概要 本発明の治療法についての態様は、温血動物において、
感染性生物に対する抗体または細胞性免疫を産生ずる方
法を含み、該方法は、前記温血動物に、腸溶皮錠の形態
の、前記抗体に対する抗原または前記細胞性免疫を惹起
する抗原をコードする遺伝子を含有する生組換アデノウ
ィルスを経口投与することからなる。　　　、。

治療法の下位群の態様において、本発明は、温血動物に
おいてＢ型肝炎ウィルスまたはロタウィルスに対する抗
体を産生ずる方法を含み、該方法は、前記温血動物に、
各々Ｂ型肝炎抗原また番よロタウィルス抗原をコードす
る遺伝子を含む生組換アデノウィルスを経口投与するこ
とからなる。

組成物に関する態様において、本発明は、温血動物にお
ける感染性生物に対する抗体に対応する抗原または細胞
性免疫を惹起する抗原をコードする遺伝子を含有する生
組換アデノウイルス力）らなる、該抗体または細胞性免
疫を生じさせるワクチンを含み、該ワクチンは腸溶皮錠
の形態に処方される。

組成物に関する下位群の態様にお（Ｓて、本発明は、各
々、Ｂ型肝炎抗原またはロタウィルス抗原をコードする
遺伝子を含有する生組換アデノウィルスからなる、温血
動物において、Ｂ型肝炎またはロタウィルスに対する抗
体を産生ずるワクチンからなり、前記ワクチンを腸溶皮
錠の形態（こ処方する。

発明の詳説 （１１アデノウイルス・ベクター ３種のアデノウィルス拳ベクター（グルラマン１ワイら
、ユーカリオテイツク・ノイイラル・ベクターズ、コー
ルド・スプリング・ノ）−バー・ラボラトリーズ（Ｇｌ
ｕｚｍａｎ、　Ｙ、　ｅｔａｌ、、　ｉｎ　Ｅｕｋａｒ
ｙｏｃｉｃＶｉｒａｌ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　　Ｃｏ１
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏ−ｒａ
ｔｏｒｉｅｓ　）、Ｐ２Ｓ５（１９８２）参照）は、容
易に構成できる。挿入可能な外来性ＤＮＡの長さを最大
にするために、ウィルスゲノムの２つの伸長部分を除去
してもよい。即ち、アデノウィルス５型ウイルスゲノム
の初期領域ｌまたは初期領域３（ＥｌおよびＥ３）また
は両方ともを除去してもよい。

△Ｅ１は、プラスミドおよび修飾アデノウィルスＤＮＡ
間のｉｎ　　ｖｉｖｏの組換えにより生じる（本明細書
に記載のプラスミドはすべてイー・コリから増殖させる
）、プラスミドは、地図単位０および１７間のアデノウ
ィルスのＤＮＡ配列を、ｐＢＲ３２２に挿入し、次いで
制限エンドヌクＶアーゼを用い消化および結紮し、地図
単位１．４および９．１間の配列を除去し、Ｘｂａｌ制
限サイトにの結合地点に配置することにより形成する。

このプラスミドは当該分野でＰＡＣと称されている。４
．０位に１つのＸ　ｂ　ａ　１制限サイトを宵する修飾
アデノウィルスＤＮＡを次の様にして形成する。　Ｘｂ
ａｌは、野生型Ａｄ５ＤＮＡを４つのサイト：４．２９
．７９および８５単位で開裂させる。２９．７９および
８５サイトが欠失している修飾ＤＮＡは、ＸｂａｌでＡ
ｄ５ＤＮＡ　、ｉ切断し、ＤＮＡをトラ７７゜フエクト
し、２９および／または７９位でＸｂａｌサイトが欠損
した修飾アデノウィルスを単離することにより単離され
る。この工程を再び行ない、４位にＸｂａｌサイトのみ
を含有する修飾アデノウィルスが単離される。かかる修
飾アデノウィルスは、オリゴヌクレオチドによる突然変
異誘発法（スミス、エムおよびギリアム、ニス、ジエネ
テイツク、ｊｌ−７ジニアリング（Ｓｍ１ｔｔｓ、　Ｍ
、　ａｎｄ　ＧｉＨｉａｍ。

Ｓ、　　ｉｎ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ　　（１９８１）、セトロウ、ジエイ・ケイおよ
びホレンダー、エイ編（Ｓｅｔｌｏｗ　、　Ｊ、　Ｋ、
　ａｎｄ　ＨｏＪｌａｅｎｄｅｒ、　Ａ、、　Ｅｄｓ、
）、第３巻、ｐｐ、１〜３２、Ｐｌｅｎｕｍ　、　Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ参照）を用いても、容易に組み立てること
ができる。この技術において、Ｘｂａｌ制限サイトは、
各Ｘｂａｌ制限エンドヌクレアーゼサイトにより決めら
れるアミノ酸をコードする領域においてサイレント変化
を生じさせるための化学的に合成され几オＩ」コ゛ヌク
Ｖオチドを用いて分解される。ΔＥ３はＥ３部配列を除
去することにより組み立てられる。２種の修飾アデノウ
ィルス（タイプ５）は、前記した方法により形成される
。一方はＸｂａｌサイトを含有せず、他方は、２９．７
９および８５位にＸｂａｌサイトのみを含有する。Ｘｂ
ａｌサイートを含有しない突然変異体のＤＮＡの左半分
を７９および８５位にＸｂａｌサイトを含有する突然変
異体のＤＮＡの右半分と結合し、７９および８５位にの
みＸｂａｌサイＩｆ含有する修飾アデノウィルスを形成
する。

このＤ　Ｎ　Ａ　ｆ　Ｘｂａｌで開裂させ、次（・で再
結紮することにより、７９および８５位間昏こＥ３領域
力ｆ欠失し、この地点に１つのＸｂａｌクローニングサ
ィトヲ有するΔＥ３ウィルスＤＮＡを形成するａ△Ｅｌ
　　ΔＥ３は、同様の方法で両方の領域における欠失に
より組み立てられる。

アデノウィルスのタイプ５の△Ｅｌ、ΔＥ３およびΔＥ
１△Ｅ３ベクターの組み立てと同様の方法で、タイプ４
および７のアゾンウィルスのベクターを形成する。例え
ば、タイプ７のアデノウィルスにおいては、Ｅ３領域は
、８０．５位のＸｂａｌサイトおよび８５位のＥｃｏＲ
Ｉ　サイト間で欠失している。

［２１６Ｘ系プラスミド（Ｈｂ、Ａｇおよびロタウィル
スｖｐ７について） Ｂ型肝炎表面抗原またはロタウィルスＶＰ７をコードす
るＤＮＡの上流にアデノウィルス２後期プロモーター、
続いてＳＶ４ｇスプライシングシグナルを位置させるこ
とのできるプラスミドを組立てることができる。これら
の各々をアゾンウィルス△Ｅｌ、△Ｅ３、！たは△Ｅｌ
△Ｅ３ベクターに挿入するためにＸｂａｌサイトでフラ
ンキングする口ａ、ｐ５ＸＨ プラスミド５ＸＨは、ＡＤＺ土後期プロモーターの一４
００ｂｐにＸ　ｂ　ａ　ｌリンカ−１および第１アデノ
ウィルス後期リーダーの末端の１３　ｂｐ前、＋ａａｂ
ｐにＥｃｏＲＩサイトを有する。これに続いて、ＨＢ　
、　ＡｇのＡＴＧの２５　ｂｐ前にＥｃｏＲニリンカー
を有し、続いて６７８　ｂｐから８０９ｂＰの別のＥ　
　ＲＩ　　リンカ−までのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ配列を宵す
るつＯ コレニ続イテ、ＳＶ４０　地図上（７）　２７５３〜２
５）６ｂｐに伸長する５ｖ４０配列を有する。これらの
配列は全てＸｂａｊリンカ−によりＥＣ０ＲＩ　フラグ
メンｈｚでの大ＰＢＲ３２２ＢａｍＨＩに挿入する。

ｂ、ｐ５ＸＲ ロタウィルスＶＰ７遺伝子を一４００ｂｐにＸｂａｌサ
イト、および＋３３）にＥｃｏＲニリンカーを有するＡ
ｄ２主後期プロモーターにヌクレオチド６および１０３
６でＥＣｏＲＩリンカ−で連結させ、ｖｐ７遺伝子の後
方２７５３〜２５）６　ｂｐ（７）ＳＶ４Ｏｉ列に２７
５３（ＳＶ４ｏ地図テノ位置）　（７）ＥｃｏＲｌす７
カーおよび２５）６ｂｐのＸｂａＩサイトと連結するこ
とにより形成する。このカセットをｐＢＲ３２２のＢ　
ａｍＨフラグメントマでの大ＥｃＯＲｘに挿入する。

Ｃ，プラスミド配列のウィルスＤＮＡベクターへの転移
および組換えアゾンウィルスの産生プロモーター・外来
遺伝子−ターミネータ−のカセットのアデノウィルスベ
クターへの転移は、次の様にするが、またはｉｎ　ｖｉ
ｖｏでの組換え（詳細は後記の実施例参照）によるかの
いずれかにより行なう。精製したアデノウィルスベクタ
ーＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼで開裂させ、次いで
自己結紮を防ぐため、仔牛腸ホヌファターゼで処理する
。ｐ６Ｘ艮またはｐ５ＸＲをＸｂａｌで開裂させること
により、プラスミド由来の配列を得る。これらを次いで
アデノウィルスベクターＤＮＡに結紮する６２９３セル
（グラームら、ジエネティック・パイララジイ（Ｇｒａ
ｈｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、）。

１旦、１０（１９７８））、ヘラセル、またはＷｉ３８
セルを次いで′ｔｓｌｋ混合物でトランスフェクトし、
寒天でおおう。プラークを７〜１０日後にとりだし、ウ
ィルス保存株を調製する。

（３）　　発現分析 Ｂ型肝炎表面抗原およびロタウィルスＶＰ７の発現を評
価するのに３種の分析法が用いられる：λ０間接免疫螢
光法 ＨＢ、ＡｇまたはＶＦ６　ＤＮＡ配列を含有する組換体
△Ｅｌ゛および△Ｅ３ウィルス保存株の発現を検出する
のに、マウスモノクローナル抗体またはウサギ抗血清を
用いる。ヤギ抗マウスまたは抗ウサギＦＩＴにで対比染
色する口 す、免疫沈降 組換えアデノウィルスで感染させたセルにおけるＨＢ、
　Ａｇ　またはロタウィルスＶＰ７の免疫沈降は、ＨＢ
５Ａｇ　またはロタウィルスＶＰ　７Ｇ二対するマウス
モノクローナル抗体またはウサギ抗血清、およびプロテ
ィンＡセファロースＣＬ４Ｂ４用いて行なう。

ｃ、ＲＩＡ ＨＢ、Ａｇの発現は、商業的に利用し得るラジオイムノ
アッセイ（Ａｕｓｒｉａ、アボット・ラボラトリーズ（
Ａｕ５ｒｉａ、　Ａｂｏｃｃ　　Ｌａｂｓ　、）　）に
ヨッテも試験される。

（４１組換アデノウィルスの免疫原的性質腸溶皮カプセ
ル昏こ入れた生凍結乾燥アデノウィルスを、ハムスター
またはチンパンジーに投与しく　１０’　〜１０５５０
％感染投与量／錠）、抗体のレベルおよび対抗からの防
御を試験することにより、免疫原性に関して評価する。

現在市販のアデノウィルスワクチンは、腸溶皮銑中に、
調製した不活性成分と混合したタイプ４またはタイプ７
の生凍結乾燥アデノウィルスを含有する。錠剤（約１０
ＴＣＩＤ５ｏのウィルス）の投与は発病のない選択的胃
腸管感染を起こす。

ワクチンは安全である。即ち、惹起されｆｃ［染は、特
に腸に限られ、ワクチンウィルスは、接種を受けた動物
から感染し得る接触者に伝達されな（・。

特異的中和抗体は、免疫化の２１日後、接腫を受けた動
物の９５％以上において見られる１本明細書に記載の本
発明の新規ワクチンは、Ｂ型肝炎表面抗原およびロタウ
ィルスｖＰ７を発現する組換アデノウィルスからなり、
Ｂ型肝炎抗原また番よロタウィルスＶＰ７に対する抗体
が、アデノウィルス同様に産生される以外は、本発明の
アデノウィルスワクチンと同様に処方され、作用する。

本発明の他の具体例においては、約１０ＴＣＩＤ５ＣＰ
組換ウイルヌまたはこれよりかなり少量でも投与するこ
とにより、所望の免疫原性応答が得られる。

最適の投与量は、用いる組換アデノウィルスによって異
なるが、この最適投与口の決定は公匂のとおりである。

（５）　　真正ＨＢ、Ａｇｙ（発現する組換体の詳細な
例アデノウィルス組換体の一種の組立ての詳細な例とし
て、ＨＢｓＡｇ翻訳開始コドンの２６　ｂｐ上流で翻訳
終止コドンからｌ　３）　ｂｐ上下流ａｄｗサブタイプ
のＩ（ＢｓＡｇ遺伝子を、Ａｄ２主要後期プロモーター
の上流の配列（＋３３〜４００ｂｐ；ツルニック、ディ
ー、セル（５ｏｌｎｉｃｋ　、　Ｄ、、　Ｃｅ１ｌ）、
２４．１３５〜１４３（１９８１）参照）オヨヒ５ｖ４
ｏの下流の配列（２７５３〜２５）６ｂＰｉツーズ、ジ
エイ編、モレキュラ・パイオロジイ・オブ・チューマー
拳パイラス、コールド−スフリング・バーバーΦラボラ
トリ−（Ｔｏｏ、ｚｅ、　Ｊ、　（Ｅｄ、　）Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　　ｏｆ　　Ｔｕｍｏｒ　　
Ｖｉｒｕｓｅｓ、　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒ
ｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａ【ｏｒｙ　）　ｐｐ、　８０１
〜８２９　（１９８０）参照）によりフランキングする
。このプラスミド’ｋＰ６ＸＨと称する（前記のとおり
）。これらの配列を、アデノウィルスゲノムの左端のＥ
ｃｏλエリンカーカらＡｄ５）７．０のＨｉｎｄｌｌサ
イトにのびるＡｄ５ＤＮＡの挿入部を互する特異的Ｘｂ
ａｌサイトプラヌミドｐＡＣに挿入する（グルラマン、
ライ、ライクル、エイチ、および・シルニック、ディー
、（ライ・グルラマン編）１−カリオテイ゛ンク・ノイ
イラル・ベクターズ、コールド・スプリング・ノ）−バ
ー・ラボラトリーズ（Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｙ、、　Ｒｃ
ｉｃｈｌ。

Ｈ，、ａｎｄ　　５ｏｌｎｉｃｋ、　Ｄ、、　（Ｙ、　
Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｅｄ、）Ｅｕｋａｒｙｏｃｉｃ　　
Ｖｉｒａｌ　　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇｒ−１ａｒｂｏｒ　　　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ　　　）、ｐ１８７〜１９２（１９８２）ッ篩）、、
任意の順番でＡｄ２主要後期プロモーター・ＨＢ　ｓ　
Ａ　　、ｉｌｌ　伝子−５”　４０プロセシングングナ
ルを含仔するカセットｔａする新規プラスミド（ｐＡ（
Ｈ−２おヨヒｐＡ（：Ｈ−９）　、￥／Ｂｉｎｄ［ｌ　
テ開ａさせる。各々のＢｉｎｄ［［開裂生成物を、地図
上９．１〜１００にのびるアデノウィルス突然変異体△
Ｅ１７）大Ｘｂａｌフラグメントと連結させる（グルラ
マン、ライ、ライフル、エイチ、およびツルニック、デ
ィー、（ライ・グルラマン欄）ユーカリオテイツク書バ
イラル・ベクターズ、コールド・スプリングΦバーバー
、ラボ５　）　ＩＪ−ズ（Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｙ。

Ｒｅ１ｃｈｌ、　Ｈ，、ａｎｄ　　５ｏＪｎｉｃｋｓ、
　　Ｄ、、　（Ｙ、Ｇｌｕｚｍａｎ。

ｅｄ、）　　Ｅｕｋａｒｙｏｃｉｃ　　Ｖｉｒａｌ　　
Ｖｅｃｔｏｒｓ、　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ｐｐ、１８７〜
１９２’（１９８２）参照）、、このＤ　Ｎ　Ａ混合物
を、２９３セル（グラハム、エフ・エル、スマイリー、
ジエイ、ラッセル、ダブりニー・シイ、およびネアン、
アール、ジャーナル・オブ・ジエネテイツク、パイララ
ジイ（Ｇｒａｈａｍ　、　Ｆ、　Ｌ、、　Ｓｍ１ｌｅｙ
、　Ｊ。

Ｒｕ５ｓｅｌｌ、　Ｗ、Ｃ０ａｎｄ　Ｎａ１ｒｎ、　　
Ｒ，、Ｊ、　Ｇｃｎ、Ｖｉｒｏｌ、）。

３６．５９〜７２（１９７７）参照）上でトランスフェ
クトしくクラハム、エフ・エルおよびフェン・チル、ニ
ブ、エイ・ジエイ、パイララジイ（Ｇｒａｈａｍ。

Ｆ、　Ｌ、　ａｎｄ　　ｖｅｎ　　ｄｅｒ　Ｅｂ　、　
Ａ、　Ｊ　、、　ＶｉｒＯＩＯｇｙ）、５２．４５６〜
４６７（１９７３）す照）、セルをプラーク検出のため
、寒天でおふう。約１０〜１４日後、５４のプラークが
得られ、各々からウィルス株が生じた。これらのウィル
スを３２ＰでラベルしたＨＢ、ＡｇＤＮＡ　プローブと
ハイブリッド形成することにより、ＨＢ、ＡｇＤＮＡの
存在に関してヌクリーンする。陽性のプラーク（５４中
４９）を２９３セルの単層上に感染させ、放射線免疫検
定法（ＡＵＳＲＩＡ、アボット・ラボラトリーズ社、ま
念はＮＭＬ−ＨＢ、ＡｇＲＴＡ、　　ニューフレアーメ
ディカル・ラボラトリーズ（ＡＵ　Ｓ　ＲＩ　Ａ　、Ａ
ｂｅｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、　　ｏ
ｒ　ＮＭＬ−ＨＢ、ＡｇＲＴＡ。

Ｎｕｃｌｅａｒ　−Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ　）およびＨＢ、Ａｇに対するモノクローナル
抗体（抗サブタイプ、ベーリンガー・マンハイム・バイ
オケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　ｌｌｉ４ａｎ
ｎｈｅｉｍ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　））　ｆ用
いた　Ｓでラベルし７’（ＨＢ、Ａｇの免疫沈降の両方
法により、セル溶菌液において真正ＨＢ、Ａｇの発現を
検出する。

６、前記例において、第１スプライヌサイトが含まれな
い様（こ、翻訳開始サイトの３３ヌクレオチド下流【こ
のびるＡｄ２主要後期プロモーターを用いる。このプロ
モーターは、アデノウィルス主要後期プロモーターの３
部分リーダーの最初の部分しか含有しない。しかし、特
に３．４．５′！、たは７タイプの他のアデノウィルス
由来の主要後期プロモーターを用いることができ、この
プロモーターの完全な３部分リーダーを用いることがで
きる。

ａ下の実施例で、Ａｄ２主要後期プロモーター、および
２００ｂｐＡｄ２３部分リーダーの左側の１６８ｂｐｑ
続いてＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子およびＳ■４０ウィルス
由来のプロセシングおよびポリアデニル化シグナルから
なるカセットを有する２種のバクテリアプラスミド、ｐ
ＨＭｌおよびｐ　ＨＭ　２の組立てを記載する。これら
のプラスミドもカセットをフランキングするアデノウィ
ルス配列を含有するので、このカセットをアデノウィル
スゲノムに挿入するのに同種の組換えを用いることがで
きる。

カセットの左側には、Ａｄ５ゲノムの左側の３５３ｂｐ
が位置し、右側には、アデノウィルス５の８〜１５．５
が存在する。プラスミドｐ　ＨＭ　１番よＨＢ、Ａｇ遺
伝子の前に１９ｂＰのＳＶ４０ウィルス配列、（ＳＶ４
０ヌクレオチド５）７３〜５）７４　）を含有する。プ
ラスミドｐ　ＨＭ　２は、この配列を含有しなし島以外
はｐ　ＨＭ　１と同じである。

ｐ　ＨＭ　ｌおよびｐ　ＨＭ　２由来のカセットを前記
よじ組換技術により、アデノウィルス５ゲノムのＥ１領
域におく。各プラスミドを直線状にし、地図上９．１〜
１００にのびるアデノウィルス突然変異体△Ｅｌの犬Ｘ
ｂａｌフラグメントと連結する（グルッマン、ライ、ラ
イクル、エイチおよびソルニ゛ンク、ディー、（ライ・
グルラマン編）、ユーカリオテイツク・パイラルベクタ
ーズ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリー
ズ（Ｇｌ　ｕｚｍａｎ　。

Ｙ、、　Ｒｅ１ｃｈｌ　、　Ｈ，ａｎｄ　５ｏｌｎｉｃ
Ｊ　Ｄ、　（Ｙ、　Ｇｌｕｚｍａｎ。

ｅｄ、）　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　　Ｖｉｒａｌ　　Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ、　　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　　）ｌａｒ
ｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）、ｐｐ１８７
〜１９２（１９８２）参照）。プラークを調べ、各々か
らウィルス株が生じていた。

これらのウィルス株（ＨＭＩおよび８Ｍ２）＆ヒ）ｆｌ
Ｒｌ育児（２９３）セルライン上に感染させた場合（ク
ラハム、エフ−エル、スマイリー・ジエイ、ラッセル、
ダブリュー・シイおよびネアン、アール、ジャーナル・
オブ拳バイララジイ（Ｇｒａｈａｍ。

Ｆ、Ｌ、、　Ｓｍ１ｌｅｙ、　Ｊ、、　　Ｒｕ５ｓｅｌ
ｌ、　Ｗ、Ｃ：、　ａｎｄ　　Ｎａ１ｒｎ。

Ｒ，、Ｊ、　　Ｇｅｎ、　　Ｖｉｒｏｌ、）、３６．５
９〜７２　（１９７７）参照）、４０時間の感染後、感
染したセル５ｘ１０６個につき約ｌμｇのＨＢ　ｓ　Ａ
　ｇ　（放射線免疫検定法およびＮ　Ｍ　Ｌ　−ＨＢ　
、　Ａｇキット陽性コントロールに対するｃｐｍの比較
に基づく）が、）１Ｍ２感染し念セルの培養上清中に観
察された。ＨＭ１ウィルスより、この量の約６０％が産
生された。本発明者らは、これらのウィルスにより産生
されたＨＢ　５Ａｇポリペプチドがグリコジル化された
形態（Ｐ２）およびグリコジル化されていない形態（Ｐ
ｉ）であることを見出した（マリオン、ビイ・エル、サ
ラザー、エフ・エイチ、アレキサングー・ジエイ・ジエ
イおよびロビンンン、ダブリュー、ジャーナル・オブ１
１ハ（ララジイ（Ｍａｒｉｏｎ、　　Ｐ、Ｌ、。

５ａＪａｚａｒ、　　Ｆ、Ｈ，、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、
　Ｊ、Ｊ、ａｎｄ　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ。

Ｗ、、　Ｊ、　Ｖｉ　ｒｏ　ｌ　、　）、３２．７９６
〜８０２（１９７９）；ピーターソン、ディー・エル、
ジャーナル・サブ・バイオロジカル・ケミストリイ（Ｐ
ｅｔｅｒｓｏｎ。

Ｄ、Ｌ、、　Ｊ、　ＢｉｏＪ、　　Ｃｈｅｍ、）、２５
６．６９７５〜６９８３（１９８１）参照）６感染後４
０時間で、ＨＢ、Ａｇ（７）大部分（７８％）が、ヒト
血清において観察される２　２　ｎｍの粒子（ゲリン、
ジエイ・エル、パーセル、アール・エイチ、ホガン、エ
ム嘩ディー、ホランド、ビイ・ブイおよびシャ／ツク、
Ｔ−ル・エム、ジャーナル・サブ・パイララジイ（Ｇｅ
ｒｉｎ。

Ｊ、　Ｌ、、　Ｐｕｒｃｅｌｌ、　ＲｏＨ，、ｔ（ｏＪ
Ｉａｎｄ、　Ｐ、　Ｖ、、　ａｎｄＣｈａｎｏｃｋ、　
Ｒ，Ｍ、、　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、）、４．７６３〜７
６８（１９６９）ｉゲリン、ジエイ・エル、ホランド、
ビイーブイ、およびパーセル・アール・エイチ、ジャー
ナル・サブ・パイララジイ（Ｇｅｒｉｎ、　Ｊ％Ｌ。

ＨｏＪＪａｎｄ、　　Ｐ、Ｖ、、　ａｎｄ　　Ｐｕｒｃ
ｅＪＪ、　Ｒ，Ｈ，、Ｊ。

ｖｉｒｏｌ、）、７．５６９〜５７６（１９７１）ｆｆ
照）と同じまたは殆ど同じ粒子（密度＝　１．２０９７
ｍ１　）でセルから培地中へ分泌された。ＨＭ　２によ
り、ＨＭｌ　よりも約４０％多いＨａ　、　Ａｇが産生
された。

しかし、ＨＭ２７．−前記ハイブリッドアデノウィルス
、ΔＥＩＨと比較した場合、８Ｍ２ウイルスによりＨＢ
、Ａｇポリペプチドにおいて７０倍の増加がみられた。

アデノウィルス主要後期プロモーターのかわりに、他の
いかなる適当な真核プロモーター、例えば、ヒト金属チ
オネインプロモーターまたはヒト・ジヒドロ葉酸還元酵
素等を用いることができる。

さらに、本実施例においては、外来遺伝子発現用のベク
ターとしてアデノウィルスタイプ５ＤＮＡ、ｉ用いたが
、池のアデノウィルスタイプもベクターとして使用でき
、特に有用なものは、タイプ３．４および７であって、
ワクチンとして用いられる。

’ｌｆＬ、５ｖ４Ｑ　　ＤＮＡ由来のプロセシングおよ
びポリアデニル化シグナルの使用を記載したが、いかな
る適当なプロセシングおよびポリアデニル化シグナルを
用いることができる。これらは、アデノウィルスＤＮＡ
、特にタイプ３．４および７由来のものである。

本発明の方法を実施する際、アデノウィルスの欠損した
初期領域３（こ外′Ｊ！：ａ仏子を挿入する場合、組換
ウィルスは感染性であり、接種では、組換ウィルスを腸
に連ぶことだけが必要である。一方、初期領域１は、γ
デノウィルス感染に対して必須である。従って、外来遺
伝子を欠損初期領域ｌに挿入する場合、ヘルパーウィル
スな共投与しなければならない。このヘルパーウィルス
は、未修飾思染性アデノウィルスであるのが好都合であ
る。

また、ヘルパーウィルスは組換ウィルスにより補足し得
る欠損’ｋ　Ｗする、それ自体は欠失ウィルスであって
もよい。この場合、ウィルス増殖および外来抗原産生は
、両方のウィルスで感染したセルにおいてのみ起こる。

この欠失ヘルパーウィルスは、組換ウィルスと同じでも
、異なるサブタイプでもよい。異なるサブタイプである
場合（例えば、組換ウィルスがＡｄ４サブタイプであっ
て、欠失ウィルスがＡｄ７サブタイプである場合）、組
換による野性型ウィルスの形成は最ｌｐ限にしなければ
ならない。ワクチン製造用のウィルスの増殖は、ヒト・
二倍体線維芽細胞における両ウィルスの共培：ＩＩま几
は互いに欠失を補足しあうことが仰られているセルライ
ンにおいて別々にウィルスを培養することにより達成さ
れ得る。

ＥｌおよびＥ３領域のほかに、プロモーター、３部分リ
ーダー、外来遺伝子、およびプロセシングおよびポリア
デニル化シグナルを含有するカセットを挿入し得るウィ
ルス・ゲノムの他のいくつかの領域がある。これらの領
域としては、ＥｌａおよびＥｌｂ間の領域、ゲノムの左
および右側の領域、およびＥ４領域、およびＬ５および
Ｅ４４領域の領域が挙げられる。いくつかの例ｔｎ下に
記載する： Ａｄ５は地図上１．４にＥｌａ　　プロモーターおよび
４．７ヲこＥｌｂプロモーターを有する。Ｅｌａのポリ
アデニル化サイトは、地図上４．６、ヌクレオチド１６
３）でアリ、ヌクレオチド１６７１には、Ｅｌｂ　プロ
モーターのＴＡＴＡボックスがある。ヌクレオチド１５
７２には特異的ＨＰａ１サイト（ＧＴＴＡＡＣ）がある
。このサイトは、アデノウイルスタイプ２主要後期プロ
モーターおよびＢ型肝炎ウィルス表面抗原の配置および
Ｅｌａポリアデニル化サイトの使用に用い得る。Ｅｌａ
　のポリアデニル化は、Ｅｌａ　の後方の５ｖ４０　ウ
ィルスＤＮＡ由来またはウィルスのＬ　４　須域出来の
ポリアデニル化ングナルの配置により起こる。前記組立
に３けるゲノムにおける別のＤＮＡは、Ｅ３領域におい
て必須でないＤ　Ｎ　Ａの除去により補償される。

他の挿入点は、ゲノムの極端に左側および右側にある。

左端では、挿入点は、Ｅ４プロモーターの逆転末端反復
配列およびＴ　、Ａ　Ｔ　Ａポックス間である。Ａｄ２
において、９９．３地図単位にＭｈｏＩｌサイトがある
。これはウィルスＤＮＡの右端から］、９１ｂｐである
。Ａｄ５において、ゲノムの左端から２４０　ｂｐにＴ
ｈａｉ（ＦｎＵ４Ｄ口）サイトがある。

この領域はＺＴＲおよびＥ４ＴＡＴＡボックスの上流間
にある。また、必要に応じて、余分のＤＮＡを調節する
ために、Ｅ３欠失突然変異体に挿入を行なう。

各々の場合、これらの領域を、現在市販のアデノワクチ
ンに用い得るアデノウイルスタイプ４およびタイプ７種
におけるアデノウィルス主要後期プロモーター、アデノ
ウィルス３部分リーダー、外来性遺伝子、およびプロセ
シングおよびポリアデニル化ングナルのカセットの挿入
点として用い得る。

本明細書では、特にタイプ４．５、’！、たは７のアデ
ノウィルスについて記載したが、本発明においては、い
かなるタイプの生態染性アデノウィルスを用いてもよい
。タイプ４または７のアデノウィルスは、画業的アデノ
ウィルスワクチンで現在用いうるタイプなので好ましい
。同様に、Ｂ型肝炎およびロタウィルスに対する抗体を
産生ずるワクチンに関する文献があるが、本発明により
、温血動物が抗体または細胞免疫を産生し、約３０００
までの塩基対からなる遺伝子によりコードされる抗体を
含有するあらゆる病原に対する経口ワクチンが提供され
る。このように、例えば、本発明の［ｇ内Ｇ：は、イン
フルエンザ、パラインフルエンザ、呼吸器系ウィルス性
疾病、Ａ型肝炎、後天的免疫欠失症候群（ＡＩＤｊ）、
コレラ、イー　コリ、百日咳、ジフテリア、破瘍風、赤
痢、淋病、肺炎マイコプラズマ等の疾病に対する免疫が
３−ｚれる。

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. （１）温血動物における感染性生物に対する抗体に対応
   する抗原または細胞性免疫を惹起する抗原をコードする
   遺伝子を含有する生組換アデノウイルスを、腸溶皮剤の
   形態で温血動物に経口投与することを特徴とする前記抗
   体または細胞性免疫を産生する方法。
2. （２）感染性生物が、Ｂ型肝炎ウイルスである前記第（
   １）項の方法。
3. （３）前記感染性生物がＢ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝
   炎表面抗原をコードする遺伝子である前記第（１）項の
   方法。
4. （４）前記生組換アデノウイルスが欠失初期領域３に位
   置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４または５
   である前記第（３）項の方法。
5. （５）前記生組換アデノウイルスが欠失初期領域１に位
   置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４または７
   であって、また同じタイプの未修飾感染性アデノウイル
   スを経口投与する前記第（３）項の方法。
6. （６）前記感染性生物がロタウイルスである前記第（１
   ）項の方法。
7. （７）前記感染性生物がロタウイルスおよびロタウイル
   ス外殻タンパク質をコードする遺伝子である前記第（１
   ）項の方法。
8. （８）前記生組換アデノウイルスが、欠失初期領域３に
   位置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４または
   ７である前記第（７）項の方法。
9. （９）前記生組換アデノウイルスが、欠失初期領域１に
   位置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４または
   ７であり、このタイプの未修飾感染性アデノウイルスを
   経口投与する前記第（７）項の方法。
10. （１０）温血動物における感染性生物に対する抗体に対
    応する抗原または細胞性免疫を惹起する抗原をコードす
    る遺伝子を含有する生組換アデノウイルスからなり、腸
    溶皮剤投与形に処方されていることを特徴とする前記抗
    体または細胞性免疫を産生するワクチン。
11. （１１）前記感染性生物が、Ｂ型肝炎ウイルスである前
    記第（１０）項のワクチン。
12. （１２）前記感染性生物が、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＢ
    型肝炎表面抗原である前記第（１０）項のワクチン。
13. （１３）前記生組換アデノウイルスが、欠失初期領域３
    に位置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４また
    は７である前記第（１２）項のワクチン。
14. （１４）前記生組換アデノウイルスが、欠失初期領域１
    に位置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４また
    は７であって、未修飾感染性アデノウイルスタイプ４ま
    たは７である前記第（１２）項のワクチン。
15. （１５）前記感染性生物がロタウイルスである前記第（
    １０）項のワクチン。
16. （１６）前記感染性生物がロタウイルスおよびロタウイ
    ルス外殻タンパク質である前記第（１０）項のワクチン
    。
17. （１７）前記生組換アデノウイルスが、欠失初期領域３
    に位置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４また
    は７である前記第（１６）項のワクチン。
18. （１８）前記生組換アデノウイルスが、欠失初期領域１
    に位置する遺伝子を有するアデノウイルスタイプ４また
    は７であって、このタイプの未修飾感染性アデノウイル
    スを経口投与する前記第（１６）項のワクチン。
19. （１９）病原性生物により生じる抗原をコードする遺伝
    子を含有するタイプ４、５または７の組換アデノウイル
    スであって、前記遺伝子が、Ｂ型肝炎表面抗原またはロ
    タウイルス外殻タンパク質をコードし、また前記遺伝子
    が、欠失前記領域１または欠失前記領域３に位置するこ
    とを特徴とする組換アデノウイルス。
20. （２０）組換アデノウイルスが欠損ウイルスであり、欠
    損組換アデノウイルスにおいて欠失している遺伝子を含
    有する別のアデノウイルスを経口投与する前記第（１）
    項の方法。