NO841993L - Immunologiske metoder for paavisning av maligne celler med metastatisk celleaktivitet, samt preparater for utfoerelse av slike metoder - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for påvisning av metastatisk celleaktivitet ved hjelp av immunologisk bestemmelse av type IV kollagenaseantigen ved bruk av polyklonale og monoklonale antistoffer mot enzymantigenet. I tillegg åpen-barer oppfinnelsen preparater som omfatter merket eller umerket enzymantigen og merkete eller umerkete polyklonale og monoklonale antistoffer mot enzymantigenet.

Én av hovedkjennetegnene på ondartede celler er inntreng-ningen av og dannelsen av metastaser. Følgelig er fremgangsmåter for tidlig påvisning og kontroll av inntrengningsprosessene av betydelig klinisk verdi. Dannelsen av metastaser er en kompleks rekkefølge av hendelser hvorved ondartede celler løs-rives fra primærtumoren, trenger inn i det omkringliggende vev, trenger i lymfe- eller blodbanene, fester seg til og trenger gjennom karvegger på et fjerntliggende sted, trenger inn i vevet og til slutt formerer seg ved celledeling hvorved det *metastatiske sentrum etableres.

De inntrengende tumorceller må trenge gjennom basalmembraner på flere steder under spredningsprosessen. Basalmembraner er ekstracellulære grunnmasser som danner et sterkt sammenhengende lag som adskiller epitel-, endotel- og parenchymalceller fra mellomliggende bindevev. Disse strukturene er satt sammen av kollagen (type IV) og ikke-kollagene bestanddeler slik som laminin, proteoglykan, entaktin og fibronektin. Basalmembraner utgjør betydelige barrierer for tumorcellene og deres nedbrytning er derfor et viktig trinn i metastaseprosessen. Denne prosessen antas nå å fremmes av proteolytiske enzymer. Forhøyede nivåer med proteaser slik som plasminogen-aktivatorer, katepsin B og D og proteoglykan-nedbrytende enzymer er blitt beskrevet både i ekstrakter fra tumorvev og i media fra dyrkede tumorceller, og disse enzymene har vært ansett som lovende sonder for å måle cellers inntrengningsstyrke. Sammenhengen mellom frigivelsen av enzymene og de ondartede cellenes evne til inntregning er imidlertid ikke blitt fastslått. Faktisk stilles plasminogen-aktivatorer av mange cellelinjer uten noen inntrengningsegen-skaper. Ettersom de ovenfor nevnte proteasene videre ikke bryter ned type IV kollagen, tilveiebringer de ikke tilstrekkelige hjelpe-midler for tumorcellene til å passere gjennom basalmembraner. Søkerne har påvist at tumorceller utskiller en nøytral protease som spesifTktTbryter ned type IV kollagen og har utviklet fremgangsmåter for rensingen av dette enzymet inntil ensartethet fra en metastatisk musetumor (Liotta et al., J. Nati. Cancer Inst., 58, 1427-1431, 1977; Liotta et al.,' Proe. Nati. Acad. Sei., 76, 2268-2272, 1978; Salo et al., The Journal of Biolo gical Chemistry, 258, s. 3058-3063, 1983) såvel som fra dyrkede tumorceller fra mennesker. Søkerne har også påvist at aktivi-teten av dette enzymet, her henvist til som type IV kollagenase, samsvarer med den metastatiske styrke hos tumorceller (Liotta et al., Nature 284, 67-68, 1980).

Ettersom det er vist at type IV kollagenaseenzymantigenet

er nyttig for påvisning av ondartede celler med metastatseegen-skaper, kan enzymet være av stor diagnostisk verdi. Målingen av type IV kollagenaseaktiviteten kan imidlertid ikke utføres i biologiske væsker, slik som kroppsvæsker, vevekstrakter eller vevsnitt, på grunn av den store mengde av protease-inhibitorer i slike prøver.

Det er formålet med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe metoder for påvisning av ondartede tumorceller med metastatisk celleaktivitet ved immunologisk bestemmelse av type IV kollagenase-enzymaritigen i biologiske prøver, slik som kroppsvæsker, vevekstrakter, vevsnitt, organ- eller cellekulturer, kulturmedier, etc. Et ytterligere formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe preparater som omfatter både merkede og umerkede sterkt rensede type IV kollagenaseenzymantigen og merkede eller umerkede polyklonale eller monoklonale antistoffer mot type IV kollagenaseenzymantigenet.

Fremgangsmåter for å rense og karakterisere type IV kollagehaseantigenet fra celler som er i stand til å trenge gjennom basalmembraner, særlig fra ondartede tumorceller, er en obligatorisk forutsetning for realiseringen av foreliggende oppfinnelse. Søkerne har oppdaget type IV kollagenasen og utviklet fremgangsmåter for rensingen og karakteriseringen av dette antigenet (Liotta et al., J. Nati. Cancer Inst., 58, 1427-1431, 1977; Liotta et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 76, 2268-

2272, 1978; Salo et al., The Journal of Biological Chemistry,

258, s. 3058-3063, 1983); Salo et al., J. Biol. Chem., 1983).

Til målingen av type IV kollagenaseaktivitet brukes radioaktivt merket type IV prokollagen som substrat, dette substratet er fremstilt ifølge en fremgangsmåte utviklet av oppfinnerne (Tryggvason et al., Biochemistry, 19, 1284-1289, 1980). Denne aktivitetsanalysen kreves for å bestemme rensingsgraden under enkelte trinn av rensingsprosessen. Ved hjelp av denne fremgangsmåten kan enzymaktiviteten bestemmes i serumfrie organ-

eller cellekulturmedier.

Type IV kollagenaseenzym kan erholdes fra serumfrie organ-kulturmedier av ondartet tumorvev eller medeier fra dyrkede tumorceller. Vevstykkene eller cellene dyrkes vanligvis in vitro i 5 dager og mediene samles opp daglig. Mediumproteinet som inneholder type IV kollagenaseantigen utfelles med ammoniumsulfat og sendes deretter gjennom flere kromatograferingskolonner som beskrevet i de illustrerende eksempler nedenunder.

Det rensede type IV kollagenaseantigen har en molekylvekt på ca. 70.000 og det ble undersøkt ved hjelp av gelelektroforese, består av to polypeptidkjeder med en molekylvekt på 62.000 og 68.000. Type IV kollagenaseenzymantigenet trenger proteolytisk aktivering for å oppvise maksimal aktivitet, og har' et pH-optimum på 7,4. Type IV kollagenaseenzymantigenet er et metallavhengig enzym og trenger kalsium for å virke. Enzymantigenet 'er spesifikt og bryter ikke ned mellomvev-kollagen av typen I, II eller III, eller andre basalmembranbestanddeler eller kasein.

Isoleringen og rensingen av type IV kollagenaseenzymantigenet gjør det mulig å produsere spesifikke antistoffer mot enzymantigenet. Fremstillingen av disse antistoffene muliggjør utviklin-gen av følsomme immunologiske fremgangsmåter for å påvise metastatisk celleaktivitet ved hjelp av den kvalitative eller kvanti-tative bestemmelse av type IV kollagenaseantigenene i biologiske prøver, slik som kroppsvæsker, vevekstrakter, vevsnitt, celle-eller organkulturer, kulturmedier, etc.

Fremstillingen av antisera, polyklonale så vel som monoklonale antistoffer, kan utføres ved allerede etablerte fremgangsmåter. For fremstillingen av antisera injiseres det rensede type IV kollagenaseantigen flere ganger under huden på forsøks-dyr, slik som kaniner eller marsvin, og etter en passende tids-periode tas serum fra dyret eller dyrene. Tilstedeværelsen av bestemte antistoffer i antiserumet undersøkes så ved hjelp av teknikkker som er kjent for fagfolk, slik som den enztmbundne immunosorbent-analyse (ELISA), "the western-immuiioblotting technique" og immunologiske farvingsmetoder.

Det er fremstilt antisera mot murin type IV kollagenaseantigenet ved hjelp av fremgangsmåter utviklet av søkerne.

Disse antisera reagerer med museantigen slik som vist ved "immunoblotting", ELISA og immunofluorescens-teknikker.

For fremstillingen av alminnelig antiserum må type IV kollagenaseenzymantigenet være et svært rent og homogent protein. Det er svært vanskelig å oppnå tilstrekkelige mengder av absolutt rent type IV kollagenaseantigen fra mennesker for å fremstille alminnelige antisera i kaniner og marsvin. For å overvinne dette problemet, har vi utnyttet fremgangsmåten til Kohler og Milstein (Nature, 256, 496, 1975) for å fremstille monoklonale antistoffer. En fordel ved denne fremgangsmåten er at antigenet ikke behøver å være absolutt rent fordi de bestemte antistoffproduserende celleklonene (hybridene) kan velges ut under in vitro betingelser.

I henhold til den ovenfor nevnte fremgangsmåte ble BALB/C-mus immunisert to ganger subkutant med 100 ug høyrenset type IV kollagenase isolert fra dyrkningsmedier med fibrosarkomaceller fra menneske. Etter seks uker ble antiseraene'prøvet ved hjelp av ELISA-metoden. Dersom de oppnådde resultater var tilfredsstillende, ble musene immunisert nok en gang intravenøst med en passende mengde type IV kollagenaseantigen. Leverceller fra to immuniserte mus og myeloma-celler fra mus (NS-1) ble så hybridisert og dyrket i henhold til vanlige tenikker på mikrotiter-plater. Av 453 platebrønner var 46 positive med hensyn til antistoffer bestemt ved hjelp av ELISA-metoden.

Med den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ble 10 egnede

hybridlinjer funnet. Disse 10 hybridlinjene var' sterkt positive når det gjelder ondartede menneske- fibrosarkoma og bryst-karci-nomaceller, men bare svakt reaktive med normale fibroblastceller fra menneskehud. Tre av disse ti hybridcellelinjene, som hadde de høyeste titerne, ble valgt ut for kloning in vitro ved for-tynningsteknikken og for fremstilling av monoklonale antistoffer.

De polyklonale og monoklonale antistoffene mot type IV kollagenaseantigenet som var fremstilt, isolert og renset slik som beskrevet ovenfor, kan merkes med egnede radioaktive, enzymatiske eller fluorescerende markører ved hjelp av vanlige fremgangsmåter som bør være åpenbare for fagfolk.

Disse nevnte polyklonale og monoklonale antistoffene og type IV kollagenaseantigenet, merket såvel som umerket, kan bindes til egnede faste bærere og brukes i de immunologiske fremgangsmåtene som utgjør en del av foreliggende oppfinnelse.

I henhold til fremgangsmåtene for påvirning av ondartede celler med metastatisk celleaktivitet bestemmes tilstedeværelsen av type IV kollagenaseenzymantigenet i biologiske prøver, slik som kroppsvæsker, vevekstrakter og -snitt, etc. ved vanlig kjente immunologiske fremgangsmåter ved hjelp av merkede eller umerkede, bundne eller ubundne type IV kollagenaseenzymantigen-preparater såvel som merkede eller umerkede, bundne eller ubundne, polyklonale eller monoklonale antistoff-preparater.

Ved de immunologiske fremgangsmåtene ble kaninantiserum brukt til å bestemme tilstedeværelsen av type IV kollagenaseantigen. Som vist .ved hjelp av "the western blotting technique", farget antiserumet to proteiner i 62 K og 68 K området som svarer til det rensede type IV kollagenaseenzymantigen. Videre ble antiserumet brukt til immunologisk farging av brystkreft-celler fra menneske og normale brystvev. Frosne snitt av vevene ble først inkubert med antiserumet og deretter med FITC-konjugert anti-kanin IgG. Resultatene viste at av 10 normale vev-prøver ga ingen en positiv fluorescens, dvs. de inneholdt ikke type IV kollagenaseantigenet. På den annen side oppviste 25 av 25 vevprøver av brystkreft sterk fluorescens i grenseområdet til tumoren. Følgelig kan de immunologiske fremgangsmåtene beskrevet i denne oppfinnelsen påvise tilstedeværelsen av ondartede tumorceller i vev, og ettersom fargingen hovedsakelig ble observert i grenseområdet til tumoren, er det tydelig at type IV kollagenaseantigenet anrikes i inntrengende celler.

Antistoffer mot type IV kollagenaseenzymantigen fra menneske fremstilt av hybridkloner fra mus, ble brukt til immunologisk farging av durkede celler. De undersøkte celler var fibrosarkoma (HT-1080) fra menneske, bryst-karsinomaceller (MCF-7) og normale fibroplaster fra menneskehud. Cellene ble dyrket på mikrotiter-plater og inkubert med antistoffene. PLatene ble så vasket og inkubert med biotynilert hest-antimus IgG/lgM og vasket. Deretter ble avidin-biotin-peroksidase-reagenser tilsatt for å farge kompleksene av mus-immunoglobulin og antimus-immunoglobulin som er bundet til cellene. Resultatene viste at de ondartede HT-1080 og MCF-7 cellene ble farget, emns de normale fibroplastene fra hud ikke ble garfet. Det er følgelig åpenbart at monoklonale antistoffer mot type IV kollagenase fra menneske kan brukes til å adskille ondartede celler som inneholder type IV kollagenaseenzymantigenet fra normale celler som ikke inneholder enzymantigenet.

Oppfinnelsen er beskrevet i ytterligere detaljer i de illustrerende eksempler nedenunder.

Eksempel 1

Isolering av type IV kollagenaseantigen.

Til fremstillingen av type IV kollagenase fra mus, dyrkes først metastatiske PMT-timorer i C57B1/6J-mus. Etter ca. to ukers vekst, tas tumoren ut, hakkes opp og inkuberes i et serum-fritt RPMI-1640 medium som organkulturer i 5 dager. Mediet samles opp daglig og dets protein utfelles med ammoniumsulfat (25-60% metning). Utfellingen oppløses i enzymbufferen 0,05M Tris-HCl, pH 7,4, 0,2 M NAC1, 10 mM CaCl2og sendes gjennom en kolonne med concanavalin-A-agarose hvortil det meste av enzymet bindes. Det bundne enzym elueres med 1 M ot-metyl-mannosid og sendes gjennom en kolonne med type IV kollagen og agarose. Kollagenet som er bundet til kolonnen ekstraheres fra EHS-basis-membran-grunnmassen som danner tumor og renses, og det inneholder intakte type IV kollagen-kjeder (185 K og 175 K). For å unngå nedbryting av kollagen-agarosen med enzymet, er bufferene frie for CaC^ under den passeringen gjennom kolonnen. Enzymene elueres fra kolonnen med enzymbuffer som inneholder 1M NaCl eller 50% etylenglykol. Sluttrensingen av enzymet oppnås ved hjelp av molekylsikt, f.eks. "Bio-Gel A" 0,5 m, hvor det passe-rer med et tilsynelatende molekylvekt på ca. 160.000. Enzymet som er renset på denne måten inneholder to polypeptid-kjeder med molekylvekter på 68 K og 62 K.

Type IV kollagenaseaktivitet fra menneske fremstilles på samme måte som murinenzymet fra serumfrie media av dyrkede fibrosarkomaceller fra menneske (HT-1080). Cellene dyrkes i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) med 10% foster-vøsker i kalveserum i rulleflasker hvoretter mediet endres til det samme serumfrie medium. Mediet samles opp daglig i 5 dager.

Eksempel 2

Fremstilling av antiserum mot type IV kollagenase fra mus.

Antigenet (100-200 ug) injiseres under huden i like store volumdeler med fosfatbuffret saltvannsoppløsning (PBS) og

Freund's fullstendig hjelpestoff og på nytt etter 4 uker med ufullsyendig Freund<1>s hjelpestoff. Nye injeksjoner gis så to ganger med ukers mellomrom. Blodprøve tas 3 uker etter den siste injeksjonen og serumet undersøkes med hensyn på spesifisitet og titer ved hjelp av ELISA, "western blotting" og immuno-fargings-teknikker.

Eksempel 3

Fremstilling og karakterisering av monoklonale antistoffer.

BALB/C-mus immuniseres med 100 ug delvis renset HT-1080-enzym i fullstendig Freund<1>s hjelpestoff, og reimmuniseres to ganger med 50 ug antigen med 3 ukers mellomrom. Titerne for antisera undersøkes 3 uker etter den siste injeksjonen og når de er tilfredsstillende (fortynning _<_ 1:500) bestemt ved hjelp av ELISA, gis dyrene 50 ug antigen intravenøst. Fire dager senere utføres hybridiseringen i henhold til Kohler & Milstein (Nature, 256, 496, 1975). Immuniserte miltceller' fra to mus smeltes sammen med NS-1 eller tilsvarende myelomaceller og de sammensmeltede cellene utplates på 96-brønners mikrotiterplater med ca. 2 x 10~\ celler/brønn og peritoneum-celler (makrofager) fra mus brukes som "mate"-celler (6 x 10 ). Cellene dyrkes i et selektivt HAT-medium (DMEM som inneholder 10 M hypoksantin, 10~<7>M aminopeptin, 1,6 x 10<5>M og 20% FCS) i 3-4 uker. Dette mediet tillater bare hybridcellene å vokse. Cellene prøves med hensyn på antistoffproduksjon ved hjelp av ELISA og vanligvis er ca. 10% av brønnene positive. Antistoffenes spesifisitet undersøkes også ved hjelp av "western blotting teknikk" og immunologisk farging.

ELISA-metoden utføres ved å bruke mikrotiterplater med 96-brønner. Ca. 50-100 ng antigen plasseres i hver brønn og tørkes. Frie bindingsseter blokkeres ved inkubering i 30 minutter med

50 ul 1% FCS og brønnene vaskes med PBS. Hybrid-supernatenter som antisera tilsettes så til brønnene (50 ul) og det inkuberes. Etter vasking med PBS, tilsettes 50 ul biotinylert anti-mus IgG-oppløsning fra hest som inneholder 1% FCS og det inkuberes i 30 minutter etterfulgt av en vasking med PBS. Deretter tilsettes et avidin-biotin-peroksidase-reagens og det inkuberes. Så tilsettes perqksydase-substratet (0,01% o-dianisidin, 0,01% ^ 2°2 i PBS) og den brune fargen som dannes måles i et "Titertek Multiscan" spektrofotometer.

"Western blotting"-teknikk kan brukes for bedre å karakterisere antistoffene fordi den viser nøyaktig hvilke polypeptid-kjeder som antistoffet reagerer med. Antigenet eller en protein-blanding som inneholder antigenet separeres først på en 10% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektroforese hvoretter proteinene i horisontal stilling suges opp på et nitrocellulose-ark ved å bruke 0, 1 A strømstyrke over natten.Arket farges så med en fargingsoppløsning av heparin og toluidin. Nitrocellul-losestrimlene som inneholder proteinet skjæres deretter ut og fargen fjernes med en oppløsning (50% etanol, 8% eddiksyre,

42% vann). Immunofargingen av strimlene utføres så ved hjelp av den samme fremgangsmåten som ble brukt ved ELISA. Positive antistoffer gir en brun farge bare med antigenet, men det må legges merke til at dersom antistoffet er rettet mot tertiær-struktur hos antigenet, kan man få et negativt resultat fordi proteinene denatureres under gelelektroforesen.

Eksempel 4

Immunofarging av type IV kollagenase.

Kanin-antiserum mot renset type IV kollagenase fra mus

ble brukt til å undersøke lokaliseringen av enzymet i normalt brystvev og ondartet brystkreft-vev fra mennesker. Frosne snitt (5 ym tykke) fra 10 normale brystvev-prøver og 25 bryst-kref t-vevsprøver ble for-inkubert med 1 % FCS og deretter vasket med PBS. Deretter ble antiserumet, 1:50 fortynning, inkubert med prøvene i 2 timer ved 20°C etterfulgt av vasking med PBS. Snittene ble så inkubert med FITC-konjugert anti-kaninserum

fra geit over natten ved 4°C og vasket med PBS. Fluorescensen ble så undersøkt. Resultatene viste at ingen av de normale vevene ble farget, mens alle de 25 kreftvevene ga en klar fluorescens. Fargingen var mest intens i frontkanten av inntrengende tumorer og mellom 10-80% av tumorcellene var positive.

Monoklonale antistoffer mot HT-1080 sarkomacelle type IV kollagenase fra menneske ble brukt å farge dyrkede HT-1080-celler, bryst-karsinomaceller fra menneske (MCF-7) og fibroblastceller fra menneskehud. Cellene ble dyrket på dekkglass inntil sammenløping og fiksert med metanol ved -20°C i 10 minutter. Cellene ble så for-inkubert med 1% FCS og vasket med PBS hvoretter de ble inkubert med muse-antistoffer i 2 timer ved 20°C og vasket. Deretter ble cellene inkubert i 30 minutter med biotinylert anti-mus-IgG fra hest, vasket og inkubert med et avidin-biotin-peroksydase-reagens. Til slutt ble cellene inkubert med peroksydase-substratet. Antistoffene ga en klar farging av de ondartede HT-1080- og MCF-7-cellene, mens fibro-blaster var negative.

Begge eksemplene på immunofarging indikerer at antistoffene mot type IV kollagenase kan påvise ondartede tumorceller med spredningsegenskaper.

Mens foreliggende oppfinnelse er blitt beskrevet ved hen-visning til visse illustrerende eksempler, vil forskjellige modifikasjoner og varianter innenfor ånden og omfanget av oppfinnelsen være åpenbar for fagfolk innen teknikken.

Claims (13)

1 . Enzympreparater,karakterisert vedat de omfatter rensede basalmembran-nedbrytende metall-proteinaser, hvis substrat er type IV kollagen og som har en molekylvekt på omtrent 70.000.

2. Enzympreparater ifølge krav 1 ,karakterisertved at de er merket med egnede markører.

3. Enzympreparater ifølge kravene 1 og 2,karakterisert vedat de er festet til egnede faste bærere.

4. Antistoffpreparater,karakterisert vedat de omfatter polyklonale antistoffer mot type IV kollagenaseenzymantigenene.

5. Antistoffpreparater,karakterisert vedat de omfatter monoklonale antistoffer mot type IV kollagenaseenzymantigenene.

6. Antistoffpreparater ifølge kravene 4 og 5,karakterisert vedat de er merket med éghede markører.

7. Antistoffpreparater ifølge kravene 4, 5 og 6,karakterisert vedat de er festet til egnede faste bærere.

8. Immunologiske fremgangsmåter for påvisning av ondartede celler med metastatisk celleaktivitet,karakterisert vedat type IV kollagenaseenzymantigenet bestemmes i biologiske prøver.

9. Immunologiske fremgangsmåter ifølge krav 8,karakterisert vedat type IV kollagenaseenzymantigenene bestemmes ved konkurrerende immunoanalyse.

10. Immunologiske fremgangsmåter ifølge krav 8 og 9,karakterisert vedat de omfatter de følgende trinn: (a) vevsnitt eller celler inkuberes med et første antistoff som er spesifikt for type IV kollagenaseenzymantigenet; (b) det første antistoffet får binde seg til enzymanti-genene; (c) et annet merket antistoff mot det første antistoffet tilsettes og det andre merkede antistoffet bindes til det første antistoffet og indikerer derved tilstedeværelsen av type IV kollagenaseenzymantigen i prøven.

1 1. Immunologiske fremgangsmåter ifølge krav 8 og 9,karakterisert vedat de omfatter de følgende trinn: (a) merket type IV kollagenaseenzymantigen inkuberes med et første antistoff som er spesifikt for type IV kollagenaseenzymantigenet i nærvær av prøven som skal undersøkes; (b) reaksjonen får finne sted hvorved type IV kollagenaseenzymantigenet i prøven konkurrerer med det merkede type IV kollagenaseenzymantigenet for antistoffet; (c) det dannede antigen-antistoff-komplekset fraskilles; (d) mengden av merket type IV kollagenaseenzymantigen i komplekset eller i supernatenten bestemmes.

12. Fremgangsmåter ifølge kravene 8 og 9,karakterisert vedat de omfatter de følgende trinn: (a) antistoffer mot type IV kollagenase inkuberes sammen med prøven; (b) type IV kollagenaseenzymantigenet i prøven får bindes til antistoffet; (c) det tilsettes et annet antistoff som bindes til et annet sted på type IV kollagenaseenzymantigenet; (d) mengden av merket antistoff som ikke er i stand til å bindes til type IV kollagenaseenzymantigenet, måles.

13. Rensefremgangsmåter,karakterisert vedat type IV kollagenaseenzymantigener renses ved hjelp av anti stoffer mot type IV kollagenaseenzymantigenene, idet antistoffene er festet til egnede faste bærere.