DD248144A1

DD248144A1 - Verfahren zur herstellung von 1,4-androstadien-3,17-dion durch fermentativen sterolabbau

Info

Publication number: DD248144A1
Application number: DD26643184A
Authority: DD
Inventors: Hans-Helmut Grosse; Lutz Blei; Volker Deppmeyer; Michael Menner; Harald Bocker; Claere Hoerhold; Birgit Gottschaldt
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1984-08-20
Filing date: 1984-08-20
Publication date: 1987-07-29
Also published as: DD248144B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum fermentativen Seitenkettenabbau von Sitosterol zu 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) als Ausgangssubstanz fuer die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Es liegt ihr die Aufgabe zugrunde, den fuer die Erziehung hoher ADD-Bildungsraten notwendigen physiologischen Zustand der Biomasse mittels Realisierung eines einfach reproduzierbaren Prozessregimes einzustellen. Dies wird dadurch erreicht, dass in Abstimmung mit der Wachstumskinetik der Biomasse im Verlauf der Fermentation zeitweise oder staendig niedrige Werte der relativen Geloestsauerstoffsaettigung realisiert werden. In einer bevorzugten Ausfuehrungsform wird das Verfahren in bezug auf den Eintrag des Sauerstoffs in die Kulturbruehe als Impulsregime durchgefuehrt, wobei die relative Geloestsauerstoffsaettigung nach Abfallen auf das 10%-Niveau durch eine Regelung in dem Bereich dieses Sollwertes gehalten wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum fermentativen Seitenkettenabbau von Sterolen zu 1,4-Androstadien-3,17-dion, welches als Ausgangssubstanz für die Herstellung von Steroidwirkstoffen von Bedeutung ist. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt also in der pharmazeutischen Industrie und in der technischen Mikrobiologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Sterole, wie z. B. Sitosterol, Cholesterol, Stigmasterol, Campesterol und Ergosterol, durch Mikroorganismen aus zahlreichen Gattungen, wie z. B. Arthrobacter, Brevibacterium, Nocardia, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Streptomyces, Corynebacterium und insbesondere Mycobacterium u.a., über das Intermediärprodukt 1,4-Androstadien-3,17-dion (im folgenden kurz ADD genannt) abgebaut werden können. Dieses Produkt wird im Fermentationsmedium nur dann angereichert, wenn keine 9a-Hydroxylierung erfolgt. Dies wiederum wird u. a. dadurch erreicht, daß Mikroorganismus-Mutanten mit Defekten in der genannten enzymatischen Leistung zur Fermentation verwendet werden.

Das erste Verfahren zur Herstellung von ADD aus Sterolen unter Verwendung von Enzymdefektmutanten (G.D.Searle & Co., US 3684657,1970, Mycobacterium spec. NFSFtL B-3683) beschreibt bei Einsatz von 1 g Sitosterol je Liter Kulturlösung und einer Fermentationszeit von 186 Stunden bis 216 Stunden theoretische Ausbeuten von 40% ADD, bezogen auf den Anteil des bei der Fermentation umgewandelten Sitosterols.

Die von I.Sauerbaum et al. (I.Europ. Kongress f. Biotechnologie, Interlaken, 1978,139-143) angegebene Fermentation von Sitosterol mit Mycobacterium spec. NRRL B-3683* in Gegenwart des unpolaren Adsorbers XAD-2 und des nichtionischen TensidsTween 20, in der 10g Sitosterol je Liter Kulturlösung in 96 Stunden zu 80% der Theorie zu einem Gemisch aus ADD und AD umgewandelt werden, ist als die bisher besteVerfahrenslösung anzusehen. Nach diesen Autoren wird hierbei die Produktbildung durch hohe Gelöstsauerstoffkonzentrationen stimuliert und die ADD-Bildung gegenüber der Bildung von 4-Androsten-3,17-dion (AD) begünstigt. Als Optimalbedingung und damit untere Grenze wird eine relative Gelöstsauerstoffsättigung der Kulturbrühe von 50% angegeben. Daraus ergeben sich für die Prozeßführung im Fermentor Anforderungen an die Belüftung und an die Umwälzung der Fermentationsbrühe, die hinsichtlich Schäumung, Aufrahmung von Substraten und Biomasse, Scherkraft- und Durchmischungsverhältnissen insbesondere bei Anwesenheit von Adorbern in der Fermentationsbrühe ungünstig sind.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel, 1,4-Androstadien-3,17-dion auf mikrobiellem Wege in hohen Ausbeuten aus Sterolen herzustellen.

* Nach JP 105289 (Kokai) wurde dieser Mycobacterium spec.-stamm als Mycobacterium vaccae klassifiziert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion mittels mikrobieller Transformation von Sterolen zu beschreiben, in welchem hinsichtlich der Fermentationsführung, insbesondere hinsichtlich der Führung der relativen Gelöstsauerstoffsättigung der Kulturbrühe, eine Lösung realisiert wird, die die Nachteile der bekannten technischen Lösungen vermeidet.

Es wurde gefunden, daß der oxidative Prozeß der Bildung von 1,4-Androstadien-3,17-dion durch mikrobiel Ie Transformation von Sterolen oder Sterolgemischen, vorzugsweise von Sterolgemischen mit Sitosterol als Hauptkomponente, mit überraschend hoher Ausbeute realisierbar ist, obwohl die relative Gelöstsauerstoffsättigung der Kulturbrühe im Verlauf der Fermentation nach Abfall vom Sättigungswert 100% zeitweise oder ständig weniger als 10% beträgt.

Das Verfahren wird in seinem Grundzug wie folgt durchgeführt:

Sterole wie Sitosterol, Cholesterol, Campesterol, Stigmasterol bzw. Ergosterol oder Gemische dieser Sterole werden in Form von Sterol-Tensid-Präparationen eingesetzt, wobei die Sterolkonzentration bezogen auf den Liter Fermentationsmedium

1 Gramm bis 50 Gramm beträgt. Zur Fermentation werden Mikroorganismen eingesetzt, die zur Ste ro !transform ation unter Bildung des Produkts ADD bzw. des Produktgemisches ADD/AD befähigt sind. Solche Mikroorganismen können aus den Gattungen Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Norcardia, Pseudomonas, Protaminobacter, Serratia, Streptomyces usw. ausgewählt werden. Insbesondere wird für das vorliegende Verfahren zur Herstellung von ADD der Stamm Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 oder eine Selektante dieses Stammes eingesetzt. Eine Selektanteistin der Kultursammlung des ZIMET unter der Registriernummer I MET SK113hinterlegtworden. Die Sterol-Tensid-Präparationen werden nach den an sich bekannten Methoden der Lyophilisierung, Vermahlung oder der Sprühtrocknung gewonnen.

Wie auch in unseren beiden parallelen Anmeldungen beschrieben, kommen als Tenside Verbindungen aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Adduktedes N,N"-Tetra-(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriaminsmit Molekulargewichten des Polypropylenglykols um 1400 bis 2000 zur Anwendung.

Die Fermentationsmedien enthalten Kohlenstoffquellen, wie beispielsweise Glycerol, Glucose, Saccharose, Stärke und/oder Melasse usw., weiterhin Stickstoffquellen, wie beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff, Ammoniumsalze, Maisquellwasser, Pflanzenmehle und/oder andere komplexe Medienbestandteile (wie z. B. Fleischextrakt, Hydrolysate usw.) sowie verschiedene Mineralsalze.

Zum Fermentationsmedium wird ein Adsorber gegeben, der vom Typ eines organischen Polymeren ist und polare Gruppen (Cupolymerisat ausStyren und Divinylbenzen mit Acrylsäurederivat-Anteil) enthält. Das Mengenverhältnis beträgt zwischen

2 Gramm pro Liter und 200 Gramm pro Liter. Zur weiteren Charakterisierung des Adsorbers wird auf eine unserer parallelen Anmeldungen verwiesen.

Die Zeitdauer der Fermentation beträgt 24 Stunden bis 192 Stunden. Es wird unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen von 2O⁰C bis 45⁰C und pH-Werten im Bereich von pH 6 bis pH 8 gearbeitet. Die Durchführung der Fermentation erfolgt im Rührfermentor oder in Fermentoren mit anderen Umwälzprinzipien, z. B. in Air-Lift-Fermentoren.

Für den jeweils verwendeten Fermentor ist eine apparative Charakterisierung vorzunehmen; diese erfolgt für den erfindungsgemäßen Zweck mit Hilfe der Sauerstoff-Transportrate in Abhängigkeit von Belüftung und Umwälzung. Die Messung der Sauerstoff-Transportrate wird in an sich bekannter Weise durchgeführt.

Für den zur Steroltransformation eingesetzten Mikroorganismus werden in Vorversuchen in an sich bekannter Weise (siehe z. B.

F. Bergter, Wachstum von Mikroorganismen, G. Fischer Verlag Jena, 1983)

— die Ertragskoeffizienten für die Biomasse aus den bestimmenden Substraten,

— die spezifische Wachstumsrate und

— die spezifische Sauerstoff-Aufnahmerate

bestimmt. Weiterhin wird während des Fermentationsprozesses die relative Gelöstsauerstoffsättigung als pO₂-Wert der Fermentationsbrühe auf an sich bekannte Weise kontinuierlich gemessen.

Für die zu Beginn des Fermentationsprozesses ablaufende Phase des Biomassewachstums wird auf der Grundlage der für den eingesetzten Fermentor voranstehend ermittelten Abhängigkeit der Sauerstoff-Transportrate der Arbeitspunkt für das Regime von Belüftung und Umwälzung der Fermentationsbrühe so gewählt, daß nach frühestens 0,5 Stunden bis spätestens 45 Stunden Fermentationszeit der pO₂-Wert der Fermentationsbrühe das 10%-Niveau unterscheidet. Mit dieser Sauerstoffauszehrung tritt ein für die Erzielung hoher ADD-Bildungsraten günstiger physiologischer Zustand der Biomasse ein.

In der anschließenden Phase der stationären Biomasse vollzieht sich ein Anstieg der relativen Gelöstsauerstoffsättigung der Fermentationsbrühe, sofern auf weitere Regelungsmaßnahmen, z.B. Reduzierung von Umwälzung und Belüftung, verzichtet wird. Der pO2-Wert kann in diesem Falle zum Ende der Fermentation wieder 100% betragen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren in der Phase der stationären Biomasse hinsichtlich des Sauerstofftransports, d.h. hinsichtlich Belüftung und Umwälzung der Fermentationsbrühe, in einem auf der Basis einer pO₂-Sollwertregelung entstehenden Impulsregime durchgeführt. Der p02-Sollwert wird aus dem Bereich von 5% bis 30% gewählt; vorzugsweise wird er auf 10% eingestellt.

Die pO₂-Sollwertregelung bei einem Sollwert von beispielsweise 10% wird hier wirksam, um das Ansteigen der relativen Gelöstsauerstoffsättigung der Fermentationsbrühe in der Phase der stationären Biomasse zu unterdrücken.

Das Impulsregime für Lufteintrag und Umwälzungsparameter (z. B. Drehzahl beim Rührfermentor) besitzt die zwei Zustände

— reduzierter bzw. gestoppter Lufteirvirag und verminderte Umwälzung für pO₂-lstwert > p0₂-Sollwert,

— Lufteintrag und aktivierte Umwälzung für pO₂-lstwert < pO₂-Sollwert.

Die Änderungsbereiche von Umwälzungsparameter und Lufteintrag sind aus der Sauerstofftransport-Charakteristik des jeweils eingesetzten Fermentors zu bestimmen.

Im Extremfall ist diese Ausführungsform dahingehend modifiziert, daß das Impulsregime bereits in der Phase des Biomassewachstums wirksam wird. Diese Verfahrensvariante ist dadurch gekennzeichnet, daß der pO₂-Wert der Fermentationsbrühe unmittelbar nach Fermentationsbeginn infolge Zuluftstop unter das Sollwertniveau, beispielsweise unter das 10% Niveau, abfällt, womit die pO₂-Sollwertregelung mittels koinzidierender Intensivierung von Belüftung und Umwälzung bei Sollwertunterschreitung frühzeitig beginnt. Mit dieser Prozeßführung werden in besonders vorteilhafter Weise

und Schäumungsprobleme vermieden und günstige Kontakt- und Durchmischungsbedingungen für die Festphasen (Adsorber, Sitosterol, Biomasse) gewährleistet. Gleichzeitig werden hohe ADD-Ausbeuten realisiert.

Bei Durchführung des Verfahrens im technischen Maßstab, beispielsweise im 10-m³-Rührfermentor, wird das voranstehende Impulsregime entsprechend der vorteilhaften technischen Realisierung modifiziert. Bevorzugte Ausführungsvarianten sind

— kontinuierliche, beispielsweise lineare Anhebung der Drehzahl bis zu einer festgelegten Obergrenze bei Unterschreitung des pO₂-Sollwertes und Intensivierung des Lufteintrags beginnend mit dem Erreichen des oberen Drehzahl-Plateaus; Drehzahlabsenkung und Reduzierung bzw. Stop des Lufteintrags bei Überschreitung des p0₂-Sollwerts oder

— Beibehaltung einer durchgängig konstanten Drehzahl und Durchführung des Impulsregims nur für die Fermentorzuluft. Die verfahrensgemäße Lösung hat folgende Vorteile:

Durch die Entwicklung des vorliegenden Verfahrens zur Herstellung von ADD über den mikrobiellen Sterolabbau, welches Während langer Abschnitte der Prozeßdauer durch niedrige Werte der relativen Gelöstsauerstoffsättigung der Fermentationsbrühe gekennzeichnet ist, werden hohe Produktausbeuten bei gleichzeitig verbesserter Fermentationsführung ohne Schäumung und Aufrahmung von Biomasse, Adsorber und Sitosterol gewährleistet. Ein zusätzlicher Vorteil wird in der Einsparung von bereitzustellender Fermentorzuluft und Elektroenergie gesehen.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung soll an Beispielen näher erläutert werden:

Beispiel 1

Aus einer Konserve des Stammes Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 wird die Impfkultur für die ADD-Fermentation kultiviert. Im ersten Schritt dazu wird eine Schrägagarkultur mittels viertägiger Bebrütung bei 35°C angelegt. Der Nähragar hat je Liter Aqua dest. die Zusammensetzung: Glycerol 20g, Bacto-Pepton 5 g, Fleischextrakt 3g, Agar agar 15g. Sein pH-Wert wird im flüssigen Zustand vor der Sterilisation auf 7,0 eingestellt; die Sterilisation dauert 20 Minuten bei 121⁰C. Anschließend erfolgen zwei submerse Vorkulturstufen. Für die erste submerse Vorkultur wird die Schrägagarkultur mit 5 ml des Kultivierungsmediums für die beiden submersen Vorkulturstufen abgeschwemmt. Dieses Medium hat je Liter Aqua dest. die Zusammensetzung: Hefeextrakt 10g, Glycerol 10g, KH₂PO₄,0,5g, K₂HPO₄ 0,5g, (NH₄I₂HPO₄1,5g, MgSO₄ · 7H₂O 0,2g, FeSO₄ · 7H₂O 0,01 g, ZnSO₄ · 7H₂O0,002g mitpH-Wert-Einstellung auf 7,0 vor der Sterilisation für 20 Minuten bei 121⁰C.

Aus der Abschwemmung werden 500 ml fassende Rundkolben beimpft, die je 50 ml des letztgenannten Mediums enthalten und 36 Stunden bei 28°C auf dem Rundschwingtisch geschüttelt werden. Jeweils 5 ml der ersten Vorkultur dienen zur Beimpf ung von Ruhdkolben der zweiten Vorkulturstufe mit den Füllbedingungen wie in der ersten Vorkulturstufe, die ebenfalls 36 Stunden bei 28°C geschüttelt werden.

Die anschließende Fermentor-Hauptkultur erfolgt über 94 Stunden mit einem Startvolumen (einschließlich Vorkultur und Sitosterol, ohne Adsorber) von 2,51 in einem Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen bei 31⁰C. Die Beimpfungsmenge aus der zweiten Vorkulturstufe bildet 10% des Startvolumens. Zum Liter Fermentationsbrühe werden 140g Adsorber vom Typ eines Copolymerisats aus Styren und Divinylbenzen mit Acrylsäurederivat-Anteil zugesetzt. Der Adsorber wird vorher mit Methanol ausgewaschen und mit Wasser gespült. Die untere Grenze für den Korndurchmesser beträgt 0,4mm. Das Fermentatinsmedium der Hauptkultur hat folgende Zusammensetzung je Liter Aqua dest.: Harnstoff 0,125g, Glucose 5g, KH₂PO₄,2g, K₂HPO₄8g, (NH₄J₂ SO₄3g, MgSO₄ · 7 H₂O 0,2g, FeSO₄ · 7H₂O 0,01 g, ZnSO₄ 7 H₂O 0,002g. Vor der Sterilisation wird der pH-Wert auf 7,0 eingestellt. Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavierung des das Medium einschließlich der notwendigen Adsorbermenge enthaltenden Fermentergefäßes während 60 Minuten bei 121°C. Die Sitosterolpräparation wird zweimal 60 Minuten im Dampftopf sterilisiert und in einem Schritt mit der Beimpfung in den auf 31 °C rückgekühlten Fermentor eingebracht. Je Liter Fermentationsbrühe werden 15g Sitosterol eingesetzt, dessen Präparation durch Naßvermahlung mit 10% eines Tensids aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Addukte des N,N"-Tetra-(-Oxypropylpropyol)-N'-(2-Oxypropy!)-diethylentriamins mit Molekulargewichten des Polypropylenglycols um 1400 bis 2000 in einer Kolloidmühle erfolgt.

Die Hauptkultur-Fermentation wird unter den zu Beginn eingestellten konstanten Bedingungen von 0,331 Luft je Liter Fermentationsbrühe und Minute bei 450 Umdrehungen je Minute (6-Blatt-Rührer) für Belüftung und Rührung durchgeführt, während der Fermentation wird die relative Gelöstsauerstoffsättigung als pO₂-Wert (100%-Eichung in der unbeimpften gerührten und belüfteten Fermentationsbrühe) gemessen und registriert; durch Probenahme werden die Kinetik der Biomasse und der ADD-Bildung ermittelt. Bei Beendigung der Fermentation liegt die Ausbeute an ADD bei 5,1 g/l. Die Kinetiken für ADD, Biomasse und pO₂-Wert sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Beispiel 2

Es wird wie im Beispiel 1 vorgegangen, um die Vorkultur für die ADD-Fermentation zu erhalten. Die Hauptkultur wird in einem Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen bei 28°C durchgeführt. Hinsichtlich der 2,51 betragenden Menge des Startvolumens sind 250 ml Impfkultur der zweiten Vorzuchtstufe und 7 g/l Sitosterolpräparation inbegriffen, deren Vorbereitung und Zugabe wie im Beispiel 1 abläuft.

Das Fermentationsmedium der Hauptkultur hat je Liter Aqua dest. die Zusammensetzung: Harnstoff 0,25g, Glucose 5g, (NH₄)₂SO₄3g, KH₂PO₄ 1 g, K₂HPO₄4g, MgSO₄ · 7H₂O 0,2g, FeSO₄ · 7H₂O 0,01 g, ZnSO₄ · 7H₂O 0,002g. Weiterhin werden zum Liter Fermentationsbrühe 60 g des Adsorbers von Beispiel 1 zugegeben. Die Sterilisationsbedingungen sind mit Ausnahme der längeren Sterilisationszeit von 90 Minuten mit denen im Beispiel 1 identisch.

Die Hauptkultur-Fermentation beginnt im Zustand der Gelöstsauerstoffsättigung der Fermentationsbrühe, der auch zur Eichung der pO₂-Sonde benutzt wird. Als Regelschwelle für den pO₂-Wert werden 10% eingestellt. Die Startdrehzahl beträgt 450~min~¹, die Luftzufuhr wird nach der Eichung der pO₂-Sonde unterbrochen.

Es erfolgt innerhalb von 0,5Stunden.der Abfall des pO₂-Wertes auf 10% durch Sauerstoffauszehrung infolge der Sauerstoffaufnahme durch die anwachsende Biomasse. Bei Unterschreitung der pO₂-Regelschwelle wird die Drehzahl auf 700 min"¹ erhöht und koinzidierend der Zuluftweg freigegeben, den dann die Luftmenge von 0,331 je Liter Fermentationsbrühe und Minute durchströmt. Nach Erhöhung des pO₂-Wertes über 10% erfolgt die Rücksetzung der Prozeßbedingungen auf 450min"¹ und Zuluftstop.

Dieses Impulsregime zur Einhaltung des p0₂-Sollwerts von 10% hat den prozeßtechnisch außerordentlich wichtigen Effekt, daß keine Aufrahmung von Biomasse und Substraten und keine Schäumung zustande kommt. Außerdem ergibt sich ein eingeschränkter Luftbedarf. Nach 92 Stunden Fermentationszeit liegt die Ausbeute an ADD bei 1,87 g/l; nach 164 Stunden (Ende der Fermentation) liegen 3,01 g/i ADD vor. Der Plateauwert der Biotrockenmasse von ca. 2,6g/l wird um die

30. Fermentationsstunde erreicht. Ab der 130. Fermentationsstunde steigt der pO2-Wert auf etwa 20% an, obwohl ohne Lufteintrag und bei 450 min"¹ gearbeitet wird.

Tabelle 1: Kinetiken für ADD, Biotrockenmasse und pO2-Wert bei Nichtanwendung einer pO₂-Sollwertregelung (Prozeßbedingungen gemäß Ausführungsbeispiel 1)

ADD(g/l)

Biotrockenmasse (g/l)

pO₂(%)

0(n.B.) 11 22 24 30 35 43 46 50 52 55 60 70 94

pO₂-lstwert< 10% für 10 Stunden pO₂-lstwert < 20% für 20 Stunden

0 0,91

2,42

4,41 5,10^;

0,965 2,24

100

Tabelle 2: Kinetiken für ADD, Biotrockenmasse und pO₂-Wert bei Zulaufstop nach Fermentationsbeginn und nachfolgender Anwendung einer p0₂-Sollwertregelung (Sollwert 10%; sonstige Prozeßbedingungen gemäß Ausführungsbeispiel 2)

ADD (g/l)

Biotrockenmasse (g/l)

pO₂(%)

0(n.B.) 0,25 0,5 21 44 68 92 128 164

0,221

0,824

1,447

1,867

2,79

3,01

1,68 2,44 2,55 2,59 2,54 2,03

100 80 10

10 20

d.h. die pCVSollwertregelung setzte ab 0,5h ein.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion durch fermentativen Sterolabbau, vorzugsweise durch fermentativen Abbau von Sito- und/oder Cholesterol, gekennzeichnet dadurch, daß in Rührfermentoren oder in Fermentoren mit anderen Umwälzprinzipien, vorzugsweise im Air-Lift-Fermentor, während der Fermentationsdauer von 24 Stunden bis 192 Stunden über das Regime von Belüftung und Umwälzung die relative Gelöstsauerstoffsättigung, gemessen als pCVWert der Fermentationsbrühe, nach 0,5 Stunden bis 45 Stunden unter das 5%- bis 30%-Niveau, vorzugsweise unter das 10% Niveau, abgesenkt und wenigstens 10 Stunden bei diesem Niveau gehalten wird.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß nach Absenkung der relativen Gelöstsauerstoffsättigung auf das 5%- bis 30%-Niveau, vorzugsweise auf das 10%-Niveau, ein aus diesem Bereich gewählter Sollwert, vorzugsweise derauf 10% eingestellte Sollwert, während der verbleibenden Dauer des fermentativen Prozesses beibehalten wird.

3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß zur Beibehaltung des aus dem Bereich von 5% bis 30% gewählten Sollwerts, vorzugsweise des 10%-Sollwerts, der relativen Gelöstsauerstoffsättigung während der verbleibenden Dauer des fermentativen Prozesses eine die Belüftung Umwälzung in Koinzidenz erfassende Sollwert-Regelung eingesetzt wird.