LU85366A1 - Methods immunologiques de determination de l'activite metastatique de cellules - Google Patents

Description

-3 - 1 - Méthodes immunologiques de détermination de l'activité métastatique de cellules

La présente invention concerne des méthodes destinées à démontrer l'activité métastatique de cellules par la détermination immunologique de l'antigène de collagénase type IV moyennant l'emploi d'anticorps polyclonaux et monoclonaux de cet antigène d'enzyme. De plus, la présente invention concerne des compositions qui comprennent l'antigène d'enzyme marqué ou non marqué et des anticorps polyclonaux et monoclonaux marqués ou non marqués de cet antigène d'enzyme.

L'une des principales caractéristiques des cellules malignes est l'envahissement et la formation de métastase. Par conséquent, les méthodes qui permettent la détection précoce ou rapide et le contrôle des processus d'envahissement sont de très importante valeur au point de vue clinique. La formation de métastase est une succession complexe d'évènements, des cellules malignes se détachant de la tumeur primaire, envahissant le tissu voisin, pénétrant dans les vaisseaux lymphatiques ou circulatoires, s'attachant à la paroi des vaisseaux et y pénétrant en un endroit éloigné, envahissant le tissu et, finalement, proliférant pour donner naissance au foyer métastatique.

Les cellules envahissantes de la tumeur doivent pénétrer des membranes basales en différents endroits au cours du processus de dissémination. Les membranes basales sont des matrices extracellulaires qui forment une feuille continue résistante séparant les cellules épithéliales, endothéliales et parenchymales du tissu conjonctif interstitiel. Ces structures sont composées de collagène (type IV) et de composants non collagènes, tels que laminine, protéoglycane, entactine et fibronectine. Les membranes basales constituent d'importantes barrières pour les cellules de la tumeur et c'est là la raison - 2 - pour laquelle leur dégradation est une étape importante dans le processus de la métastase. Il est estimé que ce processus est facilité par les enzymes protéolytiques. Des niveaux élevés de protéases telles que les activateurs plasminogènes, la cathepsine B et D et les enzymes dégradant le protéoglycane ont été décrits à la fois dans des extraits de tissus de tumeurs et dans des milieux de cellules de tumeurs cultivées, et ces enzymes ont été considérés comme des échantillons prometteurs pour la mesure du potentiel d'envahissement des cellules. Toutefois, la corrélation entre la libération des enzymes et le pouvoir d'envahissement des cellules malignes n'a pas été établie. En fait, les activateurs plasminogènes sont produits par de nombreuses lignes de cellules qui ne présentent pas de propriétés d'envahissement. De plus, comme les protéases qui ont été mentionnées plus haut ne dégradent pas te collagène type IV, elles ne constituent pas un moyen suffisant pour que les cellules de tumeurs traversent les membranes basales.

Les Demandeurs ont démontré que les cellules de tumeurs libéraient une protéase neutre qui dégrade spécifiquement le collagène type IV, et ils ont mis au point des méthodes pour la purification de cet enzyme jusqu'à homogénéité à partir d'une tumeur de souris métastatique (Liotta et al., J. Natl. Cancer Inst., 58, 1427-1431, 1977; Liotta et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 76 , 2268-2272, 1978; Salo et al., The Journal of Biological Chemistry, 258, pp. 3058-3063, 1983), de même qu'à partir de cellules de tumeurs humaines de culture. Les Demandeurs ont également démontré que l'activité de cet enzyme, appelé ici collagénase type IV, était en corrélation avec le potentiel métastatique des cellules de tumeurs (Liotta et al., Nature 284, 67-68, 1980).

- Etant donné que l'antigène d'enzyme de collagénase type IV est, comme cela a été démontré, utile à l'indication de cellules malignes de nature métastatique, l'enzyme peut être d'une importante valeur - 3 - au point de vue diagnostique. Toutefois, la mesure de l'activité de la collagénase type IV ne peut pas être effectuée dans des fluides biologiques, tels que les fluides du corps, les extraits de tissus ou les sections de tissus, en raison de la grande quantité d'inhibiteurs de protéase que contiennent de tels échantillons.

, . L'un des buts de la présente invention est de procurer des méthodes qui permettent la détection de cellules de tumeurs malignes à activité métastatique par la détermination immunologique de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV dans des échantillons biologiques, tels que des fluides du corps, des extraits de tissus, des sections de tissus, des cultures d'organes et de cellules, des milieux de culture, etc... Un autre but de la présente invention est de procurer des compositions qui comportent à la fois l'antigène d'enzyme de collagénase type IV hautement purifié marqué et non marqué et des anticorps polyclonaux ou monoclonaux marqués ou non marqués de cet antigène d'enzyme de collagénase type IV.

Les méthodes de purification et de caractérisation de l'antigène de collagénase type IV à partir de cellules pouvant pénétrer dans les membranes basales, en particulier à partir de cellules de tumeurs malignes, représentent une condition première indispensable à la réalisation de la présente invention. Les Demandeurs ont découvert la collagénase type IV et ils ont mis au point des méthodes de purification et de caractérisation de cet antigène (Liotta et al., J. Natl. Cancer Inst., 58, 1427 - 1431, 1977; Liotta et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 76, 2268 - 2272, 1978; Salo et al., The Journal of Biological Chemistry, 258, pp. 3058 - 3063, 1983; Salo et al., 3. Biol. Chem., 1983). Pour la mesure de l'activité de la collagénase type IV, il est utilisé comme substrat du procollagène type IV marqué radio-acti-vement, ce substrat étant préparé suivant une méthode mise au point par les Inventeurs (Tryggvason et al., Biochemistry, 19, 1284 -1289, 1980). Cet essai d'activité est nécessaire pour déterminer - 4 - i le degré de purification au cours des phases distinctes du processus de purification. Par cette méthode, l'activité de l'enzyme peut être déterminée dans des organes exempts de sérum ou dans des milieux de culture de cellules.

L'enzyme de collagénase type IV peut être obtenu à partir de milieux de culture d'organes exempts de sérum de tissu de tumeurs malignes ou de milieux de cellules de tumeurs cultivées. Les morceaux de tissu ou les cellules sont habituellement cultivés in vitro pendant cinq jours et les milieux sont recueillis quotidiennement. La protéine du milieu qui contient l'antigène de collagénase type IV est précipitée au moyen de sulfate d'ammonium et on la fait passer par plusieurs colonnes de chromatographie, comme il est décrit dans les exemples donnés plus loin à titre d'illustration.

L'antigène de collagénase type IV purifié a un poids moléculaire d'environ 70 000 et lorsqu'il est étudié par électrophorèse sur gel, on constate qu'il est composé de deux chaînes de polypeptides ayant des poids moléculaires de 62 000 et de 68 000. L'antigène d'enzyme de collagénase type IV nécessite une activation protéolytique pour son activité maximum et il a un pH optimum de 7,L'antigène d'enzyme de collagénase type IV est un enzyme dépendant d'un métal et il nécessite du calcium pour l'activité. L'antigène d'enzyme est spécifique et il ne dégrade pas le collagène interstitiel des types I, II ou III, les autres composants des membranes basales ou la caséine.

L'isolation et la purification de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV permettent de produire des anticorps spécifiques de l'antigène d'enzyme en question. La production de ces anticorps permet la mise au point de méthodes immunologiques sensibles pour la détection de l'activité métastatique de cellules par la détermination qualitative ou quantitative des antigènes de collagénase type IV dans des - 5 - échantillons biologiques tels que des fluides du corps, des extraits de tissus, des sections de tissus, des cultures de cellules ou d'organes, des milieux de culture, etc...

La préparation d'antisérums, anticorps polyclonaux aussi bien que monoclonaux peut être effectuée par des méthodes déjà, établies.

Pour la préparation d'antisérums, l'antigène de collagénase type IV purifié est injecté plusieurs fois, par injection sous-cutanée, à des animaux expérimentaux, tels que des lapins ou des cochons d'Inde et, après un laps de temps convenable, le sérum est retiré des animaux. La présence des anticorps spécifiques dans l'antisérum est ensuite examinée par des procédés tels que l'essai à l'immuno-sorbant lié à l'enzyme (méthode ELISA), la méthode connue sous l'appellation de "Western immunoblotting technique" et la méthode de coloration immunologique, procédés qui sont tous bien connus des spécialistes de l'art.

Il a été produit des antisérums pour l'antigène de collagénase type IV de murine par des méthodes mises au point par les Demandeurs. Ces antisérums réagissent avec l'antigène de souris, comme cela a été démontré par la méthode "Immunoblotting technique", par la méthode ELISA et par la méthode d'immunofluorescence.

Pour la préparation d'antisérum usuel, l'antigène d'enzyme de collagénase type IV doit être une protéine très pure et homogène. Il est extrêmement difficile d'obtenir des quantités suffisantes d'antigène de collagénase type IV humain absolument pur pour produire les antisérums usuels chez les lapins et les cochons d'Inde. Pour résoudre cette difficulté, les Demandeurs ont utilisé la méthode de Köhler et Milstein (Nature, 256, 496, 1975) pour préparer des anticorps monoclonaux. Un avantage qu'offre cette méthode est que l'antigène ne doit pas être absolument pur, pour la raison que les clones de cellules (hybrides) produisant l'anticorps spécifique - 6 - " peuvent être choisis dans des conditions in vitro.

Selon la méthode mentionnée plus haut, des souris BALB/C ont été immunisées deux fois par voie sous-cutanée au moyen de 100 pg de collagénase type IV hautement purifiée isolée de milieux de culture de cellules de fibrosarcomes humains. Après six semaines, les antisérums ont été testés par la méthode ELISA. Lorsque les résultats obtenus ont été satisfaisants, les souris ont été immunisées une fois de plus par voie intraveineuse à l'aide d'une quantité con- J venable d'antigène de collagénase type IV. Des cellules de la rate I de deux souris immunisées et des cellules de myélome de souris ; (NS-1) ont ensuite été hybridées et cultivées suivant le procédé j habituel sur des plaques de microtitrage. Sur 453 espaces de plaques, 46 étaient positives pour les anticorps selon la détermination par la méthode ELISA.

Par la méthode qui a été décrite plus haut, il a été trouvé dix lignes hybrides convenables. Ces dix lignes hybrides étaient fortement positives pour les cellules malignes de fibrosarcome humain et pour les cellules de carcinome du sein, mais elles n'étaient que faiblement réactives avec les fibroblastes de peau humaine normale. Trois de ces dix lignes de cellules hybrides, qui avaient les titres les plus élevés, ont été choisies pour former des clones in vitro par le procédé de dilution et pour la production d'anticorps monoclonaux.

Les anticorps polyclonaux et monoclonaux de l'antigène de collagénase type IV produit, isolé et purifié comme il a été indiqué plus haut, peuvent être marqués à l'aide d’agents de marquage radio-actifs, enzymatiques ou fluorescents convenables, par les méthodes classiques et usuelles, comme le comprendront aisément les spécialistes de l'art.

- 7 - l ' Ces anticorps polyclonaux et monoclonaux précités et l'antigène de collagénase type IV, marqués aussi bien que non marqués, ont ? pu être liés à des supports solides convenables et être utilisés lors i de l'application des méthodes immunologiques qui font partie de î la présente invention.

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\ ' . Selon les méthodes de détection de cellules malignes à activité métastatique, la présence de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV est déterminée dans des échantillons biologiques tels que des fluides du corps, des extraits de tissus, des sections de tissus, etc., par les méthodes immunologiques classiques et usuelles, à l'aide de compositions d'antigène d'enzyme de collagénase type IV marqué ou non marqué, lié ou non lié, de même qu'à l'aide de compositions d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux marqués ou non marqués, liés ou non liés.

Par les méthodes immunologiques, de l'antisérum de lapin a été utilisé pour déterminer la présence d'antigène de collagénase type IV. Comme il a été démontré par le procédé connu sous l'appellation de "Western blotting technique", l'antisérum a coloré deux protéines dans la zone 62 K et 6S K, qui correspondent à l'antigène d'enzyme de collagénase type IV purifié. De plus, l'antisérum a été utilisé pour la coloration immunologique de tissus de cancer du sein et de tissus du sein normaux. Des cryosections des tissus ont d'abord été soumises à incubation avec l'antisérum et, ensuite, avec le "FlTC-conjugated anti-rabbit IgG". Les résultats obtenus ont montré que sur dix échantillons de tissus normaux, aucun ne donnait une fluorescence positive, c'est-à-dire qu'ils ne contenaient pas l'antigène de collagénase type IV. D'autre part, vingt-cinq sur vingt-cinq échantillons de tissus de cancer du sein révélaient une intense fluorescence dans la zone de bord de la tumeur. Par conséquent les méthodes immunologiques qui sont décrites dans la présente demande de brevet permettent de détecter la présence de cellules - 8 - de tumeurs malignes dans des tissus et, étant donné que la coloration a été principalement observée au bord de la tumeur, il est évident que l'antigène de collagénase type IV est enrichi en cellules en-vahissantes.

Des anticorps de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV humain produits à partir de clones hybrides de souris ont été utilisés pour la coloration immunologique de cellules cultivées. Les cellules étudiées étaient des cellules de fibrosarcome humain (HT-1080), des cellules de carcinome du sein (MCF-7) et des fibroblastes de peau humaine normale. Les cellules ont été cultivées sur des plaques de microtitrage et soumises à incubation avec les anticorps. Les plaques ont ensuite été lavées, soumises à incubation avec du "horse anti-mouse IgG/IgM" biotinylé, et lavées. Après cela, des agents de réaction d'avidine-biotine-peroxydase ont été ajoutés pour colorer les complexes d'immunoglobuline souris - immunoglobuline anti-souris liés aux cellules. Les résultats qui ont été obtenus ont montré que les cellules HT-1080 et MCF-7 malignes étaient colorées, tandis que les fibroblastes de peau normale n'étaient pas colorés. Il est par conséquent évident que les anticorps monoclonaux de la collagénase type IV humaine pouvaient être utilisés pour différencier des cellules malignes contenant l'antigène d'enzyme de collagénase type IV de cellules normales ne contenant pas cet antigène d'enzyme.

On donnera ci-après une explication plus amplement détaillée de la présente invention à l'aide des exemples qui seront décrits dans la suite de cet exposé à titre d'illustration.

Exemple 1

Isolation d'antigène de collagénase type IV.

Pour la préparation de collagénase type IV de souris, on a tout d'abord fait croître des tumeurs PMT métastatiques chez des souris C57B1/6J. Après environ deux semaines de croissance, les tumeurs - 9 - ont été excisées, émincées et soumises à incubation dans un milieu RPMI-1640 exempt de sérum, en tant que cultures d'organes, pendant un laps de temps de cinq jours. Le milieu a été recueilli quotidiennement et sa protéine a été précipitée à l'aide de sulfate d'ammonium (saturation 25 - 60 %). Le précipité a été dissous dans le tampon d'enzyme (0,05 M Tris-HCl, pH 7,4, 0,2 M NaCl, 10 mM CaC^) et on l'a fait passer par une colonne de concanavaline-A agarose, à laquelle la majeure partie de l'activité de l'enzyme s'est liée. L'activité liée a été éluée à l'aide de 1 M d'o(-méthyi-mannoside et on l'a fait passer par une colonne de collagène type IV-agarose. Le collagène accouplé à la colonne a été extrait de la tumeur formant matrice de membrane basale EHS et a été purifié, et il contenait des chaînes de collagène type IV intactes (185 K et 175 K). Afin que la dégradation du collagène-agarose par l'enzyme soit évitée, les tampons étaient exempts de CaCl2 pendant le passage par la colonne. L'activité de l'enzyme a été éluée de la colonne à l'aide de tampon d'enzyme contenant 1 M NaCl ou de l'éthylène-glycol 50 %. La purification finale de l'enzyme a été obtenue au tamis moléculaire par exemple avec du Bio-Gel A 0,5 m, où il y a eu migration avec un poids moléculaire apparent d'environ 160 000. L'enzyme purifié de cette façon contenait deux chaînes de polypeptides de poids moléculaires 68 K et 62 K.

L'activité de la collagénase type IV humaine a été préparée de la même façon que celle de l'enzyme de murine à partir de milieux exempts de sérum de cellules de fibrosarcome humain cultivées (HT-1080). Les cellules ont été cultivées en milieu de Eagle à modification Dulbeccos (DMEM) contenant 10 % de confluence foetale dans du sérum de veau, dans des tubes roulants, après quoi le milieu a été modifié en le même milieu exempt de sérum. Le milieu a été recueilli quotidiennement pendant un laps de temps de cinq jours.

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Exemple 2

Préparation d'antisérum de la collagénase type IV de souris; L'antigène (100 - 200 pg) a été injecté par voie sous-cutanée dans des volumes égaux d'eau physiologique à tampon de phosphate (P B S ) et adjuvant de Freund complet et à nouveau, après quatre semaines, avec de l'adjuvant de Freund incomplet. Des injections de rappel ont ensuite été faites deux fois à intervalle de trois semaines. Du sang a été tiré trois semaines après le dernier rappel et le sérum a été testé pour la spécificité et le titre par le procédé ELISA, par le procédé dit "Western blotting technique" et par le procédé d'immunocoloration.

„ Exemple 3

Préparation et caractérisation d'anticorps monoclonaux.

Des souris BALB/C ont été immunisées à l'aide de 100 pg d'enzyme HT-1080 partiellement purifié dans de l'adjuvant de Freund complet et elles ont été à nouveau immunisées deux fois à l'aide de 50 pg d'antigène, à intervalle de trois semaines. Les titres des antisérums ont été testés trois semaines après la dernière injection et, les résultats obtenus ayant été satisfaisants (dilution ^ 1:500), comme il a été déterminé par la méthode ELISA, il a été administré aux animaux 50 pg d'antigène par voie intraveineuse. Quatre jours plus tard, l'hybridation a été effectuée selon Köhler & Milstein (Nature, 256, 496, 1975). Des cellules de rate immunisées de deux souris ont été fusionnées à des cellules de myélome NS-1 ou à des cellules de myélome correspondantes et les cellules fusionnées ont été plaquées sur des plaques de microtitrage à 96 espaces à raison d'environ 2 x 105 cellules / espace, et des cellules de péritoine > de souris (macrophages) ont été utilisées comme cellules feeder (6 x 103). Les cellules ont été cultivées dans un milieu HAT sélectif -4 -7 (DMEM contenant 10 M hypoxanthine, 10 M aminopeptine, 1,6 x 10 M et FCS 20 %) pendant un laps de temps de 3 - 4 semaines. Ce milieu n'a permis qu'aux cellules hybrides de croître. Les cellules ί i ί - 11 - ont été testées pour la production d'anticorps par la méthode ELISA et généralement environ 10 % des espaces des plaques étaient posi-' tifs. La spécificité des anticorps a également été testée par la méthode connue sous l'appellation de "Western blotting technique" et par coloration immunologique.

La méthode ELISA a été appliquée avec utilisation de plaques de microtitrage a 96 espaces. Environ 50 - 100 ng d'antigène ont été placés dans chaque espace et séchés. Les points à liaison libre ont été bloqués par incubation pendant un laps de temps de trente minutes à l'aide de 50 pl de FCS 1 % et les espaces ont été lavés à l'aide de PBS. L'hybride surnagea tandis que les antisérums étaient ensuite ajoutés dans les espaces (50 pl) et soumis à incubation.

Après lavage à l'aide de PBS, 50 μΐ de solution de "horse anti-mouse IgG" biotinylé contenant du FCS 1 % ont été ajoutés et soumis à incubation pendant un laps de temps de trente minutes, ce qui fut suivi d'un lavage à l'aide de PBS. Après cela, un agent de réaction d'avidine-biotine-peroxydase a été ajouté et l'on soumit à incubation. Ensuite, le substrat de peroxydase (0,01 % o-dianisidine, 0,01 % ^-£>2 ^ans ^u a ajouté et la couleur brun clair qui s'est formée a été mesurée au spectrophotomètre Titertek Multiscan.

La méthode connue sous l'appellation de "Western blotting technique" peut être utilisée pour mieux caractériser les anticorps, pour la raison qu'elle montre avec quelles chaînes de polypeptides exactement l'anticorps réagit. L'antigène ou un mélange de protéines contenant l'antigène a tout d'abord été séparé par électrophorèse sur gel de 10 % de sodium dodécyl-sulfate-polyacrylamide, après quoi les protéines ont été déposées horizontalement sur une feuille de nitro-cellulose, un courant de 0,1 A étant utilisé, pendant un laps de temps d'une nuit. La feuille a ensuite été colorée à l'aide d'une solution de coloration d'héparine-toluidine. Les bandes de nitro- - 12 - I cellulose contenant les protéines ont ensuite été coupées et la colo- i ration a été enlevée à l'aide d'une solution (50 % d'éthanol, 8 % . d'acide '"acétique et 42 % d'eau). La coloration immunologique des bandes a alors été effectuée par le même procédé que celui qui est utilisé selon la méthode ELISA. Les anticorps positifs ont donné une couleur brune de l'antigène seulement, mais “il convient de faire remarquer que si l'anticorps est dirigé sur la structure tertiaire de l'antigène, on peut obtenir un résultat négatif, pour la raison que les protéines sont dénaturées au cours de l'électrophorèse sur . gel.

Exemple 4

, Immunocoloration de collagénase type IV

De l'antisérum de lapin pour la collagénase type IV de souris purifiée a été utilisé pour étudier la localisation de l'enzyme dans des tissus du sein normaux et dans des tissus de tumeur maligne du sein. Des cryosections (de 5pm d'épaisseur) de dix échantillons de tissus de sein normaux et de vingt-cinq échantillons de tissus de cancer du sein ont été soumises à une pré-incubation à l'aide de FCS 1 % et elles ont ensuite été lavées à l'aide de PBS. Après cela, l'antisérum, dilution 1/50, a été soumis à incubation avec les échantillons pendant un laps de temps de deux heures à la température de 20°C, ce qui fut suivi d'un lavage à l'aide de PBS. Les sections ont ensuite été soumises à incubation avec du sérum "FITC-conjugated goat anti-rabbit" pendant un laps de temps d'une nuit, à la température de 4°C, et l'on a procédé à un lavage à l'aide de PBS. La fluorescence a ensuite été étudiée. Les résultats qui ont été obtenus ont indiqué qu'aucun des tissus normaux n'avait „ été coloré, tandis que les vingt-cinq tissus de cancer donnaient tous une fluorescence claire. La coloration était le plus intense au bord tourné vers les tumeurs envahissantes et dix à quatre-vingts pour cent des cellules de tumeur étaient positives.

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Des anticorps monoclonaux contre la collagénase type IV de cellules de sarcome HT-1080 humain ont été utilisés pour colorer des cellules HT-1080 cultivées, des cellules de carcinome du sein (MCF-7) et des fibroblastes de peau humaine. Les cellules ont été cultivées sur des lamelles jusqu'à subconfluence et fixées à l'aide de méthanol à -20°C, pendant un laps de temps de dix minutes. Les cellules ont ensuite été soumises à une pré-incubation à l'aide de FCS 1 % et ont été lavées à l'aide de PBS, après quoi elles ont été soumises à incubation à l'aide d'anticorps de souris, pendant un laps de temps de deux heures, à la température de 20°C, et ont été lavées. Les cellules ont ensuite été soumises à incubation pendant un laps de temps de trente minutes à l'aide de "horse anti-mouse IgG" biotinylé, ont été lavées et ont été soumises à incubation à l'aide d'un agent de réaction d'avidine-biotine-peroxydase. Enfin, les cellules ont été soumises à incubation avec le substrat de peroxydase. Les anticorps ont donné une coloration claire des cellules malignes HT-1080 et MCF-7, tandis que les fibroblastes étaient négatifs.

Les deux exemples de colaration immunologique indiquent que les anticorps de la collagénase type IV permettent de détecter les cellules de tumeurs malignes à propriétés d'envahissement.

Bien que la présente invention ait été décrite ci-dessus dans des cas d'application donnés dans certains exemples, qui ont été présentés à titre d'illustration, il est possible d'imaginer, dans le cadre et l'esprit de cette invention, diverses variantes de réalisation et diverses modifications, ce dont les spécialistes de l'art se rendront aisément compte.

Claims (11)

1. 2. Préparations d'enzymes suivant la revendication 1, caractérisées ^ en ce qu'elles sont marquées à l'aide d'agents de marquage convenables.
2. 3. Préparations d'enzymes suivant la revendication 1 et la revendication 2, caractérisées en ce qu'elles sont attachées à des supports solides convenables.
3. 4. Préparations d'anticorps caractérisées en ce qu'elles comportent des anticorps polyclonaux de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV.
4. 5. Préparations d'anticorps caractérisées en ce qu'elles comportent des anticorps monoclonaux de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV.
5. 6. Préparations d'anticorps suivant la revendication 4 et la revendication 5, caractérisées en ce qu'elles sont marquées à l'aide d'agents de marquage convenables.
6. 7. Préparations d'anticorps suivant les revendications 4, 5 et 6, caractérisées en ce qu'elles sont attachées à des supports solides convenables. * 8. Méthodes immunologiques de détection de cellules malignes à activité métastatique caractérisées en ce que les antigènes d'enzyme de collagénase type IV sont déterminés à partir d'échantillons biologiques.
7. 9. Méthodes immunologiques suivant la revendication 8, caractérisées en ce que les antigènes d'enzyme de collagénase type IV sont déter- - 15 - minés par essai immunologique compétitif.
8. 10. Méthodes immunologiques suivant la revendication 8 et la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles comportent les opérations qui sont indiquées ci-après : a) des sections de tissus ou des cellules sont soumises à incubation avec un premier anticorps spécifique de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV précité; b) on laisse le premier anticorps précité se lier à l'antigène d'enzyme précité; c) un second anticorps, marqué, du premier anticorps précité est ajouté et le second anticorps marqué se lie au premier anticorps précité, indiquant la présence d'antigène d'enzyme de collagénase type IV dans l'échantillon.
9. 11. Méthodes immunologiques suivant la revendication 8 et la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles comportent les opérations qui sont indiquées ci-après : a) de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV est soumis à incubation avec un premier anticorps spécifique de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV précité, en présence de l'échantillon à soumettre à l'essai; b) on laisse la réaction se produire, l'antigène d'enzyme de collagénase type IV de l'échantillon entrant en compétition avec l'antigène d'enzyme de collagénase type IV marqué pour l'anticorps; c) le complexe antigène - anticorps formé est séparé; d) la quantité d'antigène d'enzyme de collagénase type IV marqué présente dans le complexe ou dans le produit qui surnage est déterminée.
10. 12. Méthodes suivant la revendication 8 et la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles comportent les opérations qui sont indiquées ci-après : a) des anticorps de la collagénase type IV sont soumis à incubation avec l'échantillon; »· - 16 - b) on laisse l'antigène d'enzyme de collagénase type IV contenu dans l'échantillon se lier à l'anticorps; c) un second anticorps, qui se lie à un endroit différent de l'antigène d'enzyme de collagénase type IV précité, est ajouté; d) la quantité d'anticorps marqué qui ne peut pas se lier à l'antigène d'enzyme de collagénase type IV est mesurée.
11. 13. Méthodes de purification caractérisées en ce que des antigènes d'enzyme de collagénase type IV sont purifiés a l'aide d'anticorps des antigènes d'enzyme de collagénase type IV précités, les anticorps précités étant attachés à des supports solides convenables. V