DD276887A1

DD276887A1 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von 1,4-androstadien-3,17-dion aus sterolen

Info

Publication number: DD276887A1
Application number: DD30108587A
Authority: DD
Inventors: Birgit Gottschaldt; Hans-Helmut Grosse; Claere Hoerhold; Lutz Blei; Monika Wetzker; Gunter Plonka; Wilja Werner; Erhard Kropik
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1987-03-25
Filing date: 1987-03-25
Publication date: 1990-03-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Steroltransformation durch zugefuetterte Fermentation, wobei durch fermentativen Seitenkettenabbau als Hauptprodukt 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) entsteht, das als Ausgangssubstanz fuer die Herstellung von Steroidwirkstoffen dient. Die Erfindung basiert auf der Zudosierung von direkt metabolisierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquellen sowie von Sterol zur aktiven Beherrschung von Dauer und Intensitaet der Steroltransformationsphase. Dies wird dadurch erreicht, dass die Struktur des p H-Zeitprofils (Minima, Abfallgeschwindigkeit) bzw. das Zeitprofil der Stellglied-Realisierungshaeufigkeit zur diskreten pO2-Sollwertregelung als Indikatoren fuer den Beginn und die Intensitaet der Dosierungen benutzt werden. Dabei werden als Massnahmen fuer die untere Begrenzung des p H-Wertes die Laugendosierung oder die angepasste Reduzierung der Dosierungen zur Nichtunterschreitung der p H-Untergrenze einbezogen. Die dargestellte Fuehrung des Verfahrens ergibt hohe Raum-Zeit-Ausbeuten des Produktes ADD infolge hoher und ueber einen langen Zeitraum konstanter Steroldurchsatzraten.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein \ .ahren zum mikrowellen Seitenkettenabbau von Sterolen zu 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD). Diese Verbindung ist Ausgangssubstcnz für die Herstellung von Steroidwirkstoffen. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Industrie und in der Biotechnologie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Wie bereits vorgeschlagen₍wird die Herstellung von ADD und AD als Intermediärprodukte des Sterolabbaues durch mikrobielle Formentation vorgenommen. Dabei worden Mycobacterium vaccae NRRL B-3683 sowie danus isolierte Selektanten verwendet. Das Formontationsmedium enthält zu Fermentationsbeginn jeweils freie bzw. komplexe Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphatquellen sowie oin Sterol bzw. Sterolgemisch bis 50g/l, einen Adsorber vom Typ eines organischen Polymeren, der polaro Gruppen, vorzugswoiso Acrylsäurederivate, enthält und weiterhin ein nichtionisches Tensid aus oür Gruppe der Polyothylonoxid-Polypropylenoxid-Blockcopolymoren oder auch aus dor Gruppe der Polyothylenoxid-Polypropylenoxid-Addukto dos N,N"-Totra-(-oxypropylpropyol)-N'-(2-oxypropyl)-diethylon-triamins. Der Fermontationsprozeß wird im Falle der ADD-Forrnontation so im Rührformontor durchgeführt, daß dio technischo Realisierung der pO₂-Sollwertregelung (bei einem niisboutohogünstigerulon Niveau dor rolativon Golöstsauorstoffkonzentration) über die koinzidieronde Variation von Rührung und Belüftung in dor Woiso orfolgt, daß Schäumiing und Entmischung dor Kulturlösung als Störfaktoren dor roproduzierbaren Prozoßfüluung ausgoschaltot wordon.

Dor Biotransformation von Storolon bzw. Storolgomischen mittols Chargenformontation haftet der Nachtoil an, daß der Durchsatz dos Transformationssubstratos pro Zeiteinheit und damit dio Raum-Zoit-Aiisboute nur von den gewählten Anfangsbedingungen (Komposition dos Formentationsmediums) bestimmt werden, da diese Mongo und physiologischen Zustand dor mikrobiollon Biomasse und somit die Länge des Formontationsabschnitts mit hoher Produktbildungs- bzw. Transformationsrato fostlogon. Das besondoro Morkmal dor Chargenfermentation bosteht somit darin, daß auf die aktive Beeinflussung dor Produktionsbildungsrato und dor Dauer dos Transformationsprozessos verzichtet wird.

Für die Chargenfermentat^:on »-'in Sterolen zu ADD beträgt der bisher erreichte Maximalwert der durchschnittlichen ADD-Produktbildungsrate 1,79Gr .. ·· 4DD pro Liter Kulturlösung in 24 Stunden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung beinhaltet das Ziel, hohe Sterolmengen pro Zeitenheit in ADD umzusetzen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Umwandlung von Sterolen in ADD zu beschreiben, bei dem die Nachteile der bekannten technischen Lösungen vermieden werden.

Erfindungsgemäß wird das isalisiert, durch die Zudosierung von direkt metabolisierbaren Nährstoffen zur Fermentationslösung während der Transformationsphase, insbesondere von Kohlenstoff-Quellen wie beispielsweise Glukose den Stickstoff- und Phosphorsubstraten sowie den als Ausgangssubstrat eingesetzten Sterolen bzw. Sterolgemischen in Abhängigkeit vom pH-Wert und/oder des pO₂-Wertes sowie und/oder der Konzentration des jeweiligen Substrates im Fermentationsmedium. Dabei haben die Spezifik des verwendeten Adsorbers bzw. des Tensids untergeordnete Bedeutung. Das Verfahren wird in seinem Grundzug wio folgt durchgeführt:

Sterole wie Sitosterol, Cholesterol, Campesterol, Stigmasterol bzw. Ergosterol oder Gemische aus wenigstens zwei dieser Sterole werden in Konzentrationen von 1 Gramm je Liter bis 50 Gramm je Liter als Sterolpräparation aerob mit Mikroorganismen fermentiert, die zur Steroltransformation unter Bildung von ADD befähigt sind, wie z. B. Stämme der Gattung Mycobacterium, insbesondere Mycobacterium vaccae IMET SK 113 eingesetzt. Die Sterolpräparationen werden entweder nach bekannten Verfahren (Lyophilisierung bzw. Vermählen, beispielsweise in Korundmühlen) oder nach dem in unserer Anmeldung DD 232166 beschriebenen Sprühtrocknungsverfahren gewonnen. Es wird in Medien fermentiert, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalze enthalten. Die Fermentation erstreckt sich über 24 Stunden bis 192 Stunden und wird bei 20⁰C bis 45°C bei pH-Werten im Bereich von pH 4 bis pH 8 durchgeführt. Man setzt dem Fermentationsansatz von Beginn an oder nach einem Zeitintervall bis zu 48 Stunden bis zu 10 Gramm je Liter eines Tensids sowie einen Adsorber in einem Mengenverhältnis von 2 Gramm je Liter bis 200 Gramm je Liter zu. Als Adsorber bzw. Tensid sind die von uns bereits beschriebenen oder andere in der Technik bekannte Substanzen gemeint. Der Adsorber wird nach beendeter Fermentation mittels an sich bekannter Trennmethoden wie Filtration, Zentrifugation oder Separation von der ausfermentierten Kulturlösung einschließlich Biomasse und ggf. nicht umgesetztem Sterol abgetrennt. Anschließend wird das am Adsorber befindliche Produkt ADD zusammen mit dem Begleitprodukt AD durch Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Methanol, eluiert und durch an sich bekannte Verfahrensschritte wie Säulenchromatographie, präparative HPLC oder Umkristallisation von Nebenprodukten wie21-Hydroxy-20-mothyl-4-pregnen-3-on und/oder 21-Hydroxy-20-methyl-1,4-pregnadien-3-on gereinigt. Während der Fermentation wird die untere Grenze des pO₂-Wertes, die größer oder minimal gleich 10% gewählt wird, mittels Sollwertregelung über die Stellgrößen Rührerdrehzahl und Luftmenge eingehalten. Das Vorgehen zur Festlegung des Regimes von Belüftung und Umwälzung der Fermentationslösung im Zusammenhang mit dem Erreichen der pOyUnteryrenze in der Wachstumsphase ist auch bereits beschrieben worden.

Ab Fermentationsbeginn werden der pH-Wert, der pO₂-Wert und die Realisierungshäufigkeit der Stellgliedtätigkeit der pO₂-Sollwertregelung in an sich bekannter Weise gemessen und registriert. Mit der Realisierungshäufigkeit der Stellgliedtätigkeit der pO₂-Sollwertregeluiig ist die Anzahl der Drehzahlaufschaltungen und der gegebenenfalls damit gleichlaufenden bolüftungsintervalle je Stunde gemeint.

Das Ende der mikrobiellen Wachstumsphase unter bevorzugter Verwertung der Startdepots an direkt metahilisierbaren Nährstoffen, insbesondere der C-Quellen, wird verfahrensgemäß durch den Übergang der Fermentationskultur in die rasche Alkalisierung und/oder den Abfall der Stellglied-Realisierungshäufigkeit zur pO₂-Sollwertregelung angezeigt. Somit liegen als Indikatoren für den Beginn der Substratnachdosierur g das pH-Minimum und/oder das Maximum der Stellglied-Realisierungshäufigkeit in der ersten Fermentationsphase vor.

Der Start der Nachdosierung von Substraten erfolgt im Intervall zwischen dem Zeitpunkt des pH-Minimums bzw. des Maximums der Stellglied-Realisierungshäufigkeit und dem Zeitpunkt, wenn ein pH-Anstieg um 0,1 bis 1 (bezogen auf das pH-Minimum) und/oder ein mindestens 20%iger Abfall der Stellglied-Realisierungshäufigkeit (bezogen auf deren Maximum) "rfolgt ist. Es werden direkt metabolisierbare Kohlenstoff-Substrate wie Glukose oder Saccharose und Stickstoff- bzw. Phosphat-haltige Verbindungen sowie Sterol nachdosiert. Im weiteren Ausbau des Verfahrens erfolgt die Dosierung der Substrate bis zum Erreichen der unteren pH-Schwelle im Bereich zwischen 4,5 und 6,5 so, daß der pH-Abfall maximal 0,1 pro Stunde bsträgt. Mit dem Erreichen des pH-Schwellenwertes, beispielsweise pH 5,8, wird die Dosierung so vermindert, daß kein weiterer Anfall des pH-Wertes eintritt, bzw. es wird bei unveränderter Dosierungslänge zur Aufrcchterhaltung des Schwellenwertes in an sich bekannter Weise Lauge zudosiert. Zur Beendigung der Fermentation werden die Substratdosierungen eingestellt und der Ansatz maximal 24 Stunden weitergeführt. Als Indikatoren für die Ausfermentierung dienen wahlweise das Durchlaufen eines pH-Minimums oder ein mindestens 20%igor Abfall der Stellglied-Realisierungshäufigkeit, bezogen auf den Mittelwert der Dosierungsphaso, oder die direkte Messung des Zeitverlaufes der Substratkonzentrationen.

Die oingosetzto Adsorbormonge wird so hemesson, daß die eingestellte) Produktbildungsrate während der gesamten Formontaticnszoit ohno Beeinträchtigung durch Adsorptionskapazität bzw. -geschwindigkeit realisiert wird. Das Vorführern wird vorteilhaft wio folgt ausgeführt: h) Impfkultur

Für dio Fermentation zu ADD wird vorzugswoiso Mycobacterium vaccae IMET SK 113 odor eine der daraus inzwischen vorfügbaron Solektanton vorwondot. Die Kultivierung erfolgt in Modion, die als Kohlenstoffquelle beispielsweise Glycerol, Glukosn, Saccharose Starke und/odor Molasse usw., als Stickstoffquello beispielsweise Hefeextrakt, Harnstoff, Ammoniumsalze, Maisquellwasser, Pflanzonmohlo und/odor andero komploxo Medienbestandteile (wie z. B. Fleischextrakt, Hydrolysate usw.) sowio außordom Mineralsalze vorschiodonor Zusammensetzungen enthalten. Der pH-Wert liegt um den Noutralpunkt. Dio Bobrütungstemporatur beträgt vorzugsweise 20°C bis 45⁰C, die Bebrütungsdauor 12 bis 77 Stunden. Mit 2,5% bis 20% dor so orhaltonon Submorskultur wird das Formontationsmodium boimpft, das die gleiche odor oine andere Zusammonsotzung wio dio Impfkultur habon kann.

b) Fermentation

Dem Fermentationsmedium, das neben Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorsubstraten, Mineralsalze enthält, wird feuchter Adsorber zweckmäßigerweise bereits vor der Sterilisation zugegeben. Die Adsorbermenge liegt zwischen 2 Gramm je Liter und 200 Gramm je Liter. Die Menge ist sowohl von der Kapazität und der Adsorptionsgeschwindigkeit des ausgewählten Adsorbers als auch von der eingesetzten Sterolmenge und der damit zu erwartenden Produktmenge abhängig. Als Adsorber kommen vorteilhaft Copolymerisate aus Acrylsäureester, Ethylvinylbenzen und Divinylbenzen mit einer Korngröße oberhalb 0,4 mm zum Einsatz.

Die Sterolpräparation wird als feinverteilte Suspension als Gesamtmenge (1 Gramm je Liter bis 50 Gramm je Liter) oder portionsweise sofort oder zeitlich versetzt noch dem Beimpfen zugegeben. Auch eine Sterilisation der Gesamtmenge mit dem Medium ist möglich.

Das Tensid wird in Mengen etwa von 0,5 G: amm je Liter bis 10 Gramm je Liter entweder zusammen mit dem Sterol bzw. in Form einer Sterol-Tensid-Präparation oder ebenfalls als Gesamtmenge oder portionsweise sofort oder zeitlich versetzt nach dem B'jimpfen zugegeben.

Die Prozeßkontrolle zur ADD-Bildung bzw. zum Verbrauch der Sterole erfolgt durch bekannte analytische Verfahren, wie z.B.

durch HPLC-, GC, DC-Bestirnmung der durch Butylacetat aus dem Fermentationsmedium extrahierten Sterole als auch durch HPCL-, GC- oder DC-Bestimmung der vom Adsorber eluierten Produkte. Hierzu wird eine Probe aus dem Fermentationsar.satz entnommen, der Adsorber gegebenenfalls durch Sieben abgetrennt, mit Wasser von anhaftenden Bakterien und Mediumsbestandteilen gewaschen und nutschenfeucht ausgewogen. Eine definierte Menge wird mit 80- bis 100%igem Methanol eluiert. Durch HPCL-, GC- oder DC-Trennung, gekoppelt mit UV-Messung, kann als Produktgemisch, das vorwiegend aus ADD und/oder AD sowie den entsprechenden C₂₂-Alkoholen (21 -Hydroxy^O-methyl^-pregnen-S-on und/oder 21 -Hydroxy-20-methyl-1,4-pregnadien-3-on) als Nebenprodukten besteht, quantitativ analysiert werden.

Die technische Durchführung der Fermentation erfolgt so, daß das /\bsinken des pGyWertes etwa unter dem Schwellenwert von 10% verhindert wird, indem im Rührfermentor diskrete Drehzahlauischaltungen begleitet von Belüftungsphasen als Stellmaßnahmen realisiert werden. Dieses technische Regime kommt dem Belangen der Minimierung des Adsorberabriebes, der natürlichen Schaumbekämpfung und damit der Verhinderung der Entmischung der Kulturlösung entgegen.

In der bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren so durchgeführt, daß maximal 5 Stunden nach dem Durchlaufen des pH-Minimums kontinuierlich Glukose bzw. Saccharose und Ammoniumsulfa* bzw. Harnstoff im Kohlenstoff-Sticksioff-Verhältnis bis maximal 10 dosiert werden. Gleichlaufend erfolgt die diskrete oder kontinuierliche Zugabe von bis zu 50 Gramm Sterol je Liter z. B. in diskreten Gaben von 2 bis 10 Gramm je Liter. Die Dosierungsgeschwindigkeit der Substrate wird so gewählt, daß der pro Stunde eintretende pH-Abfall nicht größer als 0,1 wird.

Die verfahrensger.iäße Lösung hat folgende Vorteile:

Durch die Entwicklung des vorliegenden Verfahrens zur Steroltransformation mittels zugefütterter Fermentation, welches während langer Abschnitte der Prozeßdauer durch die Nachdosierung von frei metabolisierbaren Nährstoffen bzw. Sterol gekennzeichnet ist, werden hohe Raum-Zeit-Ausbeuten des Produktes ADD infolge hoher und über einen langen Zeitraum konstanter Steroldurchsatzraten erreicht.

Weiterhin wird durch die Zugabe aller Substrate in Abhängigkeit vom pGySollwert ein extensiver Sauerstoffeintrag und damit die Erhöhung des Adsorberabriebes und weitere Maßnahmen zur Schaumbekämpfung bzw. Verhinderung der Entmischung der Kulturlösung vermieden.

Als zusätzlicher Vorteil wird die Variabilität bei der Auswahl von Adsorber bzw. Tensid gesehen.

Ausführungsbeispiele

1. Mycobacteriumvaccae (IMETSK 113) wird auf Schrägagar folgender Zusammensetzung 48 Stunden bis 120 Stunden bei 28⁰C kultiviert:

20g Glycerol, 5g Bacto-Pepton, 3g Fleischextrakt, 15g Agar-Agar ad 1000 ml Aqua dest.; pH 7,0. Mit den entsprechenden Zellen je eines Röhrchens werden 500-ml-Stehrundkolben mit je 50ml Nährlösung folgender Zusammensetzung beimpft:

10g Glucose, 10g Hefeextrakt, 0,5g KH₂PO₄, 0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄I₂HPO₄, 0,2g MgSO₄ · 7H₂0,0,01 g FeSO₄ · 7H₂O, 0,002g ZnSO₄ 7H₂O, Aqua dest, ad 1 000ml; pH 7,0.

Nach 36stündigem Schütteln bei 28⁰C wird diese erste Submerskultur bei einem Impfverhältnis von 1: 10.*ur Beimpfung einer zweiten Submerskultur verwendet, deren Nährlösung folgende Zubammensetzung hat:

20g Glucose, 10g Hefeextrakt, 0,05g KH₂PO₄,0,5g K₂HPO₄,1,5g (NH₄I₂HPO₄,0,2g MgSO₄ · 7H₂0,0,01 g FeSO₄ · 7H₂0,0,002g ZnSO₄ · 7H₂O, Aqua dest. ad 1000ml; pH 7,0.

Nach42stündigom Schütteln bei 28"C wird ein Edolstahl-Glas-Rührfermentormit4,5l Bruttovolumen mit 500 ml der zweiten Submorskultur beimpft. Dio Formontationslösung hat folgende Zusammensetzung:

-λ- 27S887

43g eines Sterolgemisches mit einem Gesamtsterolgehalt von 92%, 10,75g Glucose, 10,75g Na₃C₆O₄H₅ · 2H₂0,0,44g Harnstoff, 2,95g KH₂PO₁,14,90g K₂HPO₄ · 3H₂O,4,42g (NH₄I₂SO₄,0,5g MgSO₄ · 7H₂O,0,03g FeSO₄ · 7H₂0,0,005g ZnSO₄ · 7 H₂0,400g nutschenfeuchter Adsorber EP60 (CKB Bitterfeld) sowie 6,5g des nichtionischen Tensids B9 (VEB Chem.

Korn. BUNA), Aqua dest. ad 1700ml; pH 7,0.

Das Startvolumen einschließlich Vorkultur und Adsorber beträgt 2,31.

Nach der öeimpfung wird bei einer Prozeßtemperatur von 31⁰C die relative Gelöstsauerstoffsättigung als pO₂-Wert in der gerührten und belüfteten Fermentationsbrühe als 100%-Wert geeicht. Als Regelschwelle für den pO₂-Wert werden 25% eingestellt. Die Tasisdrehzahl beträgt 450min'¹ bei unterbrochener Luftzufuhr. Bei Unterschreitung der pO₂-Regelschwelle wird die Drehzahl iuf 700min"' erhöht, gleichzeitig der Zuluftweg geöffnet und der Ansatz mit einer Luftmenge von 21 je Liter Fermentationsbrühe und Minute bis zum Erreichen der Regelschwelle von 25% belüftet.

Der Verlauf der Fermentation wird kontrolliert anhand des pH-Verlaufes oder der Realisierungshäufigkeit bzw. des Realisierungsniveaus der Stellgliedtätigkeit der pO₂-Sollwertregelung.

Nach 22h werden nach Durchlaufen dos pH-Minimums 0,73g · h"' Glucose sowie 0,6¹^g h"' (NH₄I₂SO₄ kontinuierlich nachdosiert.

Gleichlaufend dazu erfolgt die Zugabe von 21,7g des gleichen Sterolgemisches in diskreten Gaben von etwa je 7 bis 8g. Die Nachdosierung von Substraten wird abgebrochen nach 46stündiger Fermentation. Das Endvolumen beträgt 2,71. Die Ausfermentation der frei metabolisierbaren C- bzw. N-Quellen und damit der Endpunkt der Fermentation ist nach Durchlaufen des pH-Minimums nach 71 h erreicht. Die Ausbeute an ADD liegt bei 9,4g/l. Daneben werden 1,12g/l AD sowie 2,04g/l A'^p4-C₂₂-Alkohol analytisch nachgewiesen. Die Produktbildungsrate liegt bei 3,2g ADD/I - 24h.

Die Anzucht von Mycobacterium vacca<* IMET SK113 erfolgt analog zu Beispiel 1. Die Kultivierungsdauer der /weiten Submerskultur wird verlängert auf 48 Stunden. Die Bedingungen zu Anfang der Ferm" 'ation im Edelstahl-Glas-Rührfermentor hinsichtlich Beimpfung, Sterolmenge, Zusammensetzung des Ferrm iionsmediums, Prozeßtemperalur und anfänglicher Prozeßkontrolle werden analog zu Beispiel 1 eingehalten. Nach Du laufen des pH-Minimums bei 22 Stunden werden Glucose mit einer Geschwindigkeit von 1,04g · h"¹ und (NH₄I₂SO₄ mit 0,31 · h"' nachdosiert. Wiederum erfolgt gleichlaufend dazu die Zugabe von insgesamt 21,7g Sterolgemisch in drei Gaben von i * 7 bis 8g.

Die Zudosierung der Substrate wird abgebrochen nach 46stündiger Fermentation. Das Ende dss Prozesses wird angezeigt durch Auftreten eines scharfen pH-Minimums zwischen 50. und 55. Fermentationsstunde.

Die Ausbeute an ADD liegt hiernach 55 Stunden bei9,4g/l. Daneben werden 1,68 g/l ADD sowie 1,72 g/l A^M-C₂₂-Alkohol analytisch nachgewiesen. Die Produktbildungsrate beträgt 4,1 g ADD/I · 24 h.

Claims

1. Verfahren zur mikrowellen Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion aus Sterolen durch aerobe Fermentation mit Hilfe von Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium im Temperaturbereich von 20⁰C bis 45⁰C, bei pH-Werten von pH4 bis pH8 über einen Zeitraum von 24 Stunden bis 192 Stunden, gekennzeichnet durch die Nachdosierung von sowohl Sterolen als auch Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phocphorsubstraten in Abhängigkeit von pH-Wert und/oder des pO₂-Wertes und/ oder der Konzentration des jeweiligen Substrates im Fermentationsmedium.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch den Beginn der Nachdosierung spätestens

5 Stunden nach dem Durchlaufen des pH-Minimums bzw. dem Anstieg des pH-Wertes um pH 0,1 bis pH 1.

3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch den Beginn der Nachdosierung spätestens 5 Stunden nach dem Abfall der Stellglied-Realisierungshäufigkeit der p0₂-Sollwertregelung um 20%, bezogen auf das Maximum.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch die Nachdosierung von Kohlenstoff-, Stickstoff- und Phosphorsubstraten sowie Sterolen maximal entsprechend der Abnahmegeschwindigkeit.

5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet durch den Beginn der Nachdosierung spätestens zum Zeitpunkt, an dem die gemessene Konzentration des jeweiligen Substrates auf ein Zehntel des Startwertes abgefallen ist.

6. Verfahren nach Punkt 1, 2,3,4 und 5, gekennzeichnet durch die Substratnachdosierung in einem solchen Maße, daß sie zu einem maximalen pH-Wert-Abfall und pH0,1 pro Stunde führt und mit dem Erreichen des unteren pH-Schwellenwertes, bevorzugt aus dem Bereich pH4,5 bis pH 6,5, die Laugezudosierung und/oder die Reduzierung der Substratdosierraten auf das Niveau einsetzt, das die Einhaltung des pH-Schwellenwertes gewährleistet.

7. Verfahren nach Punkt 1, 2,3, 4, 5 und 6, gekennzeichnet durch den Einsatz von Sitosterol, Cholesterol, Campesterol, Stignasterol und Ergosterol oder Gemischen aus mindestens zwei dieser Sterole.

8. Verfahren nach Punkt 1,2,3,4,5,6 und 7, gekennzeichnet durch Bestimmung des Zeitpunktes der Ausfermentierung der zugesetzten Kohlenstoff-Substrate nach dem Abbruch der Zudosierung von Substraten entweder in Abhängigkeit vom Durchlaufen des pH-Minimums oder einem mindestens 20%igen Abfall der Stellglied-Realisierungshäufigkeit der pO₂-Sollwertregelung oder vom Abfall der Substratkonzentrationen für Sterol und freie Kohlenstoffquellen auf den direkt gemessenen Wert Null.