DD250453A5 - Verfhren zur behandlung von pflanzen - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Pflanzen. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Antivirusmittels, das bei der Behandlung und bei der Vorbeugung einer Vielzahl von Pflanzenkrankheiten, die durch Viren oder Viroide hervorgerufen werden, wirksam ist, das bereits bei niedrigen Konzentrationen wirksam ist und das den Pflanzen in verschiedenen Entwicklungsstadien durch verschiedene Methoden effektiv verabreicht werden kann. Erfindungsgemaess werden die Verbindung 1-b-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsaeureamid und ihre 2,3,5-Triacetyl- oder 5-Butyryl-Derivate als solche oder zusammen mit anderen Antivirusmitteln oder Penetationshilfsmitteln zur Behandlung von oder zur Vorbeugung gegenueber durch Viren oder Viroiden in Pflanzen hervorgerufenen Krankheiten verwendet. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist unter anderem gegen folgende, spezielle Viren wirksam: Potexviren, Potyviren, Closteroviren, Tymoviren, Carlaviren, Cucumuviren, Ilarviren, Tombusviren, Tobamoviren, Bromoviren, Tomatenbronzefleckenviren und Luzernemosaikviren.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Viruserkrankungen in Pflanzen.
Insbesondere ist das Anwendungsgebiet dieser Erfindung die Bekämpfung von Viruserkrankungen in Pflanzen durch Verwendung von Antivirusmitteln.
Diese Anmeldung steht der US-PS Nr.4211 771, ausgegeben am 8.JuIi 1980, der US-PS 3984396, ausgegeben am 5. Oktober 1976, der US-PS 3897415, ausgegeben am 29.JuIi 1975 und der Neuausgabe (Reissue) Nr. 29835, neu ausgegeben am 14. November 1978, nahe. Alle diese Erfindungsbeschreibungen werden hierin durch Zitat aufgenommen. Vi ren und Vi roide sind die Ursache für eine große Vielzahl von Pflanzenerkrankungen, die jährlich einen bedeutenden und teuren Ernteverlust bedeuten. Bei den aus Samen gezogenen Produkten sind die Verluste, in Abhängigkeit von den Umweltbedingungen, von Jahr zu Jahr verschieden. Bei den jährlichen Ernten von Bäumen bewirken die Viren oftmals mit zunehmendem Alter der Pflanzen progressiv ansteigende Verluste (sog. Altersrückgang). Derartige chronische Krankheiten können sehr schwerwiegende ökonomische Folgen haben, da in den Anbau der Pflanzen Zeit, Arbeit, Kapital und Land investiert wurde. Die mit den Viruserkrankungen verbundenen Kosten bei den Pflanzen beziehen sich nicht nur auf die Unkosten durch deren notwendige Ersetzung, sondern auch auf die Ernteverluste für die Zeit, in der auf die volle Produktion der neu angebauten Sorten zu warten war. Im Falle der Zitrusfruchtbäume, z. B. kann der Wachstumsprozeß mehrere Jahre betragen, bevor die Bäume den vollen Ertrag an Früchten bringen. Viren bewirken fernerhin beträchtliche Verluste bei Feldfruchternten und bei Zierpflanzen, die fast ausschließlich vegetativ vermehrt werden, besonders bei Kartoffeln, Erdbeeren, Pampelmusen, Zitronen, Äpfeln, Kirschen, Orchideen, Lilien, Iris, Rosen und Nelken. Der Virus verbleibt in den vegetativ vermehrten Stammpflanzen, und ohne eine Therapie oder ein Neuzüchtungsprogramm sind alle Nachkommen infiziert. Das Ergebnis ist ein chronischer Verlust an Erzeugnissen. Des weiteren verursachen die Überwachung geographischer Gebiete für die Erfassung von Krankheitsverläufen und von Krankheitssymptomen in den vorhandenen Pflanzen in Zusammenhang mit der Möglichkeit des Ausbruchs einer Viruserkrankung bei den Pflanzen zusätzliche Kosten. Darausfolgen eine Verminderung der Ernte bei Nahrungsmitteln und Beeinträchtigungen beim Zierpflanzenbau, die eine beträchtliche ökonomische Herausforderung für die Erzeuger und die Öffentlichkeit darstellen.
Gegenwärtig besteht die am häufigsten angewendete Methode zur Bekämpfung von Viruserkrankungen darin, eine Reihe von Kulturverfahren anzuwenden, um zu verhindern, daß die Pflanzen infiziert werden. Anerkanntes, virusfreies Saatgut wird in Erdboden gepflanzt, der vorher bedämpft worden ist, um Vektoren, z. B. Nematoden, zu zerstören. Die Pflanzorte oder die Pflanztermine werden so gewählt, daß natürliche atmosphärische Vektoren, z. B. Blattläuse und Maden, vermieden werden. Um die Initiierungszentren der Infektion auf ein Minimum zu beschränken, werden die Pflanzgebiete so ausgewählt, daß sie nicht von Unkraut oder wildwachsenden Pflanzen bewachsen sind, die von den in Frage stehenden Viren befallen sind. Wenn solche anderen Wirtreservoire vorhanden sind, kann es sich als notwendig erweisen, eine erntefreie Saison einzuschieben, um die natürlichen Kreisläufe zu unterbrechen, die es den Viren ermöglichen, kontinuierlich von der angebauten Sorte zum Wirt und zu rück überzugehen. Eine weitere Art der Bekämpfung ist die Züchtung von Pflanzen, die gegenüber Viren resistent sind. Das ist dann ein wirksames Verfahren, wenn es resistentes Material gibt, das in die gewünschten Pflanzen durch Züchtung eingebaut werden kann, und wenn später nicht neue Virusstämme auftreten, die diese Resistenz überwinden. Dieses Verfahren ist jedoch in einigen Erzeugnisarten gegenüber resistenten Virusarten nicht wirksam. Oftmals ist Züchtung keine wirksame Bekämpfungsmaßnahme, da die Menge an zur Verfügung stehenden, geeigneten, resistenten Genen begrenzt ist. Das Hauptproblem in Verbindung mit den vorstehend genannten Bekämpfungsverfahren besteht darin, daß weder Bewirtschaftungstechniken noch Resistenzzüchtungen für viele Viruserkrankungen wirksam sind. Im Gegensatz zu anderen Schädlingen oder Pflanzenerkrankungen gibt es bei den Erzeugern keine wirksamen chemischen Bekämpfungsmittel. Folglich werden bei vielen Erkrankungen keine Bekämpfungsmaßnahmen durchgeführt. Anfällige Pflanzen haben, im Gegensatz zu Tieren, die ein gut ausgebildetes Immunsystem besitzen, keine Abwehrmechanismen, um sich selbst gegen Viren schützen zu können, sobald sie infiziert sind. Sobald einmal eine Pflanze infiziert ist, ist sie für ihr ganzes Leben infiziert.
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Antivirusmittels, das bei der Behandlung und bei der Vorbeugung einer großen Vielzahl von Pflanzenkrankheiten, die durch Viren oder Viroide hervorgerufen werden, wirksam ist, das bereits bei niedrigen Konzentrationen aktiv ist und kontrollierbare Wirkungen zeigt und das der erkrankten Pflanze durch eine Vielzahl von Methoden und in verschiedenen Entwicklungsstadien der Pflanzen effektiv verabreicht werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen aufzufinden, die für die Behandlung von Viruserkrankungen bei Pflanzen geeignet sind und die die gewünschten Eigenschaften aufweisen.
Erfindungsgemäß wird die Verbindung i-ß-D-Ribofuranosyl-i^^-triazol-S-carbonsäureamid und seine 2,3,5-Triacetyl-und 5'-Butyryl-Derivate zur Bekämpfung von Pflanzenerkrankungen angewandt, die durch die verschiedensten Viren hervorgerufen werden. Es konnte gezeigt werden, daß i-ß-D-Ribofuranosyl-i^^-triazol-S-carbonsäureamid und seine Derivate ein breites Spektrum von antiviraler Wirksamkeit aufweisen. Die Verbindungen können den Pflanzen durch folgende Methoden verabreicht werden: Durchfeuchten des Bodens, lokales Verabreichen, durch Injektion oder als Blattsprühmittel. Weiterhin können die Verbindungen allein oder in Zusammenhang mit anderen Penetrationshilfsmitteln wie Dimethylsulfoxid (DMSO) und Demethylformamid (DMF) oder Antivirusmitteln, z. B. Adeninarabinosid, in Abhängigkeit von der Umgebung und der speziellen Virusart, die bekämpft werden soll, verabreicht werden.
In der US-PS 3798209, die am 14. November 1978 als Re 29835 neu ausgegeben wurde, wurde die Verbindung 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid als ein Antivirusmittel mit einem breiten Spektrum von antiviraler Wirksamkeit sowohl in vitro als auch in vivo beschrieben. Die 2,3,5-Triacetyl- und 5'-Butyryl-Derivate von 1 -/3-D-Ribofuranosyl-i,2,4-triazol-3-carbonsäureamid, die ebenfalls antivirale Wirksamkeit aufweisen, wurden in der US-PS 3897415 bzw. 3984396 beschrieben. Es folgt im weiteren eine genaue Beschreibung der Verwendung der Verbindung i-ß-D-Ribofuranosyl-I^Atriazol-S-carbonsäureamid (oder seiner Derivate) allein oder in Verbindung mit anderen Antivirusmitteln bei der Behandlung verschiedener Viruserkrankungen von Pflanzen. Zum Zwecke der weiteren Erläuterung der Erfindung werden 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid und seine Derivate austauschbar bezeichnet als (a) die Verbindung, (b) Ribavirin (nicht geschützter Name, der durch den United States Adopted Names Council übernommen wurde) oder (c) unter dem oben genannten chemischen Namen.
Eine potentielle Verwendungsmöglichkeit von Ribavirin ist die als vorbeugendes oder therapeutisches Mittel zur Behandlung durch Viren infizierter Pflanzen. Bei Feldpflanzen kann jede Behandlung als Bekämpfungsmethode wirksam sein, die den Zeitpunkt hinausschiebt, zu dem die meisten Pflanzen die Wirkung von Virusinfektionen zeigen. Eine derartige Methode besteht darin, eine schützende Strohdecke zur Abwehr von atmosphärischen Vektoren mit einem Antivirusmittel wie Ribavirin zu kombinieren. Eine zweite Methode bei Erkrankungen von Feldpflanzen besteht darin, die als Reservoir für die Viren der Erzeugnisse bekannten Unkrautarten mit Ribavirin zu besprühen. Der Vorteil der Verwendung von. Ribavirin an Stelle eines Herbizids besteht bei dieser Methode darin, daß nicht alle mitbesprühten Unkrautarten und Wildpflanzen abgetötet werden, sondern nur die zur Bekämpfung vorgesehenen Pflanzen.
Ribavirin ist weiterhin zur Behandlung von Zierpflanzen geeignet. Im Falle der Zierpflanzen ist wahrscheinlich die Abnahme der Attraktivität auf Grund der durch die Virusinfektion sichtbaren Symptome wichtiger als die durch Viruserkrankungen hervorgerufenen Ertragsverluste bei anderen Pflanzen. Virusfreie Pflanzen würden dann natürlich keine Krankheitssymptome aufweisen, die sich oftmals in Fleckenbildung und Verunstaltungen äußern und dadurch die Marktfähigkeit der Zierpflanzen vermindern, die ja wegen ihrer visuellen Attraktivität verkauft werden.
Ribavirin könnte ein sehr wichtiges Mittel zur einfacheren Erzeugung virusfreier Pflanzen und zur Erhöhung der Produktion und der Qualität der folgenden Generation von Pflanzen sein. Das könnte bei der Produktion virusfreier Stämme für vegetativ vermehrte Pflanzen, z. B. von Frucht- und Nußbäumen, Erdbeeren oder Kartoffeln, erfolgen. Weiterhin könnte Ribavirin in die üblichen Fortpflanzungsverfahren mit Gewebekulturen, wie sie routinemäßig zur Fortpflanzung vieler Zierpflanzen angewendet werden, mit einbezogen werden. Ribavirin ist darüber hinaus zur Saatgutbehandlung geeignet, um die Übertragung von Viren durch das Saatgut zu verhindern.
Eine weitere potentielle Verwendungsmöglichkeit von Ribavirin besteht darin, bei den routinemäßig angewendeten Fortpflanzungsmethoden, die gegenwärtig entwickelt werden, Viren auszuschließen oder das Pflanzengewebe in einem virusfreien Zustand zu halten. Ein Beispiel ist die Verwendung verkapselter somatischer Keime bei der Fortpflanzung von somatischem Gewebe, um geschlechtliche Variationen zu verhindern oder um der Notwendigkeit für eine extensivere Pflanzenzüchtung zuvorzukommen. Ribavirin kann insbesondere bei der Erhaltung virusfreier Pflanzen durch seine Anwendung bei somatischen Keimen geeignet sein. Bestimmte Pflanzen können geschlechtslos vermehrt werden, wobei genetische Veränderungen in der Nachkommenschaft ausgeschlossen werden, die sonst durch die geschlechtliche Vermehrung aus Samen auftreten können. Die Behandlung somatischer Keime mit Ribavirin vor der Verkapselung erhält die Nachkommenschaft der Pflanze in einem virusfreien Zustand. Die Verbindung könnte auch in Zusammenhang mit den neu entwickelten Methoden der Gentechnologie bei Pflanzen verwendet werden, wobei Ribavirin in die üblichen Fortpflanzungsverfahren mit einbezogen werden könnte. i-ß-D-Ribofuranosyl-I^Atriazol-S-carbonsäureamid und seine Esterderivate (2,3,5-Triacetyl-oder 5'-Butyrylester) sind in Wasser löslich und können Pflanzen, Saatgut, Vorräten und dem Erdboden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als wäßrige Lösung verabreicht werden. Die Verbindungen sind auch in Lösungen von Alkohol (5-15Vol.-%) und Wasser, Dimethylformamid (5-25%) und Wasser, Dimethylsulfoxid (DMSO) (5-25%) und Wasser und in Dimethylsulfoxid allein löslich
Die Verfahren zur Anwendung von Ribavirin können in drei Gruppen zusammengefaßt werden:
(1) therapeutische Behandlung der ganzen Pflanzen;
(2) Herstellung virusfreier Pflanzen durch Gewebekulturen;
(3) Behandlung von Saatgut.
Die Verbindung kann als ein Blattsprühmittel beim Einsatz für die ganze Pflanze zusammen mit Zusatzstoffen, die das Eindringen und die Benetzung unterstützen, angewendet werden. Ribavirin ist im Konzentrationsbereich von etwa 100 ppm bis etwa 2000 ppm bei der Anwendung als Blattsprühmittel und bei der Bodendurchfeuchtung wirksam.
Bei der Behandlung von Bäumen, bei denen die Größe oder die Umweltverhäitnissedie Verwendung von Blattsprühmittel nicht erlauben, kann die Verbindung durch Gravitationsfluß oder durch Druckinjektion in den Stamm injiziert werden, wie es gegenwärtig mit Fungiziden oder Antibiotika praktiziert wird. Es sind eine Reihe von Verfahren denkbar, bei denen Ribavirin zur Erzeugung virusfreier Pflanzen eingesetzt werden könnte. Eine derartige Methode könnte z. B. darin bestehen, ganze Pflanzen wie oben beschrieben zu behandeln, um größere virusfreie Zonen in Nachbarschaft zu den wachsenden Spitzen zu erhalten. Ein weiteres Verfahren könnte darin bestehen, lange Schößlingsspitzen auf Medien, die Ribavirin enthalten, zu kultivieren, um so den Virus zu eleminieren.
Ribavirin könnte auch als eine Komponente den Medien für eine normale Pflanzenzüchtung aus Gewebekulturen zugesetzt werden. Die Behandlung könnte innerhalb verschiedener Entwickiungsstadien des Protoplasten, des Kallus, des Keimlings oder des Setzlings erfolgen. Es scheint, daß Ribavirin während bestimmter Entwicklungsstadien bei bestimmten Pflanzen wirksamer ist.
Konzentrationen im Bereich von etwa 10 bis etwa 400 μ,Μ sind wirksam. Schließlich bestehen zwei Methoden, die bei der Behandlung von virusinfiziertem Saatgut angewendet werden könnten, darin, ganze Pflanzen — wie oben beschrieben — zu behandeln, um sicherzugehen, daß die davon erhaltenen Samen keine Viren enthalten sowie darin, von virusinfizierten Pflanzen erhaltenes Saatgut, von dem die betreffende Krankheit übertragen werden konnte, zu behandeln, so daß die aus diesem Saatgut gezüchteten Pflanzen nicht infiziert sind. Das Saatgut könnte auch mit Ribavirin umhüllt oder mit Ribavirin durchtränkt oder der Boden könnte mit Ribavirin durchfeuchtet werden.
Weiterhin könnte Ribavirin als eine Komponente bei der mehrfachen chemischen Behandlung von virusinfiziertem Gewebe verwendet werden.
Aus der obigen Darstellung wird verständlich, daß Ribavirin zur Vorbeugung und zur Behandlung von Viruserkankungen von Pflanzen sowohl im Gewächshaus als auch auf dem Felde geeignet ist. Es hat sich herausgestellt, daß Ribavirin gegen Viren aus der folgenden Gruppe von Pflanzenviren wirksam ist: Potexviren, Potyviren, Closteroviren, Tymoviren, Carlaviren, Cucumuviren, llarviren, Tombusviren, Tomaten-Bronzefleckenviren und Luzernemosaikviren. Viren aus der Gruppe der Tobamoviren und der Bromoviren sind gegenüber Ribavirin nicht so empfindlich.
- Ausführungsbeispiel
Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.
Die folgende Tabelle stellt die Arten von Viruserkrankungen, gegen die sich Ribavirin als wirksam erwiesen hat, zusammen.
Artdes Produkt Virus Virusgruppe
Erzeugnisses
Getreide Hirse Verzwergungsmosaikvirus „ Potyvirus
des Mais
Getreide Weizen BodenübertragbaresWeizen- Tobamovirus
mosaikvirus
Trespenmosaikvirus Bromovirus
Futter Luzerne Luzernemosaikvirus Luzernemosaik
virus
Latenter Luzernemosaik- Carlavirus
virus
Futter Rüben NekrotischesRübenver- Closterovirus
gilbungsvirus
Rübenmosaikvirus Potyvirus
Futter Mais Verzwergungsmosaikvirus Potyvirus
des Mais
Futter Sojabohne Sojabohnenmosaikvirus Potyvirus
Gemüse Kreuz- Wasserrübengelbmosaik- Potyvirus
blütler virus
Gemüse Kürbis Wassermelonenmosaik- Potyvirus
virus 1 und 2
Gurkenmosaikvirus Cucumuvirus
Gemüse Lattich Lattich-Mosaik-Virus Potyvirus
Lattich Big Vein Agent nicht klassifizierter Virus
Gemüse Pfeffer Tabak Etch Virus Potyvirus
Kartoffel-Y-Virus Potyvirus
Pfeffer-Adernscheckungs- Potyvirus
virus
Pfefferscheckungsvirus Potyvirus
Gurkenmosaikvirus' Cucumuvirus
Tabakmosaikvirus Tobamovirus
Art des Erzeugnisses
Produkt
Virusgruppe
Gemüse
Zierpflanzen Zierpflanzen
Zierpflanzen Zierpflanzen Zierpflanzen Bäume
Tomaten
Nelke Iris
Lilien Orchideen
Rosen Äpfel
Bäume
Bäume Gemüse
Kirschen
Zitrus Kartoffeln
Tomaten mosaikvirus Tomaten Aspermi Virus Tomaten bronzeflecken virus
Tabak Etch Virus Nekrotisches Ringfleckenvirus der Nelke Nelkenscheckungsvirus Irismosaikvirus mit Grannen
Bohnengelbmosaikvirus Latenter Lilienvirus Gurken mosaikvirus Odontoglossum Ringfleckenvirus
Cymbidiummosaikvirus Apfelmosaikvirus Nekrotisches Ringfleckenvirus der Kirsche Chlorotisches Apfel-Blattfleckenvirus
Stammfurchungsvirus des Apfels
TulareApfel MosaikVirus Apfelmosaikvirus Nekrotisches Ringfleckenvirus der Kirsche Chlorotisches Ringfleckenvirus der Kirsche Citrus Tristeza Virus
Kartoffel-X-Virus Kartoffel-Y-Virus Kartoffel-S-Virus
Tobamovirus
Cucumuvirus
Tomatenbronze-
fleckenvirus
Poty virus
Closterovirus
Tombusvirus Potyvirus
Potyvirus Carlavirus Cucumuvirus Tobamovirus
Potexvirus
llarvirus
llarvirus
Closterovirus Closterovirus llarvirus llarvirus llarvirus
llarvirus
Closterovirus
Potexvirus Potyvirus Carlavirus
In einer Untersuchung wurde die Wirksamkeit des Ribavirins als Antivirusmittel gegen den Tabakmosaikvirus (TMV) und gegen den Chloretischen Langbohnen-Ringfleckenvirus (CCMV) untersucht. Der Stamm U1 des Tabakmosaikvirus wurde in Tabakpflanzen (Nicotina Tabacum L. „Xanthi") kultiviert und die Infizierbarkeit auf 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH = 7,0 und 1 % Celite durch die Halbblattmethode auf Nicotiana Tabacum L. „Xanthi No" mit 5 bis 12 Reproduktionen jeder Impfstelle in statistischer Auswahl geprüft. Der chlorotische Landbohnen-Scheckungsvirus wurde in Langbohnen (Vigna Unguiculata L.Walp „California Blackeye") kultiviert. Die Infizierbarkeit des Pflanzensaftes, verdünnt mit dem oben genannten Puffer, wurde mittels der Halbblattmethode auf Sojabohnen (Glycine Max L.) geprüft. Vier Stunden nach der mechanischen Beimpfung wurden Plättchen von 7 mm Durchmesser aus den infizierten Blättern entnommen. Zehn dieser Plättchen wurden je Behandlungsreihe mit der geeigneten Lösung an Chemikalien durch angelegtes Vakuum infiltriert und danach auf Papierhandtüchern zehn bis fünfzehn Minuten trocknen gelassen. Die Plättchen wurden auf der Lösung der Chemikalien in Petrischalen von 3,5 cm Durchmesser schwimmen gelassen. Diese Anordnung befand sich in einem Pflanzen-Klimaraum bei 25°C, der 14 Stunden mit ungefähr 15000Ix beleuchtet wurde. Zur Kontrolle wurden Plättchen ebenso mit destilliertem Wasser behandelt. Nach 96 Stunden Inkubationszeit wurden alle Plättchen aus den Lösungen entnommen und bei -20°C eingefroren, bis die Infizierbarkeit geprüft wurde. Der Grad der Infektion bei den mit Chemikalien behandelten Plättchen wurde mit denen aus der Wasserbehandlung verglichen. Jede Verbindung wurde mit zwei bis vier unterschiedlichen Konzentrationen untersucht, die sich um das Fünffache unterscheiden, und jedes Experiment wurde wenigstens zweimal wiederholt. Das Standardmedium für das Wachstum des Tabak-Kallus bestand aus den Murashige- und Skoog-Salzen, dazu 3mg/l Indolessigsäure, 0,3mg/l Kinetin und 40g/l Saccharose in 0,8% Agarose. Das Regenerationsmedium war das gleiche, außer daß esO,3mg/l Indolessigsäure und zusätzlich 10mg/l 6-lsopentenylamino-purin enthielt. Das Kallusgewebe wurde aus Markgewebe von Tabakpflanzen, die mit TMV infiziert waren, gewonnen. Die einzelnen Chemikalien wurden Filter-sterilisiert und dem Medium nach Autoklavieren zugesetzt. Es wurden die Randzonen der KaIIi, die in Gegenwart von Chemikalien getrieben wurden, entnommen, um zu verhindern, daß irgendein Teil des ursprünglichen Samenkallus verwendet würde, der dann auf seinen Infektionsgrad durch das TMV geprüft wird. Neue Triebe, die auf den chemikalienhaltigen Kulturmedien wuchsen, wurden ebenfalls entnommen und auf ähnliche Art und Weise untersucht. So konnte gezeigt werden, daß Ribavirin die Vermehrung von TMV und CCMV in diesen Systemen inhibiert. CCMV reagierte bei der Vermehrung empfindlicher auf das Ribavirin als das TMV. Das Tabak-Kallus wuchs und differenzierte sich bei einer Konzentration an Ribavirin, die doppelt so hoch lag wie die, die zur Inhibierung der Vermehrung von TMV auf Blattplättchen nötig war. Das neu gebildete Tabak-Kallus bzw. die Triebe enthielten jedoch noch TMV. Die Konzentration an Ribavirin, die zur 90%igen Inhibierung der Virusvermehrung in Blattplättchen nötig war, betrug 0,2 mM zur Inhibierung des TMV und 0,1 mM zur Inhibierung des CCMV.
Weitere Versuche wurden mit Li I ium Long if lorum „Arei", einer Sorte, für die beschrieben wurde, daß es schwierig ist, sie frei von Viren zu erhalten, durchgeführt. Andere Versuche wurden mit Lilium „Enchantment" durchgeführt. Beide Arten enthielten den Latenten Lilienvirus (LSV) und den Tulpenbrandvirus (TBV). Meristems, die auf Ribavirin enthaltenden und rebavirinfreien Medien präpariert wurden, wurden isoliert und danach auf einem Medium ohne Ribavirin kultiviert. Die Anzahl der neu gebildeten Meristems und das durchschnittliche Gewicht der Zwiebel wurden durch Ribavirin im Konzentrationsbereich von 0,0 bis 40,0μ,Μ nicht signifikant beeinflußt. Bei einer Konzentration von 400,0/xM wurde das Zwiebelwachstum wesentlich vermindert. Blattproben der Pflanzen wurden auf die Anwesenheit von LSV und TBV hin mittels ELISA, den Immun-Diffusions-Tropfentest und Elektronenmikroskopie untersucht. Der Anteil der Pflanzen der Art L. Longiflorum „Arai", der durch LSV und/ oder TBV infiziert war, wurde durch 40,0μΜ Ribavirin reduziert, während für die Sorte L. „Enchantment" das Ergebnis weniger deutlich ist. Diese Versuche lassen darauf schließen, daß Ribavirin ein geeignetes Mittel sein kann, um den Anteil an virusfreien Pflanzen zu erhöhen, wenn die Meristem-Kultivierung auf Blumenzwiebeln angewendet wird.
In einem weiteren Versuch wurde die Wirksamkeit von Ribavirin in Verbindung mit Adeninarabinosid gegenüber dem Tabakmosaikvirus auf Tabakgewebekulturen untersucht. Mit TMV infizierte Tabak-Kallus-Kulturen wurden verschiedenen Kombinationen von Ribavirin und Adeninarabinosid in einem festen, triebbildenden Medium einen Monat lang ausgesetzt und die neu gebildeten Triebe auf den Virus hin untersucht. Die Anwesenheit dieser Verbindungen im Kulturmedium verminderte die Häufigkeit der Entwicklung von Trieben. Bei verschiedenen Kombinationen dieser beiden Stoffe waren beiden hervorgebrachten Trieben, die geprüft wurden, keine TMV nachweisbar. Wenn die Triebe auf ein Medium ohne die Zusatzstoffe übertragen wurden, setzten sie das Wachstum fort und entwickelten dabei keine TMV-Symptome, wenn die Pflanzen vier bis fünf Blätter von über einem cm aufwiesen. Einige der Pflanzen wurden im Gewächshaus voll ausgetrieben und bei der Untersuchung auf Infektion festgestellt, daß sie frei von TMV waren. Sowohl Ribavirin als auch Adeninarabinosid inhibierten wirksam die Vermehrung von TMV, wenn auf Infizierbarkeit geprüft wurde. Sowohl Ribavirin als auch Adeninarabinosid inhibierten wirksam die Vermehrung von TMV in Blattzellen, wenn die Behandlung bald nach der Infizierung begann. Wenn nicht organisierte Kallus-Zellen mit TMV infiziert und danach mit Ribavirin oder Adeninarabinosid behandelt wurden, inhibierte keine dieser Verbindungen die Vermehrung von TMV. Wenn Ribavirin jedoch mit einer Konzentration von 0,5 bis 1,OmM zusammen mit Adeninarabinosid in einer Konzentration von 0,1 bis 1,OmM bei Tabakgewebekulturen verwendet wurde, wurden vorhandene TMV bekämpft.
Andere Versuche an Zierpflanzen, wie Orchideen, zeigen, daß Ribavirin bei der Bekämpfung des üblichen pathogenen Virus von Cymbidien, dem Orchideenstamm des Tabakmosaikvirus (TMV-O), wirksam ist. Gewebekulturmedien, in denen Orchideen cloniert werden, wurde Ribavirin mit einer Konzentration von 30 bis 1 000ppm zugesetzt, und es wurde auch dazu verwendet, ganze Orchideenpflanzen auf vorbestimmte Art und Weise damit zu besprühen oder zu tränken. Die Virustiter wurden mittels Durchstrahlungs-Elektronenmikroskopie (TEM) und serologische ELISA-Tests bestimmt. Um das Eindringen von Ribavirin zu verbessern, wurde allen Behandlungslösungen, einschließlich der Kontrollproben, 200ppm Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben. Diese Untersuchungen zeigen, daß Gewebekulturen von Cymbidiumorchideen auf Wunsch von Orchideenstamm des Tabakmosaikvirus befreit werden können. Kulturen, die mit allen vier in der Untersuchung verwendeten Konzentrationen an Ribavirin gezüchtet wurden (30,100,300 und 1 000 ppm), wiesen ein virusfreies Neuwachstum auf. Alle unter diesen Bedingungen entwickelten Gewebe waren virusfrei: Triebe, Wurzeln und undifferenzierte, protokorumartige Körper. In Gegenwart von Ribavirin wurden durch Odontoglossum-Ringfleckenvirus infizierte Cymbidium-Mutterpflanzen regeneriert. 'Meristems oder Protokorum-Gewebe wurden auf flüssigem oder festem (0,7%Agarose) Knudson-C-Medium, wie es von Morel für Orchideen modifiziert wurde, kultiviert. Diese Versuche haben gezeigt, daß Protokorumgewebe von gesundem, aus Samen gezogenem Cymbidium gut auf dem Medium mit einem Zusatz von 0,10 oder 25ppm Ribavirin wuchs, daß es aber nach vier Kulturwochen auf dem Medium mit 50 ppm Ribavirin nekrotisch wurde. Von der sechsten Nachfolgekultur an konnte mit Hilfe des ELISA-Tests kein Virus mehr nachgewiesen werden.
In einer weiteren Untersuchung wurde nachgewiesen, daß durch den Kartoffel-Y-Virus infizierte Kartoffelkulturen mittels der Meristemspitzen-Kultur regeneriert werden können. Obwohl der nach diesem Verfahren erhaltene Anteil gesunder Pflanzen gewöhnlich hoch ist, werden aufwendige Medien benötigt, und außerdem ist das Nachwachsen von Meristem-Pflanzenteilen gering. Meristems wurden auf einem Medium nach Murashige und Skoog, das zusätzlich mit Vitamin B5 und Wachstumsförderern versetzt war, kultiviert. Andere Pflanzenteile (Triebe, Teile von Trieben, Stengelteile) wurden auf dem Medium nach Murashige und Skoog ohne Zusatz von Wachstumsförderern kultiviert. Die Anwesenheit von Kartoffel-Y-Viren im Pflanzenmaterial wurde vor und nach der in vitro-Kultur durch biologische Indexierung auf Tabak-Testpflanzen oder durch Serologie (ELISA) kontrolliert.
Die aus diesen Versuchen erhaltenen Ergebnisse bestätigen, daß der Kartoffel-Y-Virus aus infizierten Pflanzen durch die Meristem-Kultur eliminiert wurde. Der Zusatz von Ribavirin (10,25 und 50 ppm) verbesserte die Regenerationsrate, jedoch macht ihre Phytotoxizität diese Verbindung bei Konzentrationen, die das Viruswachstum inhibieren, als Bekämpfungsmittel für Viren bei der Meristemkultur von Kartoffeln, die durch das Kartoffel-Y-Virus infiziert sind, ungeeignet. Für andere Pflanzenteile (Triebe, Teile von Trieben und Teile von Stengeln) erhöht Ribavirin bei Konzentrationen von 25 oder 50 ppm nach der in vitro-Kultur von drei oder vier Wochen die Anzahl der virusfreien Pflanzen signifikant.
Cymbidium-Protokorum, das mit dem Odontoglossum-Ringflecken-Virus infiziert war, wurde zur Vermehrung auf flüssigem Knudson-C-Medium, das 0,10, 25 oder 40ppm Ribavirin enthielt, kultiviert. Nach drei monatlichen Nachfolgekulturen auf dem gleichen Medium zeigte sich, daß Ribavirin bei einer Konzentration von 10ppm die Vermehrung von ORSV nicht inhibierte, während sich die Konzentration der Viren in den Protokoren, die auf Medien mit 25ppm Ribavirin erhalten wurden, progressiv verkleinerte.
Es wurde somit ein Antivirusmittel entdeckt, das gegenüber bestimmten Pflanzenerkrankungen, die durch Viren oderViroide Verursacht werden, wirksam ist.
Während Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung dargestellt und beschrieben wurden, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß eine Vielzahl weiterer Modifizierungen möglich sind, ohne daß man sich dabei von den hierin beschriebenen Vorstellungen des erfindungsgemäßen Verfahrens entfernt. Die Erfindung soll deshalb dadurch nicht begrenzt werden, sondern nur durch die folgenden Erfindungsansprüche.
Claims (18)
1. Verfahren zur Behandlung von Pflanzen, um durch Viren oder Viroide hervorgerufenen Krankheiten vorzubeugen oder diese zu hemmen, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge von i-ß-D-Ribofuranosyl-i^^-triazol-S-carbonsäureamid oder dessen 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate angewendet werden.
2. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß die durch Viren oder Viroide hervorgerufene Krankheit durch einen Virus aus der Gruppe der Tobamoviren, Closteroviren, Tombusviren, Carlaviren, Cucumuviren, Potexviren, llarviren, Potyviren, Bromoviren, Tymoviren, Luzernemosaikviren und Tomatenbronzefleckenviren hervorgerufen wird.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge des oben genannten 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamids oder seines 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivates als Bodendurchfeuchtungsmittel angewendet wird.
4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge des oben genannten 1 -ß-D-Ribofuranosyl-i^^-triazol-S-carbonsäureamids oder seines 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivates durch Druck-oder Schwerkraftinjektion angewendet wird.
5. Verfahren nach Punkt !,gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge des oben genannten 1-^3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamids oder seines 2,3,5-Triacetyl-oder 5'-Butyryl-Derivates als Blattsprühmittel angewendet wird.
6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder sein 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivat zusammen mit einer wirksamen Menge eines Penetrierhilfsmittels Dimethylsulfoxid (DMSO) oder anderer Penetriermittel oder oberflächenaktiver Mittel angewendet wird.
7. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge von 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seines 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivates in Gewebekulturen zur Pflanzenvermehrung eingearbeitet wird.
8. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge von 1 -/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder sein 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivat mit einer schützenden Abdeckung verbunden werden, um durch Luft übertragene Vektoren abzuweisen, die Viruserkrankungen auf Pflanzen übertragen.
9. Verfahren zur Verhinderung von Pflanzenerkrankungen, die durch Viren oder Viroide verursacht werden nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge von 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl-oder 5'-Butyryl-Derivate auf solche Unkrautsorten angewendet wird, die als Reservoire der Viren des betreffenden Erzeugnisses bekannt sind.
10. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß 1-ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-
. carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in Konzentrationen von etwa 100 bis etwa 2000ppm angewendet werden.
11. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß 1 -ß-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl-oder 5'-Butyryl-Derivate in Konzentrationen von etwa 100 bis etwa 20Ö0ppm angewendet werden.
12. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß i-ß-D-Ribofuranosyl-I^Atriazol-S-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in die genannten Gewebekulturen in Konzentrationen von etwa 10 bis etwa 400μ.Μ eingearbeitet werden.
13. Verfahren zur Behandlung von Pflanzen, um durch Tabakmosaikviren hervorgerufenen Viruserkrankungen in'Tabak-Kallus-Kulturen vorzubeugen oder diese zu hemmen nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß 1-^3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in Konzentrationen im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 1,OmM und Adenin-arabinosid in einer Konzentration im Bereich von etwa 0,1 bis 1,OmM in ein festes, Triebe erzeugendes Medium eingearbeitet werden.
14. Verfahren zur Verhinderung von durch Viren oder Viroiden verursachten Pflanzenerkrankungen nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge von 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate auf vegetatives Saatgut angewendet werden.
15. Verfahren zur Verhinderung von durch Viren oder Viroiden verursachten Pflanzenerkrankungen nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine wirksame Menge von 1-/3-D-Ribofuranosyl-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seiner 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in den Pflanzboden für die Verwendung in Gewächshäusern oder Versuchspflanztöpfen als Prophylaktikum eingearbeitet werden.
16. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß 1-/3-D-Ribofuranosy!-1,2,4-triazol-3-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in wäßriger Lösung angewendet werden.
17. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß i-ß-D-Ribofuranosyl-i^^-triazol-S-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in einer Lösung von Wasser und Alkohol (etwa 5 bis etwa 15Vol.-%) angewendet werden.
18. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß i-ß-D-Ribofuranosyl-i^^-triazol-S-carbonsäureamid oder seine 2,3,5-Triacetyl- oder 5'-Butyryl-Derivate in einer Lösung bestehend aus Wasser und Dimethylformamid (etwa 5 bis 25 Vol.-%) angewendet werden.
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