DD301740A7

DD301740A7 - Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Sterolen zuAndrosta-1,4-Dien-3,17-Dion

Info

Publication number: DD301740A7
Application number: DD34242290A
Authority: DD
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1990-07-02
Publication date: 1993-09-16

Abstract

Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Sterolen zu Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD) durch Degradation der Seitenkette. Die Verbindung ADD ist als Intermediärprodukt des Sterolabbaus bekannt und dient als Schlüsselprodukt für die Herstellung einer Reihe von Steroidwirkstoffen. Die Aufgabe der Erfindung, mit hohen analytischen Produktbildungsraten und hohen molaren Ausbeuten zunächst ADD-Rohprodukte herzustellen, deren AD-Nebenproduktanteil so niedrig ist, daß mittels einfacher präparativer Aufarbeitung ADD hoher Reinheit erhalten wird, wird dadurch gelöst, daß für einen Mikroorganismus der Species Mycobacterium vaccae eine definierte Führung der Impfkultur angewendet wird, die mit einer spezifischen Alkalisierung als meßtechnisch erfaßbarem Parameter einhergeht. Nach Fermentation der Hauptkultur in an sich bekannter Weise und nach Abtrennung von anderen Begleitstoffen wird dann durch einfache Aufarbeitung (Auskristallisation) das Zielprodukt ADD in hoher Reinheit gewonnen.{mikrobieller Abbau von Sterolen; Mikroorganismus Mycobacterium vaccae; definierte Führung der Impfkultur; Hauptprodukt Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD); hohe Produktbildungsrate; niedriger Androst-4-en-3,17-dion-Anteil (AD)}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Sterolen zu Androsta-1,4-dien-3,17-dton (ADD). ADD ist als Intermediärprodukt des Sterolabbaus bekannt und dient als Schlüsselprodukt bei der Herstellung von Steroidwirkstoffen. Aus ADD können durch bekannte Synthesen hochwirksame Steroide der Pregnanreihe mit einem großen Anwendungsbereich in der Humantherapie und auch in der Veterinärmedizin gewonnen werden

Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Forschung und Industrie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Herstellung von ADD und Androst-4-en-3,17-dion (AD) durch mikrobielle Fermentation von Sterolen ist bereits des öfteren beschrieben worden. Dabei werden zur Gewinnung von ADD als Hauptprodukt des Sterolabbaus der Mikroorganismus Mycobacterium spec. NRRL B-3683 sowie aus diesem isolierte Selektanten verwendet (vgl. Patentschriften US 3684857, DD 248143 und DD 248144). Das hierbei vorzugsweise eingesetzte Fermentationsmedium enthält zu Fermentationsbeginn jeweils freie bzw. komplexe Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie neben verschiedenen Mineralsalzen ein Sterol bzw. Sterolgemisch bis 50g/l, einen Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren, der polare Gruppen, vorzugsweise Acrylsäurederivate, enthält und weiterhin ein nichtionisches Tensid aus der Gruppe der Polyethylenoxid-Polypropyljnoxid-Addukte des N',N"-Tetra-(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylentriamins (siehe Patentschrift DD 248145). Schäumung und Entmischung als Störfaktoren der reproduzierbaren Prozeßführung werden durch koinzidierende Variation von Rührung und Belüftung als Stellmaßnahmen einer Soll-Wert-Regelung der relativen Gelöstsauerstoff-Sättigung der Kulturlösung (pO₂-Wert) stark vermindert (siehe Patentschrift DD 248144). Die angegebene Prozeßführung zur fermentativen Gewinnung von ADD ist durch das Auftreten von Nebenprodukten wie AD, 21 -Hvdroxy-20-methylprogna-1,4-dien-3-on (1,4-C₂₂-Alkohol) sowie Spuren von 21-Hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-on (4-C₂₂-AIkOhOl) gekennzeichnet. Dabei werden insbesondere Rohproduktgemische erhalten, die als Nebenkomponente stets 9% bis 12% AD (bezogen auf die Gesamtmenge an ADD und AD) enthalten, und die mittlere Produktbildungsrate beträgt für die Chargenfermentation (Batch-Verfahren) höchstens 1,79Gramm ADD je Liter Fermentationslösung im Rohprodukt in 24 Stunden. Dabei werden bis zum Ende der Fermentation analytisch molare Ausbeuten an ADD (bezogen auf die eingesetzte Sterolmenge) von 50% bis 70% der Theorie erreicht. Über die Chargenfermentation hinausgehend, wurde inzwischen auch ein hinsichtlich der erzielten Produktbildungsraten verbessertes Verfahren zur fermentativen Gewinnung von ADD aus Sterolen offengelegt (sieiie Patentschrift DD 276887). Die Zufütterung von frei metabolisierbaren Nährstoffen zum Fermentationsmedium in Abhängigkeit vom pH-Profil und/oder vom pGyWert während der Transformationsphase (I ed-batch-Verfahren) bewirkt hierbei eine Intensivierung der Produktbildung. Die analytischen Produktbildungsraten betragen bis zu 3Gramm ADD je Liter Fermentationslösung im Rohprodukt in 24 Stunden. Der Anteil des Nebenprodukts AD ist gegenüber der Chargenfermentation allerdings auf 11 % bis 13% erhöht. Die molaren Ausbeuten an ADD (analytisch, bezogen auf die eingesetzte Sterolmenge) bis zum Ende der Fermentation liegen unter 60% der Theorie.

Bekannt sind Inzwischen weiterhin fermentative) Verfahren, in denen unter anderem der ivlikroorganismen-Stamm Mycobacterium vaccao 7IMET11094 zur mikrobiollon Transformation von Sterolen zum Produkt ADD (vgl, die Patentschriften DD 29134'iundDD 291342) sowie auch zu anaeron Zielvorbindungen -so unter anderem zu 9a-Hydroxy-.indrost-4-e'i-3,17-dion (Vgl. Patentschrift DD 29¹341) und zu 2a,3a,6a-MS - 004 herangezogen wird. Ebenso wie die eingangs skizzierten früheren technischen Lösungen zur ADD-Gewinnung laufen diese fermentativen Verfahren in den Stufen Vor- und Hauptkultur ab, wobei die Vorkultur in Medien durchgeführt wird, die immer auch sog. komlexe Nährmedienbestandteile wie Hefeextrakte und/oder Peptone enthalten. In den auf dem Einsatz von Stamm M. vaccae ZIMET11094 basierenden bisherigen Verfahren zur Herstellung von ADD werden Ausbeuten bis zu 4,0Gramm ADD je Liter Fermentationslösung im Rohprodukt erreicht. Allen genannten Verfahren haften dabei noch folgende Nachteile an:

- Sowohl im Batch-Verfahren mit seinen relativ niedrigen ADD-Bildungöraten als auch insbesondere im Fed-batch-Verfahren mit bereits höheren ADD-Bildungsraten werden Rohprodukt-Gemische erhalten, die mehr als 9,0% des !inerwünschten Nebenprodukts AD (bezogen auf die Gesamtmenge an ADD und AD) aufweisen. Dieses in der Fermentation entstehende ADD/AD-Gemisch kann nur durch die Einschaltung aufwendiger ergänzender Verfahrensschritte getrennt und damit nur unter erheblichen Ausbeuteverlusten bis auf ein Endprodukt mit einem AD-Anteil <3,0% aufgereinigt werden. (Diese Reinheitsfordorung resultiert im Gesamtverfahren zur Herstellung von Steroidwirkstoffen aus den Erfordernissen der nachfolgenden Syntheseschritte.)

- In beiden Verfahrensgrundtypen werden bis zum Ende der fermentativen Umsetzung im Rohprodukt analytisch nur molare ADD-Ausbeuten bis zu maximal 70% der Theorie erreicht. Diese Ausbeuteverhältnisse sind angesichts des Kostenniveaus bei den Einsat/stoffen sowie angesichts der Effektivität des Gesamtverfahrens verbesserungsbedürftig.

Ziel der Erfindung

Die vorliegende Erfindung verfolgt das Ziel, Androsta-1,4-dien-3,17-dion fermeniativ in hohen Ausbeuten sowie in großer Reinheit herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Transformation von Sterolen zu Androsta-1,4-dien-3,17-dion zu beschreiben, das dieses Produkt mit hohen molaren Ausbeuten liefert. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Das dargelegte Verfahren zur mikrobiellen Gewinnung von Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD) wird unter aeroben Bedingungen in den Fermentationsstufen Vorkultur und submerser Hauptkultur durchgeführt, wobei in letztgenannter Stufe Sterole wie Sito-, Stigma-, Campe-, Ergo- oder Cholesterol bzw. Gemische dieser Sterole in Konzentrationen von 1,0g/l bis 50g/l eingesetzt werden. Der wäßrige Fermentationsansatz der Hauptkultur enthält dabei neben wenigstens einer Kohlenstoff- und wenigstens einer organischen Stickstoffquelle sowie neben Mineralstoffen weiterhin in an sich bekannter Weise eine Sterol-Tensid-Präparation mit einem Mindestgehalt von 10g Sterol oder Sterolgemisch je Liter Präparationsflüssigkeit. Verfahrenswesentlich ist nun, daß dieser Fermentationsansau mit einer Impfkultur des Stammes Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 inokuliert wird, die einer Vorkultur entnommen ist, in welcher zürn Überimpfungszeitpunkt eine pH-Änderung in Richtung . Alkalisierung von mindestens ApH = 0,3 als Ausdruck für das Auftreten von Limitationen sowohl an frei verwertbaren Kohlenstoff- als auch an frei verwertbaren Stickstoffquellen eingetreten ist. Werden die mit M. vaccae ZIMET11094-lnokulum dieser Kennzeichnung beimpften wäßrigen Fermentationsansätze der Hauptkultur dann in an sich bekannter Weise, nämlich bei pH-Werten um den Neutralpunkt (pH = 7,0 ± 1,0) für die Dauer von 24 Stunden bis 192 Stunden bei Temperaturen zwischen 20⁰C und 45⁰C unter Zusatz von Adsorbentien, kultiviert, so läuft die Steroltransformation zu ADD in dieser Kultivierungsstufe mit höheren molaren Ausbeuten sowie mit erhöhten Rohorodukt-Bildungsgeschwindigkeiten ab, wobei der Anteil an unerwünschtem Nebenprodukt AD, bezogen auf die insgesamt gebildete Menge an ADD und AD, deutlich erniedrigt ist und weniger als 9% beträgt.

Die Hauptkultur kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Volumens sowie in Glasfermentoren und in Stahl-Großtanks durchgeführt werden, wobei in jedem dieser Fermentationsgefäße ein herkömmliches Regime der Belüftung realisierbar sein muß.

Der verfahrensgemäße mikrobielle Abbau von Storolen zu ADD läßt sich mit besonderem Vorteil ausführen, wenn ein Hauptkultur-Fermentationsansatz der oben beschriebenen Zusammensetzung mit einer Impfkultur von M. vaccae ZIMET11094 inokuliert wird, die aus einer mehrstufigen Vorkultur dieses Stammes gerade dann entnommen worden ist, nachdem in dieser eine pH-Änderung der oben angegebenen Beschaffenheit, d. h. eine Änderung von mindestens ΔρΗ = 0,3 in Richtung Alkalisierung, als Markierung für das Auftreten einer Limitation an frei verwertbaren Kohlenstoffquellen vor einer Limitation an frei verwertbaren Stickstoffquellen eingetreten ist.

In solcherart beimpften Hauptkultur-Fermentationsansätzen kann-bei Einhaltung der übrigen Bedingungen- der in o.a. definierte Anteil an AD im Rohprodukt deutlich aufwerte unter 8% herabgedrückt werden (vgl. die Ausführungsbeispiele 3 und 4), und zwar sowohl in einer als Batch-Kultur a's auch in einer als Fed-batch-Kultur durchgeführten Hauptfermentation. Das Verfahren wird in seiner weiteren Ausgestaltung nun vorteilhaft wie folgt realisiert: Zur Anzucht von Biomasse wird von Konserven des genannten Sterol-Umwandlers M. vaccae ZIMET11094 ausgegangen, die durch Einfrieren unter Zusatz von Glycerol hergestellt worden sind. Die Biomasse-Anzucht erfolgt durch eine oder durch mehrere nacheinander vorgenommene submerse Kultivierungsstufe(n). Die Anzahl der zu durchlaufenden Impfkulturstufen richtet sich nach den Erfordernissen der Maßstabsvergrößerung.

Der Mikroorganismus wird hierbei unter aeroben Bedingungen in Medien kultiviert, die als Kohlenstoffquellen vorzugsweise Glycerol oder Glukose, als Stickstoffquellen vorzugsweise Hefeextrakt, Nitrate, Harnstoff oder Ammoniumsalze sowie weiterhin Mineralsalze verschiedener Zusammensetzungen enthalten. Außerdem sind dem Nährmedium der lernen Impfkultur

vorteilhafterweise noch weitere komplexe Bestandteile wie Sojamehl und/oder Sojahydrolysat beigegeben. Der pH-Wert liogt um den Neutralpunkt Im Bereich von pH 6,7 bis pH 7,4. Die Inkubationstemperatur wird zwischen 25⁰C und 45⁰C, vorzugsweise zwischen 28⁰C und 34°C, gewählt; die Bebrütungsdauer beträgt 10 Stunden bis 80 Stunden, vorzugsweise 3Θ bis 48 Stunden. Mit 2,5% bis 20%, vorzugsv.uise mit 10%, des Volumens der vorausgehenden Impfkulturstiife wird die jeweils nachfolgende Kulturstufe beimpft, wobei in den einzelnen Stufen das Fermentationsmedium nicht unbedingt die gleiche Zusammensetzung wie in der vorausgegangenen Anzuchtstufe aufweisen muß (vgl. hierzu die Ausführungsbeispiele). In diesem Zusammenhang kann es von Vorteil sein, beim Nährmedium dar letzten Stufe der M. vaccae ZIMET 11094-Vorkultivierung in Vorversuchen in an sich bekannter Weise

a) die Biomasse-Ertragskoeffizienten in Abhängigkeit von den bestimmenden Substraten dieses Modiums, so von den freien Kohlenstoffquellen (wie Glukose, Zitraten bzw. Glycerol) und/oder von den freien Stickstoffquellen (wie Nitraten, Ammoniumsalzen bzw. freien Aminosäuren), sowie

b) die maximalen spezifischen Wachstumsraten der Zellpopulation

mit dem Ziel zu ermitteln, aus diesen Daten Anhaltspunkte für solche Dotierungen dieses Mediums zu gewinnen, die gegen Ende der Stufe, d. h. nachdem der pH-Wert ein Minimum durchlaufen hat und die erwähnte pH-Änderung in Richtung Alkalisierung zu verzeichnen ist, zu einer Limitation an freien Kohlenstoffquellen und einer nachfolgenden Limitation der eingesetzten froien Stickstoffquellen im Vorkultur-Medium führen. Wie die diesbezüglichen Vorversuche ergeben haben, läßt sich dieser SoII-Zustand, d. h. der sog. Reifezustand der Impfkultur, immer dann erreichen, wenn das C/N-Verhältnis der in der abschließenden Vorkultivierungsstufe verwendeten Substrate im Bereich von 4:1 bis 32:1 liegt.

Darüber hinaus läßt sich im Ergebnis weiterer durchgeführter Untersuchungen die Feststellung treffen, daß der an der verfahrensgemäßen pH-Änderung erkennbare Reifezustand der Impfkultur vorzugsweise immer dann erreicht ist, wenn die entsprechenden analytischen Nachweise im Medium das Vorhandensein

- einer (Rest-)Konzentration an freier Kohlenstoffquelle S0,1 g/l,

- begleitet von einer (Rest-)Konzentration an freier Stickstoffquelle S 1,0% der maximal verwertbaren Stickstoffmenge, belegen.

Wird die Anzucht der letzten Impfkultur-Stufe im gerührten, belüfteten Fermentor vorgenommen (vgl. Ausführungsbeispiel 4), so ist ihr verfahrensgemäßer Reifezustand insbesondere auch daran erkennbar, daß zusätzlich zu der spezifischen pH-Änderung in Richtung Alkalisierung eine Absenkung des Sauerstoff-Verbrauchs, quantitativ erfaßt über die sog. Sauerstoff-Aufnahmerate, auf wenigstens 2,0% des Maximalwertes eingetreten ist.

Eine auf diese Weise angezüchtete Impfkultur von M. vaccae ZIMET11094 im Reifezustand wird in einem Volumenverhältnis von 5% bis 30%, vorzugsweise von 10% bis 20%, des Volumens des Hauptkultur-Nährmediums zur Inokulation eben dieser Kultur verwendet. Die verfahrensgemäße Führung der letzten Impfkulturstufe diesos Stammes ergibt somit reproduzierbar ein physi alogisch definiertes Inokulum, welches insbesondere hinsichtlich seines pH-Status sowie hinsichtlich seines Limitationszustandes genau charakterisiert ist.

Die Fermentation der Hauptkultur zur Transformation von Sterolen zu ADD sowie die chemische Aufarbeitung der Rohprodukte erfolgen dann in an sich bekannter Weise, vorzugsweise nach den in den Patentschriften DD 248143 (Batch-Kultivierung) und DD 276887 (Fed-batch-Kultivierung) angegebenen Teilverfahren. Dabei werden molare ADD-Ausbeuten höher als 70% der Theorie sowie hohe Rohprodukt-Bildungsgeschwindigkeiten ermöglicht; und der Anteil an unerwünschtem Nebenprodukt AD wird, bezogen auf die Gesamtmenge der gebildeten Produkte ADD und AD, signifikant auf Werte niedriger als 9% heruntergedrückt.

Im Ergebnis dieses Befundes lassen sich die nach diesem Verfahren erhaltenen Rohprodukte (nach Abtrennung der übrigen ' Nebenprodukte und Begleitstoffe) durch einfache Auskristallisation und damit in hohen präparativen Ausbeuten zu einem ADD-Endprodukt reinigen, dessen AD-Anteil bei 1,0% liegt (vgl. Ausführungsbeispiele 3 und 4), d. h., die eingangs genannte Reinheitsforderung kann erheblich unterböte ι werden.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Eine M. vaccae ZIMET 11094-Probe wird 48 Stunden bis 120 Stunden bei 28⁰C als Schrägagarkultur auf 20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar, Aquadest. ad 1000ml, pH7,0; kultiviert.

Mit aliquoten Mengen der erhaltenen Zellkultur je eines Röhrchens werden 500ml-Stehrundkolben mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft:

10g Glukose; 10g Hefeextrakt; 0,5g KH₂PO₄; 0,5g K₂HPO₄; 1,5g (NH₄I₂HPO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01 g FeSO₄ 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7 H₂O; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,0.

Nach Inkubation über 43 Stunden bei 28⁰C auf einer Rotationsschüttelmaschine (180U/min) wird diese Submerskultur im Verhältnis 1:10 zur Beimpfung einer zweiten Submerskultur verwendet, deren Nährlösung eine weitgehend gleiche Zusammensetzung besitzt. Variiert werden jedoch die Konzentrationen an Glukose bzw. Hefeextrakt in folgender Weise (je Variante 3 Stehrundkolben mit je 50ml Nährmedium):

Variante	Cnefeexlrakt	^Glucose
	(g-r¹)	(g-r¹)
1	10	10
2	10	CJl
3	10	20
4	15	20
CJI	20	0
6	20	CJl
7	20	10

Nach 48 Stunden Schütteln bot 28⁹C werden diese SuLmorskulturen im Verhältnis 1:5 zur Beimpfung sterolhaltlgor Hauptkulturen verwondet.

Dazu werdon je Variante jeweils 3 Stehrundkolben mit jo 50 ml Nährmedium folgender Zusammensetzung verwendet: 1,2 g KH₂PO₄; 6,0g K₂HPO₄ · 3H₂O; 1,8g (NH₄IjSO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01g FoSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7H₁O; 0,20g Harnstoff; 4,6g Glukose; 5,0g Dinatriumziuatdihydr at; 20g Sitostorol/Camposterol-Gomisch (ZZW Wittonborgo) sowie 220ml (Schüttvolumen) makroporösos Styron-Divinylbenzon-Polymeros mit Acrylsäuremethylestor-Anteil; Aqua dost, ad 1000ml; pH7,2.

Die Kulturen werden 96 Stunden bei 28°C geschüttolt. Nach beendetor Fermentation wird der o.g. Adsorber durch Siebon von der Nährlösung abgetrennt, durch Waschen mit Aqua dost, von anhaftenden Verunreinigungen befreit und anschließend mit Methanol oluiert (100ml Methanol je Stohrundkolben). In den so erhaltonen Eluaten wird dio Menge der entstandenen Produkte analytisch bestimmt (GC oder DC).

Folgende Produktausbeuton wurden erhalten (Durchschnittswerte üus je 3 Experimenten der jeweils gloichon Impfkultur-Variante):

Variante	Biotrockenmasse	ADD	AD	AD
	(Inoculum)			ADD + AD
	(Ο-Ι-'ί	(g-ΐΊ	(g-r¹)	(%)
1	0,91	3,9	0,5	11,5
2	0,86	5,3	0,6	10,2
3	1,13	4,2	1,7	28,8
4	1,13	6,3	0,7	10,0
5	0,50	0,6	0,2	25,0
6	0,98	6,8	0,9	11,7
7	1,13	4,9	0,4	7,5

Beispiel 2

Die Anzucht der Schrägagarkulturen von M. vaccae ZIMET11094 erfolgt wie in Beispiel 1 angegeben. Mit (liquoten Mengen der erhaltenen Zollkultur je eines Röhrchens werden 500-ml-Steilbrustflaschen mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft:

Glukose 10g; Hefeextrakt 10g; KH₂PO₄ '.,Cg; (NH₄)₂HPO₄ 1,5g; MgSO₄ · 7H₂O0,2g; 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7H₂Q; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,4.

Nach 48stündiger Inkubation bei 29⁰C wird diese 1. Submerskultur im Verhältnis 1:5zur Beimpfung einer 2.Submerskultur (2-l-Steilbrustflasche mit 250 ml Medium) verwendet, deren Nährlösung die gleiche Zusammensetzung aufweist. pH-Verlauf und Glukosekonzentration werden gemessen. Nach vollständigem Verbrauch der enthaltenen Glukose und einer Alkalisierunpsphase von ΔρΗ S 0,3 am Ende der aktiven Wachstumsphase ist die Anzucht der Impfkuitur beendet, und ein Edelstahl-Glas-Rührfermentor von 4,51 Bruttovolumen wird mit 600 ml der 2. Submerskultur beimpft. Das Fermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

15g (MH₄)jSO₄; 24g NaHPO₄-12H₂O; 9g KH₂PO₄; 0,6g MgSO₄-7H₂O; 0,03g FeSO₄-7H₂O; 0,006gZnSO₄-7H₂O; Glukose30g; 30g Magermilchpulver; Adsorber gemäß Beispiel 1; Aqua dest. ad 1600ml; pH6,8.

Nach der Beimpfung wird bei einer Prozeßtemperatur von 31⁰C die relative Gelöstsauerstoffsättigung als pOj-Wert in der gerührten und belüfteten Fermentationsbrühe als 100%-Wort geeicht. Die Einhaltung eines vorgegebenen pOj-Soll-Wertes von 40% wird durch die koinzidierende Variation von Rührung und Bolüftung erreicht. Dabei beträgt die Basisdrehzahl 460 U/min bei unterbrochen*. Luftzufuhr. Bei Unterschreitung der Regelschwelle wird die Drehzahl auf 600U/min erhöht, gleichzeitig der Zuluftweg geöffnet und mit 0,31 Luft je Minute und je Liter Fermentationslösung bis zum Erreichen der Regelschwelle von 40% belüftet.

Die Zugabe des Sterol-Substrates erfolgt durch Zupumpen einer wäßrigen Suspension in zwei Portionen. Dabei werden von Beginn der Fermentation an 15g eines Sitosterol/Campesterol-Gemisches (ZZW Wittenberge) in 400ml Aqua dest. im Verlauf von einer Stunde zugepumpt. Weitere 15g des gleichen Gemisches in 400 ml Aqua dest. sowie 2,5ml dos nichtionischen Tensides Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Addukt des N,N'-Tetra(-Oxy-)-propylpropyol)-N'-(2-oxyprcpyl)-diethylen-triamin in 100ml Aqua dest. werden zwischen der 22. und der 23. Fermentationsstunde ebenfalls kontinuierlich zugepumpt, so daß die Gesamtmenge an Sterol 30g bei einem Nettovolumen von 3I im Fermentor beträgt. Als Antischaummittel wird das Silikonöl Antaphron (Chemiewerk Nünchritz) eingesetzt. Durch Zudosierung von 1 η NaOH bei Säuerung wird ein unterer pH-Grenzwert von 5,6 eingehalten.

Die Fermentation wird nach 96 Stunden beendet. Der im Gesamtansatz enthaltene Adsorber wird durch Sieben abgetrennt und erschöpfend eluiert.

Das Eluat enthält 17,3g ADD und 1,7g AD. Damit beträgt die auf das eingesetzte Sterol bezogene Ausbeute an ADD 83,6Mol-%, die ADD-Produktbildungsrate 1,44g ADD je Liier Nährbrüho und je 24 Stunden und der Anteil an AD, bezogen auf die Gesamtproduktmenge an ADD und AD, liegt bei 8,9%.

Beispiel 3

Anzucht und Vermehrung des Stammes M. vaccae ZIMET11094 bis zur ersten Submerskultur erfolgen wie unter Beispiel 1 angegeben.

Mit dieser ersten Submerskultur wird in einer 2-l-Steilbrustflasche eine zweite Submerskultur im Verhältnis 1:10 beimpft, deren Nährmedium folgende Zusammensetzung hat:

10g Glukose; 12g Hefeextrakt; 0,5g KH₂PO₄; 0,5g K₂HPO₄; 1,5g (NH₄)₂HPO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ 7H₂O; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,0.

Der Verlauf des pH-Wertes während der Kultivierung bei 28⁰C wird kontrolliert. Nach 42stündigem Schütteln ist die am Ende der aktiven Wachstumsphase zu beobachtende Alkalisierung von dem Minimalwert von pH = 6,4 bis auf einen pH-Wert von 7,2 fortgeschritten. Mit 50CmI dieser Impfkultur wird ein Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen beimpft. Das Fermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:

43 g «ines Steroiijumischos mit oincm Gesamtsterolgohalt von 93,5% (ZZW Wittonborgo); 700ml (Schütlvolumon) dee Absorbers aus Beispiel 1; 6,5g des nichtionischen Tensidos aus Boispiol 2; 15g Glukose; 10,75g Dinetrlumnltratdihydrat:

2,0g Sojamehl; 0,44g Harnstoff; 4,42g(NH₄)JSO₄; 2,95g KH₂PO₄; 14,9gK₂HPO₄ 3H₂O₁O₁SgMgSO₄ · 7H₂O · 0,03g FeCI, CH₂O; 0,005g ZnSO, · 7H₂O; Aqua dest. ad 1700ml; pH6,9.

Das Startvoliimon einschließlich Vorkultur und Adsorber beträgt 2,31. Die Führung der Fermentation bozüglich Rührung und Belüftung orfolgt wio unter Beispiel 2 angegeben. Dabol beträgt die Basisdrehzahl 450 U/min bei unterbrochener Luftzufuhr, die Sprungdrehzahl 700U/min boi einer Bolüftung mit 2I Luft je Liter Formentntionslösung und Minute bis zum Erreichen des pOj-Schwollonwertes von 25%.

Der Verlnu' dor Fermentation wird anhand des pH-Vorlaufs sowie anhand der Realisiorungshäufigkoit und/oder des Realisierungsniveaus der Stollgliedtätigkeit dor p0₂-Soll-Wort-Rogolung kontrolliert. Nach 21 Stunden worden bis zur 91. Stunde 0,17 g/h Glukose sowio0,0Bg/h (NH₄I₂SO₄ als wäßrigo Lösungon kontinuierlich nachdosiert. Gloichloufond dazu erfolgt zwischen 21 Stundon und 30 Stunden die Zugabe von '^1,5g dos gloichon Sterolgomischos in diskreten Gaben von je etwa 7 g bis 8g.

Das Endvolumon nach 91 Stumf. .·,' *· .nentation beträgt 2,41 (ohne Probonvolumon). Als pH-Schwellwort wird 7,0 gewählt. Die Zudosiorung von Natronlauge zur Einhaltung dieses Schwellenwertes dauert von dor 50. Stunde bis zum Abbruch der Fermentation nach 91 Stunden an. Zur Aufarbeitung des gesamten Ansatzes worden sämtliche zur Prozeßkontrolle entnommenen Probon und Vorläufe voreinigt. Dio Abtrennung dos Adsorbers orfolgt durch Filtration.

Im Filtrot wird die nicht umgesetzte Storolmengo analytisch bostimmt. Der Adsorber wird durch Waschen von anhaftenden Verunreinigungen bofroit und mit 4,91 Methanol erschöpfend eluiort. Im Koholuat wird die Monge dor entstandenen Produkte ebenfalls analytisch bostimmt. Nach Abdestillioren dos Lösungsmittel bleiben 31,0g eines hochviskoson, braunen Rückstandes zurück (1. Rohprodukt). Daraus worden nach einer bereits dargologton Methode (DD 248364) die C₂₂-Alkoholo sowie weitere unerwünschte Begloitprodukto entfernt.

Dio in insgesamt 23,5 g dos zweiten Rohproduktes vorbliobenon Mengen on ADD und AD werdon wiederum analytisch bestimmt.

Die entsprechenden Werto sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.

	Anal. Worte	I.Rohprodukt	2. Rohprodukt
	(Endprobo)
	g/i	9	g
Masse			23,5
ADD	7,7	20,1	19,8
AD	0,9	1,7	1,6
1,4-C₂₂-AIk.	0,96	2,3	-

Die im ersten Rohprodukt erreichte analytische Produktbildungsrato für ADD beträgt danach 2,12 g ADD/I χ 24 h, der AD-Anteil 7,8%.

Der nach der C₂₂-Alkohol-Abtrennung verbleibende braune, hochviskose Rückstand wird unter Erwärmen in '/7 der der analytisch bestimmten Gesamtmenge an ADD und AD entsprechenden Menge Butylacetat gelöst. Unter Rühren und gleichzeitiger Zugabe der gleichen Menge an Cyclohexan kristallisiert das ADD/AD-Gomisch beim Erkalten zu einem dicken Kristallbrei aus. Nach Verdünnen mit Cyclohoxan-Diothylether (1:1) werden die Kristalle abgesaugt, mit dem gloichon Lösungsmittolgomisch gewaschen und anschließend getrocknet.

Es werden 16,9g Kristalle erhalten, die 90% ADD und weniger als 1 % AD enthalten. Die Ausbeute an kristallisiertem ADD beträgt 77,5%. Die präparative Gesamtausbeute an ADD, bezogen auf umgesetztes Sterol, liegt boi 39% (56,6% d. Th.).

Beispiel 4

Die Anzucht von Mycobacterlum vaccae ZIMET11094 bis zur ersten Submerskultur erfolgt analog zu Beispiel 1.

Die zweite Submerskultur wird in einem gerührten und belüfteten Edolstahl-Glas-Fermentor mit 4,51 Bruttovolumen fermentiert.

Das Nährmedium der zweiten Submerskultur hat folgende Zusammensetzung:

10g Glukose, 20g Hefeextrakt; 0,5g KH₂PO₄0,5g K₂HPO₄; 1,5g (NH₄I₂HPO₄; 0,2g MgSO₄ · 7H₂O; 0,01 g FeSO₄ · 7H₂O; 0,002g ZnSO₄ · 7H₂O; Aqua dest. ad 1000ml; pH7,2.

2 Liter dieses Nährmediums werden mit 200ml der ersten Submerskultur beimpft.

Nach der Beimpfung wird bei einer Prozeßtemperatur von 31 °C dio rel? ο Gelöstsauerstoffsättigung als pO₂-Wert in der gerührten und belüfteten Fermentationsbrühe als 100-%-Wert geeicht, /.is Regelschwelle für den pO₂-Wert werden 75% eingestellt. Die Basisdrehzahl beträgt 500U · min"' bei unterbrochener Luftzufuhr. Bei Unterschreitung der pO₂-Regelschwelle wird die Drehzahl auf 650U min"¹ erhöht, gleichzeitig der Zuluftweg geöffnet und der Ansatz mit einer Luftmenge von

11 · Γ¹ · min"¹ belüftet. Die Anzahl der parallel erfolgenden Zuschaltungen von Rührung und Belüftung je Zeiteinheit wird elektronisch gezählt und als Meßgröße für die Bestimmung der relativen O₂-Verbrauchsrate benutzt.

Nach 40 bis 41 Fermentationsstunden fällt dieser Wert auf ca. Vw des Maximalwertes; gleichzeitig ist eine Alkalisierung um etwa ΔρΗ = 0,4 zu beobachten. Die Kultivierung der Impfkultur wird nach 41 Stunden beendet.

Zur Steroltransformation wird ein Edelstahl-Glas-Rührfermentor mit 4,51 Bruttovolumen mit 500ml der zweiten Submerskultur beimpft. Die Zusammensetzung der Nährlösung ist analog zu der in Beispiel 1 angegebenen.

Die technische Durchführung der Fermentation orfolgt analog zu Beispiel 1. Dabei wird kein weiteres Sterol nachdosiert. Die Fermentation wird nach 70 Stunden beendet.

Dio orziolton Er(iebnisso sind in der folgenden Tabolle aufgoführt.

	Anal. Worte	I.Rohprodukt	2. Rohprodukt
	(Endprobo)
	g/i	g	g
Masso	-		22,6
ADD	7,5	21,1	19,8
AD	0,6	1,7	1,7
1,4-C₂₂-AIk.	0,8	3,1

Dio Im ersten Rohprodukt erroichte analytische Produk'.bildungsrate für ADD beträgt danach 2,89g.ADD - Γ¹ 24h ',der AD-Antoil /,46%.Die weitero Aufarbeitung wird analog zu Beispiel 3 fortgeführt. Es worden danach 17,4g Kristalle erhalten, die 96,6% ADD und wenigor als 1 % AD enthalten. Dio Ausbouto der Kristallisation an ADD beträgt 85%. Die präparative Gosamtausbeute, bozogen auf umgesetztes Storol, liegt bei 49,4Gew.-%, entsprechend 71,6% d. Th.

In Betracht gezogene Druckschriften: DD 279901 DD 277697 DD 291342 DD 291341

Claims

1. Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Sterolen zu Androst2-1.4-dien-3,17-dion (ADD) mittels Inkubation des Mikroorganismen-Stammes Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 unter aeroben Bedingungen in den Fermentationsstufen Vorkultur und submerser Hauptkultur, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Hauptkultur-Fermentationsmedium an sich bekannter Zusammensetzung jeweils mit einer Impfkultur des genannten Stammes inokuliert, die einer Vorkultur entnommen ist, in welcher eine pH-Änderung in Richtung Alkalisierung von mindestens ΔρΗ = 0,3 als Ausdruck für das Auftreten von Limitationen sowohl an frei verwertbaren Kohlenstoff- als auch an frei verwertbaren Stickstoffquellen eingetreten ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fermentationsmedium oben genannter Spezifizierung mit einer Impfkultur von M. vaccae ZIMET1 iO94 inokuliert, die einer Vorkultur entnommen ist, nachdem in dieser eine pH-Änderung obiger Beschaffenheit als Ausdruck für das Auftreten einer Kohlenstoff-Limitation vor einer Stickstoff-Limitation eingetreten ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fermentationsmedium oben genannter Spezifizierung mit einer Impfkultur von M. vaccae ZIMET 11094 inokuliert, die einer Vorkultur entnommen ist, nachdem in dieser eine pH-Änderung obiger Beschaffenheit als Ausdruck für das Erreichen eines durch die Relationen

- Konzentration an freier Kohlenstoffquelle Ss 0,1 g/l und

- Konzentration an freier Stickstoffquelle S 1,0% der maximal verwertbaren Stickstoffmenge charakterisierten Systemzustandes eingetreten ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fermentationsmedium oben genannter Spezifizierung mit einer Impfkultur von M. vaccae ZIMET11094 inokuliert, die einer Vorkultur entnommen ist, in welcher zusätzlich zur pH-Änderung obiger Beschaffenheit eine Absenkung des Sauerstoff-Verbrauchs auf äi 2,0% des Maximalwertes eingetreten ist.